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Immunology and Infection

Un nuovo modello Enteroid epiteliali umane di enterocolite necrotizzantesi

doi: 10.3791/59194 Published: April 10, 2019

Summary

Enteroids stanno emergendo come un modello di romanzo nello studio della malattia umana. Il protocollo descrive come simulare un modello enteroid di enterocolite necrotizzante umano mediante trattamento di lipopolisaccaride (LPS) di enteroids generato dal tessuto neonatale. Enteroids raccolti dimostrano cambiamenti infiammatori simili a quelli osservati nella enterocolite necrotizzante umana.

Abstract

Enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia devastante degli infanti neonati. Esso è caratterizzato dalle alterazioni patofisiologiche multiple nell'epitelio intestinale umano, che porta ad aumento della permeabilità intestinale, alterato restituzione ed ha aumentato la morte delle cellule. Anche se ci sono numerosi modelli animali di NEC, risposta alla lesione ed interventi terapeutici può essere altamente variabile tra specie. Inoltre, è eticamente impegnativo per studiare la fisiopatologia della malattia o nuovi agenti terapeutici direttamente nei soggetti umani, soprattutto bambini. Di conseguenza, è altamente desiderabile per sviluppare un nuovo modello di NEC utilizzando tessuto umano. Enteroids sono 3-dimensionale organoids derivato dalle cellule epiteliali intestinali. Sono ideali per lo studio delle complesse interazioni fisiologiche, segnalazione delle cellule e della difesa ospite-patogeno. In questo manoscritto Descriviamo un protocollo che culture umane enteroids dopo aver isolato cellule staminali intestinali da pazienti sottoposti a resezione delle viscere. Le cellule della cripta sono coltivate in media che contengono fattori di crescita che favoriscono la differenziazione nel vari nativo di tipi delle cellule dell'epitelio intestinale umano. Queste cellule sono coltivate in un mix sintetico, collageno delle proteine che fungono da un'impalcatura, che imita l'extra-cellulare della membrana dello scantinato. Di conseguenza, enteroids sviluppare apicale basolaterale polarità. La somministrazione concomitante di lipopolisaccaride (LPS) in media provoca una risposta infiammatoria nel enteroids, che portano a istologica, genetica e le alterazioni di espressione della proteina simili a quelli osservati in NEC umano. Un modello sperimentale di NEC utilizzando tessuto umano può fornire una piattaforma più accurata per droga e del trattamento di prova prima della sperimentazione umana, come ci sforziamo di identificare una cura per questa malattia.

Introduction

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Enteroids umana sono un ex vivo sistema di coltura 3-dimensionale generato da cellule staminali isolate da cripte intestinali dei campioni di tessuto intestinale umano. Questo modello innovativo è stato introdotto da Hans Clevers et nel 2007 in seguito alla scoperta di Lgr5 + cellule staminali presso le cripte di piccolo intestino in topi1. Loro lavoro gettato le basi per l'istituzione di un ex vivo cultura epiteliale intestinale di più tipi di cellule che potrebbero essere attraversate senza significativi cambiamenti genetici o fisiologici2. Dopo questa scoperta, enteroids sono stati utilizzati come un nuovo modello per studiare la normale fisiologia digestiva e fisiopatologia delle malattie intestinali come la malattia di viscere infiammatoria, interazioni ospite-patogeno e medicina rigenerativa2.

