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Immunology and Infection

Necrotizing Enterocolitis의 소설 인간 상피 Enteroid 모델

doi: 10.3791/59194 Published: April 10, 2019

Summary

Enteroids 인간 질병의 연구에 새로운 모델로 떠오르고 있다. 프로토콜 신생아 조직에서 생성 된 enteroids의 lipopolysaccharide (LPS) 치료를 사용 하 여 인간의 necrotizing enterocolitis에의 enteroid 모델을 시뮬레이션 하는 방법을 설명 합니다. 수집 된 enteroids 그 인간의 necrotizing enterocolitis에 본 유사 염증 성 변화를 보여 줍니다.

Abstract

Necrotizing enterocolitis (NEC) 신생아 유아의 치명적인 질병입니다. 그것은, 손상 회복, 그리고 세포 죽음 증가 증가 창 자 침투성으로 이어지는 인간 장 상피에 여러 pathophysiologic 변경 특징. NEC의 수많은 동물 모델을 확인 하 고는, 부상 및 치료 내정간섭에 응답 종 사이 매우 다양 수 있습니다. 또한, 그것은 질병 이상 또는 인체, 특히 아이 들에서 직접 새로운 치료제 연구를 윤리적으로 도전입니다. 따라서, 그것은 매우 바람직한 인간 직물을 사용 하 여 NEC의 새로운 모델을 개발입니다. Enteroids는 3 차원 organoids 장 상피 세포에서 파생 된. 그들은 복잡 한 생리 적인 상호 작용, 세포 신호, 및 호스트 병원 체 방어의 연구에 이상적입니다. 이 원고에 우리 기술 프로토콜 그 문화 인간 enteroids 창 자 절제술 환자에서 장 줄기 세포를 분리 한 후. 토 굴 세포 감 별 법 인간 장 상피의 다양 한 셀 형식 기본으로 격려 하는 성장 인자를 포함 하는 미디어에 교양. 이 세포는 여분의 세포 지하실 막을 흉내 낸를 발판으로 봉사 하는 단백질의 합성, collagenous 믹스에서 성장 된다. 그 결과, enteroids 개발 꼭대기 basolateral 극성. 미디어에서 lipopolysaccharide (LPS)의 공동 관리 enteroids, 조직학, 유전, 선도 및 단백질 식 변경 그 인간의 선관위에서 본 비슷한 염증 반응을 발생 합니다. 우리가이 질병을 위한 치료를 식별 하기 위해 노력 하 고 인간의 조직을 사용 하 여 NEC의 실험 모델 약물 및 치료 인체 실험, 사전 테스트에 대 한 더 정확한 플랫폼을 제공할 수 있습니다.

Introduction

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인간 enteroids 있다 전 비보 3 차원 문화 시스템 인간의 창 자 조직 샘플의 장 지하실에서 분리 된 줄기 세포에서 생성 된. 이 획기적인 모델 2007 마우스1소장의 지하실에서 Lgr5 + 줄기 세포의 발견 다음에 Hans Clevers 연구진이 개척 했다. 그들의 작품 전을 설정 하기 위한 토대를 마련 여러 종류의 세포는 상당한 유전적 또는 생리 변화2없이 passaged 수 비보 장 상피 문화. 이 발견 이후 enteroids 정상 소화 생리학, 선 동적인 장 질병, 호스트 병원 체 상호 작용, 재생 의학2등 장 질환의 병 태 생리학을 공부 하 고 새로운 모델으로 사용 되었습니다.

