Summary
انتيرويدس تبرز كنموذج رواية في دراسة الأمراض البشرية. البروتوكول وصف كيفية محاكاة نموذج انتيرويد للبشرية التهاب الأمعاء والقولون النّاخر استخدام العلاج lipopolysaccharide (لبس) من انتيرويدس التي تم إنشاؤها من أنسجة الأطفال حديثي الولادة. انتيرويدس التي تم جمعها تبين التغيرات المثيرة شبيهة بتلك التي شهدتها البشرية التهاب الأمعاء والقولون النّاخر.
Abstract
التهاب الأمعاء والقولون النّاخر (NEC) مرض مدمر للأطفال حديثي الولادة. تتميز بالتعديلات باثوفيسيولوجيك متعددة في ظهارة الأمعاء البشرية، مما يؤدي إلى زيادة نفاذية الأمعاء، ضعف في الرد، وزاد موت الخلية. على الرغم من أن هناك العديد من النماذج الحيوانية من اللجنة الوطنية للانتخابات، قد تكون الاستجابة للإصابة والتدخلات العلاجية اختلافاً كبيرا بين الأنواع. وعلاوة على ذلك، أنها تمثل تحديا أخلاقيا لدراسة المرض الفيزيولوجيا المرضية أو العوامل العلاجية رواية مباشرة على البشر، لا سيما الأطفال. ولذلك، مرغوب فيه للغاية تطوير نموذج رواية من NEC باستخدام الأنسجة البشرية. انتيرويدس أورجانويدس الأبعاد 3-المستمدة من الخلايا الظهارية المعوية. مثالية لدراسة التفاعلات الفسيولوجية المعقدة، مما يشير إلى خلية، والدفاع المضيف الممرض. في هذه المخطوطة يصف لنا بروتوكول انتيرويدس البشرية تلك الثقافات بعد عزل الخلايا الجذعية المعوية من المرضى الذين يخضعون لاستئصال الأمعاء. الخلايا سرداب تستزرع في الوسائط التي تحتوي على عوامل النمو التي تشجع على التفرقة في الخلية مختلف أنواع الأم من ظهارة الأمعاء البشرية. وتزرع هذه الخلايا في مزيج الاصطناعية، كولاجينوس من البروتينات بمثابة سقالة، محاكاة الغشاء الطابق السفلي خارج الخلوية. نتيجة لذلك وضع انتيرويدس قطبية قمي باسولاتيرال. الإدارة المشارك من lipopolysaccharide (LPS) في وسائل الإعلام يسبب استجابة التهابية في انتيرويدس، مما يؤدي إلى نسيجية، والوراثية، والبروتين التعبير تعديلات مماثلة لتلك التي شهدتها البشرية NEC. نموذج تجريبي من NEC باستخدام الأنسجة البشرية قد توفر منبرا أكثر دقة للمخدرات والعلاج الاختبار قبل التجارب على الإنسان، ونحن نسعى جاهدين للتعرف على علاج لهذا المرض.
Introduction
انتيرويدس البشرية هي السابقين فيفو ثقافة ثلاثي الأبعاد نظام المتولدة من الخلايا الجذعية المعزولة من الخبايا المعوية من عينات الأنسجة المعوية البشرية. كان رائدا هذا النموذج الرائد بها هانز كليفيرس et al في عام 2007 عقب اكتشاف Lgr5 + الخلايا الجذعية في الأقبية الأمعاء الدقيقة في الفئران1. عملهم وأرسى الأساس لإقامة السابقين فيفو ثقافة الظهارية المعوية العديد من أنواع الخلايا التي يمكن أن تكون باساجيد دون التغييرات الوراثية أو الفسيولوجية الهامة2. ومنذ هذا الاكتشاف، استخدمت انتيرويدس كنموذج رواية لدراسة فسيولوجيا الجهاز الهضمي الطبيعي، والفسيولوجيا المرضية للأمراض المعوية مثل مرض التهاب الأمعاء والتفاعلات المضيف الممرض والطب التجديدي2.
