Summary
Здесь мы описываем доклиническую модель ортотопической трансплантации сердца, которая была прочно установлена и использована для исследования новых стратегий кардиопротекторной защиты.
Abstract
Пятьдесят лет после первого успешного доклада, пересадка сердца остается золотым стандартом лечения для пациентов с прогрессирующей сердечной недостаточностью. Для изучения острых и долгосрочных последствий новых методов лечения были использованы несколько малых животных, связанных с трансплантацией сердца. Тем не менее, лишь немногие из них проверены и продемонстрировали успех в клинических испытаниях. Крайне важно оценить новые методы лечения в клинически релевантной модели крупного животного для эффективного и надежного перевода выводов базовых исследований. Здесь мы описываем доклиническую модель ортотопической трансплантации сердца, которая была прочно установлена и ранее использовалась для исследования новых стратегий кардиопротекторной защиты. Эта процедура фокусируется на острой травме ишемии и реперфузии и является надежным методом для исследования новых вмешательств, которые были протестированы и проверены в небольших экспериментальных моделях, таких как модель мурин. Мы демонстрируем его полезность в оценке сердечной деятельности в ранний посттрансплантационный период и другие потенциальные возможности, связанные с моделью.
Introduction
Пятьдесят лет после первого успешного доклада, пересадка сердца остается золотым стандартом лечения для пациентов с прогрессирующей сердечной недостаточностью1. Хотя ишемическое время до четырех часов допускается адекватно, ишемическое время более шести часов связано с низкими исходами2. Первичная дисфункция трансплантата остается основной причиной ранней заболеваемости и смертности после трансплантации2,3. Причины первичной дисфункции трансплантата являются многофакторными и включают в себя использование маргинальных органов, реципиента легочных сосудистых заболеваний, гиперострый отказ, и ишемия-реперфузионтравмы, полученные во время трансплантации3.
Многочисленные исследования исследовали новые методы сохранения донорского сердца, чтобы уменьшить частоту первичной дисфункции трансплантата4,5,6,7. Это обычная практика для оценки новых методов и методов лечения в моделях ишемии-реперфузии травмы или гетеротопической трансплантации сердца. Кроме того, небольшие модели животных позволяют модели выживания и долгосрочного наблюдения, чтобы исследовать развитие отторжения и сердечного аллотрансплантата васкулопатии11,12,13. Тем не менее, большинство из этих стратегий не первоначальные клинические экспериментальные испытания или никогда не достигают этой стадии. Чрезвычайно важно оценить новые методы лечения в клинически релевантной модели крупного животного для эффективного и надежного перевода выводов базовых исследований.
Свиное сердце часто считается наиболее анатомически похожим на сердце человека при использовании моделей большого животного. Таким образом, это идеальная платформа для проведения кардиологических хирургических исследований. Тем не менее, Есть несколько важных факторов, чтобы рассмотреть при использовании свиной модели. Во-первых, ткани, как правило, описывается как хрупкие и рыхлые, особенно в правом предсердии и легочной артерии, будучи склонны к слезам14. Кроме того, свиное сердце считается чувствительным к манипуляциям и склонным к аритмии, поэтому в начале эксперимента нужно регулярно вводить антиартметик каждому животному. Важным анатомическим различием между свиной моделью и клинической трансплантацией сердца является левая гемазигосная вена в свиней, которая стекает непосредственно в коронарную синус. Это должно быть ligated во время процедуры реципиента, чтобы избежать непрерывного кровотечения. Наконец, свиная модель очень чувствительна к ишемии, но она по-прежнему подходит для острых исследований при пересадке сердца15.
Данная рукопись описывает доклиническую модель ортотопической трансплантации сердца, которая была прочно установлена и использована для исследования новых кардиопротекторов5,6,8 ,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Институциональный комитет по уходу за животными утвердил все экспериментальные протоколы, и животные прошли лечение в соответствии с "Руководством по уходу и использованию лабораторных животных", подготовленным Институтом лабораторных животных, Национальный исследовательский совет, 1996 год. Мужские йоркширские свиньи (40-50 кг) использовались для проведения ортотопических пересадок сердца (размер животного может варьироваться в зависимости от усмотрения исследователей и экспериментальных целей).
1. Процедура донора
- Анестетик индукции и подготовки животных:
- Премедикаментат животное с помощью внутримышечной инъекции кетамина (20 мг/кг), мидазолама (0,3 мг/кг) и атропина (0,04 мг/кг). Выполните анестетической индукции и техническое обслуживание с использованием ингаляционного изофлуран (конечная приливная концентрация: 1%-3%) 3 л/мин O2 через маску для лица.