사용 전으로 enteroids의 vivo 모델 장 이상의 연구에 대 한 대체 기술을 통해 몇 가지 장점을. 지난 몇 십년에 대 한 동물 모델과 불멸 하 게 장 암 파생 셀 라인 장 생리학3,,45연구 사용 되었습니다. 단일 세포 배양 세포 유형 정상적인 창 자 상피에 존재 함으로써 셀을 크로스 토크와 세그먼트-특이성 단백질 표정, 신호, 및 병원 체 유발 질병6부족의 다양성을 대표 하지 않는다. Enteroids에 있는 줄기 세포 상피 세포 유형 enterocytes, Paneth 세포, 잔 세포, enteroendocrine 세포와 더 많은3주요로 구분합니다. 그들은 극성을 전시, 상피 전송 기능을 수행 하 고 장 세그먼트 특이성6허용 합니다. Enteroids 인간 장 상피의 여러 세포 유형 정리 수 있습니다, 이후 그들은 암 세포 기반 시스템의 인정된이 제한을 극복 하기 위해 수 있습니다. 시간이 지남에, 셀 라인의 파생 상품 subcloned는 고 단백질 식 및 지역화3에 큰 다양성을 전시 진화. 그와 반대로, 상당한 유전적 또는 생리 변화2없이 enteroids는 passaged 수 있습니다. 선관위에 대 한 수많은 동물 모델 존재, 부상 및 치료 내정간섭에 응답 종 사이 높게 가변 될 수 있습니다. 이러한 제한으로 인해 치료 동물 모델에서 파생 된 시간의 90% 실패 때문에 독성 또는 효능3인간의 재판에서 테스트 했을 때. Enteroids 복잡 한 장 이상과 따라서 더의 더 나은 이해로 이어지는 이러한 결함을 극복할 수 있는 유망한 전 임상 모델 역할 성공적이 고 비용 효율적인 치료 혁신. 또한 최근 증거는 enteroid에서 생성 되는 조직의 나이 생물학으로 중요 한7남아 있다. Enteroids 신생아 조직, NEC와 환자에 게 생리 관련성 유지에서 생성 되므로 이것은 우리의 모델에 대 한 특히 중요 한 정보 이다.

인간 질병의 모델로 enteroids의 유틸리티 확장, 심한와 보급 조건 치료를 찾는 희망 하 고 있습니다. Necrotizing enterocolitis (NEC) 신생아 장 괴 사 특징의 엄청난 장 질환 이며 자주 죽음8, 패 혈 증, 창 자 벽의 구멍 뚫 기를 리드. 때문에 선관위의 복잡 하 고 multifactorial 이상, 질병의 정확한 메커니즘 하지 아직 되었습니다 완전히 해명 했습니다; 그러나, 증가 창 자 침투성은 질병 과정8에서 명확 하 게 연루 되었습니다. 주어진 NEC와 잠재적인 치료제의 연구는 윤리적으로 인체, 특히 어린이에 도전, 매우 인간의 신생아 티슈를 사용 하 여 NEC의 생물학 관련 enteroid 모델을 활용 하는 것이 좋습니다. 지금까지, enteroids NEC의 연구에서 제한 된 역할을 있다. 이 프로토콜 enteroids enterocolitis necrotizing의 연구에 대 한 vivo 모델 전 소설으로 인간의 창 자 조직 샘플에서 파생 된의 사용을 설명 합니다.

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Protocol

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기관 심사 위원회 승인 (IRB #2013-15152) 얻은 앤 로버트 H. Lurie 어린이 병원의 시카고, 시카고, 일리노이에서 창 자 절제술 환자에서 조직 샘플의 컬렉션에 대 한. 모든 프로토콜은 기관 및 국가 지침 및 인간의 복지에 대 한 규정에 따라 수행 했다. 부모의 동의서 정보 요구 되었고 모든 경우에서 샘플 수집 전에 얻은.

1. 시 약 준비

  1. 문화 미디어 재고 솔루션 전체 조직 컬렉션에 대 한 준비: 1 L의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM), 110 mL의 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린-스 (최종 농도 1%)의 11 mL 1.1 ml 필터 소독 인슐린 (최종 농도 0.1%.) 4 ° c.에 게 재고 솔루션
  2. 킬레이트 버퍼 #1 준비: 문화 미디어 (1.1에서와 같이), 30 mL 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 600 µ L (최종 농도 10 m m), 300 µ L Gentamicin (최종 농도 1%)의 고 암포 B (최종 농도 0.2%)의 60 µ L. 4 ° c.에 게 재고 솔루션
  3. 킬레이트 버퍼 #2 준비: 문화 미디어 (1.1에서와 같이), 30 mL Gentamicin (최종 농도 1%)의 0.5 M EDTA (최종 농도 5 m m), 300 µ L의 300 µ L 고 암포 B (최종 농도 0.2%)의 60 µ L. 4 ° c.에 게 재고 솔루션
  4. 인간의 Minigut 미디어 준비: 41.4 mL DMEM/F-12, FBS (최종 10%), 500 µ L의 페니실린-스 (최종 농도 1%), L-글루타민 (최종 농도 1%), Gentamicin (최종 농도 1%), 암포 b (최종 100 µ L의 500 µ L의 500 µ L의 5 mL 농도 0.2%), 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane 술 폰 산 (HEPES)의 500 µ L (최종 농도 10 m m), 100 x 500 µ L N-2 보충, 및 50 x의 1 mL 50 mL의 전체 볼륨에 대 한 비타민 A 마이너스 B-27 보충. -20 ° c.에 게 재고 솔루션
  5. 인간의 Minigut 미디어 완료 준비: 10 mL의 인간 Minigut 미디어 (준비에서 1.4), 10 µ L 100 µ g/mL Wnt3a의 (최종 농도가 100 ng/mL), 100 µ g/mL 머리 (최종 농도가 100 ng/mL), 1 mg/mL R Spondin의 10 µ L의 10 µ L (최종 농도 1 µ g/mL) 500 µ g/mL 표 피 성장 인자 (EGF) (최종 농도 50 ng/mL), 1의 10 µ L의 10 µ L M N-진 (최종 농도 1 m m) 10, 500 µ M의 10 m m Y-27632 (최종 농도 10 μ M), 10 µ L의 µ L A-83 (최종 농도 500 nM), 10 mM SB202190 (마지막의 10 µ L 농도 10 μ M), 1 M 니코틴의 100 µ L (최종 농도 10 m m)와 1 µ L 100 µ M [레이] 15 gastrin 1 (최종 농도 10 nM)의. 전체 용량 10 mL. 4 ° c.에 게 재고 솔루션
    참고: 솔루션 내에서 48 h 사용 해야 합니다.