L'uso di enteroids come un ex vivo modello per lo studio della fisiopatologia intestinale ha diversi vantaggi rispetto a tecniche alternative. Per i parecchi decenni passati, modelli animali e linee cellulari derivate da cancro intestinale immortalate sono state utilizzate per studiare la fisiologia intestinale3,4,5. Cella singola culture non rappresentano la diversità dei tipi di cellule presenti nell'epitelio intestinale normale, quindi mancano le celle cross-talk e segmento-specificità nell'espressione della proteina, segnalazione e malattia indotta da agente patogeno6. Cellule staminali in enteroids differenziarsi nei principali tipi di cellule epiteliali quali enterociti, cellule di Paneth, cellule caliciformi, cellule enteroendocrine e altre3. Polarità per mostre, svolgono funzioni di trasporto epiteliale e consentire per segmento intestinale specificità6. Poiché enteroids può ricapitolare i più tipi di cellule dell'epitelio intestinale umano, sono in grado di superare questa limitazione riconosciuta di sistemi basati su cellule di cancro. Nel corso del tempo, derivati di linee cellulari sono subcloned ed evolvono per presentano una maggiore diversità di espressione e la localizzazione della proteina3. Al contrario, enteroids possono essere attraversate senza significativi cambiamenti genetici o fisiologici2. Sebbene esistano numerosi modelli animali per NEC, risposta alla lesione ed interventi terapeutici può essere altamente variabile tra specie. A causa di queste limitazioni, terapie derivate da modelli animali non riuscire il 90% del tempo quando provati nelle prove umane a causa di differenze nella tossicità o l'efficacia3. Enteroids servire come modelli pre-clinici promettenti che possono colmare queste lacune, che conduce ad una migliore comprensione della patofisiologia intestinale complesso e quindi più redditizia e di successo innovazioni terapeutiche. C'è anche la prova recente che l'età del tessuto che un enteroid viene generato da rimane biologicamente importante7. Questo è un dettaglio particolarmente importante per il nostro modello poiché enteroids vengono generati dal tessuto neonatale, mantenendo quindi rilevanza fisiologica ai pazienti con NEC.

L'utilità di enteroids come modelli di malattie umane continua ad espandersi, nella speranza di trovare cure per le condizioni gravi e pervasive. Enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia devastante intestinale dei neonati caratterizzata da necrosi intestinale e frequentemente conduce alla perforazione della parete delle viscere, setticemia e morte8. A causa di patofisiologia complessa e multifattoriale di NEC, il meccanismo esatto della malattia non è ancora stato completamente delucidato; Tuttavia, la permeabilità intestinale aumentata è stata chiaramente implicata nella malattia processo8. Dato che lo studio del NEC e potenziali agenti terapeutici è eticamente impegnativo nei soggetti umani, soprattutto bambini, è altamente auspicabile per utilizzare un modello di enteroid biologicamente rilevanti del NEC utilizzando tessuto umano neonatale. Finora, enteroids hanno un ruolo limitato nello studio del NEC. Questo protocollo descrive l'uso di enteroids derivati da campioni di tessuto intestinale umano come un romanzo ex vivo modello per lo studio di enterocolite necrotizzantesi.

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Protocol

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L'approvazione del Consiglio di revisione istituzionale è stata ottenuta (IRB #2013-15152) per la raccolta di campioni di tessuto da pazienti sottoposti a resezione delle viscere all'ospedale Ann e Robert H. Lurie bambini di Chicago, Chicago, IL. Tutti i protocolli sono stati eseguiti in conformità alle linee guida istituzionali e nazionali e dei regolamenti per il benessere umano. Consenso informato dei genitori è stato richiesto e ottenuto prima della raccolta del campione in tutti i casi.

1. preparazione dei reagenti

  1. Prepara la soluzione di riserva di terreni di coltura per intero tessuto collection: 1 L di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM), 110 mL di siero bovino fetale (FBS), 11 mL di penicillina-streptomicina (concentrazione finale 1%) e 1,1 mL di insulina filtro-sterilizzato (concentrazione finale 0.1%.) Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
  2. Preparare chelante Buffer #1: 30 mL di terreni di coltura (come descritto in 1.1), 600 µ l di 0,5 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (concentrazione finale di 10 mM), 300 µ l di gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 µ l di anfotericina B (concentrazione finale 0,2%). Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
  3. Preparare il tampone di chelante #2: 30 mL di terreni di coltura (come descritto in 1.1), 300 µ l di EDTA 0.5 M (concentrazione finale di 5mM), 300 µ l di gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 µ l di anfotericina B (concentrazione finale 0,2%). Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
  4. Preparare il supporto di Minigut umana: 41,4 mL di DMEM/F-12, 5 mL di FBS (finale 10%), 500 µ l di penicillina-streptomicina (concentrazione finale 1%), 500 µ l di L-Glutammina (concentrazione finale 1%), 500 µ l di gentamicina (concentrazione finale 1%), 100 µ l di amfotericina B (finale concentrazione 0,2%), 500 µ l di 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane dell'acido solfonico (HEPES) (concentrazione finale di 10 mM), 500 µ l di 100 x N-2 supplemento e 1 mL di 50 x B-27 supplemento meno vitamina A per un volume totale di 50 mL. Conservare la soluzione di riserva a-20 ° C.
  5. Preparare umano Minigut Media Complete: 10 mL di umana Minigut Media (preparati a 1.4), 10 µ l di 100 µ g/mL Wnt3a (concentrazione finale 100 ng/mL), 10 µ l di 100 µ g/mL Noggin (concentrazione finale 100 ng/mL), 10 µ l di 1 mg/mL R-Spondin (concentrazione finale di 1 µ g/mL) , 10 µ l di 500 µ g/mL Epidermal Growth Factor (EGF) (concentrazione finale di 50 ng/mL), 10 µ l di 1 M N-acetilcisteina (concentrazione finale di 1 mM), 10 µ l di 10 mM Y-27632 (concentrazione finale di 10 µM), 10 µ l di 500 µM A-83 (concentrazione finale 500 nM), 10 µ l di 10 mM SB202190 (finale concentrazione di 10 µM), 100 µ l di 1 M nicotinammide (concentrazione finale di 10 mM) e 1 µ l di 100 µM [leu] 15-gastrin 1 (concentrazione finale di 10 nM). Volume totale 10 mL. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
    Nota: Soluzioni devono essere utilizzate entro 48h.

