Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Morfologiske og funksjonell evaluering av Ribbon synapser på spesifikke frekvens regioner av Mouse cochlea

doi: 10.3791/59189 Published: May 10, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Dette manuskriptet beskriver en eksperimentell protokoll for evaluering av morfologiske egenskaper og funksjonell status for bånd synapser i normale mus. Den nåværende modellen egner seg også for støy-indusert og alder-relaterte cochlear synaptopathy-begrensede modeller. De correlative resultatene av tidligere mus studier er også diskutert.

Abstract

Cochlear indre hårceller (IHCs) overfører akustiske signaler til spiral Ganglion neurons (SGNs) gjennom bånd synapser. Flere eksperimentelle studier har indikert at hår celle synapser kan være de første målene i sensorineural hørselstap (SNHL). Slike studier har foreslått begrepet cochlear "synaptopathy", som refererer til endringer i bånd synapse nummer, struktur eller funksjon som resulterer i unormal Synaptic overføring mellom IHCs og SGNs. Selv om cochlear synaptopathy er irreversibel, påvirker det ikke hørsels terskelen. I støy induserte eksperimentelle modeller er begrenset skade på IHC synapser i utvalgte frekvensområder benyttet for å identifisere de miljømessige faktorene som spesielt forårsaker synaptopathy, så vel som de fysiologiske konsekvensene av å forstyrre dette indre øret krets. Her presenterer vi en protokoll for å analysere cochlear Synaptic morfologi og funksjon på et bestemt frekvensområde i voksen mus. I denne protokollen utføres cochlear lokalisering av spesifikke frekvensområder ved hjelp av steds frekvens kart i forbindelse med cochleogram data, som følger de morfologiske karakteristikkene av bånd synapser evalueres via Synaptic immunostaining. Den funksjonelle status bånd synapser bestemmes deretter basert på amplituder av hørbar hjernestammen respons (ABR) bølge I. Den nåværende rapporten viser at denne tilnærmingen kan brukes til å utdype vår forståelse av patogenesen og mekanismer av Synaptic dysfunksjon i sneglehuset, som kan hjelpe i utviklingen av romanen terapeutiske intervensjoner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Frekvenser i området ca 20 \ u201220, kan 000 Hz oppfattes som hørsels stimuli av mennesker. Menneskelig hørsel er normalt mest følsom nær 1 000 Hz, hvor gjennomsnittlig lydtrykksnivå er 20 μPa hos unge voksne (dvs. 0 desibel med lydtrykksnivå [dB SPL]). I noen patologiske tilstander er hørselstap begrenset til bestemte frekvenser. For eksempel, i de tidlige stadier av støy-indusert hørselstap (NIHL), en "hakk" (dvs., hørsel terskel høyde) kan observeres i audiogram ved 4 kHz1. Langs det pattedyr cochlea-partisjonen produserer dens graderinger av stivhet og masse et eksponentiell frekvens kart med høyfrekvent lyd deteksjon ved bunnen av cochlea og lavfrekvent deteksjon på Apex2. Ja, det er et cochleaimplantat-kart langs basilar membranen, noe som fører til det som er kjent som tonotopic Organization2,3. Hvert gitt sted på basilar membranen har den høyeste følsomheten til bare en bestemt lyd frekvens, som vanligvis kalles den karakteristiske frekvensen3,4, selv om svar på andre frekvenser kan også observeres.

Til dags dato har ulike musemodeller vært ansatt for å undersøke normal funksjon, patologiske prosesser og terapeutisk effekt i hørselssystemet. Presis kunnskap om fysiologiske parametre i musen cochlea er en forutsetning for slike studier av hørselstap. Musen cochlea er anatomisk delt inn i apikale, midtre og basale svinger, som tilsvarer ulike frekvensområder. Ved å merke hørselsnerven afferents på cochlea-kjernen for å analysere de tilsvarende perifere innervasjon IDene i sneglehuset, ble Müller et al. lyktes i å etablere et steds frekvens kart i den normale musen in vivo5. I intervallet på 7,2-61.8 kHz, som tilsvarer posisjoner mellom 90% og 10% av hele lengden av basilar membranen, kan musen cochlear steds frekvens kart beskrives av en enkel lineær regresjon funksjon, noe som tyder på en sammenheng mellom normalisert avstand fra cochlear base og logaritmen av den karakteristiske frekvensen5. I laboratoriemus kan steds frekvens kartet brukes til å utforske forholdet mellom hørsels terskler innenfor bestemte frekvensområder og cochleograms som viser antall manglende hårceller i relative områder langs basilar membranen6. Viktigere er det sted-frekvens kartet gir et posisjoneringssystem for etterforskning av minimale strukturelle skader, for eksempel skade på båndet synapser av hårceller på bestemte cochlear frekvens steder i mus med perifer hørsels traume7 ,8.

