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Immunology and Infection

Un modelo de enteroide epitelial humano novedoso de Enterocolitis necrosante

doi: 10.3791/59194 Published: April 10, 2019

Summary

Enteroids se perfila como un modelo novedoso en el estudio de las enfermedades humanas. El protocolo describe cómo simular un modelo enteroide de enterocolitis necrosante humana tratamiento de lipopolisacárido (LPS) de enteroids generados a partir de tejido neonatal. Enteroids recogidos demuestran cambios inflamatorios similares a los observados en humana enterocolitis necrotizante.

Abstract

La enterocolitis necrotizante (NEC) es una enfermedad devastadora de los recién nacidos. Se caracteriza por múltiples alteraciones fisiopatológicas en el epitelio intestinal humano, conduce a aumento de la permeabilidad intestinal, alteración de restitución y aumenta la muerte celular. Aunque existen numerosos modelos animales de NEC, respuesta a la lesión y las intervenciones terapéuticas puede ser altamente variable entre especies. Además, es éticamente desafiante para el estudio de la fisiopatología de la enfermedad o nuevos agentes terapéuticos directamente en seres humanos, especialmente los niños. Por lo tanto, es altamente deseable para el desarrollo de un modelo novedoso de NEC con tejido humano. Enteroids son 3 dimensiones organoides derivados de las células epiteliales intestinales. Son ideales para el estudio de las interacciones fisiológicas complejas, señalización celular y defensa huésped-patógeno. En este manuscrito se describe un protocolo enteroids humana las culturas después de aislar las células madre intestinales de pacientes sometidos a resección intestinal. Las células de la cripta se cultivan en medios que contienen factores de crecimiento que estimulan la diferenciación en el varios nativo de tipos celulares del epitelio intestinal humano. Estas células crecen en una mezcla sintética, colágeno de proteínas que sirven como andamio, mímico la membrana basal extracelular. Como resultado, enteroids desarrollar polaridad apical basolateral. La administración concomitante de lipopolisacárido (LPS) en medios de comunicación provoca una respuesta inflamatoria en enteroids, que conduce a histologic, genética y alteraciones de la expresión de proteína similares a ésos vistos en NEC humana. Un modelo experimental de NEC utilizando tejido humano puede proporcionar una plataforma más precisa de drogas y tratamiento de prueba antes de los ensayos en humanos, como nos esforzamos por identificar una cura para esta enfermedad.

Introduction

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Enteroids humanas son un ex vivo sistema de 3 dimensiones de la cultura generado a partir de células madre aisladas de criptas intestinales de las muestras de tejido intestinal humano. Este modelo innovador fue pionero por Hans Clevers et en 2007 tras el descubrimiento de Lgr5 + células en las criptas del intestino en ratones1. Su trabajo sentó las bases para el establecimiento de un ex vivo cultura epiteliales intestinales múltiples tipos de células que pueden ser pasados sin cambios genéticos o fisiológicos significativos2. Desde este descubrimiento, enteroids se han utilizado como un modelo novedoso para el estudio de la fisiología digestiva normal y la fisiopatología de enfermedades intestinales como la enfermedad inflamatoria intestinal, interacciones huésped-patógeno y medicina regenerativa2.