2. cripta isolamento e placcatura dall'intero tessuto

  1. Al momento della raccolta nella suite operativa, posizionare il campione di tessuto intestinale piccolo umano in di freddo Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS). Lavare il campione in DPBS freddo fino al chiaro delle feci e sangue. Conservare campione a 4 ° C in Medium RPMI 1640 fino al momento per l'isolamento di cripta.
    Nota: Tessuto non può essere memorizzato più di 24 h.
    1. Assicurarsi che il campione sia chiaro delle feci e sangue. Utilizzando le forbici per dissezione delicate, rimuovere qualsiasi eccesso grassi o chirurgici clip/graffette ecc. Pesare il campione.
      Nota: Scopo per un pezzo circa 0,75-2,5 g.
  2. Il campione tagliato a pezzi di 0,5 cm e posto in 30 mL di tampone di chelanti n. 1 (come preparato al punto 1.2).
    1. Agitare a bassa velocità per 15 min a 4 ° C.
    2. Filtro tessuto con colino di cella 100 µm e scartare flusso attraverso.
  3. Aggiungere il tessuto a 30 mL di tampone di chelatazione #2 (come preparata al punto 1.3).
    1. Agitare a bassa velocità per 15 min a 4 ° C.
    2. Filtro tessuto attraverso un colino di cella di 100 µm e scartare flusso attraverso.
  4. Scongelare i 500 mL di matrice della membrana basale su ghiaccio per uso nel punto 2.8.
  5. Aggiungere tessuto a 10 mL di DMEM freddo in una provetta conica da 50 mL e agitare vigorosamente per 10 s.
    1. Filtrare attraverso un colino di cella di 100 µm e raccogliere flusso attraverso (etichetta n. 1). Tenere il tubo #1 sul ghiaccio.
    2. Aggiungere del tessuto a un'altra 10 mL di DMEM freddo in una provetta conica separato 50 mL e agitare vigorosamente per 10 s.
    3. Filtrare attraverso un colino di cella di 100 µm e raccogliere flusso attraverso (etichetta #2).
    4. Ripetere due volte fino a quando ci sono quattro provette coniche con flusso attraverso (provette di #1-4).
  6. Filtro tubo #1 soluzione attraverso un 100 µm cella colino e trasferimento flusso attraverso in provetta conica da 15 mL (etichetta n. 1). Ripetere per #2-4.
    1. Centrifugare le provette da 15 mL #1-4 a 200 x g per 15 min a 4 ° C.
  7. Nella cappa a flusso laminare, rimuovere il supernatante da tubi #1-4 e scartare. Evitare di perturbare la nube del tessuto immediatamente di sopra del pellet, anche se questo significa lasciando alcuni surnatante.
    1. Pipettando lentamente, mescolate insieme il pellet con le rimanenze surnatante in tubi #1-4.
    2. Trasferire il composto da tubi #1-4 in una provetta conica da mL 2 singole.
    3. Centrifugare la provetta conica a 200 x g per 20 min a 4 ° C.
  8. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 500 µ l di matrice della membrana basale.
    Nota:
    tenere la matrice della membrana basale su ghiaccio in ogni momento e lavorare velocemente per i passaggi successivi. Questo prodotto si polimerizza molto rapidamente a temperatura ambiente.
    1. Applicare 50 µ l di campione/seminterrato membrana matrice sospensione al centro di un pozzo in una piastra a 24 pozzetti. Questo dovrebbe apparire a forma di cupola.
      Nota: Uso di puntali refrigerati per aiuti in più agevole trasferimento della sospensione, riducendo al minimo polimerizzazione.
    2. Ripetere 9 volte per riempire 10 pozzi totale.
  9. Posizionare la piastra a 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO2 incubatrice per 30 min consentire di polimerizzazione.
  10. Aggiungere 500 µ l di umana Minigut Media completa (come preparato al punto 1.5) in ciascun pozzetto. Sostituire ogni 2 giorni.
  11. Raccogliere enteroids dopo 5-10 giorni, quando è visualizzato in erba. Vedere i passaggi 4 e 5 per istruzioni per la raccolta.