I pattedyr cochlea, bånd synapser består av et presynaptiske nerve bånd, en elektron-tett projeksjon som tethers en Halo av release-klar Synaptic blemmer som inneholder glutamat i IHC, og en postsynaptic tetthet på nerve terminalen i SGN med glutamat reseptorer9. Når du Transduction cochlear, resulterer hår celle bunten i IHC depolarization, som fører til glutamat utgivelse fra IHCs på de postsynaptic afferente terminalene, og dermed aktivere hørsels Tien. Aktivering av denne veien fører til transformasjon av lyd-indusert mekaniske signaler til en rate kode i SGN10. Faktisk er IHC Ribbon synapse svært spesialisert for Indefatigable lydoverføring til priser for hundrevis av Hertz med høy Temporal presisjon, og er av avgjørende betydning for presynaptiske nerve mekanismer for lydkoding. Tidligere studier har avdekket at båndet synapser varierer sterkt i størrelse og tall på ulike frekvensområder i voksen Mouse cochlea11,12, sannsynligvis reflekterer strukturell tilpasning til den spesielle lydkodingen for behov for overlevelse. Nylig har eksperimentelle dyrestudier vist at cochlear synaptopathy bidrar til flere former for hørselshemninger, inkludert støy indusert hørselstap, alders relatert hørselstap og arvelig hørselstap13, 14. dermed har metoder for å identifisere korrelert endringer i Synaptic nummer, struktur og funksjon på bestemte frekvensområder blitt stadig mer brukt i studier av hørsels utvikling og indre øret sykdom, ved hjelp av modeller som genereres via eksperimentell manipulering av genetiske eller miljømessige variabler15,16,17.

I den gjeldende rapporten, presenterer vi en protokoll for å analysere Synaptic nummer, struktur og funksjon i et bestemt frekvensområde av basilar membran i voksen mus. Cochlear frekvens lokalisering utføres ved hjelp av et gitt sted-frekvens kart i kombinasjon med en cochleogram. De normale morfologiske karakteristikkene av cochlear bånd synapser evalueres via presynaptiske nerve og postsynaptic immunostaining. Den funksjonelle status for cochlear Ribbon synapser bestemmes basert på suprathreshold amplituder av ABR bølge I. Med mindre endringer, kan denne protokollen brukes til å undersøke fysiologiske eller patologiske tilstander i andre dyremodeller, inkludert rotter, marsvin og gerbils.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle prosedyrer ble utført i samsvar med NRC/lignende guide for Stell og bruk av Laboratoriedyr (8th Edition). Studien protokollen ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee of Capital Medical University, Beijing, Kina.

1. Animal utvalg

  1. For alle eksperimenter, bruk voksen C57BL/6J mannlige mus (8 uker gammel) som dyret modellen.
    Merk: C57BL/6J mus bærer en skjøte variant av Cdh23 utstillingen akselerert senescence i hørselssystemet, reflektert som en 40% tap av bånd synapser på basal sving av sneglehuset og en 10% tap på midten sving av 6 måneders alder, etterfulgt av en rask økning av dette tapet i hele sneglehuset med alderen18,19. Derfor anbefaler vi forsiktighet når du bruker C57BL/6J mus eldre enn 6 måneder for hørsels forskning. Andre stammer av mus kan brukes avhengig av spesifikke eksperimentelle mål.
  2. Inspiser musene ved å bruke en profesjonell diagnostisk lomme Otoskop for å utelukke ytre eller mellomøret patologi før hørsels vurderinger. Potensielle tegn kan inkludere væske eller Pus i den ytre øre kanalen, rødhet og hevelse i lokalt vev, og tromme membran perforering.
    Merk: Selv om dette er sjelden oppdages, en gang identifisert, mus med ytre eller mellomøret sykdommer bør utelukkes.

2. hørsels vurdering

  1. Bedøve mus som bruker en intraperitoneal injeksjon av en blanding av ketamin hydrochloride (100 mg/kg) og xylazine hydroklorid (10 mg/kg). Bedømme dybden av anestesi via smertefulle stimuli (f. eks toe-klype refleks).
    Merk: Når toe-klype refleks er helt fraværende, har dyret nådd en tilstrekkelig dybde av anestesi for hørsels testing. Hvis mer tid er nødvendig for bilaterale ABR-innspillinger, administrere en lavere dose (en femtedel av den opprinnelige doseringen) av anestesi for å gjenopprette den opprinnelige bedøvelse flyet. Pass på å unngå narkose overdose, da dette kan føre til døden i mus.
  2. Oppretthold det anesthetized dyrets kroppstemperatur ved 37,5 ° c ved hjelp av en temperaturregulerende varmepute. Plasser det anesthetized dyret i et elektrisk og akustisk skjermet rom for å unngå interferens i hele hørselstesten.
    Merk: Opprettholde fysiologiske temperaturen under hele prosedyren til dyret er helt våken, for å hindre død forårsaket av post-anestesi nedkjøling.
  3. Plasser subdermal nål elektroder (20 mm, 28 G) på toppunktet av skallen (opptaks elektroden), i ipsilateral parotid regionen under høydepunktene i målt øret (referanse elektrode), og i den kontralateral parotid regionen (jordelektroden), med en dybde på 3 mm under huden av musen hodet, henholdsvis20.
  4. Bruk en lukket felt høyttaler for å utføre akustisk stimulering via et 2 cm plastrør med en kjegle-formet spiss. Monter spissen i den ytre øre kanalen21.
    Merk: Sørg for at den elektriske impedans i opptaks-og referanse elektrodene er mindre enn 3 kOhm (vanligvis 1 kOhm). Hvis impedans er høy, endre innsetting stedet av elektroden, rengjøre elektroden med alkohol, eller erstatte elektroden for å unngå endringer i ABR bølge amplitude.
  5. For ABR-opptak genererer tone pips (3 MS varighet, 1 MS stigning/fall tider, med en hastighet på 21.1/s, frekvens: 4 – 48 kHz) og presenterer dem ved å redusere SPLs fra 90 til 10 dB i 5 \ u201210 dB SPL trinn20. I dette trinnet forsterkes svarene (10 000 ganger), filtreres (0,1 – 3 kHz), og gjennomsnitt (1 024 prøver/stimulans nivå).
    Merk: ABRs samles for hvert stimulans nivå i 10 dB trinn, med ytterligere 5 dB trinn nær terskelen.
  6. På hver frekvens, bestemme ABR-terskelen, som refererer til minimal SPL resulterer i en pålitelig ABR-opptak med en eller flere synlige bølger som kan tydelig identifiseres ved visuell inspeksjon (figur 1).
    Merk: Det er vanligvis nødvendig å gjenta prosessen for lav SPLs rundt terskelen for å sikre konsistens av bølgeformene. Responsen terskelen er den laveste stimulans nivå som bølgeform kan observeres, når en reduksjon på 5 dB ville føre til forsvinningen av bølgeform.