2. 토 굴 격리 및 전체 조직에서 도금

  1. 요원에 있는 컬렉션의 시간에 인간의 작은 창 자 조직 샘플에서 찬 Dulbecco 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS) 놓습니다. 대변과 혈액의 클리어까지 차가운 DPBS에 표본을 씻어. 토 굴 격리에 대 한 준비까지 4 ° C에서 견본 RPMI 1640 매체에 저장 합니다.
    참고: 조직 24 시간 이상 저장할 수 없습니다.
    1. 표본은 분명 대변과 혈액의 다는 것을 확인 하십시오. 섬세 한 해가 위를 사용 하 여 모든 초과 지방 또는 수술 클립/스테이플 등 제거. 무게는 견본.
      참고: 조각 약 0.75-2.5 g에 대 한 목표.
  2. 표본 0.5 cm 조각으로 잘라 하 고 킬레이트 화 버퍼 # 1의 30 mL에 장소 (로 단계 1.2 준비).
    1. 4 ° c.에 15 분 동안 낮은 속도 흔들
    2. 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 조직 필터 및 흐름을 통해 삭제.
  3. (1.3 단계에서 준비)로 조직 킬레이트 화 버퍼 # 2의 30 mL를 추가 합니다.
    1. 4 ° c.에 15 분 동안 낮은 속도 흔들
    2. 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 조직 필터 및 흐름을 통해 삭제.
  4. 2.8 단계에서 사용 하기 위해 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스의 500 mL 녹여
  5. 10 mL 50 mL 원뿔 튜브에 차가운 DMEM의 조직을 추가 하 고 10 대 손으로 적극적으로 악수 s.
    1. 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터 및 수집 (레이블 #1)를 통해 흐름. 튜브 얼음에 # 1를 유지.
    2. 별도 50 mL 원뿔 튜브에 차가운 DMEM의 또 다른 10 mL에 조직을 추가 하 고 10 대 손으로 적극적으로 악수 s.
    3. 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터 및 수집 (레이블 #2)를 통해 흐름.
    4. 두 개의 추가 시간 흐름 (레이블이 튜브 #1-4)를 통해 4 개의 원뿔 관까지를 반복 합니다.
  6. 필터 튜브 100 µ m 셀 스 트레이너 및 전송 흐름을 통해 15 mL 원뿔 튜브 (레이블 #1)으로 통해 #1 솔루션. #2-4를 반복 합니다.
    1. 원심 분리기 15 mL 튜브 #1-4 200 x g 에서 4 ° c.에서 15 분
  7. 층 류 두건에 튜브 #1-4에서에서는 상쾌한을 제거 하 고 삭제 합니다. 경우에 일부 상쾌한 남겨두고 조직 바로 위에 펠 릿의 구름을 방해 하지 마십시오.
    1. 천천히 pipetting으로 남은 튜브 #1-4에서에서 표면에 뜨는와 펠 릿을 함께 섞는다.
    2. 하나의 단일 2 mL 원뿔 튜브로 튜브 #1-4에서에서 혼합물을 전송.
    3. 4 ° c.에 20 분 200 x g 에서 원뿔 튜브 원심
  8. 상쾌한을 제거 하 고 다시 지하실 멤브레인 매트릭스의 500 µ L에 펠 릿을 중단.
    참고:
    모든 시간에 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스를 유지 하 고 신속 하 게 다음 단계에 대 한 작업. 이 제품은 실 온에서 매우 신속 하 게 polymerizes.
    1. 24-잘 접시에 잘의 센터에 견본/지하실 막 매트릭스 서 스 펜 션의 50 µ L를 적용 됩니다. 이 돔 모양으로 나타납니다.
      참고: 냉장된 피 펫 팁의 사용 최소화 합 정지, 매끄러운 전송에 에이즈.
    2. 10 총 우물을 채우기 위해 9 번을 반복 합니다.
  9. 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터 중 합 수 있도록 30 분에 24-잘 접시를 놓습니다.
  10. 각 우물에 인간 Minigut 미디어 완벽 한 (준비 단계 1.5에서에서)의 500 µ L를 추가 합니다. 2 일 마다 교체 합니다.
  11. 5-10 일 후, 신진 시각 때 enteroids를 수집 합니다. 단계 4 및 5 컬렉션 지침에 대 한 참조.

