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Immunology and Infection

Um novo modelo Enteroid epitelial humana de enterocolite necrosante

doi: 10.3791/59194 Published: April 10, 2019

Summary

Enteroids estão emergindo como um novo modelo no estudo de doenças humanas. O protocolo descreve como simular um modelo enteroid de humano enterocolite necrosante usando lipopolissacarídeo (LPS) tratamento do enteroids gerados a partir de tecido neonatal. Enteroids coletados demonstram alterações inflamatórias parecido com aqueles vistos em enterocolite necrosante humana.

Abstract

Enterocolite necrosante (NEC) é uma doença devastadora de recém-nascidos. É caracterizada por várias alterações fisiopatológicas no epitélio intestinal humana, levando ao aumento da permeabilidade intestinal, prejudicada a restituição e aumentou a morte celular. Embora existam vários modelos animais de NEC, resposta a lesões e intervenções terapêuticas pode ser altamente variável entre as espécies. Além disso, é eticamente desafiante para estudar a fisiopatologia da doença ou novos agentes terapêuticos diretamente em seres humanos, especialmente crianças. Portanto, é altamente desejável para desenvolver um novo modelo de NEC usando tecido humano. Enteroids são organoids 3-dimensional derivado de células epiteliais intestinais. Eles são ideais para o estudo das interacções fisiológicas complexas, sinalização celular e defesa do hospedeiro-patógeno. Este manuscrito, descrevemos um protocolo que enteroids de culturas humanas depois isolar células-tronco intestinais de pacientes submetidos à ressecção intestinal. As células da cripta são cultivadas em meios que contêm fatores de crescimento que estimulam a diferenciação a várias nativo de tipos de célula do epitélio intestinal humano. Estas células são cultivadas em uma mistura sintética, colágenas de proteínas que servem como um andaime, imitando a extracelular da membrana basal. Como resultado, enteroids desenvolver polaridade apical-basolateral. Co-administração de lipopolissacarídeo (LPS) em mídia provoca uma resposta inflamatória no enteroids, levando a histológica, genética e alterações de expressão de proteínas semelhantes aos observados em humano NEC. Um modelo experimental de NEC usando tecido humano pode fornecer uma plataforma mais precisa para drogas e tratamento de teste antes de testes em humanos, como nós nos esforçamos para identificar uma cura para esta doença.

Introduction

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Enteroids humanas são um ex vivo sistema de cultura 3-dimensional gerado a partir de células-tronco isoladas de criptas intestinais de amostras de tecido intestinal humana. Este modelo inovador foi pioneira por Hans Clevers et al. em 2007, após a descoberta de células-tronco Lgr5 + em criptas do intestino delgado em ratos1. Seu trabalho lançou as bases para o estabelecimento de um ex vivo cultura epitelial intestinal de vários tipos de células que podem ser passadas sem alterações significativas de genética ou fisiológica2. Desde essa descoberta, enteroids têm sido usados como um novo modelo para o estudo da fisiologia digestiva normal e da fisiopatologia de doenças intestinais como a doença inflamatória intestinal, interações patógeno-hospedeiro e medicina regenerativa2.