الاستخدام من انتيرويدس كالسابقين فيفو نموذج لدراسة الفيزيولوجيا المرضية المعوية مزايا عديدة على تقنيات بديلة. للعقود العديدة الماضية، استخدمت خطوط مخلدة الخلية المستمدة من سرطان الأمعاء ونماذج حيوانية لدراسة علم وظائف الأعضاء المعوية3،،من45. الثقافات خلية واحدة لا تمثل تنوع أنواع الخلايا الموجودة في ظهارة الأمعاء العادية، وبالتالي تفتقر إلى خلية إلى خلية عبر الحديث والجزء-خصوصية في التعبير البروتين، والإشارات، والأمراض الناجمة عن العوامل الممرضة6. الخلايا الجذعية في انتيرويدس تفرق في أهم أنواع الخلايا الظهارية مثل انتيروسيتيس بانته الخلايا والخلايا قدح، والخلايا انتيروندوكريني و أكثر3. معرض قطبية، الاضطلاع بمهام النقل الظهارية، والسماح ل خصوصية المعوية الجزء6. حيث يمكن أن الخص انتيرويدس متعددة أنواع خلايا ظهارة الأمعاء البشرية، فقادرة على التغلب على هذا القيد المعترف بها من الأنظمة المستندة إلى خلايا السرطان. مع مرور الوقت، مشتقات خطوط الخلية هي سوبكلونيد وتتطور إلى إبداء قدر أكبر من التنوع في التعبير والتعريب البروتين3. على العكس من ذلك، يمكن أن باساجيد انتيرويدس دون التغييرات الوراثية أو الفسيولوجية الهامة2. وبالرغم من وجود العديد من النماذج الحيوانية للجنة الوطنية للانتخابات، قد تكون الاستجابة للإصابة والتدخلات العلاجية اختلافاً كبيرا بين الأنواع. ونتيجة لهذه القيود، تفشل العلاجات المستمدة من النماذج الحيوانية 90% الوقت عند اختبارها في التجارب البشرية بسبب الاختلافات في سمية أو كفاءة3. انتيرويدس بمثابة نماذج ما قبل السريرية الواعدة التي يمكن التغلب على أوجه القصور هذه، مما يؤدي إلى فهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية المعوية المعقدة، ومن ثم أكثر الابتكارات العلاجية ناجحة وفعالة من حيث التكلفة. وهناك أيضا أدلة حديثة من الأنسجة التي يتم إنشاؤها انتيرويد من العمر ما زالت هامة بيولوجيا7. هذه تفاصيل مهمة خاصة لنموذجنا منذ انتيرويدس تتولد من أنسجة الأطفال حديثي الولادة، وبالتالي الحفاظ على أهميتها الفسيولوجية للمرضى مع اللجنة الوطنية للانتخابات.
الأداة المساعدة انتيرويدس كنماذج لأمراض البشرية تواصل توسيع، أملا في إيجاد علاجات لظروف قاسية وانتشارا. التهاب الأمعاء والقولون النّاخر (NEC) هو مرض معوي مدمرة الولدان تتميز بنخر الأمعاء وكثيراً ما يؤدي إلى ثقب جدار الأمعاء وتسمم الدم والموت8. سبب الفيزيولوجيا المرضية المعقدة والمتعددة العوامل من NEC، الآلية الدقيقة لهذا المرض قد لا بعد تم تماما توضيح؛ ومع ذلك، زيادة نفاذية الأمعاء كان متورطا بوضوح في عملية المرض8. ونظرا لأن دراسة اللجنة الوطنية للانتخابات والعوامل العلاجية المحتملة تحديا أخلاقيا في البشر، وبخاصة الأطفال، فمن المرغوب فيه جداً الاستفادة من نموذج انتيرويد بيولوجيا ذات صلة من NEC باستخدام الأنسجة البشرية في الأطفال حديثي الولادة. لم انتيرويدس حتى الآن بدور محدود في الدراسة للجنة الوطنية للانتخابات. ويصف هذا البروتوكول استعمال انتيرويدس المستمدة من عينات الأنسجة المعوية البشرية كرواية السابقين فيفو نموذج للدراسة لالتهاب الأمعاء والقولون النّاخر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على موافقة المجلس الاستعراض المؤسسي (IRB #2013-15152) لجمع عينات الأنسجة من المرضى الذين يخضعون لاستئصال الأمعاء في Ann وروبرت H. لوري الأطفال في مستشفى شيكاغو، شيكاغو. وأجريت جميع البروتوكولات امتثالا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية واللوائح لرفاهية الإنسان. المطلوب موافقة الوالدين علم مكتوب والحصول عليها قبل جمع العينة في جميع الحالات.
1-كاشف إعداد
- تعد وسائل الإعلام ثقافة حل الأسهم لجمع الأنسجة كلها: 1 لتر من تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو)، 110 مل للجنين البقري المصل (FBS)، 11 مل من البنسلين-ستربتوميسين (التركيز النهائي 1%) و 1.1 مل من تصفية تعقيم الأنسولين (التركيز النهائي 0.1 ٪). حل تخزين المخزون عند 4 درجة مئوية.
- إعداد المخزن المؤقت Chelating #1: 30 مل وسائط الثقافة (كما هو موضح في 1.1)، 600 ميليلتر من 0.5 م الإيثيلين حمض (يدتا) (تركيز نهائي 10 ملم)، 300 ميليلتر جنتاميسين (التركيز النهائي 1%) و 60 ميليلتر من الامفوتريسين ب (التركيز النهائي 0.2%). حل تخزين المخزون عند 4 درجة مئوية.
- إعداد المخزن المؤقت Chelating #2: 30 مل وسائط الثقافة (كما هو موضح في 1.1)، 300 ميليلتر من 0.5 م يدتا (تركيز النهائي 5 مم)، 300 ميليلتر الجنتاميسين (التركيز النهائي 1%) و 60 ميليلتر من الامفوتريسين ب (التركيز النهائي 0.2%). حل تخزين المخزون عند 4 درجة مئوية.
- تعد وسائل الإعلام مينيجوت البشرية: 41.4 مل دميم/و-12، 5 مل FBS (النهائي 10%)، 500 ميليلتر من البنسلين-ستربتوميسين (التركيز النهائي 1%)، 500 ميليلتر للأم الجلوتامين (التركيز النهائي 1%)، 500 ميليلتر من الجنتاميسين (التركيز النهائي 1%)، 100 ميليلتر من الامفوتريسين ب (النهائي تركيز 0.2%)، 500 ميليلتر من حمض السلفونيك N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane م 1 (حبيس) (تركيز نهائي 10 ملم) وتكملة N-2 500 ميليلتر من 100 x 1 مل 50 x B-27 تكميل ناقص فيتامين (أ) لإجمالي حجم 50 مل. حل تخزين المخزون عند-20 درجة مئوية.
- إعداد البشرية الكامل وسائل الإعلام مينيجوت: 10 مل من "وسائل الإعلام مينيجوت البشرية" (أعد 1.4)، 10 ميليلتر من 100 ميكروغرام/مل Wnt3a (تركيز نهائي 100 نانوغرام/ملليلتر)، 10 ميليلتر من 100 ميكروغرام/مل رأس (تركيز نهائي 100 نانوغرام/ملليلتر)، 10 ميليلتر من 1 ملغ/مل R-سبوندين (التركيز النهائي 1 ميكروغرام/مل) ، 10 ميليلتر من 500 ميكروغرام/مل البشرة عامل النمو (مماثلة) (تركيز نهائي 50 نانوغرام/ملليلتر)، 10 ميليلتر من 1 م ن-أسيتيل (التركيز النهائي 1 ملم)، 10 ميليلتر من 10 مم Y-27632 (تركيز نهائي 10 ميكرومتر)، 10 ميليلتر من 500 ميكرون A-83 (تركيز نهائي 500 nM)، 10 ميليلتر من 10 مم SB202190 (النهائي تركيز 10 ميكرومتر)، 100 ميليلتر من 1 م نيكوتيناميد (تركيز نهائي 10 مم) و 1 ميليلتر من 100 ميكرومتر [لوي] 15-جاسترين 1 (تركيز نهائي 10 نانومتر). إجمالي حجم 10 مل. حل تخزين المخزون عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب استخدام الحلول ضمن ح 48.
2-سرداب العزل والطلاء من الأنسجة كاملة
-
في وقت جمع في جناح المنطوق، ضع عينة الأنسجة المعوية البشرية الصغيرة في الفوسفات مخزنة المالحة (دببس البرد دولبيكو). تغسل العينة في دببس الباردة حتى واضح من البراز والدم. تخزين العينات في 4 درجات مئوية في المتوسط RPMI 1640 حتى جاهزة لعزل سرداب.
ملاحظة: لا يمكن تخزين الأنسجة أكثر من 24 ساعة.- تأكد من أن العينة من الواضح من البراز والدم. باستخدام مقص تشريح دقيق، قم بإزالة أي فائض الدهون أو الجراحية مقاطع/المواد الغذائية إلخ. وزن العينة.
ملاحظة: هدف لقطعة حوالي 0.75-2.5 g.
- تأكد من أن العينة من الواضح من البراز والدم. باستخدام مقص تشريح دقيق، قم بإزالة أي فائض الدهون أو الجراحية مقاطع/المواد الغذائية إلخ. وزن العينة.
-
قطع العينة إلى قطع 0.5 سم ومكان في 30 مل من خالب العازلة #1 (كما أعدت في الخطوة 1، 2).
- يهز على سرعة منخفضة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تصفية الأنسجة من خلال 100 ميكرومتر خلية مصفاة وتجاهل التدفق من خلال.
-
إضافة الأنسجة إلى 30 مل من خالب العازلة #2 (كما أعدت في الخطوة 1، 3).
- يهز على سرعة منخفضة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تصفية الأنسجة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر وتجاهل التدفق من خلال.
- ذوبان الجليد 500 مل من الغشاء مصفوفة على الجليد للاستخدام في الخطوة 2.8.
-
إضافة نسيج إلى 10 مل دميم الباردة في أنبوب 50 مل مخروطية واهتز بشدة باليد لمدة 10 ق.
- التصفية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر وجمع التدفق من خلال (التسمية #1). إبقاء أنبوب #1 على الجليد.
- إضافة نسيج إلى آخر 10 مل من دميم الباردة في أنبوب مخروطي منفصل 50 مل واهتز بشدة باليد لمدة 10 ق.
- التصفية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر وجمع التدفق من خلال (التسمية #2).
- كرر مرتين إضافية حتى هناك أربعة أنابيب مخروطية الشكل مع التدفق من خلال (أنابيب المسمى #1-4).
-
أنبوب تصفية الحل #1 من خلال 100 ميكرومتر خلية مصفاة ونقل تدفق من خلال إلى 15 مل الأنبوبة المخروطية (التسمية #1). كرر #2-4.
- الطرد المركزي 15 مل أنابيب #1-4 في 200 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
-
وفي هود الاندفاق الصفحي، إزالة المادة طافية من أنابيب #1-4 وتجاهل. تجنب الإخلال بسحابة الأنسجة مباشرة فوق بيليه، حتى لو كان ذلك يعني ترك بعض المادة طافية.
- قبل بيبيتينج ببطء، تخلط معا بيليه مع بقايا طافية في أنابيب #1-4.
- نقل الخليط من أنابيب #1-4 في أنبوب مخروطي مل 2 واحد واحد.
- الطرد المركزي الأنبوبة المخروطية في 200 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
-
إزالة المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 500 ميليلتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي.
ملاحظة: إبقاء المصفوفة الغشاء على الجليد في جميع الأوقات، والعمل بسرعة للخطوات المقبلة. بوليميريزيس هذا المنتج بشكل سريع جداً في درجة حرارة الغرفة.- تطبيق 50 ميليلتر من العينة/الطابق السفلي غشاء مصفوفة تعليق إلى مركز بئر في صفيحة 24-جيدا. وهذا يجب أن يظهر على شكل قبة.
ملاحظة: استخدام الماصة المثلجة نصائح الإيدز في سلاسة نقل التعليق، التقليل من البلمرة. - كرر 9 مرات لملء 10 مجموع الآبار.
- تطبيق 50 ميليلتر من العينة/الطابق السفلي غشاء مصفوفة تعليق إلى مركز بئر في صفيحة 24-جيدا. وهذا يجب أن يظهر على شكل قبة.
- ضع لوحة 24-جيدا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة لمدة 30 دقيقة للسماح البلمرة.
- إضافة 500 ميليلتر "البشرية كاملة وسائط الإعلام مينيجوت" (كما أعدت في الخطوة 1، 5) لكل بئر. استبدال كل يومين.
- جمع انتيرويدس بعد 5-10 أيام، عندما هو متصور في مهدها. راجع الخطوات 4 و 5 لمجموعة التعليمات.
3-تحريض NEC التجريبية
- إضافة 10 ميليلتر 5 ملغ/مل من lipopolysaccharide (LPS) إلى 500 ميليلتر "البشرية مينيجوت وسائط كاملة" (كما أعدت في الخطوة 1، 5) في كل بئر في اليوم 0. استبدال كل يومين حتى جمع.
4-الإعداد لتضمين البارافين
-
قم بإزالة الوسائط بلطف.
- أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني ولطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً لحل المصفوفة الغشاء بالرعاية غير في انتيرويدس.
- الطرد المركزي خليط برنامج تلفزيوني/انتيرويد في < 300 x غ لمدة 5 دقائق بيليه وإزالة برنامج تلفزيوني.
- إضافة بارافورمالدهيد 4% إلى إصلاح في درجة حرارة الغرفة ح 1.
-
الطرد المركزي في < 300 x غ لمدة 5 دقائق بيليه، ثم قم بإزالة برنامج تلفزيوني.
- تغسل برفق مع 1 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي في < 300 x غ لمدة 5 دقائق بيليه، ثم قم بإزالة برنامج تلفزيوني.
- كرر الخطوة 4.3.1.
-
تذوب كمية كافية من الأنسجة تجهيز هلام (حوالي 300 ميليلتر) بوضع المبلغ المطلوب في أنبوب مخروطي والاحترار في حاضنة حمام جافة عند 65 درجة مئوية لمدة 3-10 دقيقة حتى السائل.
- إضافة النسيج تجهيز جل لبيليه وتخلط برفق.
- ساترة، تضع عصابة صغيرة لاستنساخ.
- "الماصة؛" الأنسجة تجهيز مزيج هلام وانتيرويد إلى عصابة استنساخ التي شنت على ساترة.
-
تسمح الأنسجة تجهيز مزيج هلام وانتيرويد على ترسيخ عند 4 درجة مئوية عن ح 1.
- غمر حلقة الاستنساخ مع خليط طدت إلى إيثانول 70% في الإعداد لتضمين البارافين.
5-انتيرويد جمع للجيش الملكي النيبالي واستخراج البروتين
- إزالة بلطف "مينيجوت البشرية وسائل الإعلام كاملة" من كل بئر.
-
أضف 1 مل برنامج تلفزيوني ولطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً لحل المصفوفة الغشاء. كن حذراً لا ننأى انتيرويدس.
- وضع برنامج تلفزيوني/انتيرويد الخليط في أنبوب مخروطي عقيمة 2 مل.
- الطرد المركزي في < 300 x غ لمدة 5 دقائق بيليه.
- إزالة برنامج تلفزيوني، مع الحرص على عدم إزالة انتيرويدس برفق.
- كرر الخطوة سلسلة 5.2 مرتين أخريين.
- تجميد في-80 درجة مئوية حتى جاهزة للبروتين و/أو استخراج الحمض النووي الريبي.
- إجراء عزل الجينات التعبير والبروتين من انتيرويدس استخدام PCR qRT الراسخة والتقنيات "الغربية النشاف".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فورا بعد الطلاء، تظهر الخبايا المعوية المعزولة حديثا كقضبان ممدود. في غضون ساعات، سوف تأخذ انتيرويد على مظهر جولة (الشكل 1). خلال الأيام القليلة المقبلة، سوف تبدأ انتيرويدس تشكيل المجالات كما هو مبين في الشكل 1ب. مهدها وينبغي أن يحدث بين 5-10 أيام (الشكل 1ج) وينبغي أن يحدث جمع انتيرويد في ذلك الوقت.
كما يحمل انتيرويدس المتزايد قطبية، تتضمن تجويف مركزي، إلى حدود قمي ومجال باسولاتيرال (الشكل 2). كما تظهر انتيرويدس السلامة الهيكلية، ويمثله cytoskeleton أكتين قوية (الشكل 3). وبعد عدة أيام في الثقافة، انتيرويدس لبس تعامل خبرة المبرمج أكثر وسوف يكون عائد أقل من السيطرة على المجموعة (الشكل 4). كما رأينا في NEC البشرية ونماذج مورين من NEC9، تم العثور على تعبير زيادة عن عدد القتلى مثل مستقبلات 4 (TLR4) في انتيرويدس لبس معاملة مقارنة بعناصر التحكم (الشكل 5).
رقم 1: سرداب الثقافة وتشكيل انتيرويد البشرية من النسيج كله. () يوم 0 الثقافة سرداب مع مظهر جولة، شقة. (ب) انتيرويدس يوم 4 مع تشكيل كروي. (ج) يوم 7 انتيرويدس مع الناشئين (السهم الأسود). تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : المظهر النسيجي انتيرويد. هايموتوكسيلين وتلطيخ ويوزين. يعرض تجويف مركزي انتيرويد ومعارض قطبية، مع مجال قمي وباسولاتيرال. هايموتوكسيلين (الأرجواني) يمثل النواة، بينما يمثل ويوزين (الوردي) مكونات سيتوسوليك. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : انتيرويد أكتين سيتوسكيليتون- إيمونوفلوريسسينسي صورة مجهرية من انتيرويدس. انتيرويد يعرض السلامة الهيكلية كما يتضح من سيستوسكيليتون أكتين بارزة (أرجواني). الملون الأنوية مع DAPI (الأزرق)، مقياس بار = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: هو تناقص الغلة الثقافة البشرية انتيرويد مع العلاج لبس. 5 يوم انتيرويدس في الثقافة، ونمت من نفس العينة النسيج كله. () تعامل انتيرويدس مع مراقبة الثقافة الإعلامية. عرض نمو قوي. (ب) تعامل انتيرويدس مع لبس في ثقافة وسائل الإعلام. فقط بضع الباقين على قيد الحياة انتيرويدس. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5 الرقم: التعبير TLR4 زيادة في التجريبية NEC انتيرويدس- قرة-بكر () أظهرت زيادة التعبير مرناً TLR4 في انتيرويدس تعرض للبس (p = 0.03). (ب) تحليل لطخة غربية تظهر زيادة التعبير TLR4 في انتيرويد البشرية التجريبية NEC (p = 0.02). الممثل وصمة عار الغربية يصور. القيم هي وسائل ± SEM العينات 3 كل مجموعة. * ف < 0.05 باختبار t للطالب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه الرواية السابقين فيفو انتيرويد المعوية البشرية نموذج يخدم كوسيلة مفيدة لدراسة الخلل في جدار الأمعاء في التهاب الأمعاء والقولون النّاخر (NEC). تم تكييف أساليب المعالجة انتيرويد المعروضة هنا من الأعمال السابقة للدكتور حسن ضبابية، ومايكل هيلمراث وفيرتهايم جايسون10،،من1112.
التفاصيل المحيطة بالجامع جمع الأنسجة وتوقيت سرداب العزلة خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. يجب جمعها فورا في وقت استئصال المنطوق الأنسجة والمجهزة لعزل سرداب فور وصول الأنسجة في المختبر. نحن نخبة من الأنسجة من المرضى أقل من 3 أشهر من العمر لهذا النموذج. يمكن أن يحدث التأخير في تجهيز خلال 24 ساعة بعد جمع الأنسجة كله إذا لزم الأمر. بالإضافة إلى ذلك، نوعية العينة الأنسجة البشرية تؤثر بشكل كبير العائد من سرداب العزلة. الأمعاء صحية دون علم الأمراض الكامنة ومن المرضى الأصغر سنا (< 2 أشهر عمر) قد وجد أن تسفر عن نتائج أفضل. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي اختيار الأنسجة التي تم جمعها من منطقة أصح، عادة في نهايات القاصي من العينة ريسيكتيد. استخدام قطعة أكبر من الأمعاء لا يحسن عزل القبو بالمجلدات الحل الموصوفة في البروتوكول أعلاه. عدد الأجزاء المعوية حوالي 1-2 سم في الطول، ووزنها 0.75-2.5 g الأمثل. كان على غرار استحثاث NEC تجريبية عن طريق التعرض للبس من نماذج الثقافة والحيوان خلية الراسخة. أظهرت أعمال المنشأة من حاكم وآخرون بالدور الحاسم ل TLR4 (مستقبلات لبس) في اللجنة الوطنية للانتخابات التنمية9،13،،من1415. ويحفز تفعيل لبس TLR4 السيتوكينات proinflammatory، والحد من سلامة الحاجز، وتنشيط الكريات البيضاء سوبيبيثيليال التي تميز الأحداث مما يشير إلى المشاركة في لجنة الانتخابات الوطنية البشرية. وقد تورط TLR4 كجزيء رئيسي في الترويج لالتهاب7 والحيوانات أن نقص TLR4 الوظيفية أظهرت حماية من تنمية NEC15. تكون مستويات يتناقل من لبس مرتفعة في المرضى الذين يعانون من اللجنة الوطنية للانتخابات ومرتفعة في البراز والبلازما من نماذج حيوانية من اللجنة الوطنية للانتخابات. الحث على لبس التهاب الأمعاء في الحيوانات يشبه NEC البشرية، مما يبرز أهمية التهاب في هذا المسار. النسخ المتطابق بثقافة الخلية المنشأة ونماذج حيوانية للجنة الوطنية للانتخابات، نعتقد أن الاستقراء NEC تجريبية عن طريق الإدارة لبس في الثقافة انتيرويد مفيدة السابقين فيفو نموذج الولدان البشرية للدراسة للجنة الوطنية للانتخابات. تمشيا مع التقارير السابقة في نماذج ثابتة أخرى، أظهرت لنا انتيرويدس NEC التجريبية زيادة التعبير عن TLR4 بالمقارنة مع عناصر التحكم.
البروتوكول لتحريض NEC تجريبية عن طريق التعرض لبس شهدت العديد من التعديلات الهامة والتحسينات. في البداية، انتيرويدس كانت تزرع لمدة 5 أيام، ثم تلقيح مع لبس ح 24 والتي جمعت في وقت لاحق. ويوصي البروتوكول الآن تلقيح لبس في اليوم 0 مع التعرض المستمر في كل تغيير ثقافة وسائل الإعلام حتى جمع. بالإضافة إلى ذلك، كان الأمثل جرعة لبس. واختير بعد إجراء منحنى الجرعة وتجريب عدة تركيزات مختلفة من لبس، 5 ملغ/مل. وكان أيضا التجريب مع التطعيم لبس مباشرة في خليط مصفوفة/انتيرويد الغشاء وقت الطلاء من تجربته؛ بيد أن هذا كان مرهقة ولم تتحسن النتائج.
وهناك القيود التي ينبغي أن تعالج تطور استخدام النموذج انتيرويد البشرية. منذ الاكتشاف في عام 2007، استخدمت عدة بروتوكولات مختلفة إنشاء والثقافة انتيرويدس. عدة عوامل النمو اللازمة انتيرويد الصيانة والتمايز الافتقار إلى التوحيد القياسي، مما قد يؤثر على إمكانية تكرار نتائج. بالإضافة إلى ذلك، يفتقر إلى ثقافة انتيرويد القوات الميكانيكية التي تؤثر على ظهارة الأمعاء البشرية في الظروف الفسيولوجية. قد يؤثر الضغط الناجم عن تدفق لومينال والتمعج التعبير الجيني والبروتين الذي لا تحتسب في هذا النموذج. كما يفتقر هذا النموذج إلى الأعصاب والخلايا المناعية، وميكروبيومي، والمفرج و mesenchyme التي تكون موجودة في ظهارة الأمعاء البشرية.
يسبب التعرض للبس في هذا النموذج انتيرويد المعوية البشرية استجابة التهابات المؤدية إلى النسجية، الوراثية، والبروتين التعبير تعديلات مماثلة لتلك التي وجدت في NEC البشرية. على الرغم من أن هناك العديد من النماذج الحيوانية الحالية للجنة الوطنية للانتخابات، استجابة للإصابة المعوية والتدخلات العلاجية تختلف على نطاق واسع بين الأنواع. نظراً لأنها تمثل تحديا أخلاقيا لدراسة المرض الفيزيولوجيا المرضية أو لاختبار العوامل العلاجية رواية مباشرة في البشر، ولا سيما الرضع ومن المهم جداً الاستمرار في زراعة هذه الرواية السابقين فيفو النموذجي من NEC باستخدام الأنسجة البشرية. انتيرويدس البشرية قابلة للتعديل الوراثي، وقد تكون أساسية في تطوير العلاجات للعديد من الأمراض المعوية البشرية16. التوجهات المقبلة ينبغي أن تهدف إلى انتيرويدس الثقافة البشرية على سقالة نفاذية في دائرة التروية مع قمي وتدفق باسولاتيرال أجل استخراج الزوائد سرداب المجراة في العمارة كذلك الفسيولوجية قوات مثل التمعج وتدفق لومينال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها معهد لمعهد الصحة الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي ومنحة مرض الكلي (K08DK106450) وجائزة جروسفيلد جاي من "الرابطة الأمريكية لجراحي طب الأطفال" إلى C.J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
- Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).
- Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).
- Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
- Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).