3입니다. 실험 NEC의 유도

  1. 0에 인간 Minigut 미디어 완벽 한 (단계 1.5에서에서 준비)에 각 잘의 500 µ L를 lipopolysaccharide (LPS)의 5 mg/mL의 10 µ L를 추가 합니다. 컬렉션까지 2 일 마다 교체 합니다.

4입니다. 파라핀 포함을 위한 준비

  1. 부드럽게 미디어를 제거 합니다.
    1. PBS의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 아래로 주의 enteroids를 lyse 않기로 지하실 멤브레인 매트릭스를 해산 하기 위해 플라스틱.
    2. PBS/enteroid 혼합물을 원심 < 작은 PBS를 제거 하 5 분에 대 한 300 x g .
  2. 4% paraformaldehyde 1 시간 실 온에서 해결 하기 위해 추가 합니다.
  3. 원심에서 < 300 x g 5 분 작은, 그리고 PBS를 제거 합니다.
    1. 부드럽게 1 mL의 PBS로 세척 하 고 원심에서 < 300 x g 5 분 작은, 그리고 PBS를 제거 합니다.
    2. 4.3.1 단계를 반복 합니다.
  4. 충분 한 양의 젤 (약 300 µ L) 원뿔 튜브에 원하는 금액을 배치 하 고 액체까지 3-10 분 동안 65 ° C에서 드라이 목욕 인큐베이터에서 온난 하 여 처리 하는 조직에 녹 인 다.
    1. 펠 릿을 젤 처리 조직을 추가 하 고 부드럽게 혼합.
    2. coverslip에서 작은 복제 반지를 놓습니다.
    3. 복제 반지는 coverslip에 장착으로 젤과 enteroid 혼합 처리 조직 플라스틱
  5. 젤, enteroid 혼합물 1 h 4 ° C에서 고형화 처리 하는 조직을 수 있습니다.
    1. 파라핀을 포함 하기 위한 준비에 70% 에탄올으로 응고 혼합 복제 반지를 잠수함.

5. Enteroid 컬렉션 RNA 및 단백질 추출에 대 한

  1. 부드럽게 각 우물에서 인간 Minigut 미디어 완전 제거 합니다.
  2. 1 mL PBS를 추가 하 고 부드럽게 아래로 지하실 멤브레인 매트릭스를 해산 하기 위해 플라스틱. 수는 enteroids을 분리 하지 않도록 주의 하십시오.
    1. 살 균 2 mL 원뿔 관으로 PBS/enteroid 혼합물을 놓습니다.
    2. 원심에서 < 작은 5 분 300 x g .
    3. 부드럽게 PBS는 enteroids를 제거 하지 않도록 주의 복용 제거 합니다.
  3. 단계 시리즈 5.2 두 번 더 반복 합니다.
  4. 단백질 또는 RNA 추출에 대 한 준비까지-80 ° C에 고정 합니다.
  5. 잘 설립 qRT-PCR 및 서양 Blotting 기술을 사용 하 여 enteroids의 유전자 표현과 단백질 격리를 수행 합니다.