3. induzione di NEC sperimentale

  1. Aggiungere 10 µ l di 5 mg/mL di lipopolisaccaride (LPS) a 500 µ l di umana Minigut Media completa (come preparato al punto 1.5) in ciascun pozzetto il giorno 0. Sostituire ogni 2 giorni fino alla raccolta.

4. preparazione per inclusione in paraffina

  1. Rimuovere delicatamente il supporto.
    1. Aggiungere 1 mL di PBS e pipettare delicatamente su e giù per dissolvere la matrice della membrana basale con cura non per lisare il enteroids.
    2. Centrifugare la miscela di PBS/enteroid a < x 300 g per 5 min per pellet e rimuovere PBS.
  2. Aggiungere 4% paraformaldeide per fissare a temperatura ambiente per 1 h.
  3. Centrifugare a < x 300 g per 5 min a pellet e quindi rimuovere PBS.
    1. Lavare delicatamente con 1 mL di PBS e centrifugare a < x 300 g per 5 min a pellet e quindi rimuovere PBS.
    2. Ripetere il punto 4.3.1.
  4. Sciogliere un volume sufficiente del tessuto lavorazione gel (circa 300 µ l) posizionando la quantità desiderata in una provetta conica e riscaldandola in un'incubatrice di bagno secco a 65 ° C per 3-10 min fino a liquido.
    1. Aggiungere il gel al pellet di lavorazione del tessuto e mescolare delicatamente.
    2. Su un vetrino coprioggetti, posizionare un piccolo anello di clonazione.
    3. Dispensare il tessuto di miscela di gel ed enteroid di elaborazione in un anello di clonazione montato su un vetrino coprioggetti.
  5. Consentire il miscela di gel ed enteroid a solidificare a 4 ° C per 1 h di lavorazione del tessuto.
    1. Immergere l'anello di clonazione con miscela solidificata in etanolo al 70% in preparazione per inclusione in paraffina.

5. Enteroid collezione per estrazione di proteine e RNA

  1. Rimuovere delicatamente umana Minigut Media completa da ogni pozzetto.
  2. Aggiungere 1 mL di PBS e pipettare delicatamente su e giù per dissolvere la matrice della membrana basale. Fare attenzione a non dissociare la enteroids.
    1. Mettere PBS/enteroid composto in una provetta conica sterile mL 2.
    2. Centrifugare a < x 300 g per 5 min a pellet.
    3. Rimuovere delicatamente il PBS, facendo attenzione a non per rimuovere il enteroids.
  3. Ripetere i passaggio serie 5.2 altre due volte.
  4. Congelare a-80 ° C fino al momento per proteine e/o estrazione del RNA.
  5. Eseguire l'isolamento di espressione e proteina di gene di enteroids utilizzando ben consolidata qRT-PCR e tecniche di Western Blotting.

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Representative Results

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Immediatamente dopo il placcaggio, cripte intestinali appena isolate vengono visualizzati come barre di forma allungate. Poche ore, il enteroid avrà un aspetto rotondo (Figura 1a). Nei prossimi giorni, il enteroids inizierà a formare sfere come visto in Figura 1b. In erba dovrebbe verificarsi tra 5-10 giorni (Figura 1c) ed enteroid collezione dovrebbe verificarsi in quel momento.

