Summary
Enteroids 人間の病気の研究に新たなモデルとして浮上しています。プロトコルでは、新生児の組織から生成された enteroids のリポ多糖 (LPS) 治療を使用して人間の壊死性腸炎の enteroid モデルをシミュレートする方法について説明します。収集した enteroids は、人間の壊死性腸炎で見られるそれらと同類の炎症性変化を示しています。
Abstract
壊死性腸炎 (NEC) は、新生児の壊滅的な病気です。反発、障害、細胞死の増加は高められた腸の透磁率につながる人間の腸上皮の複数の病態生理学的変化によって特徴付けられます。NEC の多数の動物モデル、種の間高い変数傷害および治療上の介在への応答可能性があります。さらに、疾患の病態やヒト、特に子供たちに直接新規の治療薬を研究する倫理的挑戦です。したがって、人間のティッシュを使用して NEC の新たなモデルを開発する非常に望ましいです。Enteroids は、腸管上皮細胞由来三次元 organoids です。彼らは、複雑な生理学的な相互作用、細胞シグナリング、およびホスト病原体の防御の研究に最適です。本稿で述べるプロトコルその文化人間 enteroids 腸切除を受けた患者からの腸管幹細胞の隔離の後。ひと腸管上皮のさまざまなセルの種類のネイティブへの分化を促す成長因子を含んでいる媒体で陰窩細胞を培養しています。これらの細胞は、細胞外の基底膜を模倣、足場として機能する蛋白質の合成、コラーゲン ミックスで栽培されています。その結果、enteroids は、頂基底極性を開発します。メディアのリポ多糖 (LPS) の共同管理は、enteroids、組織学的、遺伝的につながるとタンパク質発現変化人間 NEC で見られるそれらに類似の炎症反応を引き起こします。人間のティッシュを使用して NEC の実験モデルとして、この病気の治療法を識別する薬と治療の人間の試験の前にテストのためのより正確なプラットフォームがあります。
Introduction
人間 enteroids、ex vivo 3次元培養システム人間の腸組織サンプルの腸陰窩から分離された幹細胞から生成されます。この画期的モデル マウス1小腸の陰窩に Lgr5 幹細胞の発見に続く 2007 のハンス Clevers らの先駆者だった。自分の仕事は元の確立のための基礎を築いた重要な遺伝的または生理学的な変更2継代できる複数のセル型の vivo 腸管上皮文化。この発見以来 enteroids は、通常の消化生理学や再生医療2ホスト病原体の相互作用、炎症性腸疾患などの腸疾患の病態生理を研究する新たなモデルとして使用されています。
使用例として enteroids の消化管病態生理学の研究のための生体モデル代替技術いくつか利点があります。過去数十年の動物モデルと不死化腸癌由来細胞株は、腸の生理3,4,5を勉強する使用されています。単一細胞培養は、それにより細胞のクロストークとタンパク質発現、シグナル伝達、病原体による疾患6セグメント特異性に欠けている細胞の種類通常の腸の粘膜上皮に存在の多様性を表していません。Enteroids の幹細胞は、上皮細胞など上皮細胞、パネート細胞、杯細胞、enteroendocrine 細胞より3主要なに分化します。彼らは極性を展示、上皮の輸送機能を遂行し、腸管特異性6できます。Enteroids は、ひと腸管上皮の種類の細胞を要約することができます、のでこの認識された癌細胞ベースのシステムの制限を克服するためが。時間をかけて細胞の誘導体、subcloned と進化蛋白発現および局在3の大きい多様性を展示します。それどころか、enteroids は重要な遺伝的または生理学的な変更2継代することができます。NEC のための多数の動物モデルが存在する種の間高い変数傷害および治療上の介在への応答可能性があります。これらの制限の結果として動物モデルから派生した治療は、時間の 90% を失敗する毒性または有効性3の違いによる人間の臨床試験でテストしたとき。複雑な消化管病態、したがってより多くのよりよい理解につながる Enteroids これらの欠陥を克服することが有望なの前臨床モデルとして成功し、コスト効果の高い治療技術革新。また、enteroid から生成される組織の時代は生物学的に重要な7最近の証拠があります。Enteroids は NEC の患者に生理学的な関連性を堅持、新生児の組織から生成されるので、これは我々 のモデルのための特に重要な詳細です。
ヒトの病気のモデルとして enteroids のユーティリティは展開し、重度と普及条件に治療法を見つけることを期待して続けます。壊死性腸炎 (NEC) は腸管壊死によって特徴付けられる新生児の壊滅的な腸疾患と腸の壁、敗血症、および死8の穿孔につながり。NEC の複雑で多因子性病態、原因、病気の正確なメカニズムはまだ解明されていない完全に;ただし、腸管透過性亢進は、明らかに病気プロセス8に関与しています。与え、NEC および潜在的な治療薬の研究は、特に子供たちは人間の倫理的挑戦的な人間の新生児のティッシュを使用して NEC の生物学的に関連する enteroid モデルを利用するため非常に重要です。これまで、enteroids では、NEC における限られた役割があります。このプロトコルでは、壊死性腸炎研究用生体モデル ex 小説として人間の腸組織サンプルから派生した enteroids の使用について説明します。