3. cochlear tissue behandling

  1. Etter ABR-opptak euthanize de anesthetized musene via cervical forvridning, halshugge dem, avslører Bulla fra ventrale IDen, og åpner med skarp saks for å få tilgang til sneglehuset.
  2. Ved hjelp av en fin tang, fjerne timelige bein, bryte stigbøylen arterien, fjerne stigbøylen fra det ovale vinduet, og brudd den runde vinduet membran. Lag et lite hull på toppen av sneglehuset ved å dreie tuppen av en nål forsiktig (13 mm, 27 G).
  3. Fest de isolerte beina med 4% (WT/Vol) paraformaldehyde i 0,1 M fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7,4) over natten ved 4 ° c. Bruk en pipette med fin spiss, og skyll forsiktig bindemiddel gjennom perilymphatic områder via påføring til de ovale eller runde vinduene (som innløp) og åpningen på toppen (som et utløp).
    Merk: Noen proteiner krever en kort varighet av fiksering for å unngå ødeleggelse av sine epitopes for immunolabeling. I slike tilfeller, ruge bein i 4% paraformaldehyde ved romtemperatur (RT) for 2 t, avhengig av produsentens instruksjoner for immunhistokjemi. Fiksering kan også utføres via hjerte-blod for å fjerne cochlear blodet, unngå bakgrunnsstøy på grunn av ikke-spesifikke flekker på senere stadier, spesielt i musemodeller av cochlear synaptopathy.
  4. Skyll beina tre ganger i 5 minutter med 0,1 M kaldt PBS å fjerne rester paraformaldehyde. Avkalke beina med 10% ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) enten ved RT for 4 t eller ved 4 ° c i 24 timer via skånsom risting i en horisontal shaker ved 20 RPM. EDTA kan oppdateres midtveis.
    Merk: Avkalking tider er underlagt konsentrasjonen av EDTA og brukernes preferanser. Decalcified vev bør opprettholde en viss grad av seighet, noe som forenkler manipulering av å isolere cochlear hele-mounts på senere trinn. Temporal bein kan bli decalcified i 10% EDTA med rotasjon, slik at forskerne å forlate laboratoriet etter ABR tester og fiksering eksperimenter. Avkalking tiden er fleksibel innenfor området 20 til 30 timer ved 4 ° c.
  5. Overfør en decalcified Temporal bein fra EDTA til 0,1 M PBS. Bruk #3, #5 Dumont tang og 27 G nål for å analysere apikale, midtre og basale cochlear regioner i sving og deretter analysere sneglehuset ut av benet under et stereo disseksjon mikroskop (som tidligere beskrevet22). Lag en rekke små kutt langs spiral leddbånd ved hjelp av en barberhøvel blad, og fjerne tectorial membranen og Reissner ' s membran (figur 2).
    Merk: Så lenge dissekert cochlea er intakt, kan denne prosessen endres i henhold til den enkelte operatørens vanlige protokoll.
  6. Videre analysere de resterende hørsels epitel inkludert spiral limbus i individuelle cochlear svinger (Apex, midtre og base med krok region) for hel-Mount forberedelser.
  7. Under en 40x olje målsetting av et lett mikroskop, måle basilar membran lengde med en 250 μm skala plassert i okularet, som kan justeres langs stereocilia av IHCs.
  8. Beregn lengden på hver cochlear sving ved å legge til alle segment lengder (250 μm per segment), og samtidig oppnå den totale lengden på basilar membranen ved å summere lengden på hver sving.
  9. Konverter den totale lengden på basilar membranen inkludert kroken regionen i en prosentandel basert på avstand fra cochlear Apex (0% refererer til cochlear Apex, 100% til cochlear base).
  10. Konverter denne avstanden til den karakteristiske frekvensen for cochlear ved hjelp av en logaritmisk funksjon (d (%) = 1-156,5 + 82,5 × log (f), med en helling på 1,25 mm/oktav av frekvens, der d er normalisert avstand fra cochlear Apex i prosent, f er frekvensen i kHz), som tidligere beskrevet5,6. Dermed kan frekvensområdet i et tilsvarende område av basilar membranen på hver enkelt cochlear-sving anskaffes.