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Representative Results

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도금, 직후 갓 격리 장 지하실 길쭉한 봉으로 표시 됩니다. 시간 내는 enteroid (그림 1a) 둥근 모양에 걸릴 것입니다. 앞으로 몇 일 동안에 enteroids 그림 1b에서 보듯이 구체를 형성 시작 합니다. 신진그림 1(c) 5-10 일 사이 발생 해야 하 고 enteroid 컬렉션은 그 시간에 발생 한다.

성장 enteroids 또한 중앙된 루멘, 꼭대기 국경과 basolateral 도메인 (그림 2)를 포함 하는 극성을 전시할 것 이다. Enteroids 또한 강력한 걸 골격 (그림 3)로 표현 하는 구조적 무결성을 보여줍니다. 몇 일 후에 문화, LPS 처리 enteroids 더 많은 apoptosis 경험과 제어 그룹 (그림 4) 보다 더 낮은 항복을 할 것 이다. 인간의 NEC와 NEC9murine 모델에서 본, 수용 체 통행세 같이 4 (TLR4)의 증가 표현 LPS 처리 enteroids 컨트롤 (그림 5)에 비해에서 발견 되었다.

Figure 1
그림 1: 크립 트 문화 및 전체 조직에서 인간 enteroid 형성. 라운드, 평면 모양으로 () 0 토 굴 문화. (b) 회전 타원 체 형성 4 일 enteroids. (c) 7 일 enteroids 신진와 (검은 화살표). 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 2
그림 2 : 한 enteroid의 조직학 외관. Haemotoxylin 고 오신 얼룩입니다. enteroid 중앙된 루멘을 표시 하 고 두 혀끝과 basolateral 도메인 극성을 전시. (퍼플) haemotoxylin (핑크) 오신 cytosolic 구성 요소를 표시 하는 반면, 핵을 나타냅니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : Enteroid 걸 골격. Immunoflorescence는 enteroids의 현미경 사진. 눈에 띄는 걸 cystoskeleton (마젠타)에 의해 증명으로 enteroid 구조적 무결성을 표시 합니다. 핵 물 DAPI (파란색), 스케일 바 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: LPS 치료와 인간 enteroid 문화 수확량 감소. 하루 5 enteroids 같은 전체 조직 샘플에서 성장 하는 문화. () Enteroids 처리 제어 문화 미디어. 표시 강력한 성장을 합니다. (b) Enteroids 문화 미디어에서 LPS를 처리. 만 몇 살아남은 enteroids. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 실험 NEC enteroids에 증가 TLR4 식. () qRT-PCR enteroids LPS에 노출에 TLR4 mRNA 식을 증가 보였다 (p = 0.03). (b) 서쪽 오 점 분석 보여주는 실험 인간 enteroid NEC TLR4 식 증가 (p = 0.02). 묘사 된 대표적인 서쪽 오 점입니다. 값은 그룹당 3 샘플의 의미 ± sem의입니다. * 학생의 t p < 0.05 테스트합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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Ex vivo 인간 창 자 enteroid 모델이이 소설 장 장벽 부전 necrotizing enterocolitis (NEC)에서 연구에 대 한 유용한 방법으로 제공 합니다. 여기에 제시 된 enteroid 처리 방법 박사 안개 좋은, 마이클 Helmrath와 제이슨 베르트 하 임10,,1112의 이전 직장에서 적응 했다.