La crescente enteroids esporrà inoltre polarità, contenente un lume centralizzato, un bordo apicale e un dominio basolaterale (Figura 2). Enteroids mostrano anche l'integrità strutturale, rappresentato da un robusto citoscheletro (Figura 3). Dopo diversi giorni nella cultura, il enteroids di LPS trattati esperienza più apoptosi e avranno una resa inferiore rispetto al gruppo di controllo (Figura 4). Come visto in NEC umano e modelli murini di NEC9, un'aumentata espressione di Toll-like receptor 4 (TLR4) è stata trovata in enteroids LPS trattati rispetto ai controlli (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Cripta cultura e formazione umana enteroid dal tessuto tutto. (un) giorno 0 cripta cultura con aspetto rotondo, piatto. (b) 4 giorno enteroids con formazione della sferoide. (c) il giorno 7 enteroids con in erba (freccia nera). Scala bar = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 2
Figura 2 : Apparenza istologica di un enteroid. Haemotoxylin ed eosina. Il enteroid consente di visualizzare un lume centralizzato ed esibisce polarità, con sia un dominio apicale e basolaterale. Il haemotoxylin (viola) rappresenta il nucleo, mentre l'eosina (rosa) rappresenta componenti citosoliche. Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Citoscheletro di actina Enteroid. Micrografo di immunofluorescenza di un enteroids. Il enteroid consente di visualizzare l'integrità strutturale come dimostra l'actina prominente cystoskeleton (magenta). Nuclei macchiati con DAPI (blu), scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Enteroid umana cultura rendimento è diminuito con il trattamento LPS. Giorno 5 enteroids nella cultura, cresciuta dallo stesso campione intero tessuto. (un) Enteroids trattati con terreni di coltura di controllo. Visualizzare una crescita robusta. (b) Enteroids trattati con LPS in terreni di coltura. Solo pochi sopravvissuti enteroids. Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: TLR4 aumentata espressione in sperimentale NEC enteroids. (un) qRT-PCR ha mostrato aumentato espressione del mRNA di TLR4 in enteroids esposti ai LPS (p = 0,03). (b) l'analisi Western blot visualizzando ha aumentato l'espressione di TLR4 in sperimentale umano enteroid NEC (p = 0,02). Macchia occidentale rappresentanza raffigurata. I valori sono mezzi ± SEM di 3 campioni per ogni gruppo. * p < 0.05 mediante test t di Student. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Questo romanzo ex vivo enteroid intestinale umano modello serve come un metodo utile per lo studio della disfunzione della barriera intestinale in enterocolite necrotizzante (NEC). I metodi di elaborazione di enteroid qui presentati sono stati adattati dal precedente lavoro della d. ssa Misty Good, Michael Helmrath e Jason Wertheim10,11,12.

Dettagli che circondano l'intera collezione dei tessuti e la tempistica di isolamento cripta sono punti critici in questo protocollo. Tessuto deve essere raccolti immediatamente al momento della resezione attiva e trattato per l'isolamento di cripta appena arriva il tessuto in laboratorio. Abbiamo scelto il tessuto dai pazienti meno di 3 mesi di età per questo modello. Trattamento ritardato può verificarsi entro 24h dopo il prelievo di tessuto intero se necessario. Inoltre, la qualità del campione di tessuto umano influisce notevolmente il rendimento di isolamento di cripta. Piccolo intestino sano senza patologia sottostante e da pazienti più giovani (< 2 mesi di età) sono stati trovati per produrre i migliori risultati. Inoltre, il tessuto raccolto dovrebbe essere scelti dalla zona più sana, in genere all'estremità distale dell'esemplare resecato. Utilizzando un pezzo più grande dell'intestino non migliorare l'isolamento di cripta con i volumi di soluzione descritta nel protocollo di cui sopra. Intestinale segmenti circa 1-2 cm di lunghezza, peso 0,75-2.5 g sono ottimali. L'induzione di NEC sperimentale via l'esposizione LPS è stata modellata da modelli dell'animale e della coltura cellulare consolidata. Il lavoro consolidate di am et al hanno dimostrato il ruolo critico di TLR4 (recettore LPS) in NEC sviluppo9,13,14,15. L'attivazione di LPS di TLR4 stimola citochine proinfiammatorie, una riduzione di integrità della barriera e l'attivazione dei leucociti subepiteliali che caratterizzano gli eventi di segnalazione coinvolte nel NEC umano. TLR4 è stato implicato come una molecola chiave nel promuovere l'infiammazione7 e animali che mancanza funzionale TLR4 sono hanno dimostrato protezione dallo sviluppo di NEC15. Livelli circolanti di LPS sono elevati in pazienti con NEC ed elevate nel plasma di modelli animali di NEC e sgabello. LPS induce l'infiammazione intestinale in animali analogo umano NEC, che evidenzia l'importanza dell'infiammazione in questa via. Rispecchiando la cultura cellulari stabilizzate e modelli animali di NEC, crediamo che induzione sperimentale NEC tramite l'amministrazione dei LPS nella cultura enteroid è un utile ex vivo modello neonatale umana per lo studio del NEC. In linea con i rapporti precedenti in altri modelli consolidati, nostro enteroids NEC sperimentale ha dimostrato l'espressione aumentata di TLR4 rispetto ai controlli.