El uso de enteroids como una ex modelo vivo para el estudio de la fisiopatología intestinal tiene varias ventajas sobre técnicas alternativas. Durante las últimas décadas, se han utilizado para estudiar la fisiología intestinal3,4,5modelos animales y líneas celulares inmortalizadas de derivados del cáncer intestinal. Cultivos celulares solo no representan la diversidad de tipos de células presentes en el epitelio intestinal normal, careciendo de tal modo Charla cruzada de célula a célula y segmento-especificidad de expresión de la proteína, la señalización y la enfermedad inducida por el patógeno6. Las células madre en enteroids se diferencian en los principales tipos de células epiteliales como enterocitos, células de Paneth, células caliciformes, células enteroendocrinas y más3. Presentan polaridad, realizar funciones de transporte epiteliales y permiten de especificidad del segmento intestinal6. Desde enteroids puede recapitular los múltiples tipos de células de epitelio intestinal humano, son capaces de superar esta limitación reconocida de sistemas basadas en células de cáncer. Con el tiempo, derivados de líneas celulares se subcloned y evolucionan para exhibir una mayor diversidad en la expresión y localización de proteínas3. Por el contrario, enteroids pueden ser pasados sin cambios genéticos o fisiológicos significativos2. Aunque existen numerosos modelos animales para NEC, respuesta a la lesión y las intervenciones terapéuticas puede ser altamente variable entre especies. Como resultado de estas limitaciones, terapias derivadas de modelos animales fallan el 90% del tiempo en los ensayos en humanos debido a diferencias en la toxicidad y eficacia3. Enteroids servir como modelos preclínicos prometedores que pueden superar estas deficiencias conducen a una mejor comprensión de la compleja Fisiopatología intestinal y por lo tanto, más exitosas y rentables de las innovaciones terapéuticas. También hay evidencias recientes que la edad del tejido que un enteroide se genera a partir sigue siendo biológicamente importantes7. Esto es un detalle especialmente importante para nuestro modelo ya enteroids se generan a partir del tejido neonatal, manteniendo así relevancia fisiológica en pacientes con NEC.

La utilidad de enteroids como modelos de enfermedades humanas continúa expandiéndose, con la esperanza de encontrar curas para condiciones severas y penetrantes. Enterocolitis necrotizante (NEC) es una enfermedad intestinal devastadora de los recién nacidos caracterizada por necrosis intestinal y con frecuencia conduce a la perforación de la pared intestinal, septicemia y muerte8. Debido a la fisiopatología compleja y multifactorial de la NEC, el mecanismo exacto de la enfermedad ha no aún se han aclarado completamente; sin embargo, el aumento de la permeabilidad intestinal se ha implicado claramente en el proceso de la enfermedad8. Dado que el estudio de posibles agentes terapéuticos y NEC es éticamente desafiante en seres humanos, especialmente los niños, es muy conveniente utilizar un modelo biológicamente relevantes enteroide de NEC utilizando tejido humano neonatal. Hasta el momento, enteroids tienen un papel limitado en el estudio de NEC. Este protocolo describe el uso de enteroids derivada de las muestras de tejido intestinal humano como una novela de la ex modelo vivo para el estudio de la enterocolitis necrosante.

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Protocol

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Se obtuvo aprobación de la Junta de revisión institucional (IRB 2013 # 15152) para recogida de muestras de tejido de pacientes sometidos a resección intestinal en Ann y Robert H. Lurie Infantil Hospital de Chicago, Chicago, Illinois. Todos los protocolos se realizaron conforme a las directrices institucionales y nacionales y reglamentos para el bienestar humano. Consentimiento informado parental fue requerido y obtenido antes de la recogida de la muestra en todos los casos.

1. preparación del reactivo

  1. Preparar solución stock de medios de cultivo para la colección de todo tejido: 1 L de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM), 110 mL de suero bovino Fetal (FBS), 11 mL de penicilina-estreptomicina (concentración final 1%) y 1,1 mL de insulina filtro esterilizado (concentración final 0,1%). Almacenar la solución a 4 ° C.
  2. Preparación de Buffer quelante #1: 30 mL de medio de cultivo (como se describe en la 1.1), 600 μl de 0.5m ácido etilendiaminotetracético (EDTA) (concentración final 10 mM), 300 μL de gentamicina (concentración final 1%) y 60 μL de anfotericina B (concentración final 0,2%). Almacenar la solución a 4 ° C.
  3. Preparación de Buffer quelante #2: 30 mL de medio de cultivo (como se describe en la 1.1), 300 μL de EDTA 0,5 M (concentración final 5mM), 300 μL de gentamicina (concentración final 1%) y 60 μL de anfotericina B (concentración final 0,2%). Almacenar la solución a 4 ° C.
  4. Preparar medios Minigut humano: mL 41,4 DMEM/F-12, 5 mL de SFB (final 10%), 500 μl de penicilina-estreptomicina (concentración final 1%), 500 μl de L-glutamina (concentración final 1%), 500 μl de gentamicina (concentración final 1%), 100 μl de la anfotericina B (final concentración 0.2%), 500 μl de ácido sulfónico N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane M 1 (HEPES) (concentración final 10 mM), 500 μl de 100 x N-2 suplemento y 1 mL de 50 x B-27 suplemento menos vitamina A para un volumen total de 50 mL. Almacene la solución stock a-20 ° C.
  5. Preparación completa de medios Minigut humano: 10 mL de Minigut Human Media (preparado en 1.4), 10 μl de Wnt3a de 100 μg/mL (concentración final 100 ng/mL), 10 μl de Noggin (concentración final 100 ng/mL), 10 μl de 1 mg/mL R-Spondin de 100 μg/mL (concentración final 1 μg/mL) , 10 μl de 500 μg/mL del Factor de crecimiento epidérmico (EGF) (concentración final 50 ng/mL), 10 μl de 1 M N-acetilcisteína (concentración final 1 mM), 10 μl de 10 mM Y-27632 (concentración final 10 μm), 10 μl de 500 μm A-83 (concentración final 500 nM), 10 μl de 10 mM (final de SB202190 concentración 10 μm), 100 μl de 1 M nicotinamida (concentración final 10 mM) y 1 μl de 100 μm [leu] 15-gastrin 1 (concentración final 10 nM). Volumen total de 10 mL. Almacenar la solución a 4 ° C.
    Nota: Las soluciones deben utilizarse dentro de 48 h.