4. Immunofluorescence farging

  1. Etter disseksjon, plasser hver cochlear sving i et separat 2,5 mL sentrifugerør og ruge cochlear svinger i 10% geit serum/PBS/0.1% Triton X-100 for 1 time ved RT på en rotator.
  2. Fjern den blokkerende/permeabilization løsningen over fra hvert rør ved hjelp av en 200 μL dråpespiss under et disseksjon mikroskop og ruge prøvene med primær antistoffer fortynnet i 5% geit serum/PBS/0.1% Triton X-100 over natten ved 4 ° c på en rotator.
    Merk: For immunolabeling av cochlear Synaptic bånd, bruk presynaptiske nerve markør musen anti-kar bok syl-Terminal binding protein 2 IgG1 (CtBP2, merking av B-domenet til RIBEYE stillas protein, 1:400) og postsynaptic markør musen anti-glutamat reseptor 2 IgG2a (GluR2, merking en delenhet av AMPA reseptor, 1:200)23.
  3. Skyll tre ganger i 5 minutter med 0,1 M kaldt PBS å fjerne rester primære antistoffer og ruge prøvene med sekundære antistoffer fortynnet i 5% geit serum/PBS/0.1% Triton X-100 ved RT for 2 \ u20123 h i mørket på en rotator.
    Merk: Forbered riktig sekundære antistoff blandinger med geit anti-mus Alexa fluor 568 (IgG1, 1:500) og geit anti-mus Alexa fluor 488 (IgG2a, 1:500), som er komplementære til den primære antistoffer som brukes i trinn 4,2. For å forbedre merkingen effektivitet for Synaptic bånd, anbefaler vi å velge bestemte sekundære antistoffer. Noen laboratorier forlenge inkubasjons med sekundære antistoffer for å øke GluR2 immunolabeling24.
  4. Skyll tre ganger i 5 minutter med 0,1 M PBS for å fjerne gjenværende sekundære antistoffer og overføre prøvene fra 2,5 mL sentrifugerør til 35 mm plater som inneholder 0,1 M PBS.
  5. Plasser en dråpe festemiddel som inneholder 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) på lysbildet, og Overfør prøvene fra PBS til festemiddelet. Plasser den ene kanten av en dekkglass på lysbildet, og slipp den for å la dekkglass falle forsiktig.
    Merk: For å sikre at hårcellene vender oppover, og at det ikke oppstår bretting eller vridning av cochlea-prøver under prosedyren, monterer du cochlear-prøver under et stereo disseksjon mikroskop.
  6. Plasser lysbildene i en lysbilde boks ved 4 ° c over natten for å la lysbildene tørke og deretter bildet under et laser konfokalmikroskopi mikroskop.

5. morfologiske evaluering av cochlear Ribbon synapser

  1. Bilde lysbilder ved hjelp av en konfokalmikroskopi mikroskop med tre lasere-en 405 NM UV diode, en 488 NM Argon laser, og en 561 NM diode-pumpet Solid-State (DPSS) laser å opphisse DAPI (eksitasjon spektrum 409-464 NM), Alexa fluor 488 (eksitasjon spektrum 496-549 NM) og Alexa fluor 568 (Eksitasjon spektrum 573 – 631 NM), henholdsvis.
  2. Skaff konfokalmikroskopi z-stabler over en avstand på 8 μm fra hver cochlear turn ved hjelp av en 63x høyoppløselig olje nedsenking linse.
    Merk: Når dette er definert, bør alle parametere for digitalisering fargefotomikrografier lagres og brukes jevnt på alle lysbildene.
  3. For Synaptic punctum teller, angi z-stabler (0,3 μm trinn størrelse) til span hele lengden av IHCs, og dermed sikre at alle Synaptic puncta kan bli avbildet.
  4. Flett bildene som inneholder puncta i en z-stabel for å oppnå projeksjon av z-aksen, og Importer til programvaren for bildebehandling.
  5. Del totalt antall i Synaptic i hver z-stabel ved bestemte frekvensområder med antall IHCs (lik DAPI-antallet for kjernefysiske manuelle tellinger) for å beregne antall Synaptic puncta for hvert IHC. Ved hver spesifikke frekvens region, gjennomsnittlig alle Synaptic puncta i tre bilder av ulike mikroskopiske felt som inneholder 9-11 IHCs.
    1. Skissere regionen av interesser (ROIs) inkludert basolateral regionene på hvert IHC bruke Frihånd valgknappen. Bruk måle funksjonen for automatisk kvantifisering av puncta, og vannskille funksjonen til å skille mellom tett tilstøtende flekker.
    2. Etter hver automatisert telling, Utfør visuelle inspeksjoner med manuelle korrigeringer for å sikre at puncta teller pålitelig.
      Merk: Forskere bør være blindet om hvorvidt raset er fra toppen, midten eller basal omdreining av sneglehuset.
  6. Visuelt vurdere Synaptic struktur og distribusjon, for å manuelt isolere individuelle IHCs fra sine naboer ved blyant Tool (M) for bedre å visualisere cytoskjelettkomponenter arkitektur og Synaptic lokalisering.
  7. Å inspisere det sidestilling av presynaptiske nerve bånd (CtBP2) og postsynaptic reseptor flekker (GluR2), ekstra det Voxel mellomrom i nærheten bånd av det rektangulær Marquee verktøyet og isolere individ bånd av avling. Igjennom klikker image ≫ image størrelse, erverve en thumbnail oppstille av disse miniatyr prognosene, hvilke kanne så bli brukt til å identifisere par synapser (opptrådte idet undersøke saken grundig sidestilt parene av CtBP2-positiv og GluR2-positiv puncta) mot foreldreløs bånd (mangler postsynaptic glutamat reseptor patcher) (Figur 3).
    Merk: Normal cochlear synapser vises som kombinert immunolabeling av det presynaptiske nerve båndet i hår cellen (anti-CtBP2) og postsynaptic glutamat reseptor plaster på hørsels nerve terminalen (anti-GluR2)25. Noen laboratorier bruker konfokalmikroskopi anslag i forbindelse med 3D-modellering for å kvantifisere Synaptic patch størrelse eller volum26,27. Før betydelig tap av bånd synapser, bånd viser endringer i størrelse eller uten paret glutamat reseptor patcher er sannsynlig indikasjon på Synaptic dysfunksjon27,28.