세부 사항 전체를 둘러싼 조직 수집 및 토 굴 격리의 타이밍은이 프로토콜에서 중요 한 단계. 조직 요원 절제 시 즉시 수집 하 고 조직 연구실에 도착 하자마자 토 굴 격리에 대 한 처리 해야 합니다. 우리는이 모델에 대 한 보다 3 개월 환자에서 조직 선택. 지연된 처리 24 시간 이내 전체 조직 컬렉션 후 필요한 경우 발생할 수 있습니다. 또한, 인간의 조직 샘플의 품질에는 크립 트 격리의 수익률을 크게 달라 집니다. 기본 병 리 없이 젊은 환자에서 건강 한 소장 (< 2 개월) 최상의 결과 얻을 발견 되었습니다. 또한, 수집 된 조직은 절제 견본의 원심 끝에 일반적으로 건강 한 지역에서 선택 되어야 한다. 내장의 더 큰 조각을 사용 하 여 위의 프로토콜에 설명 된 솔루션 볼륨 암호 격리를 향상 되지 않습니다. 장 세그먼트 길이, 약 1-2 cm 무게 0.75-2.5 g는 최적. LPS 노출을 통해 실험 NEC의 유도 잘 설립 셀 문화 및 동물 모델에서 모델링 했다. 설립된 작업의 Hackam 그 외 여러분 나타났다 TLR4의 중요 한 역할 (LPS 수용 체) NEC 개발9,13,,1415에. TLR4의 LPS 활성화 자극 proinflammatory cytokines, 장벽, 성실과 인간의 선관위에 관련 된 신호 이벤트 특성 subepithelial 백혈구의 활성화에 있는 감소. TLR4 염증7 와 부족 기능 TLR4는 NEC15의 개발 로부터 보호를 증명 하는 동물에 핵심 분자로 연루 되었습니다. LPS의 순환 수준 NEC 환자에서 높은 있으며 NEC의 동물 모델의 플라즈마의 자에 상승. LPS이이 통로에 염증의 중요성을 강조 하는 인간의 NEC 유사한 동물에 장 염증을 유도 합니다. 미러링 설립된 세포 배양 및 동물 모델 NEC의, 우리는 enteroid 문화에서 LPS 관리를 통해 실험 NEC의 유도 NEC의 연구에 대 한 vivo 인간 신생아 모델 전 유용 믿습니다. 다른 설립 모델에서 이전 보고서에 맞춰 우리의 실험 NEC enteroids 컨트롤에 비해 TLR4의 증가 식 시연.

LPS 노출을 통해 실험 NEC의 유도 대 한 프로토콜 몇 가지 중요 한 수정 및 개선을 겪고 있다. 처음, enteroids 5 일 동안 자란 다음 24 h에 대 한 LPS를 주사 되었고 이후에 수집. 프로토콜은 지금 컬렉션까지 모든 문화 미디어 변화에 지속적인된 노출 0 하루에 LPS 접종을 권장합니다. 또한, LPS의 복용량 최적화 되었다. 여러 다른 LPS 농도 복용량 곡선 및 시험을 수행, 후 5 mg/mL이 선정 됐다. 도금의 당시 지하실 멤브레인 매트릭스/enteroid 혼합물에 직접 LPS 접종 실험은 또한 trialed; 그러나, 이것은 복잡 하 고 결과 개량 하지 않았다.

진화 하는 인간 enteroid 모델의 활용으로 해결 해야 하는 한계가 있다. 2007 년에서 발견 이후 여러 다른 프로토콜 설정 하 고 enteroids 문화 사용 되었습니다. 수많은 성장 요인 enteroid 유지와 분화 부족 표준화, 재현성에 영향을 미칠 수 있습니다 필요한. 또한, enteroid 문화 생리 조건에서 인간의 창 자 상피에 영향을 주는 기계적인 힘 부족 합니다. Luminal 흐름과 연동에서 압력이이 모델에 대 한 차지 하지 하는 유전자와 단백질 표정에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 모델은 또한 신경, 면역 세포, 미생물, 맥 관 구조 및 mesenchyme 인간 장 상피에 존재 하는 부족 합니다.

이 인간 창 자 enteroid 모델에서 LPS에 노출 이끌어 더, 유전, 염증 반응 고 단백질 식 변경 된 것과 유사한 인간 선관위에서 발견 됩니다. NEC의 현재 동물 모델을 여러 가지 있지만, 장 부상 및 치료 내정간섭에 응답 종 사이 널리 다릅니다. 질병 이상 공부 하거나 인간, 특히 유아에서 직접 테스트 하는 새로운 치료 에이전트 윤리적 도전 이므로 배양 인간 직물을 사용 하 여 NEC의 vivo 모델 전이 소설을 계속 대단히 중요 하다. 인간 enteroids 유전자 수정 의무가 있으며 많은 인간의 창 자 질병16에 대 한 치료의 개발에 기본적인 수 있습니다. 미래 방향 꼭대기와 관류 챔버에 투과 비 계에 문화 인간의 enteroids를 목표로 한다 고 연동 등 luminal 흐름 basolateral 흐름을 vivo에서 토 굴-모 건축 뿐만 아니라 생리를 재현 하기 위해 강제로 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 당뇨병과 소화와 신장 질환 그랜트 (K08DK106450) C.J.H.에 미국 소아 외과 협회에서 제이 Grosfeld 상 건강 연구소의 국립 연구소에 의해 지원 되었다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
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Necrotizing Enterocolitis의 소설 인간 상피 Enteroid 모델
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Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).More

Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

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