2. cripta aislamiento y forro de todo tejido

  1. En el momento de la recogida en el operativo conjunto, coloque la muestra de tejido intestinal pequeño humano en de frío Dulbecco fosfato tampón salino (DPBS). Lavar a la muestra en frío DPBS hasta claro de heces y sangre. Almacenar la muestra a 4 ° C en Medio RPMI 1640 hasta que esté listo para el aislamiento de la cripta.
    Nota: Tejido no se puede almacenar más de 24 h.
    1. Asegúrese de que la muestra esté libre de heces y sangre. Con tijeras de disección delicadas, quite cualquier exceso grasa quirúrgicas clips/grapas o etcetera. Pesar a la muestra.
      Nota: Objetivo para una pieza de aproximadamente 0.75-2.5 g.
  2. Cortar a la muestra en trozos de 0,5 cm y colocar en 30 mL de Buffer quelante #1 (como preparado en el paso 1.2).
    1. Agitar a baja velocidad durante 15 min a 4 ° C.
    2. Filtro de tejido a través de 100 μm tamiz de célula y deseche el flujo a través.
  3. Añadir el tejido a 30 mL de Buffer quelante #2 (como preparado en el paso 1.3).
    1. Agitar a baja velocidad durante 15 min a 4 ° C.
    2. Filtro de tejido a través de un tamiz celular de 100 μm y deseche el flujo a través.
  4. Descongelar 500 mL de matriz de la membrana del sótano en hielo para su uso en el paso 2.8.
  5. Añadir tejido a 10 mL de DMEM frío en un tubo cónico de 50 mL y agitar vigorosamente a mano 10 s.
    1. Filtrar con un colador de celda de 100 μm y recoger el flujo a través de (sello #1). Mantenga el tubo #1 en el hielo.
    2. Añadir tejido a otro 10 mL de DMEM frío en un tubo cónico de 50 mL separados y agite vigorosamente a mano 10 s.
    3. Filtrar con un colador de celda de 100 μm y recoger el flujo a través (sello #2).
    4. Repetir dos veces más hasta que hay cuatro tubos cónicos con flujo a través de (tubos etiquetados #1-4).
  6. Filtro tubo solución #1 a través de una 100 μm células colador y la transferencia de flujo a través de en tubo cónico de 15 mL (etiqueta #1). Repetir #2-4.
    1. Centrifugar 15 mL tubos #1-4 a 200 x g durante 15 min a 4 ° C.
  7. En la campana de flujo laminar, retire el sobrenadante de los tubos #1-4 y deseche. Evitar perturbar la nube de tejido inmediatamente por encima de la pelotilla, incluso si eso significa dejar algunas sobrenadante.
    1. Transfiriendo poco a poco, mezclar el sedimento con las sobras de sobrenadante en tubos #1-4.
    2. Transferir la mezcla de tubos #1-4 en un tubo cónico de solo 2 mL.
    3. Centrifugar el tubo cónico a 200 x g durante 20 min a 4 ° C.
  8. Quite el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μl de la matriz de la membrana del sótano.
    Nota:
    mantener la matriz de la membrana del sótano en hielo en todo momento y trabajar rápidamente para los próximos pasos. Este producto se polimeriza muy rápidamente a temperatura ambiente.
    1. Aplique 50 μl de suspensión de matriz de la membrana basal muestra al centro de un pozo en una placa de 24 pozos. Esto debe aparecer en forma de cúpula.
      Nota: Uso de puntas de pipeta frío ayuda en la transferencia suave de la suspensión, reduciendo al mínimo la polimerización.
    2. Repetir 9 veces para rellenar pozos total 10.
  9. Colocar la placa de 24 pocillos de 37 ° C, 5% CO2 incubadora de 30 min permitir la polimerización.
  10. Añadir 500 μl de humano Minigut los medios de comunicación (como preparado en el paso 1.5) a cada pocillo. Reemplace cada 2 días.
  11. Recoger enteroids después de 5-10 días, cuando se visualiza el florecimiento. Ver pasos 4 y 5 para las instrucciones de la colección.