6. funksjonell evaluering av cochlear Ribbon synapser

  1. Samle alle ABR-bølger for hver frekvens stimulans presentert på en SPL på 90 dB for analyse av suprathreshold ABR bølgen jeg amplituder.
    Merk: Nevrofysiologiske og morfologiske studier har vist at lav spontan-rate, høy terskel fibre er spesielt sårbare for aldring og støyeksponering29,30. Selv om det enkle tap av bånd synapser ikke kan påvirke ABR terskler, resulterer det vanligvis i betydelige reduksjoner i ABR bølgen jeg amplituder, fordi disse afferents inkludert lav spontan-rate, høy terskel fibre og høy spontan-rate, lav terskel fibre bidrar sterkt til de summerte aktivitetene til cochlear nervefibre28,29,31. En suprathreshold intensitet av 90 dB SPL er valgt her.
  2. Bestem peak-til-peak bølgen jeg amplitude ved hjelp av en offline analyse program (Figur 4). Hver bølge jeg i ABR testen består av en start positive (p) utslag og påfølgende negative (n) utslag. ABR bølgen jeg amplitude er definert som forskjellen i spenning mellom IP (den positive toppen av bølge i) og in (den negative toppen av bølge I)29.
    Merk: I patologiske tilstander kan cochlear synaptopathy avgjøres basert på den suprathreshold amplituder av ABR-bølgen I, som reflekterer de oppsummerte reaksjonene på SGNs fremkalt av lyd. Imidlertid er cochlear følsomhet som ikke er kompromittert på grunn av OHC dysfunksjon en forutsetning for denne metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ABR hørselstester ble utført for 10 C57BL/6J mus (8 ukers alder) under anestesi. ABRs ble elicited ved hjelp av tone burst stimuli ved 4, 8, 16, 32 og 48 kHz. Hørsels terskelen til hvert dyr ble visuelt oppdaget ved å skille minst én klar bølgeform i ABR. Alle mus utstilt ABR terskler som svar på tone serieopptak, varierer mellom 25 og 70 dB SPL avhengig av hyppigheten av stimulans. Resultatene indikerte at hørsels terskelen var lavest på 16 kHz (figur 1), tilsvarende omtrent 43% avstand fra cochlear Apex (figur 2), noe som tyder på at akustisk følsomhet er betydelig redusert i andre cochlear Regioner.

Cochlear-fester ble isolert fra timelige ben i voksne mus under et stereo disseksjon mikroskop (figur 2a). Hele-mounts av hørsels epitel ble dissekert i tre stykker, lengder som ble målt og til slutt omgjort til prosent avstand fra cochlear Apex. Frekvens plasseringen på den basilar membranen til hver cochlear-sving ble beregnet ved hjelp av en logaritmisk funksjon, som tidligere beskrevet5,6 (figur 2B).

For å evaluere de morfologiske karakteristikkene av cochlear bånd synapser, antistoffer mot CtBP2 og GluR2 ble brukt til å merke presynaptiske nerve og postsynaptic strukturer, henholdsvis. I normale ører av voksen mus avslørte immunostaining sidestilt par av Synaptic bånd og glutamat reseptor patcher studding overflaten av basolateral membran av IHCs, med 8 – 20 par per IHC (Figur 3A). Selv om det store flertallet av puncta dukket opp som sidestilt par i normale ører, kan foreldreløse bånd observeres sjelden ved høy forstørrelse (Figur 3B). Antallet IHC Ribbon-synapser (immunopositive spots for både CtBP2 og GluR2) var høyest i området 16 kHz, og ble betydelig redusert etter hvert som avstanden fra dette stedet økte (Figur 3C). Den Synaptic teller bestemmes basert på konfokalmikroskopi anslag gir et anslag over det maksimale antall hørsels nervefibre som overfører informasjon fra sneglehuset til hjernen29.