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Protocol
施設内審査委員会の承認が得られた (IRB #2013 15152) アンとロバート H. Lurie こどもホスピタル オブ シカゴ、シカゴ、イリノイで腸切除術を受けた患者の組織サンプルのコレクションのため。すべてのプロトコルは、制度と国家のガイドラインおよび人類の福祉のための規則に準拠して行われました。書かれた情報に基づいた保護者の同意が求められ、すべてのケースでサンプル コレクションの前に得られます。
1. 試薬の準備
- 文化メディア ストック ソリューション全体の組織コレクションの準備: 1 L のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM)、110 mL の胎仔ウシ血清 (FBS) のペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%) の 11 mL1.1 ml フィルター滅菌インスリン (最終濃度 0.1%)4 ° C で原液を保存します。
- キレート バッファー #1 を準備: 文化、メディア (前述 1.1) 30 mL 0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 600 μ L (最終濃度 10 mM)、300 μ L (終濃度 1%) ゲンタマイシンのアムホテリシン b (最終濃度 0.2%) 60 μ L。4 ° C で原液を保存します。
- キレート バッファー #2 の準備: 30 mL の培地 (1.1 で説明します) と、ゲンタマイシン (最終濃度 1%) の 0.5 M EDTA (最終濃度 5 mM)、300 μ l 300 μ Lアムホテリシン b (最終濃度 0.2%) 60 μ L。4 ° C で原液を保存します。
- 人間の Minigut メディアの準備: 41.4 mL DMEM/F - 12、5 FBS (最後の 10%)、ペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%)、L-グルタミン (最終濃度 1%)、ゲンタマイシン (最終濃度 1%)、アムホテリシン B (最終の 100 μ L の 500 μ L の 500 μ L の 500 μ L の濃度 0.2%)、1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane スルホン酸 (HEPES) 500 μ L (終濃度 10 mM) 500 μ L 100 x の N-2 を補足、50 x の 1 mL B-27 を補うビタミン A マイナス 50 mL の容量の。-20 ° C で原液を保存します。
- 人間の Minigut メディア完了の準備: 10 mL ヒューマン メディア Minigut (で準備した 1.4)、100 μ g/mL Wnt3a の 10 μ L (終濃度 100 ng/mL)、100 μ g/mL 頭 (最終濃度 100 ng/mL) 1 mg/mL R Spondin の 10 μ L の 10 μ L (終濃度 1 μ g/mL)、500 μ G/ml 表皮成長因子 (EGF) (最終濃度 50 ng/mL)、1 の 10 μ L の 10 μ L M N-アセチルシステイン (最終濃度 1 mM)、10 μ L 500 μ m 10 mM Y-27632 (最終濃度 10 μ M)、10 μ L の A-83 (最終濃度 500 nM)、10 mM SB202190 (最後の 10 μ L濃度 10 μ M)、1 M ニコチンアミドの 100 μ L (終濃度 10 mM) と 100 μ M [ルー] 15 ガストリン 1 (最終濃度 10 nM) の 1 μ L。容量 10 mL。4 ° C で原液を保存します。
注:ソリューションは、48 時間以内に使用する必要があります。
2. 地下室分離と全体の組織からめっき
-
手術群のコレクションの時に、人間の小さい腸組織サンプルで冷たいダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) を配置します。便と血のクリアまで冷たい DPBS で供試体を洗います。地下室の分離のための準備ができるまで 4 ° C で試験片を RPMI 1640 媒体に格納します。
注:組織は、24 時間以上保存できません。- 試料を便と血を明確に確認してください。繊細な解剖はさみを使用すると、余分な脂肪や手術クリップ/いる針を取り等。供試体の重量を量る。
注:作品約 0.75 2.5 g を目指してください。
- 試料を便と血を明確に確認してください。繊細な解剖はさみを使用すると、余分な脂肪や手術クリップ/いる針を取り等。供試体の重量を量る。