O uso de enteroids como um ex vivo de modelo para o estudo da fisiopatologia intestinal tem várias vantagens sobre técnicas alternativas. Há várias décadas, modelos animais e linhas celulares de câncer-derivado intestinal imortalizado tem sido costumava estudar fisiologia intestinal3,4,5. Culturas de célula única não representam a diversidade de tipos de células presentes no epitélio intestinal normal, assim, falta uma célula para outra-conversas cruzadas e segmento-especificidade na expressão da proteína, sinalização e doença induzida por patógeno6. Células-tronco em enteroids diferenciar em principais tipos de células epiteliais como enterócitos, células de Paneth, células de goblet, células enteroendócrina e mais3. Eles apresentam polaridade, realizar as funções de transporte epitelial e permitam a especificidade de segmento intestinal6. Desde que enteroids pode recapitular os vários tipos de células do epitélio intestinal humano, eles são capazes de superar essa limitação reconhecida de sistemas baseados em células de câncer. Ao longo do tempo, derivados de linhagens celulares são subcloned e evoluem para apresentam maior diversidade na proteína expressão e localização3. Pelo contrário, enteroids podem ser passadas sem alterações significativas de genética ou fisiológica2. Embora existam vários modelos animais para o NEC, resposta a lesões e intervenções terapêuticas pode ser altamente variável entre as espécies. Como resultado dessas limitações, derivada de modelos animais de terapêutica falham 90% do tempo quando testado em ensaios em humanos devido a diferenças na toxicidade ou eficácia3. Enteroids servir como modelos pré-clínicos promissoras que podem superar estas deficiências, levando a um melhor entendimento da fisiopatologia intestinal complexa e, portanto, mais bem sucedidas e rentáveis inovações terapêuticas. Há também evidências recentes que a idade do tecido que um enteroid é gerada a partir permanece biologicamente importantes7. Isto é um detalhe especialmente importante para nosso modelo desde enteroids são gerados a partir de tecido neonatal, mantendo assim a relevância fisiológica para portadores de NEC.

O utilitário de enteroids como modelos de doenças humanas continua a expandir-se, na esperança de encontrar curas para condições severas e penetrante. Enterocolite necrosante (NEC) é uma doença intestinal devastadora dos neonatos, caracterizada por necrose intestinal e frequentemente leva à perfuração da parede do intestino, septicemia e morte8. Devido à complexa e multifatorial fisiopatologia da NEC, o mecanismo exato da doença ainda não foi totalmente elucidado; no entanto, aumento da permeabilidade intestinal tem sido claramente implicado no processo doença8. Dado que o estudo da NEC e potenciais agentes terapêuticos é eticamente desafiador em seres humanos, especialmente crianças, que é altamente desejável utilizar um modelo de enteroid biologicamente relevantes da NEC usando tecido humano neonatal. Até agora, enteroids tem um papel limitado no estudo da NEC. Este protocolo descreve o uso de enteroids, derivado de amostras de tecido intestinal humana, como um romance ex vivo de modelo para o estudo da enterocolite necrosante.

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Protocol

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Foi obtida a aprovação do Conselho de revisão institucional (IRB #2013-15152) para coleta de amostras de tecido de pacientes submetidos à ressecção intestinal, Ann e do Robert H. Lurie crianças Hospital de Chicago, Chicago, IL. Todos os protocolos foram realizados em conformidade com as orientações institucionais e nacionais e normas para o bem-estar humano. Consentimento informado dos pais foi requerido e obtido antes da coleta de amostra em todos os casos.

1. preparação do reagente

  1. Prepare a solução stock de meios de cultura para a coleção inteira de tecido: 1L de Dulbecco modificado águia médio (DMEM), 110 mL de soro Fetal bovino (FBS), 11 mL de penicilina-estreptomicina (concentração final 1%) e 1,1 mL de insulina filtro esterilizado (concentração final 0,1%.) Solução estoque de loja a 4 ° C.
  2. Preparar o Buffer Chelating #1: 30 mL de meio de cultura (como descrito no ponto 1.1), 600 µ l de 0,5 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (concentração final 10 mM), 300 µ l de gentamicina (concentração final 1%) e 60 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final). Solução estoque de loja a 4 ° C.
  3. Preparar o Buffer Chelating #2: 30 mL de meio de cultura (como descrito no ponto 1.1), 300 µ l de 0,5 M EDTA (concentração final 5mM), 300 μL de gentamicina (concentração final 1%) e 60 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final). Solução estoque de loja a 4 ° C.
  4. Preparar a mídia de Minigut humana: 41,4 mL de DMEM/F-12, 5 mL de FBS (final 10%), 500 µ l de penicilina-estreptomicina (concentração final 1%), 500 µ l de L-glutamina (concentração final 1%), 500 µ l de gentamicina (concentração final 1%), 100 µ l de anfotericina B (final concentração 0,2%), 500 µ l de 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfônico (HEPES) (concentração final 10 mM), 500 µ l de 100 x N-2 complementar e 1 mL de 50 x B-27 suplemento menos vitamina A para um volume total de 50 mL. Solução estoque de loja a-20 ° C.
  5. Preparar humana completa de mídia de Minigut: 10 mL de humano Minigut Media (preparado no 1.4), 10 µ l de Wnt3a de 100 µ g/mL (concentração final de 100 ng/mL), 10 µ l de 100 µ g/mL Noggin (concentração final de 100 ng/mL), 10 µ l de R-Spondin de 1 mg/mL (concentração final de 1 µ g/mL) , 10 µ l de 500 µ g/mL, fator de crescimento epidérmico (EGF) (concentração final de 50 ng/mL), 10 µ l de 1 M N-acetilcisteína (concentração final 1 mM), 10 µ l de 10mm Y-27632 (concentração final de 10 µM), 10 µ l de 500 µM A-83 (concentração final 500 nM), 10 µ l de SB202190 (final de 10 mM concentração 10 µM), 100 µ l de 1 M de nicotinamida (concentração final 10 mM) e 1 µ l de 100 µM [leu] 15-gastrina 1 (concentração final de 10 nM). Total de volume de 10 mL. Solução estoque de loja a 4 ° C.
    Nota: Soluções devem ser usadas dentro de 48 h.

2. a cripta isolamento e chapeamento de todo tecido

  1. No momento da coleção na suíte operativa, coloca a amostra de tecido intestinal pequeno humano no de frio Dulbecco fosfato Buffered Saline (DPBS). Lave o espécime em DPBS frio até limpo de fezes e sangue. Espécime de loja a 4 ° C em meio RPMI 1640 até que esteja pronto para isolamento de cripta.
    Nota: Tecido não pode ser armazenado mais de 24 h.
    1. Certifique-se que o espécime está livre de fezes e sangue. Usando tesouras de dissecação delicadas, retire qualquer excesso gordo ou cirúrgicos clipes/grampos etc. Pese a amostra.
      Nota: Apontar para um pedaço de aproximadamente 0,75-2.5 g.
  2. Cortar a amostra em pedaços de 0,5 cm e coloque em 30 mL de quelantes Buffer #1 (como preparado na etapa 1.2).
    1. Agitar em velocidade baixa por 15 min a 4 ° C.
    2. Tecido de filtrar através de filtro de célula 100 µm e descartar fluir.
  3. Adicione o tecido a 30 mL de quelantes Buffer #2 (como preparado na etapa 1.3).
    1. Agitar em velocidade baixa por 15 min a 4 ° C.
    2. Filtro de tecido através de um filtro de célula de 100 µm e descartar fluir.
  4. 500 mL de matriz de membrana basal no gelo para uso na etapa 2.8 de descongelar.
  5. Adicione o tecido a 10 mL de DMEM frio em um tubo cónico de 50 mL e agitar vigorosamente à mão por 10 s.
    1. Filtrar através de um filtro de célula de 100 µm e coletar o fluxo através de (rótulo #1). Mantenha o tubo #1 no gelo.
    2. Adicione o tecido para outro 10 mL de DMEM frio em um tubo cônico separado de 50 mL e agitar vigorosamente à mão por 10 s.
    3. Filtrar através de um filtro de célula de 100 µm e coletar o fluxo através de (#2).
    4. Repita duas vezes adicionais até que existam quatro tubos cónicos com fluxo através de (tubos etiquetados #1-4).
  6. Filtro do tubo #1 solução através de um 100 µm célula Coagem e transferência fluir em tubo cônico de 15 mL (rótulo #1). Repita para #2-4.
    1. Centrifugar tubos de 15 mL #1-4 200 x g por 15 min a 4 ° C.
  7. O capuz de fluxo laminar, remover o sobrenadante de tubos #1-4 e descarte. Evite perturbar a nuvem de tecido imediatamente acima a pelota, mesmo que isso signifique deixar alguns sobrenadante para trás.
    1. Pipetando lentamente, misture a pelota com a sobrenadante em tubos #1-4 de sobra.
    2. Transfira a mistura de tubos #1-4 em um tubo cônico de único mL 2.
    3. Centrifugar o tubo cônico a 200 x g por 20 min a 4 ° C.
  8. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 µ l de matriz de membrana basal.
    Nota:
    manter a matriz da membrana basal no gelo em todos os momentos e trabalhar rapidamente para as próximas etapas. Este produto se polimeriza rapidamente à temperatura ambiente.
    1. Aplique 50 µ l de suspensão de matriz de membrana de amostra/porão no centro de um poço em uma placa de 24. Isto deve aparecer em forma de cúpula.
      Nota: Uso de pontas de pipetas refrigerados auxilia na transferência mais suave da suspensão, minimizando a polimerização.
    2. Repita 9 vezes para encher 10 poços totais.
  9. Coloque a placa de 24 em 37 ° C, 5% CO2 incubadora durante 30 min permitir a polimerização.
  10. Adicione 500 µ l de humano Minigut mídia completa (como preparado na etapa 1.5) para cada poço. Substitua a cada 2 dias.
  11. Recolha enteroids após 5-10 dias, quando a brotação é visualizada. Consulte as etapas 4 e 5 para obter instruções de coleta.