Den funksjonelle statusen til cochlear Ribbon synapser ble undersøkt i alle voksne mus basert på ABR Wave i amplituder, som gir informasjon om funksjonell integritet av hørbar nervefibre29,31. ABR bølgen jeg amplituder på hver frekvens av stimulans presentert på et lydtrykksnivå på 90 dB ble målt fra topp til følgende trau, som vist i Figur 4a. ABR bølgen jeg amplitude var høyest med en frekvens på 16 kHz, tilsvarende den laveste hørsel terskelen, og amplitude verdier betydelig redusert som avstand fra denne plasseringen økt (Figur 4B). Dette resultatet er i overensstemmelse med de observerte endringene i bånd synapse tellinger, noe som indikerer at synapser innenfor dette cochlear-området kan vise den mest levende Synaptic-funksjonen. Videre, i tidligere mus studier av støy-indusert og alder-relaterte cochlear neurodegeneration, suprathreshold amplituder av ABR bølgen jeg redusert i forhold til bånd tap, indikerer at ABR bølgen jeg amplitude er sterkt korrelert med graden av cochlear synaptopathy29,31.

Figure 1
Figur 1 : Hørsels vurdering. I ABR-terskel sammenligninger mellom forskjellige frekvenser av tone burst stimuli viste at hørsels terskelen var lavest ved 16 kHz i 10 voksne C57BL/6J mus. Den ABR responsen var betydelig forhøyet på andre frekvensområder (enveis ANOVA med Dunnett er flere sammenligning post hoc test; *: P < 0,01, n = 20 ører). Data uttrykkes som gjennomsnittet ± SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Cochlear frekvens lokalisering hos mus. (A) et representativt bilde av hele eksplanterte sneglehuset, som har blitt dissekert ut av Tinning benet under et stereo disseksjon mikroskop. (B) muse cochlea er delt inn i apikale, midtre og basale svinger, der cochlea lateral veggen er fjernet. Røde sirkler på fragmenter av cochlea basilar membran indikerer frekvens steder og deres tilsvarende normalisert posisjoner i sneglehuset (0% refererer til cochlear Apex, 100% til cochlear base). Scale bar = 250 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Konfokalmikroskopi analyse over cochlear bånd synapser hos mus. (A) representative bilder av bånd synapser for de 4, 8, 16, 32 og 48 kHz regionene, immunostained for presynaptiske nerve bånd (CtBP2, rød) og postsynaptic strukturer (GluR2, grønn). Hvite stiplede linjer brukes til å skissere indre hårceller som referanse. Scale bar = 10 μm. (B) High-Power miniatyrbilder fra konfokalmikroskopi z-stabler viser at disse bånd synapser dukket opp som tett sidestilt par CtBP2-positive (rød) og GluR2-positive (grønn) puncta (venstre og midtre), mens foreldreløse bånd (høyre) mangler postsynaptic glutamat reseptor patcher var svært sjeldne. Scale bar = 0,5 μm. (C) kvantitativ analyse av sammenkoblet bånd puncta med alle presynaptiske nerve og postsynaptic Component avslørte det antallet av Synaptic puncta per indre håret cellen var viktig høyere for det 16 kHz område enn inne annet hyppigheten områder (ettall-vei Anova med Dunnett er flere sammenligning post hoc test; *: P < 0,01, n = 6 ører). Data uttrykkes som gjennomsnittet ± SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Analyse av ABR bølgen jeg amplituder hos mus . (A) representant ABR bølgeform fra en 8 uker gammel C57BL/6J mus eksponert for en 16 kHz ren tone stimulans på en intensitet av 90 DB (stimulans utbruddet ved 0 MS). Romertall markere toppene av ABR bølgene. Stiplede linjer markere bølgen jeg peak og trau, indikerer amplitude. (B) kvantitativ analyse av gjennomsnittlig bølge jeg amplituder som svar på de 4, 8, 16, 32 og 48 kHz stimuli presentert på et lydtrykksnivå på 90 DB. ABR bølgen jeg amplituder var høyest på frekvensen av 16 kHz og signifikant lavere på andre frekvenser (enveis ANOVA med Dunnett er flere sammenligning post hoc test; *: P < 0,01, n = 20 ører). Data uttrykkes som gjennomsnittet ± SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Siden cochlear synaptopathy først ble karakterisert i voksen mus med en midlertidig terskel forskyvning (TTS) indusert av 8 \ u201216 kHz oktav band støy på 100 dB SPL for 2 h31, forskere har i økende grad undersøkt virkningene av synaptopathy i ulike pattedyr, inkludert aper og mennesker32,33. I tillegg til støyeksponering, flere andre forhold har vært forbundet med cochlear synaptopathy (f. eks, aldring, bruk av ototoxic narkotika, og genetiske mutasjoner), fører til kortsiktige avbrudd av suprathreshold audition, etterfulgt av irreversible degenerasjon av hørselsnerven. I den tidlige fasen av cochlear fornærmelse oppstår synaptopathy ofte på et bestemt frekvensområde, spesielt i eksperimentelle modeller der skade på IHC synapser er begrenset til å velge frekvensområder24,31. Derfor er vår protokoll viktig ved at den muliggjør etterforskning av Synaptic morfologi og funksjon på en bestemt frekvens region.