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試料を 0.5 cm に切るし、キレート バッファー #1 の 30 mL (1.2 の手順で準備) として配置します。
- 4 ° C で 15 分間低速で振る
- 100 μ m の細胞のストレーナーをティッシュをフィルター処理して破棄を通過。
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(手順 1.3 の準備)、キレート バッファー #2 の 30 mL に組織を追加します。
- 4 ° C で 15 分間低速で振る
- 100 μ m セル ストレーナー ティッシュをフィルター処理して破棄を通過。
- 基底膜マトリックス 2.8 の手順で使用するため氷の上の 500 の mL を解凍します。
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10 mL を 50 mL の円錐管に冷たい DMEM に組織を追加し、10 の手によって積極的に振る s。
- 100 μ m セル ストレーナー フィルター (ラベル #1) 流れを収集しています。チューブ #1 氷の上を保ちます。
- 別の 50 mL の円錐管に冷たい DMEM の別の 10 mL に組織を追加し、10 の手によって積極的に振る s。
- 100 μ m セル ストレーナー フィルター (ラベル #2) 流れを収集しています。
- 追加で 2 回流れる (ラベルの付いたチューブ #1-4) と 4 つの円錐管までを繰り返します。
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フィルター チューブ #1 溶液 100 μ m セル ストレーナーと転送を通過する流れを 15 mL コニカル チューブ (ラベル #1)。#2 - 4 を繰り返します。
- 4 ° C で 15 分間 200 × gで遠心する 15 mL チューブ #1-4
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層流フードのチューブ #1-4 から上澄みを除去し、破棄します。つまり、一部の上澄みを残していて、ペレットのすぐ上の組織のクラウドを中断することを避けてください。
- ゆっくりとピペッティングで混ぜて一緒にペレット #1-4 管の培養上清中の残り物。
- チューブ #1-4 から 1 つの単一の 2 mL の円錐管に混合物を転送します。
- 4 ° C で 20 分 200 x gで円錐形の管を遠心分離します。
-
上澄みを除去し、再基底膜マトリックスを 500 μ l 添加の餌を中断します。
注:すべての回で氷の上基底膜マトリックスを維持し、すぐに次のステップの作業します。この製品は、室温で非常に迅速に重合します。- 24 ウェル プレートには井戸の中心に試料/地階膜マトリックス懸濁液 50 μ L を適用します。これはドーム型が表示されます。
注:チルド ピペット チップの使用は、重合を最小限に抑え、サスペンションのスムーズな転送に役立ちます。 - 10 の総井戸を埋めるため 9 回を繰り返します。
- 24 ウェル プレートには井戸の中心に試料/地階膜マトリックス懸濁液 50 μ L を適用します。これはドーム型が表示されます。
- 37 ° C で重合させる 30 分間 5% CO2インキュベーターで 24 ウェル プレートを配置します。
- 人間 Minigut メディアいる完了手順 1.5 で準備) 500 μ L を各ウェルに追加します。2 日おきに置き換えます。
- 新進は可視化、5 ~ 10 日後 enteroids を収集します。手順 4 と 5 についてはコレクションを参照してください。
3. 実験 NEC の誘導
- 0 日目に人間 Minigut メディアいる完了手順 1.5 で準備) 各ウェル内の 500 μ L に 5 mg/mL のリポ多糖 (LPS) の 10 μ L を追加します。コレクションまで 2 日おきに置き換えます。
4. パラフィン埋め込むことのための準備
-
メディアを慎重に取り外します。
- 1 mL の PBS を追加し、そっと上下しないように注意して、enteroids の溶解と基底膜マトリックスを溶解するピペットします。
- PBS/enteroid 混合物を遠心分離機 < 300 x gペレットし、PBS を削除する 5 分間。
- 1 時間室温で修正する 4% パラホルムアルデヒドを追加します。
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遠心分離機 < 300 x gペレット、し、PBS を削除する 5 分間。
- 1 mL の PBS で軽く洗って、遠心分離機 < 300 x gペレット、し、PBS を削除する 5 分間。
- 4.3.1 のステップを繰り返します。
-
円錐管に必要な量を配置し、3 10 分の 65 ° C で乾燥風呂インキュベーターで液体になるまで地球温暖化ゲル (約 300 μ L) を処理するティッシュの十分な量を溶かします。