3. indução de NEC Experimental

  1. Adicione 10 µ l de 5 mg/mL de lipopolissacarídeo (LPS) a 500 µ l de humano Minigut mídia completa (como preparado na etapa 1.5) em cada poço no dia 0. Substitua a cada 2 dias até coleção.

4. preparação para a incorporação de parafina

  1. Remova cuidadosamente a mídia.
    1. Adicionar 1 mL de PBS e pipetar suavemente para cima e para baixo dissolver a matriz da membrana basal com cuidado para não lisar os enteroids.
    2. Centrifugue a mistura de PBS/enteroid a < x 300 g por 5 min de pelotas e remover PBS.
  2. Adicione 4% paraformaldeído para fixar a temperatura ambiente durante 1 h.
  3. Centrifugar a < x 300 g por 5 min de Pelotas, e em seguida remover PBS.
    1. Lave delicadamente com 1 mL de PBS e centrifugar a < x 300 g por 5 min de Pelotas, e em seguida remover PBS.
    2. Repita a etapa 4.3.1.
  4. Derreta um volume suficiente do tecido processamento gel (cerca de 300 µ l) colocando a quantidade desejada em um tubo cônico e aquecimento-lo em uma incubadora de banho seco a 65 ° C para 3-10 min até o líquido.
    1. Adicione o tecido gel para a pelota de processamento e misture delicadamente.
    2. Em uma lamela, coloque um pequeno anel de clonagem.
    3. Pipete o tecido mistura de gel e enteroid de processamento em um anel de clonagem montado sobre uma lamela.
  5. Permitir que o tecido processamento a mistura de gel e enteroid para solidificar a 4 ° C, durante 1 h.
    1. Submergi o anel clonagem com mistura solidificada em 70% etanol em preparação para a incorporação de parafina.

5. Enteroid coleção para extração de proteínas e RNA

  1. Remova cuidadosamente o humano Minigut completa de mídia de cada poço.
  2. Adicione 1 mL de PBS e pipetar suavemente para cima e para baixo dissolver a matriz da membrana basal. Tenha cuidado para não se dissociam a enteroids.
    1. Coloque a mistura de PBS/enteroid em um tubo cônico estéril de 2 mL.
    2. Centrifugar a < x 300 g por 5 min granular.
    3. Remova cuidadosamente a PBS, tomando cuidado para não remover a enteroids.
  3. Repita a série passo 5.2 mais duas vezes.
  4. Congele em-80 ° C até que esteja pronto para proteínas e/ou extração de RNA.
  5. Realize o isolamento de expressão e proteína de gene da enteroids utilizando técnicas de mancha ocidental e bem-estabelecida qRT-PCR.

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Representative Results

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Imediatamente após o chapeamento, criptas intestinais recém isoladas aparecem como hastes alongadas. Horas depois, o enteroid terá uma aparência redonda (Figura 1um). Nos próximos dias, o enteroids vai começar formando esferas como visto na Figura 1b. Brotamento deve ocorrer entre 5-10 dias (Figura 1c) e enteroid coleção deve ocorrer na época.