Det kan brukes til å diskriminere normal og unormal hørselsfunksjon, noe som ytterligere reflekterer normalt og unormalt område i det indre øret. Siden forbehandling teknikker ble først brukt til å plotte intakt og mangler hårceller i de forskjellige cochlear svinger, har cochleogram blitt en rutine metode for kvantifisere hår celle tap6. Derfor, for å relatere morfologiske fornærmelser i sneglehuset til relevante fysiologiske endringer, er det rimelig å inkludere et steds frekvens kart på cochleogram. Denne metoden gjør det mulig for en å bestemme antall og struktur av synapser basert på deres posisjoner langs cochlear basilar membranen i forhold til etablerte cochlear steds frekvens kart, og dermed gi tilstrekkelig informasjon for detaljerte sammenligninger mellom histologiske og fysiologiske utfall. Noen studier vurderer imidlertid synaptopathy basert på cochlear-segmentet eller-distansen langs cochlea-kanalen, som ikke tillater direkte sammenligninger mellom individuelle cochleae på grunn av variasjoner i basilar membran lengde. Derfor er det spesielt viktig å standardisere cochleogram ved å konvertere individuelle cochlear lengder fra millimeter til en relativ prosentandel.

Synaptopathy kan bekreftes via visualisering av immunostaining for CtBP2 protein (Synaptic isoformen "Ribeye") i basolateral regioner av IHCs. Disse CtBP2-positive patcher kan tjene som en strukturell markør for kvantifisering av presynaptiske nerve bånd, og tilstedeværelsen av færre patcher indikerer vanligvis presynaptiske nerve tap. Selv om tidligere studier har rapportert at 98% av presynaptiske nerve bånd er sammenkoblet med post-Synaptic terminaler i det normale øret30, kan det enkle antallet CtBP2-positive oppdateringer ikke være nøyaktig for kvantitativ analyse av fullstendig synapser, da dette kan føre til overvurdering av synapse teller i det skadde øret ved å involvere "foreldreløse" (presynaptiske nerve bånd ikke sammenkoblet med postsynaptic terminaler). For å forbedre nøyaktigheten av estimering synapse tall, ekstra antistoffer mot postsynaptic struktur som GluA2, GluA2/3, eller PSD-95 brukes. Den postsynaptic tetthet protein PSD-95, en membran-assosiert dinatriuminosinat kinase (MAGUK) stillas protein, kan merkes ved hjelp av et antistoff mot PSD-95, som er mest observert på kontaktene mellom hårceller og SGN fiber avslutninger34, i 35. Imidlertid er antistoff mot GluR2 mer spesifikk for AMPA-type ionotrope glutamat reseptorer i postsynaptic membranen, som mer pålitelig kan identifisere bånd synapser (sidestilt par av immunofluorescent puncta av presynaptiske nerve CtBP2 og postsynaptic GluR2)15. I tillegg til morfologiske analyse, kan histologiske analyse av komplett synapser brukes som en funksjonell indikator for synaptopathy. I voksen mus med cochlear synaptopathy, reduksjoner i ABR Wave jeg amplitude etter presentasjonen av moderat til høyt nivå tone stimuli oppstår på frekvenser tonotopically knyttet til regioner av Synaptic tap26,29. Synapse teller innhentet ved hjelp av denne metoden er begrenset i at det tar ca 10 minutter å skanne ett område på basilar membranen. Videre, for å evaluere romlige variasjoner i Synaptic nummer og morfologi basert på IHC location, er det nødvendig å nøyaktig identifisere grensen til ICH kroppen (f. eks via myosin VIIa farging) og å utføre spesielle bildebehandlings trinn26 . Ved hjelp av slike metoder, tidligere studier har bekreftet at Synaptic tapet er større på den modiolar siden av IHC enn på søyle side i dyremodeller av støy-indusert degenerasjon26.