Il protocollo per l'induzione di NEC sperimentale tramite esposizione di LPS ha subito diverse importanti modifiche e miglioramenti. Inizialmente, enteroids sono state coltivate per 5 giorni, poi inoculati con LPS per 24 h e successivamente raccolti. Il protocollo raccomanda ora inoculazione dei LPS il giorno 0 con esposizione continuata a ogni cambio di terreni di coltura fino alla raccolta. Inoltre, il dosaggio di LPS è stato ottimizzato. Dopo aver eseguito una curva dose e sperimentando diverse concentrazioni differenti di LPS, 5 mg/mL è stato selezionato. Sperimentazione con inoculazione dei LPS direttamente nella miscela di matrice/enteroid della membrana dello scantinato al tempo di placcatura è stato anche sperimentato; Tuttavia, questo era ingombrante e non ha migliorato i risultati.

Ci sono limitazioni che dovrebbero essere affrontati come si evolve l'utilizzazione del modello umano enteroid. Dopo la scoperta nel 2007, diversi protocolli sono stati usati per stabilire e cultura enteroids. I numerosi fattori di crescita necessari per enteroid manutenzione e differenziazione standardizzazione della mancanza, che può influenzarne la riproducibilità. Inoltre, enteroid cultura manca di forze meccaniche che interessano l'epitelio intestinale umano in condizioni fisiologiche. Pressione da flusso di luminal e peristalsi può influenzare l'espressione genica e proteica, che non viene contabilizzata in questo modello. Questo modello manca anche i nervi, cellule immunitarie, un microbiome, sistema vascolare e mesenchima che sono presenti nell'epitelio intestinale umano.

L'esposizione a LPS in questo modello di enteroid intestinale umano provoca una risposta infiammatoria che conduce a istologico, genetica, e le alterazioni di espressione della proteina simile a quelli trovano in NEC umano. Anche se ci sono parecchi modelli animali attuale del NEC, risposta alla lesione intestinale ed interventi terapeutici varia ampiamente tra le specie. Dal momento che è eticamente impegnativo per studiare la fisiopatologia della malattia o per testare nuovi agenti terapeutici direttamente negli esseri umani, soprattutto i neonati, è estremamente importante continuare a coltivare questo romanzo ex vivo modello di NEC utilizzando tessuto umano. Enteroids umani sono suscettibili di modificazione genetica e può essere fondamentale per lo sviluppo di terapie per molte malattie intestinali umane16. Direzioni future dovrebbero mirare alla cultura umana enteroids su un'impalcatura permeabile in una camera di aspersione con apicale e basolaterale flusso per riprodurre in vivo cripta-villo architettura pure come fisiologica forza come la peristalsi e flusso di luminal.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dall'Istituto di salute Istituto nazionale di diabete e digestivo e rene malattia Grant (K08DK106450) e il premio Jay Grosfeld associazione chirurgica pediatrica americana-C.J.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Un nuovo modello Enteroid epiteliali umane di enterocolite necrotizzantesi
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Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).More

Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

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