A crescente enteroids também irá expor a polaridade, contendo um lúmen centralizado, uma borda apical e um domínio basolateral (Figura 2). Enteroids também mostrar integridade estrutural, representada por um citoesqueleto de actina robusto (Figura 3). Depois de vários dias na cultura, os LPS tratados enteroids experiência mais apoptose e terá um rendimento mais baixo do que o grupo controle (Figura 4). Como visto no NEC humana e modelos murino de NEC9, um aumento da expressão de receptores Toll-like 4 (TLR4) foi encontrado em enteroids LPS tratados comparados aos controles (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Cultura da cripta e formação humana enteroid do tecido todo. (um) dia 0 cultura cripta com aparência redonda e plana. (b) dia 4 enteroids com formação de esferoide. (c) 7 dia enteroids com brotamento (seta preta). Barras de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 2
Figura 2 : Aparência histológica de um enteroid. Haemotoxylin e coloração de eosina. O enteroid exibe um lúmen centralizado e apresenta polaridade, com ambos um domínio apical e basolateral. O haemotoxylin (roxo) representa o núcleo, enquanto a eosina (rosa) representa os componentes citosólica. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Citoesqueleto de actina Enteroid. Micrografia de reacção de um enteroids. O enteroid exibe integridade estrutural, como demonstrado pelo cystoskeleton de actina proeminente (magenta). Núcleos corados com DAPI (azul), a escala da barra = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Rendimento de cultura humana enteroid é diminuído com o tratamento de LPS. Dia 5 enteroids em cultura, cultivada a partir da mesma amostra de tecido todo. (um) Enteroids tratados com controle de meios de cultura. Exibir crescimento robusto. (b) Enteroids tratados com LPS em meios de cultura. Sobrevivendo apenas alguns enteroids. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Expressão de TLR4 aumentou em experimental NEC enteroids. (um) qRT-PCR mostrou aumento da expressão de RNAm de TLR4 em enteroids expostos ao LPS (p = 0,03). (b) análise ocidental do borrão mostrando aumento da expressão de TLR4 em experimental humana enteroid NEC (p = 0,02). Borrão ocidental representante retratado. Os valores são meios ± SEM de 3 amostras por grupo. * p < 0,05 pelo teste t de Student. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Este romance ex vivo enteroid intestinal humano modelo serve como um método útil para o estudo da disfunção da barreira intestinal em (NEC) de enterocolite necrosante. Os métodos de processamento de enteroid aqui apresentados foram adaptados do trabalho anterior de DRS Misty Good, Michael Helmrath e do Jason Wertheim11,de10,12.

Detalhes em torno de toda a coleção de tecido e sincronismo de isolamento cripta são passos críticos no presente protocolo. Tecido deve ser recolhido imediatamente no momento da ressecção operativa e processado para isolamento de cripta, tão logo o tecido chega no laboratório. Nós selecionamos o tecido de pacientes menos de 3 meses de idade para este modelo. Atraso de processamento pode ocorrer dentro de 24 h após a coleta de tecido inteiro se necessário. Além disso, a qualidade da amostra de tecido humano afeta grandemente o rendimento do isolamento da cripta. Intestino saudável, sem patologia subjacente e de pacientes mais jovens (< 2 meses de idade) foram encontrados para produzir os melhores resultados. Além disso, o tecido coletado deve ser escolhido da área mais saudável, geralmente nas extremidades distais do espécime ressecado. Usando um pedaço maior do intestino não melhora o isolamento da cripta com os volumes de solução descrita no protocolo acima. Intestinal segmentos de aproximadamente 1-2 cm de comprimento, pesando 0,75 a 2,5 g são ideais. A indução da NEC experimental através de exposição de LPS foi modelada de modelos de cultura e animal célula bem estabelecida. O trabalho estabelecido de Hackam et al mostrou o papel crítico de TLR4 (receptor de LPS) em NEC desenvolvimento9,13,14,15. Ativação de LPS de TLR4 estimula cytokines proinflammatory, uma diminuição da integridade da barreira e ativação de leucócitos subepithelial que caracterizam os eventos de sinalização envolvidas na NEC humana. TLR4 tem sido implicada como uma molécula-chave na promoção da inflamação7 e animais que falta funcional TLR4 são demonstraram proteção contra o desenvolvimento da NEC15. Níveis circulantes de LPS são elevados em pacientes com NEC e elevado em fezes e plasma de modelos animais de NEC. LPS induz inflamação intestinal em animais que se assemelha a humana NEC, que destaca a importância da inflamação nesta via. Espelhamento da cultura celulares estabelecidas e modelos animais de NEC, acreditamos que a indução da NEC experimental através da administração de LPS em enteroid cultura é um útil ex vivo humano neonatal modelo para o estudo da NEC. Em consonância com os relatórios anteriores em outros modelos estabelecidos, nosso enteroids NEC experimental demonstrou aumento da expressão de TLR4 em comparação aos controles.