Tidligere studier har vist at lav spontan rente, høy terskel fibre er mer utsatt for støy skade enn høy spontan rente, lav terskel fibre i dyremodeller av begrenset synaptopathy. Disse studiene gir begrunnelsen for å bruke suprathreshold amplituder av ABR bølgen jeg (målt ved hjelp av moderat til høyt nivå tone stimuli) for å vurdere Synaptic funksjon i dyremodeller med normal ABR terskel og forvrengning produkt otoacoustic utslipp ( DPOAEs). Fordi bølgen jeg av ABR reflekterer oppsummerte nevrale reaksjoner av hørsels nervefibre, når synaptopathy er vurdert via ABR bølgen jeg amplitude, DPOAE testing bør også utføres for å utelukke OHC Kader, som også kan redusere ABR amplituder på grunn av forstyrrelse av mechanoelectric Transduction. Selv om den første bølgen av den sammensatte handlingen potensial (CAP), som er målt fra runde-vinduet elektroder, representerer også oppsummert aktivitet av cochlear nerve, denne metoden er mer invasiv og kompleks enn ABR målinger. Hvis DPOAE svar tilbake til det normale etter midlertidig terskel skift i støy-eksponert mus31 eller de ennå ikke har forverret i aldrende mus29, den suprathreshold amplitude av ABR bølgen jeg kan sterkt forutsi graden av cochlear synaptopathy , siden berørte neurons er taus når deres Synaptic forbindelser til IHCs er forstyrret. Men hvis følsomheten for cochlea reduseres på grunn av ulike faktorer (f.eks. OHC dysfunksjon), reduseres i ABR jeg amplitude kan ikke lenger tilskrives utelukkende til Synaptic tap fordi de vil gjenspeile kombinasjonen av alle cochlear skade. Derfor er kontrollerte eksperimentelle forhold for synaptopathy modell forberedelser nødvendig for å sikre at det ikke er fare for at cochlea-følsomheten påvirkes av andre faktorer. Dessverre, selv om ABR bølgen jeg amplitude gir et objektivt mål på hørbar nerve fiber tap hos dyr, er det vanskelig å måle hos mennesker. Videre, blandede patologi som involverer synaptopathy, tap av hårceller, og tilstedeværelsen av andre misdannelser i cochlea kan co-forekomme hos mennesker, begrenser bruken av ABR bølgen jeg amplitude målinger i kliniske innstillinger. ABR-bølge ventetid beregnes som tiden i millisekunder fra utbruddet av stimulans til den positive toppen av hver bølge, noe som gir innsikt i overførings tidene langs hørsels veien. Ingen vesentlige endringer i bølgen jeg ventetid har blitt observert i musemodeller av støy-indusert eller alder-relaterte cochlear synaptopathy36. Imidlertid tyder noen bevis på at effekten av maskering støy på ABR Wave V ventetid kan brukes til å diagnostisere cochlear synaptopathy hos mennesker37.

Flere nyere studier har støttet forestillingen om at cochlear synaptopathy er den primære innledende begivenheten knyttet til skjult hørselstap, tinnitus og hyperakusis. Selv om begrepet cochlear synaptopathy i indre øre sykdommer nå er godt etablert, er den detaljerte innvirkningen på hørsels evnen fortsatt ukjent. Protokollen som presenteres i den aktuelle studien gjør det mulig etterforskning av morfologi og funksjon i cochlear bånd synapser innenfor en bestemt frekvens region. Dermed kan denne protokollen brukes til å undersøke cochlear synaptopathy, dens underliggende mekanismer, og effekten av potensielle terapeutiske intervensjoner i ulike eksperimentelle dyremodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81770997, 81771016, 81830030); felles finansieringen prosjektet av Beijing Natural Science Foundation og Beijing Education Committee (KZ201810025040); Beijing Natural Science Foundation (7174291); og Kina postdoktor Science Foundation (2016M601067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine hydrochloride Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China H35020148 100 mg/kg
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA X-1251 10 mg/kg
TDT physiology apparatus Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
Electric Pad Pet Fun 11072931136
Dumont forceps 3# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0203-3-PO
Dumont forceps 5# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0209-5-PO
Stereo dissection microscope Nikon Corp., Tokyo, Japan SMZ1270
Goat serum ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 Millipore Corp., Billerica, MA, USA MAB397 mouse 
Purified Mouse Anti-CtBP2 BD Biosciences, Billerica, MA, USA 612044 mouse 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21124 goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21131 goat
Mounting medium containing DAPI ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9557
Confocal fluorescent microscopy Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SP8 II
Image Pro Plus software Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA version 6.0
Professional diagnostic pocket otoscope Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China HS-OT10
Needle electrode Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China 1029 20 mm, 28 G
Closed-field speaker Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA CF1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36, (3), 86-92 (2015).
  2. Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  3. Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72, (5), 1441-1449 (1982).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94, (3), 951-986 (2014).
  5. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202, (1-2), 63-73 (2005).
  6. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197, (1-2), 1-10 (2004).
  7. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
  8. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. Journal of Neuroscience. 35, (19), 7509-7520 (2015).
  9. Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361, (1), 95-114 (2015).
  10. Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11, (12), 812-822 (2010).
  11. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
  12. Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138, (1), 25-30 (2018).
  13. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
  14. Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12, (3), 135-149 (2016).
  15. Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
  16. Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8, (3), 191-207 (2016).
  17. Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7, (1), 1054 (2017).
  18. Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283, (1-2), 80-88 (2012).
  19. Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8, (10), 19058-19064 (2015).
  20. Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6, (6), (2016).
  21. Zhou, X., Jen, P. H. -S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091, (1), 16-26 (2006).
  22. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  23. Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28, (3), 857-872 (2000).
  24. Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
  25. Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69, (5), 242-255 (2015).
  26. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16, (2), 205-219 (2015).
  27. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33, (47), 18409-18424 (2013).
  28. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  29. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33, (34), 13686-13694 (2013).
  30. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110, (3), 577-586 (2013).
  31. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29, (45), 14077-14085 (2009).
  32. Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
  33. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  34. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14, (3), 321-329 (2013).
  35. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
  36. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49, (5), 316-326 (2017).
  37. Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36, (13), 3755-3764 (2016).
Morfologiske og funksjonell evaluering av Ribbon synapser på spesifikke frekvens regioner av Mouse cochlea
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L., Qu, T. F., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S. S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).More

Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L., Qu, T. F., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S. S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter