Summary
Enteroids växer fram som en ny modell i studiet av mänskliga sjukdomar. Protokollet beskrivs hur du simulerar en enteroid modell av mänskliga nekrotiserande enterokolit använder lipopolysackarid (LPS) behandling av enteroids genereras från neonatal vävnad. Insamlade enteroids påvisa inflammatoriska förändringar besläktad med de som setts hos människa nekrotiserande enterokolit.
Abstract
Nekrotiserande enterokolit är (NEC) en förödande sjukdom hos nyfödda. Den kännetecknas av flera patofysiologiska förändringar i människans tarm epitel, vilket leder till ökad intestinal permeabilitet, nedsatt restitution och ökade celldöd. Det finns ett flertal djurmodeller av NEC, kan svar till skada och terapeutiska insatser vara mycket varierande mellan arter. Det är dessutom etiskt utmanande att studera sjukdomen patofysiologi eller nya terapeutiska medel direkt på människor, särskilt barn. Därför är det önskvärt att utveckla en ny modell av NEC med mänsklig vävnad. Enteroids är 3-dimensionella organoids härrör från tarmepitelceller. De är idealiska för studiet av komplexa fysiologiska samspel, cellsignalering och värd-patogen försvar. I detta manuskript beskriver vi ett protokoll att kulturer mänskliga enteroids efter isolera intestinal stamceller från patienter som genomgår tarm resektion. Crypt cellerna odlas i media som innehåller tillväxtfaktorer som stimulerar differentiering i olika cell typer infödingen av human intestinal epitel. Dessa celler odlas i en syntetisk, kollagena blandning av proteiner som fungerar som en byggnadsställning, härma extra-cellulära basalmembranet. Som ett resultat, utveckla enteroids apikala-basolateral polaritet. Samtidig administrering av lipopolysackarid (LPS) i media orsakar en inflammatorisk reaktion i enteroids, leder till histologisk, genetisk och protein uttryck förändringar liknande de som setts i mänskliga NEC. En experimentell modell av NEC med mänsklig vävnad kan ge en mer exakt plattform för läkemedel och behandling provning innan försök på människa, som vi strävar efter att identifiera ett botemedel mot denna sjukdom.
Introduction
Mänskliga enteroids är en ex vivo 3-dimensionell kultur systemgenererade från stamceller isoleras från intestinal kryptor av human intestinal vävnadsprover. Denna banbrytande modell var pionjärer av Hans Clevers et al. i 2007 efter upptäckten av Lgr5 + stamceller på kryptor av tunntarmen i möss1. Deras arbete lade grunden för att upprätta en ex vivo intestinal epitelial kultur flera celltyper som kunde vara passaged utan betydande genetiska eller fysiologiska förändringar2. Sedan denna upptäckt, har enteroids använts som romanen modell för att studera normal mag fysiologi och Patofysiologi av tarmsjukdomar såsom inflammatorisk tarmsjukdom, värd-patogen interaktioner och regenerativ medicin2.
Användning av enteroids som ex vivo modell för studier av intestinal patofysiologin har flera fördelar jämfört med alternativa tekniker. För de senaste decennierna, har djurmodeller och förevigade intestinal cancer-derived cellinjer använts för att studera tarmens fysiologi3,4,5. Encelliga kulturer representerar inte mångfalden av celltyper förekommer i normal tarm epitel, därmed saknar celler överhörning och segment-specificitet i proteinuttryck, signalering och patogen-inducerad sjukdom6. I enteroids stamceller differentieras till stora epitelial celltyper såsom enterocyter, Paneth celler, bägarceller, enteroendokrina celler och mer3. De uppvisar polaritet, utföra epitelial transport funktioner och möjliggör intestinal segmentet specificitet6. Eftersom enteroids kan sammanfatta de flera celltyper av human intestinal epitel, är de kunna övervinna denna erkända begränsning av cancer cell-baserat system. Med tiden, derivat av cellinjer är subcloned och utvecklas för att uppvisa större mångfald i protein uttryck och lokalisering3. Däremot kan enteroids vara passaged utan betydande genetiska eller fysiologiska förändringar2. Även om många djurmodeller för NEC finns, kan svar till skada och terapeutiska insatser vara mycket varierande mellan arter. Till följd av dessa begränsningar therapeutics härrör från djurmodeller misslyckas 90% av tiden när testas i mänskliga prövningar på grund av skillnader i toxicitet eller effekt3. Enteroids fungera som lovande prekliniska modeller som kan övervinna dessa brister, vilket leder till en bättre förståelse för komplexa intestinal patofysiologi och därför mer framgångsrikt och kostnadseffektivt terapeutiska innovationer. Det finns också nya rön som åldern av vävnad som en enteroid genereras från återstår biologiskt viktiga7. Detta är en särskilt viktig detalj för vår modell eftersom enteroids genereras från neonatal vävnad, därigenom bibehålla fysiologiska betydelse för patienter med NEC.