O protocolo para indução da NEC experimental através de exposição de LPS sofreu várias modificações importantes e melhorias. Inicialmente, enteroids foram cultivados por 5 dias, então inoculados com LPS para 24h e posteriormente recolhidos. O protocolo agora recomenda a inoculação de LPS no dia 0 com exposição continuada em cada mudança de meios de cultura até coleção. Além disso, a dosagem de LPS foi otimizada. Depois de executar uma curva de dose e testagem várias concentrações diferentes de LPS, 5 mg/mL foi selecionado. Experimentação com inoculação de LPS diretamente na mistura de matriz/enteroid de membrana basal aquando do chapeamento foi também testada; no entanto, isto era pesado e não melhorar os resultados.

Existem limitações que devem ser abordadas como a utilização do modelo enteroid humana evolui. Desde a descoberta em 2007, vários protocolos diferentes tem sido usados para estabelecer e cultura enteroids. Os inúmeros fatores de crescimento necessários para enteroid manutenção e diferenciação falta padronização, que pode afetar a reprodutibilidade. Além disso, enteroid cultura carece de forças mecânicas que afetam o epitélio intestinal humano em condições fisiológicas. Pressão de fluxo luminal e peristaltismo pode influenciar a expressão de gene e proteína, que não é contabilizado neste modelo. Este modelo também carece de nervos, células do sistema imunológico, um microbiome, vascularização e mesênquima que estão presentes no epitélio intestinal humano.

Exposição ao LPS neste modelo enteroid intestinal humana provoca uma resposta inflamatória levando a histológica, genética e alterações de expressão de proteínas semelhantes às encontraram no NEC humana. Embora existam vários modelos animais atuais da NEC, resposta a lesão intestinal e intervenções terapêuticas varia amplamente entre as espécies. Desde que é eticamente desafiador para estudar a fisiopatologia da doença ou para testar novos agentes terapêuticos diretamente em seres humanos, especialmente crianças, é extremamente importante para continuar a cultivar este romance ex modelo vivo de NEC usando tecido humano. Enteroids humanos são passíveis de modificação genética e pode ser fundamentais no desenvolvimento de terapias para muitas doenças intestinais humanas16. Sentidos futuros deverão visar cultura humana enteroids sobre um andaime permeável em uma câmara de perfusão com apical e basolateral fluxo a fim de reproduzir a arquitetura de cripta-vilosidades in vivo, bem como fisiológica forças como o peristaltismo e fluxo luminal.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Instituto de saúde Instituto Nacional de Diabetes, digestivo e renal doença Grant (K08DK106450) e o Jay Grosfeld prêmio da associação americana de cirurgia pediátrica para C.J.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

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References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  2. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291, (8), 3759-3766 (2016).
  3. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239, (9), 1124-1134 (2014).
  4. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, (3), 736-749 (1989).
  5. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7, (9), 902-910 (1990).
  6. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, (11), 633-642 (2016).
  7. Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, (4), 549-568 (2018).
  8. Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51, (12), 1907-1913 (2016).
  9. Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190, (7), 3541-3551 (2013).
  10. Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
  11. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
  12. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23, (4), 399-405 (2014).
  13. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179, (7), 4808-4820 (2007).
  14. Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176, (5), 3070-3079 (2006).
  15. Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143, (3), 708-718 (2012).
  16. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, (1), 81-83 (2011).
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Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).More

Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

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