3. inducción de NEC Experimental

  1. Añadir 10 μl de 5 mg/mL de lipopolisacárido (LPS) a 500 μl de humano Minigut los medios de comunicación (como preparado en el paso 1.5) en cada pozo en el día 0. Reemplace cada 2 días hasta la colección.

4. preparación para inclusión en parafina

  1. Retire con cuidado los medios de comunicación.
    1. Añadir 1 mL de PBS y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para disolver la matriz de la membrana basal con cuidado de no lisar la enteroids.
    2. Centrifugar una mezcla de PBS/enteroide a < 300 x g durante 5 min para pellets y eliminar PBS.
  2. Añadir el paraformaldehído al 4% para fijar a temperatura ambiente durante 1 h.
  3. Centrifugue a < 300 x g durante 5 min para la pelotilla y después quitar PBS.
    1. Lavar suavemente con 1 mL de PBS y centrifugue a < 300 x g durante 5 min para la pelotilla y después quitar PBS.
    2. Repetir el punto 4.3.1.
  4. Fundir un volumen suficiente del proceso de gel (alrededor de 300 μL) colocando la cantidad deseada en un tubo cónico y calentamiento en una incubadora de baño seco a 65 ° C durante 3-10 min hasta que el líquido del tejido.
    1. Añadir el gel a la pelotilla de proceso del tejido y mezclar suavemente.
    2. Sobre un cubreobjetos, colocar un pequeño anillo de clonación.
    3. Pipeta el tejido mezcla de gel y enteroide de procesamiento en un anillo de clonación montado sobre un cubreobjetos.
  5. Deje que la mezcla de gel y enteroide solidificar a 4 ° C por 1 h de proceso del tejido.
    1. Sumerja el anillo de clonación con la mezcla solidificada en etanol al 70% en preparación para la inclusión en parafina.

5. enteroide colección para extracción de proteínas y ARN

  1. Suavemente Retire humano Minigut Media completa de cada bien.
  2. Añadir 1 mL de PBS y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para disolver la matriz de la membrana del sótano. Tenga cuidado de no disociar el enteroids.
    1. Coloque la mezcla de PBS/enteroide en un tubo cónico estéril de 2 mL.
    2. Centrifugue a < 300 x g durante 5 minutos para que sedimenten.
    3. Retire suavemente el PBS, teniendo cuidado de no para eliminar el enteroids.
  3. Repetir paso serie 5.2 dos veces más.
  4. Congelación de-80 ° C hasta que esté listo para la proteína o la extracción de RNA.
  5. Realizar gene expresión y proteína de aislamiento de la enteroids uso bien establecido de qRT-PCR y técnicas de Western blot.

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Representative Results

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Inmediatamente después de la galjanoplastia, las criptas intestinales recién aisladas aparecen como barras alargadas. Dentro de las horas, el enteroide tendrá un aspecto redondo (figura 1a). En los próximos días, iniciará el enteroids formando esferas como se ve en la figura 1b. Florecimiento debe ocurrir entre 5-10 días (figura 1c) y colección enteroide debe ocurrir en aquel momento.

La enteroids creciente exhibirá también la polaridad, que contiene una luz centralizada, un borde apical y un dominio basolateral (figura 2). Enteroids también muestran integridad estructural, representada por un citoesqueleto de actina robusta (figura 3). Después de varios días en la cultura, las enteroids de LPS tratados experimentan apoptosis más y tendrá un menor rendimiento que el grupo control (figura 4). Como se ve en NEC humana y en modelos murinos de la NEC9, un aumento de la expresión de receptores Toll-like 4 (TLR4) fue encontrado en enteroids de LPS tratados comparados a los controles (figura 5).

Figure 1
Figura 1: Cripta cultura y formación humana enteroide de todo tejido. (un) día 0 cultura cripta con aspecto redondo, plano. (b) día 4 enteroids con formación esferoide. (c) día 7 enteroids con incipiente (flecha negra). Barras de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 2
Figura 2 : Aspecto histológico de un enteroide. Estudio y eosina. El enteroide muestra una luz centralizada y exhibe la polaridad, con un dominio apical y basolateral. El estudio (púrpura) representa el núcleo, mientras que la eosina (color rosa) representa componentes citosólicas. Barra de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Citoesqueleto de actina enteroide. Micrografía de un enteroids en Immunoflorescence. El enteroide muestra integridad estructural según lo demostrado por el cystoskeleton de actina prominente (magenta). Núcleos teñidos con DAPI (azul), escala de la barra = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Rendimiento de cultura humana enteroide se disminuye con el tratamiento de LPS. Día 5 enteroids en la cultura, de la misma muestra de tejido todo. (una) Enteroids tratados con medios de cultivo de control. Mostrar un crecimiento robusto. (b) Enteroids tratados con LPS en medios de cultivo. Sólo sobreviven unos pocos enteroids. Barra de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Expresión de TLR4 aumentó en experimental NEC enteroids. (un) qRT-PCR demostró que aumentó la expresión del mRNA de TLR4 en enteroids expuestos a LPS (p = 0,03). (b) análisis de Western blot mostrando mayor expresión de TLR4 en experimental humano enteroide NEC (p = 0,02). Inmunoblot representativo representado. Los valores son medios ± SEM de 3 muestras por grupo. * p < 0.05 por prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Esta novela ex vivo enteroide intestinal humano modelo sirve como un método útil para el estudio de la disfunción de la barrera intestinal en la enterocolitis (NEC) necrotizante. Los métodos de procesamiento enteroide presentados aquí fueron adaptados de la obra anterior de los Drs. Misty Good, Michael Helmrath y Jason Wertheim10,11,12.

Detalles que rodean toda la colección de tejidos y el tiempo de aislamiento de la cripta son pasos críticos en este protocolo. Tejido y debe realizarse inmediatamente en el momento de la resección operativa procesado para el aislamiento de la cripta tan pronto como llega el tejido en el laboratorio. Se seleccionaron los tejidos de pacientes menos de 3 meses de edad para este modelo. Procesamiento diferido puede ocurrir dentro de 24 h después de la recolección de tejido entero si es necesario. Además, la calidad de la muestra de tejido humano afecta en gran medida el rendimiento de aislamiento de la cripta. Intestino sano sin patología subyacente y de los pacientes más jóvenes (< 2 meses de edad) se han encontrado para producir los mejores resultados. Además, debe elegirse el tejido recogido de la zona más saludable, por lo general en los extremos distales del espécimen resecado. Utilizando un pedazo más grande del intestino no mejora el aislamiento de la cripta con los volúmenes de la solución descrita en el protocolo anterior. Intestinal segmentos de aproximadamente 1-2 cm de longitud, pesando 2.5 0.75 g son óptimas. La inducción de NEC experimental mediante exposición de LPS fue modelada de modelos animales y cultura celulares bien establecidas. El trabajo establecido de Hackam et al demostraron el papel fundamental de TLR4 (receptor de LPS) en NEC desarrollo9,13,14,15. La activación de TLR4 LPS estimula citocinas proinflamatorias, una reducción en la integridad de la barrera y activación de los leucocitos subepiteliales que caracterizan a los eventos de señalización implicados en NEC humana. TLR4 se ha implicado como una molécula clave en la promoción de la inflamación7 y animales que falta son TLR4 funcional ha demostrado protección contra el desarrollo de NEC15. Niveles circulantes de LPS son elevados en pacientes con NEC y elevados en plasma de animales modelos de NEC y taburete. LPS induce inflamación intestinal en los animales que se asemeja a NEC humana, que pone de relieve la importancia de la inflamación en esta vía. Reflejo de la cultura de células establecidas y en modelos animales de NEC, creemos que la inducción de NEC experimental mediante la administración de LPS en cultura enteroide es una útil ex vivo humano neonatal modelo para el estudio de NEC. En línea con informes anteriores en otros modelos establecidos, nuestro enteroids NEC experimental demostró aumento de la expresión de TLR4 en comparación con controles.

El protocolo para la inducción de NEC experimental mediante exposición de LPS ha sufrido varias modificaciones importantes y mejoras. Inicialmente, enteroids fueron cultivados durante 5 días, inoculados con LPS por 24 h y posteriormente recogidos. El protocolo recomienda inoculación de LPS en el día 0 con la continua exposición en cada cambio de medio de cultivo hasta de colección. Además, se optimizó la dosis de LPS. Después de realizar una curva de dosis y pruebas varias concentraciones de LPS, se seleccionaron 5 mg/mL. Experimentación con la inoculación de LPS directamente en la mezcla de matriz/enteroide membrana basal en el momento de la galjanoplastia también fue exitosa; sin embargo, esto fue engorroso y no mejorar los resultados.

Existen limitaciones que deben ser abordadas como la utilización del modelo humano enteroide evoluciona. Desde el descubrimiento en el año 2007, se han utilizado varios protocolos distintos para establecer y enteroids de la cultura. Los numerosos factores de crecimiento necesarios para enteroide mantenimiento y diferenciación falta estandarización, que puede afectar la reproducibilidad. Además, enteroide cultura carece de fuerzas mecánicas que afectan el epitelio intestinal humano en condiciones fisiológicas. Presión de flujo luminal y peristalsis puede influir en expresión de gene y proteína, lo que no se contabiliza en este modelo. Este modelo también carece de nervios, las células inmunes, microbioma, vasculatura y mesénquima que están presentes en el epitelio intestinal humano.

Exposición a LPS en este modelo humano enteroide intestinal provoca una respuesta inflamatoria conduce a histologic, genética y alteraciones de la expresión de proteínas similares a los encuentran en NEC humana. Aunque existen varios modelos animales actuales de NEC, respuesta a la lesión intestinal y las intervenciones terapéuticas varía ampliamente entre especies. Ya que es éticamente desafiante para el estudio de la fisiopatología de la enfermedad o para probar a nuevos agentes terapéuticos directamente en seres humanos, especialmente niños, es sumamente importante seguir cultivando esta novela ex vivo modelo de NEC con tejido humano. Enteroids humanos son susceptibles de modificación genética y puede ser fundamentales en el desarrollo de terapias para muchas enfermedades intestinales humanas16. Direcciones futuras deben apuntar a la cultura humana enteroids en un andamio permeable en una cámara de perfusión apical y basolateral de flujo a fin de reproducir arquitectura cripta-vellosidad en vivo así como fisiológica las fuerzas tales como peristalsis y flujo luminal.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por el Instituto de Salud Instituto Nacional de Diabetes y el Jay Grosfeld Premio de la Asociación Americana de cirugía pediátrica C.J.H., digestivo y riñón enfermedad Grant (K08DK106450)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

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References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  2. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291, (8), 3759-3766 (2016).
  3. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239, (9), 1124-1134 (2014).
  4. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, (3), 736-749 (1989).
  5. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7, (9), 902-910 (1990).
  6. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, (11), 633-642 (2016).
  7. Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, (4), 549-568 (2018).
  8. Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51, (12), 1907-1913 (2016).
  9. Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190, (7), 3541-3551 (2013).
  10. Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
  11. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
  12. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23, (4), 399-405 (2014).
  13. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179, (7), 4808-4820 (2007).
  14. Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176, (5), 3070-3079 (2006).
  15. Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143, (3), 708-718 (2012).
  16. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, (1), 81-83 (2011).
Un modelo de enteroide epitelial humano novedoso de Enterocolitis necrosante
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Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).More

Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

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