Nyttan av enteroids som modeller för humana sjukdomar fortsätter att expandera, i hopp om att hitta botemedel för allvarliga och genomgripande förhållanden. Nekrotiserande enterokolit (NEC) är en förödande tarm sjukdom hos nyfödda kännetecknas av intestinal nekros och ofta leder till perforation av tarmväggen, septikemi, och död8. På grund av komplex och multifaktoriell patofysiologin av NEC, har den exakta mekanismen av sjukdomen inte ännu helt klarlagd; men har ökad intestinal permeabilitet varit tydligt inblandade i sjukdom processen8. Eftersom studien av NEC och potentiella terapeutiska medel är etiskt utmanande på människor, särskilt barn, det är mycket önskvärt att utnyttja en biologiskt relevanta enteroid modell av NEC med mänsklig neonatal vävnad. Hittills har enteroids en begränsad roll i studiet av NEC. Det här protokollet beskriver användningen av enteroids härrör från human intestinal vävnadsprover som en roman ex vivo modell för studier av nekrotiserande enterokolit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutionella granskning styrelsens godkännande erhölls (IRB #2013-15152) för insamling av vävnadsprover från patienter som genomgår tarm resektion vid Ann och Robert H. Lurie Children's Hospital of Chicago, Chicago, IL. Alla protokoll utfördes institutionella och nationella riktlinjer och förordningar för mänsklig välfärd. Skriftliga informerade föräldrarnas samtycke krävs och utvunnen före provtagning i alla fall.
1. REAGENSBEREDNING
- Förbereda kultur Media stamlösning för hela vävnad samling: 1 L av Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM), 110 mL av fetalt bovint Serum (FBS), 11 mL Penicillin-Streptomycin (slutlig koncentration 1%) och 1,1 mL filter-steriliseras insulin (slutlig koncentration 0,1%.) Lagra stamlösning vid 4 ° C.
- Förbereda Chelating buffert #1: 30 mL odlingssubstrat (som beskrivs i punkt 1.1), 600 µL 0,5 M etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) (slutlig koncentration 10 mM), 300 µL Gentamicin (slutlig koncentration 1%) och 60 µL av amfotericin B (slutlig koncentration 0,2%). Lagra stamlösning vid 4 ° C.
- Förbereda Chelating buffert #2: 30 mL odlingssubstrat (som beskrivs i punkt 1.1), 300 µL 0,5 M EDTA (slutlig koncentration 5mM), 300 µL Gentamicin (slutlig koncentration 1%) och 60 µL av amfotericin B (slutlig koncentration 0,2%). Lagra stamlösning vid 4 ° C.
- Förbereda mänskliga Minigut Media: 41,4 mL DMEM/F-12, 5 mL FBS (sista 10%), 500 µL av Penicillin-Streptomycin (slutlig koncentration 1%), 500 µL av L-glutamin (slutlig koncentration 1%), 500 µL Gentamicin (slutlig koncentration 1%), 100 µL av amfotericin B (slutlig koncentration 0,2%), 500 µL av 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonsyra (HEPES) (slutlig koncentration 10 mM), 500 µL av 100 x n-2 komplettera och 1 mL 50 x B-27 komplettera minus Vitamin A för en total volym om 50 mL. Beståndet förvaras vid-20 ° C.
- Förbereda mänskliga Minigut Media komplett: 10 mL av mänskliga Minigut Media (beredd i 1,4), 10 µL av 100 µg/mL Wnt3a (slutlig koncentration 100 ng/mL), 10 µL av 100 µg/mL skalle (slutlig koncentration 100 ng/mL), 10 µL av 1 mg/mL R-Spondin (slutliga koncentrationen 1 µg/mL) , 10 µL 500 µg/mL Epidermal Growth Factor (EGF) (slutlig koncentration 50 ng/mL), 10 µL 1 M N-acetylcystein (slutlig koncentration 1 mM), 10 µL 10 mm Y-27632 (slutlig koncentration 10 µM), 10 µL 500 µm A-83 (slutlig koncentration 500 nM), 10 µL 10 mM SB202190 (final koncentration 10 µM), 100 µL av 1 M nikotinamid (slutlig koncentration 10 mM) och 1 µL 100 µM [leu] 15-gastrin 1 (slutlig koncentration 10 nM). Total volym 10 mL. Lagra stamlösning vid 4 ° C.
Obs: Lösningar måste användas inom 48 h.
2. crypt isolering och plätering från hela vävnad
-
Vid tidpunkten för insamling i operativa suite, placera mänskliga små tarmvävnaden provet i kalla Dulbeccos fosfat buffrad koksaltlösning (DPBS). Tvätta preparatet i kall DPBS till klart av avföring och blod. Lagra exemplar vid 4 ° C i RPMI 1640 Medium tills redo för crypt isolering.
Obs: Vävnaden kan inte lagras mer än 24 h.- Kontrollera att provexemplaret framgår av avföring och blod. Med känsliga dissekera sax, ta bort någon överflödig fett eller kirurgiskt klipp/klammer etc. Väga preparatet.
Obs: Sikta på en bit ca 0,75-2,5 g.
- Kontrollera att provexemplaret framgår av avföring och blod. Med känsliga dissekera sax, ta bort någon överflödig fett eller kirurgiskt klipp/klammer etc. Väga preparatet.
-
Skär preparatet i 0,5 cm bitar och placera i 30 mL kelaterande buffert #1 (som bereddes i steg 1.2).
- Skaka på låg hastighet under 15 minuter vid 4 ° C.
- Filtrera vävnad genom 100 µm cell sil och kasta flödet genom.
-
Lägga till vävnaden i 30 mL kelaterande buffert #2 (som bereddes i steg 1.3).
- Skaka på låg hastighet under 15 minuter vid 4 ° C.
- Filtrera vävnad genom en 100 µm cell sil och kasta flödet genom.
- Tina 500 mL basalmembranet matris på is för användning i steg 2,8.
-
Tillsätt vävnad till 10 mL kall DMEM i en 50 mL konisk tub och skaka kraftigt för hand för 10 s.
- Filtrera genom en 100 µm cell sil och samla flödet genom (etikett 1). Håll röret #1 på isen.
- Tillsätt vävnad till en annan 10 mL kall DMEM i ett separat 50 mL koniska rör och skaka kraftigt för hand för 10 s.
- Filtrera genom en 100 µm cell sil och samla flödet genom (etikett #2).
- Upprepa ytterligare två gånger tills det finns fyra koniska rör med flödet genom (märkta rör #1-4).
-
Filter tube #1 lösning genom ett 100 µm cell sil och överföring flöde genom i 15 mL koniska rör (etikett 1). Upprepa för #2-4.
- Centrifugera 15 mL rör #1-4 vid 200 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
-
I LAF, avlägsna supernatanten från rören #1-4 och kassera. Inte störa molnet av vävnad omedelbart ovanför pelleten, även om det innebär att efterlämna några supernatanten.
- Genom pipettering långsamt, blanda ihop pelleten med överblivna supernatanten i rör #1-4.
- Över blandningen från rören #1-4 till ett enda 2 mL koniska rör.
- Centrifugera koniska röret vid 200 x g i 20 min vid 4 ° C.
-
Avlägsna supernatanten och resuspendera pelleten i 500 µL av basalmembranet matris.
Obs: hålla basalmembranet matrisen på isen hela tiden och arbetar snabbt för nästa steg. Denna produkt polymerizes mycket snabbt i rumstemperatur.- Gälla i mitten av en brunn i en 24-well platta 50 µL prov/källaren membran matrix suspension. Detta bör visas kupolformad.
Obs: Användning av kylda pipettspetsar hjälpmedel smidigare överföring av fjädringen, minimera polymerisation. - Upprepa 9 gånger att fylla 10 totala brunnar.
- Gälla i mitten av en brunn i en 24-well platta 50 µL prov/källaren membran matrix suspension. Detta bör visas kupolformad.
- Placera plattan 24 brunnar i 37 ° C, 5% CO2 inkubator för 30 min att tillåta polymerisation.
- Tillsätt 500 µL av mänskliga Minigut Media komplett (som bereddes i steg 1,5) till varje brunn. Ersätt varje 2 dagar.
- Samla in enteroids efter 5-10 dagar, när spirande visualiseras. Se steg 4 och 5 för samling instruktioner.
3. induktion av experimentella NEC
- Tillsätt 10 µL av lipopolysackarid (LPS) 5 mg/mL till 500 µL av mänskliga Minigut Media komplett (som bereddes i steg 1,5) i varje brunn dag 0. Ersätta varannan dag tills samlingen.
4. förberedelser för Paraffin inbäddning
-
Ta försiktigt bort media.
- Tillsätt 1 mL PBS och Pipettera försiktigt upp och ner för att upplösa basalmembranet matrisen med omsorg inte lyse i enteroids.
- Centrifugera PBS/enteroid blandning på < 300 x g i 5 min till pellet och ta bort PBS.
- Lägga till 4% paraformaldehyd fixar i rumstemperatur i 1 h.
-
Centrifugera vid < 300 x g i 5 min pellets, och sedan ta bort PBS.
- Tvätta försiktigt med 1 mL PBS och centrifugera vid < 300 x g i 5 min pellets, och sedan ta bort PBS.
- Upprepa steg 4.3.1.
-
Smält en tillräcklig volym av vävnaden bearbetning gel (omkring 300 µL) genom att placera önskad mängd i ett koniskt rör och uppvärmningen det i en torr bad inkubator vid 65 ° C för 3-10 min tills vätskan.
- Lägg till vävnaden bearbetning gel att pelleten och blanda försiktigt.
- På ett täckglas, placera en liten kloning ring.
- Pipettera vävnaden bearbetning gel och enteroid blandning till en kloning ring monterad på ett täckglas.
-
Att vävnaden bearbetning gel och enteroid blandningen stelnar vid 4 ° C för 1 h.
- Dränka kloning ringen med stelnad blandning i 70% etanol i förberedelse för paraffin inbäddning.
5. Enteroid samling för RNA och Protein utvinning
- Ta försiktigt bort mänskliga Minigut Media komplett från varje brunn.
-
Tillsätt 1 mL PBS och Pipettera försiktigt upp och ner för att upplösa matrisen basalmembranet. Var noga med att inte separera enteroids.
- Placera PBS/enteroid blandning i en steril 2 mL koniska rör.
- Centrifugera vid < 300 x g i 5 min till pellet.
- Ta försiktigt bort PBS, noga med att inte ta bort enteroids.
- Upprepa steg serie 5.2 två gånger.
- Frysa i-80 ° C tills redo för protein och/eller RNA-extraktion.
- Utföra gen uttryck och protein isolering av den enteroids som använder väletablerade qRT-PCR och Western Blotting tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Omedelbart efter plätering visas nymalen isolerade intestinal kryptor som avlånga stavar. Inom timmar tar enteroid på en runda utseende (figur 1en). Under de kommande dagarna börjar enteroids utgör områden som ses i figur 1b. Spirande skulle uppstå mellan 5-10 dagar (figur 1c) och enteroid samling bör ske på den tiden.
Den växande enteroids ställer också polaritet, som innehåller en centraliserad lumen, en apikal gräns och en basolateral domän (figur 2). Enteroids visar också strukturella integritet, företrädd av en robust aktin cytoskelettet (figur 3). Efter flera dagar i kultur, de LPS behandlade enteroids Upplev mer apoptos och kommer att ha en lägre avkastning än kontrollgruppen (figur 4). Som sett i mänskliga NEC och murina modeller av NEC9, hittades ett ökat uttryck av Toll-like receptor 4 (TLR4) i LPS behandlade enteroids jämfört med kontroller (figur 5).
Figur 1: Crypt kultur och mänskliga enteroid formation från hela vävnad. (en) dag 0 crypt kultur med runda, platta utseendet. (b) dag 4 enteroids med sfäroid bildandet. (c) dag 7 enteroids med spirande (svart pil). Skala barer = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Histologiska utseendet av en enteroid. Haemotoxylin och Eosin färgning. Enteroid visar en centraliserad lumen och utställningar polaritet, med både en apikala och basolateral domän. Haemotoxylin (lila) är kärnan, medan eosin (rosa) representerar cytosoliska komponenter. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Enteroid aktin cytoskelettet. Immunoflorescence mikrograf av en enteroids. Enteroid visar strukturell integritet vilket framgår av den framstående aktin cystoskeleton (magenta). Atomkärnor fläckade DAPI (blå), Scale bar = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Mänskliga enteroid kultur är sjönk med LPS behandling. Dag 5 enteroids i kultur, vuxit från den samma hela vävnadsprov. (en) Enteroids behandlade med kontroll kultur media. Visa stark tillväxt. (b) Enteroids behandlades med LPS i kultur media. Endast ett fåtal överlevande enteroids. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: Ökade TLR4 uttryck i experimentell NEC enteroids. (en) qRT-PCR visade ökat TLR4 mRNA uttryck i enteroids utsätts för LPS (p = 0,03). (b), Western blot analys visar ökat TLR4 uttryck i experimentell mänskliga enteroid NEC (p = 0,02). Representativa western blot skildras. Värden är medel ± SEM 3 prover per grupp. * p < 0,05 av Student's t -test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna roman ex vivo human intestinal enteroid modell fungerar som en användbar metod för att studera tarmbarriären dysfunktion i nekrotiserande enterokolit (NEC). Enteroid bearbetningsmetoderna presenteras här anpassades från tidigare arbete av Drs. Misty Good, Michael Helmrath och Jason Wertheim10,11,12.
Detaljerna kring hela vävnad samling och tidpunkten för crypt isolering är viktiga steg i detta protokoll. Vävnaden måste samlas in omedelbart vid tidpunkten för operativ resektion och bearbetas för crypt isolering så snart vävnaden anländer i labbet. Vi valt vävnad från patienter mindre än 3 månader gammal för denna modell. Fördröjd behandling kan förekomma inom 24 h efter hela vävnad samling om det behövs. Dessutom påverkar kvaliteten på mänsklig vävnad provet kraftigt avkastningen av kryptan isolering. Friska tunntarmen utan underliggande patologi och från yngre patienter (< 2 månaders ålder) har visat sig ge de bästa resultaten. Dessutom bör samlas in vävnaden väljas från det friskaste området, vanligtvis i distala ändarna av opererande preparatet. Med hjälp av en större bit av tarmen förbättrar inte crypt isolering de beskrivna lösningen volymer i protokollet ovan. Intestinala segment ungefär 1-2 cm lång, väger 0,75-2,5 g är optimala. Induktion av experimentella NEC via LPS exponering var modellerad från väletablerade cellmodeller kultur och djur. Det etablerade arbetet av Hackam et al. visade TLR4 kritiska roll (LPS-receptorn) i NEC utveckling9,13,14,15. LPS aktivering av TLR4 stimulerar proinflammatoriska cytokiner, en minskning av barriär integritet och aktivering av subepitelial leukocyter som kännetecknar händelserna signalering inblandade i mänskliga NEC. TLR4 har varit inblandad som en viktig molekyl för att främja inflammation7 och djur som saknar funktionell TLR4 är har visat skydd från utvecklingen av NEC15. Cirkulerande nivåer av LPS är förhöjda hos patienter med NEC och förhöjda i avföring och plasma av djurmodeller av NEC. LPS inducerar tarminflammation i djur som liknar mänskliga NEC, som belyser betydelsen av inflammation i denna väg. Spegla de etablerade cellkultur och djurmodeller av NEC, tror vi att induktion av experimentella NEC via LPS administration i enteroid kultur är en användbar ex vivo human neonatal modell för studier av NEC. I linje med tidigare rapporter i andra etablerade modeller visat våra experimentella NEC enteroids ökat uttryck av TLR4 jämfört med kontroller.
Protokollet för induktion av experimentella NEC via LPS exponering har genomgått flera viktiga ändringar och förbättringar. Inledningsvis var enteroids odlas för 5 dagar, då inokuleras med LPS för 24 h och därefter samlas in. Protokollet nu rekommenderar LPS inympning på dag 0 med fortsatt exponering i varje kultur media förändring fram till samlingen. Dessutom kan optimerades doseringen av LPS. Efter en dos kurva och trialing flera olika LPS koncentrationer, valdes 5 mg/mL. Experimenterande med LPS inokulering direkt i basalmembranet matris/enteroid blandningen vid tidpunkten av bordläggningen var också trialed; men detta var besvärligt och bättre inte resultat.
Det finns begränsningar som bör tas upp som utnyttjandet av mänskliga enteroid modellen utvecklas. Sedan upptäckten i 2007, har flera olika protokoll använts för att upprätta och kultur enteroids. Många tillväxtfaktorer krävs för enteroid underhåll och differentiering brist på standardisering, som kan påverka reproducerbarhet. Dessutom saknar enteroid kultur mekaniska krafter som påverkar människors intestinala epitelet i fysiologiska förhållanden. Påtryckningar från luminala flöde och peristaltiken kan påverka genen och protein uttryck, som inte redovisas i denna modell. Denna modell saknar också nerver, immunceller, microbiom, kärlsystemet och mesenchyme som finns i människans tarm epitel.
Exponering för LPS i denna mänskliga intestinal enteroid modell orsakar en inflammatorisk reaktion som leder till histologisk, genetiska, och protein uttryck förändringar liknande dem i mänskliga NEC. Det finns flera aktuella djurmodeller av NEC, varierar svar till intestinal skada och terapeutiska insatser kraftigt mellan arter. Eftersom det är etiskt utmanande att studera sjukdomen patofysiologi eller testa nya terapeutiska medel direkt i människor, speciellt spädbarn, är det ytterst viktigt att fortsätta att odla denna roman ex vivo modell av NEC med mänsklig vävnad. Mänskliga enteroids är mottagliga för genetisk modifiering och kan vara grundläggande i utveckling av terapier för många mänskliga tarmsjukdomar16. Framtida riktlinjer bör syfta till att kultur mänskliga enteroids på en genomsläpplig byggnadsställning i en perfusion kammare med apikala och basolateral flöde till för att reproducera Invivo crypt-villus arkitektur såväl som fysiologiska styrkor såsom peristaltiken och luminala flöde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av det nationella institutet för hälsa Institutet för Diabetes och mag och njur sjukdom Grant (K08DK106450) och Jay Grosfeld Award från American Pediatric kirurgiska Association till C.J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
- Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).
- Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).
- Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
- Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).