- Подтвердите атестетической адекватности, обеспечивая расслабленный тон челюсти и отсутствие боли во время ног щепотку. Анестетической адекватности необходимо следовать институциональным руководящим принципам.
- Как только анестезиологическая адекватность подтверждается, выполнять orotracheal интубации с помощью эндотрахеальная трубка размером 6,5-8 мм.
- Поместите монитор насыщения кислородом на ухо или нижнюю губу для непрерывного мониторинга. Поместите каутери электрод площадку на спине животного.
- Вставьте периферийный внутривенный доступ через ухо вены (например, 20 г ангиокат). Начать техническое обслуживание инфузии (например, 0,9% NaCl). Для предотвращения аритмий вводят 2 г сульфата магния.
- Вставьте перкутанную центральную венозную оболочку, используя технику Селдинджера, в правую яремную вену, если должны быть выполнены правосторонние катетеризация сердца и измерения сердечного выхода. Поместите животное в положение Trendelenburg для облегчения венозного доступа. Кроме того, это может быть сделано в левой внутренней яремной вены. Если доступ не может быть установлен, этот шаг может быть выполнен после стернотомии средней линии путем вскрытия внутренней яремной вены (слева или справа) и вставки оболочки непосредственно.
- Закупка донорского сердца:
- Выполните стернотомию средней линии от середины шейки матки до ниже сифоидного процесса с помощью каутерии. Откройте грудину пилой кости. Обеспечить адекватный гемостаз на протяжении всей процедуры (например, приждить грудину и/или применение костного воска).
- В области шейки матки, убирать стерноклеидомастоидную мышцу в центр и вскрыть правую сонную артерию (альтернативно, это можно сделать с левой сонной артерии). Поместите артериальную линию доступа (например, 20 г Ангиокат) в правую сонную артерию для инвазивного мониторинга артериального давления.
- Вскрыть и удалить тимус из-за перикарда. Аккуратно поднимите тимус из перикарда, используя каутерию, и вскрыть структуру из перикарда. Чтобы предотвратить кровотечение, прижречь мелкие сосуды, которые происходят из аорты и верхней полы вены (SVC) для орошения тимуса.
- Откройте перикард. Вскрыть аортолегумонарное пространство с помощью каутерии. Для этого, имеют помощник убирать правый желудочковой вытеков трек неполноценно и легочной артерии влево и хирург втягивать аорты вправо. Делайте это осторожно, чтобы избежать прямых поражений легочной артерии.
- Очистите передний аспект восходящей аорты от соединительной ткани. Тщательно убирайте правый желудочковый участок оттока и поместите портмоне-строку шов с помощью 4-0 prolene на проксимальной восходящей адвентиции адвентиции (избегайте полной толщины швов). Закрепите этот шов турникетом.
- Администрирование 30000 единиц гепарина (300 U/Kg) для достижения системной антикоагуляции. Вставьте канюли доставки кардиоплегии (например, канюли корня Корня DLP) в восходящую аорту между швом кошелька, ранее помещенным и закрепляющим, затягивая турникет. Подготовьте кардиоплегическое решение, которое будет использоваться и подключитесь к канюле доставки.
- Откройте SVC и нижнюю поливу вены вены (IVC), а также левую нижнюю легочную вену для обеспечения адекватного вентиляции сердца. Поместите аортальный крест-зажим на дистальную восходящую аорту (выше канюли кардиоплегии). Кроме того, левый желудочек может быть вентилируемым путем открытия левого предсердного придатка и размещения всасывания.
- Инициировать инфузию кардиоплегии, направленную на давление корня аорты от 80 до 100 мм рт. с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Авторы применили модель, используя 1,5 л стандартного внеклеточного гиперкалемического кардиоплегического раствора при 4 градусах Цельсия. Различные решения и объемы могут быть использованы в соответствии с экспериментальной настройки. - Поместите ледяную слякоть (0,9% NaCl) в грудной полости и над органом для охлаждения после начала кардиоплегии. После того, как кардиоплегия инфузии закончена, приступить с кардиэктомии в традиционной манере. Раздела аорту и легочную артерию после неназначенной артерии и при бифуркации, соответственно, чтобы обеспечить достаточную длину для имплантации.