- ペレットにゲルを処理組織を加え、軽く混ぜます。
- 観察小さなクローンのリングを配置します。
- ピペットの組織観察の上にマウントされているクローンのリングにゲルと enteroid の混合物を処理します。
-
1 h の 4 ° C で凝固するゲルと enteroid の混合物を処理組織を許可します。
- パラフィン包埋に備えて 70% エタノールに固化した混合物とクローンのリングが水没します。
5 RNA および蛋白質の抽出のための Enteroid コレクション
- 軽く各ウェルから人間 Minigut メディア完全削除します。
-
1 mL の PBS を追加し、そっと上下に基底膜マトリックスを溶解するピペットします。Enteroids を分離しないように注意します。
- 滅菌 2 mL の円錐管に PBS/enteroid 混合物を配置します。
- 遠心分離機 < 300 x gペレットへ 5 分。
- Enteroids を削除しないように注意して、PBS を慎重に取り外します。
- 5.2 の一歩シリーズをさらに 2 回繰り返します。
- 蛋白質や RNA の抽出の準備ができるまで-80 ° C で凍結します。
- 老舗 qRT PCR および西部にしみが付くことのテクニックを使用して enteroids の遺伝子発現および蛋白質の分離を実行します。
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Representative Results
めっき直後後新鮮単離腸陰窩は細長い棒として表示されます。時間以内に、円形の外観 (図 1、) で、enteroid になります。次の数日間、enteroids を図 1bに見られるように球を形成して開始します。新進は、5-10 日 (図 1c) の発生が、enteroid コレクションは、その時に発生します。
成長している enteroids も集中ルーメン、頂の境界線および基底のドメイン (図 2) を含む極性を展示いたします。Enteroids はまた、堅牢なアクチン細胞骨格 (図 3) で表される構造の健全性を示します。文化で数日後扱われる LP enteroids よりアポトーシスの経験し、対照群 (図 4) よりも低い収率を持っています。人間 NEC、NEC9のマウスモデルで見られる Toll 様受容体 4 (TLR4) の発現増加はコントロール (図 5) と比較して扱われる LP enteroids で発見されました。
図 1:地下墓地文化と人間 enteroid 全体組織から形成します。ラウンド、フラットな外観を持つクリプト文化が (、) 0 日目。(b) 回転楕円体の形成と 1 日 4 enteroids。新進の日 7 (c) enteroids (黒矢印)。スケール バー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: Enteroid の組織学的外観。Haemotoxylin ・ エオシン染色します。Enteroid は集中ルーメンを表示し、樹状突起と基底の両方のドメインの極性を展示します。エオシン (ピンク) ゾル性細胞質の成分を表すに対し、haemotoxylin (パープル) は、核を表します。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: Enteroid アクチン細胞骨格。Immunoflorescence、enteroids の顕微鏡写真。著名なアクチン cystoskeleton (マゼンタ) によって示されるように、enteroid は構造完全性を表示します。核染色 DAPI (青)、スケール バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:人間 enteroid 文化収量は低下したが LPS 処理します。同じ全ティッシュ サンプルから成長して文化の日 5 enteroids。(は) Enteroids で治療文化メディア コントロール。堅調な成長が表示されます。(b) Enteroids lps 文化メディアで扱われます。いくつか現存する唯一の enteroids。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:実験の NEC enteroids の増加の TLR4 式。(、) の qRT PCR LPS にさらされて enteroids で tlr 4 発現の増加を示した (p = 0.03)。西部のしみの分析 (b) 表示実験人間 enteroid NEC における tlr 4 発現を増加した (p = 0.02)。代表的な西部のしみが描かれています。値は、平均 ± SEM グループごとの 3 つのサンプルです。* p < スチューデントのt検定によって 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
Ex vivo ひと腸 enteroid モデルこの小説は、壊死性腸炎 (NEC) の腸粘膜バリアー障害の研究のための有用な方法として機能します。ここで紹介する enteroid 処理方法は、夫妻ミスティ良い、マイケル ・ Helmrath、ジェイソン ヴェルトハイムの10、11,12の前の仕事から合わせられました。
詳細全体を取り巻く組織の採取と地下室の分離のタイミングは、このプロトコルの重要なステップです。組織を手術切除の時にすぐに収集され、組織は研究室に到着するとすぐに地下室分離処理する必要があります。我々 はこのモデルのより小さい 3 ヶの患者から組織を選択しました。遅延処理は、全体組織の採取後 24 h 内で発生することが必要な場合。さらに、人体組織サンプルの品質は、地下室の分離の収量を大きく影響します。健康的な小腸基礎となる病理学と若い患者 (< 生後 2 か月) 最高の結果が得られることがわかった。さらに、健康的な領域で、切除標本の遠位端に通常から収集した組織を選択必要があります。腸の大きい部分を使用して上記のプロトコルで説明されているソリューション ボリュームとクリプト分離が向上しません。腸内セグメントの長さは、約 1-2 cm 重量 0.75 2.5 g が最適です。LPS 曝露による実験的 NEC の誘導は、確立された細胞培養および動物モデルからモデル化しました。設置作業 Hackam らの TLR4 の重要な役割を示した (LPS 受容体) NEC 開発9,13,14,15で。TLR4 の LPS 活性化障壁の整合性、および人間の NEC に関与するシグナル伝達イベントを特徴付ける上皮下の白血球の活性化の軽減、炎症性サイトカインを刺激します。TLR4 は、炎症7と動物機能 TLR4 が欠如が NEC15の開発からの保護を示している促進の鍵分子として関与しています。組合の循環血中濃度は NEC の患者で上昇、スツールと NEC の動物モデルのプラズマで上昇。組合は、この経路の炎症の重要性を強調する人間の NEC のような動物の腸の炎症を誘発します。ミラーリングの確立された細胞培養および NEC の動物モデル、enteroid 文化 LPS 投与による実験的 NEC の誘導は ex vivo ひと新生児モデル NEC の研究のための有用であると考えます。他の確立されたモデルの以前の報告に伴い当社実験 NEC enteroids はコントロールに比べて TLR4 の発現の増加を示した。
LPS 曝露による実験的 NEC の誘導するためのプロトコルには、いくつかの重要な変更と改善を受けています。最初に、enteroids が 5 日間、栽培され 24 時間 LP 接種、し、その後収集します。プロトコルは、コレクションまであらゆる文化メディア変更で継続的な露出と 0 日目に LPS 接種を推奨しています。さらに、LPS の投与量を最適化しました。いくつか異なる LPS 濃度線量曲線と試用を実行した後は、5 mg/mL が選ばれました。めっき時に基底膜マトリックス/enteroid の混合物に直接 LPS 接種実験はまた試験的;しかし、これは面倒でした、結果は改善しなかった。
人間の enteroid モデルの利用の拡大に伴って対処すべき制限があります。2007 年に発見以来の確立し、文化の enteroids に複数の異なるプロトコルを使用されています。Enteroid 維持と分化の欠如の標準化のため、再現性に影響を与える可能性があります必要な多数の成長因子。さらに、enteroid 文化は生理学的条件で人間の腸の粘膜上皮に影響を与える機械力を欠いています。内腔の流れや蠕動運動からの圧力はないこのモデルで説明される遺伝子および蛋白質の表現に影響を与えます。このモデルは、神経、免疫細胞、マイクロバイ、血管および人間の腸の粘膜上皮に存在する間充織にも欠けています。
この人間の腸 enteroid モデルでは, LPS の暴露により、遺伝的、組織学的につながる炎症反応とタンパク質発現変化に似て人間 NEC。NEC の現在いくつかの動物モデルが、種の間広く腸管損傷と治療に対する応答が異なります。人間、特に乳幼児に直接新しい治療上のエージェントをテストするまたは疾患の病態を研究する倫理的挑戦だから ex vivo モデル人間のティッシュを使用して NEC のこの小説を開拓していく極めて重要です。人間 enteroids 遺伝子組み換えに適しているし、多くの人間の腸疾患16のための療法の発展の基礎があります。文化人間 enteroids 根尖と灌流チェンバの透過性足場のこと将来の方向性を目指すべきし、蠕動運動や内腔の流れなど強制的に体内クリプト絨毛アーキテクチャだけでなく、生理を再現するために基底流。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、糖尿病、消化器・腎臓病グラント (K08DK106450) C.J.H. にアメリカの小児外科協会からジェイ Grosfeld 賞の健康研究所の国立研究所によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
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