- После удаления поместите орган в органный пакет с раствором консервации не менее 500 мл (стандартный внеклеточный гиперкалемичный раствор). Поместите это на лед и держать на 4 градуса х. C. Этот шаг может быть изменен в соответствии с экспериментальной конструкцией и целью.
2. Процедура получателя:
- Анестетик индукции и подготовки животных:
- Выполните анестезию и мониторинг, как описано в донорской процедуре (шаги от 1.1.1 до 1.1.6).
- После вставки перкутанной центральной венозной оболочки ввести в правой яремной вены, вставьте центральный венозный катетер (например, двойной люмен) в левую яремную вену с использованием техники Селдингер. Кроме того, это может быть сделано после стернотомии средней линии, как описано выше.
- Сердечно-легочной шунтирования (CPB):
- Выполните стернотомию средней линии и разоблачить сердце и большие сосуды, как описано в донорской процедуре (шаги 1.2.1 до 1.2.4).
- Вскрыть между SVC и невозметичной артерии, и IVC и перикарда с помощью Metzenbaum и "правый угол" щипцы. Окружите SVC и IVC с помощью пупочной ленты (альтернативно можно использовать простой шелковый шов O). Закрепите каждую ленту/шву турникетом.
- Поместите 2 концентрических кошелька строки швы с помощью 4-0 prolene шов на дистальный восходящей адвентиции адвентиции (избежать полной толщины швов). Поместите швы с кошельком с помощью 4-0 пролен на IVC и SVC на уровне периферийного отражения. Закрепите эти швы турникетами.
- Во время подготовки CPB, есть помощник установки и премьер системы в соответствии с следователями и экспериментальных потребностей. Нынешняя процедура использует ту же установку, используемую в отделении сердечно-сосудистой хирургии учреждения и использует помощь квалифицированного перфузиста. Система шунтирования оснащена 2 литрами кристаллоидного раствора (например, плазмалита) с 500 мг солумедрола.
- Администрирование 30000 единиц гепарина (300 U/Kg) для достижения системной антикоагуляции. Активированное время свертывания (ACT) должно быть выше 300 с, если тест доступен.
- Каннуляция аорты с 17 до 21 F артериальной канюли. Используйте экстракорпоральный мембранный оксигенатор (ECMO) канюли (например, артериальная канюля EOPA), вставленную с использованием техники Селдинджера, чтобы облегчить этот шаг и избежать потери крови. Кроме того, стандартное шунтирование артериальной канюли может быть использовано.
- Соедините канюлу с артериальной линией объездной цепи с помощью разъема 3/8-3/8. Обеспечить полное деэфирное, чтобы избежать эмболии воздуха.
- Выполните бикавальный каниуляции. Для этого, канюль SVC, а затем IVC с помощью 24 до 28 F под углом одноступенчатой венозной канюли (например, DLP одного люмена угловой венозной канюли).
- Во-первых, сделать небольшой разрез (5 мм) в центре кошелька строки шов. Разбавите разрез небольшим угловой инструмент (например, под прямым углом или оснастки). Вставьте канюли, направляя угол превосходно в SVC и неполноценно в IVC (вдали от сердца). Безопасный путем затягивания турникет проведения кошелек строки шов.
- Между каждым шагом, покрыть разрез пальцем, чтобы избежать чрезмерного кровотечения. Соедините канюли к венозной линии объездной цепи с помощью разъема 3/8-3/8-1/2 Y. Обеспечить детрансляцию, чтобы избежать шлюза в системе.
- Инициировать CPB. Отрегулируйте потоки для поддержания артериального давления выше 50 мм рт. ст. (примерно 4 л/мин). Поддержание нормомемии на протяжении всей процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры могут быть изменены в соответствии с экспериментальным дизайном. Вазоактивные лекарства следует вводить только во время CPB, если это необходимо для оказания помощи в регуляции давления (например, инфузии эпинефрина).
- Имплантация донорского сердца:
- После начала CPB, откройте левую плевру и урептать родное сердце вправо. Вскрыть и окружить левую гемазигосовую вену с помощью инструмента резкого вскрытия (например, Метценбаум) и правого угла, соответственно. Лигат дистасически с O Шелковый галстук. Только одна лигатура необходима, как родное сердце будет удалено.
- Перекрестный зажим получателя аорты проксимально к артериальной канюле. Snare обе вены cava с турникетами ранее размещены с использованием O шелковые галстуки. Удалите родное сердце получателя. Кроме того, сердце может быть арестован с помощью стандартных гипотермической крови на основе кардиоплегии.
- Во время кардиэктомии, убедитесь, что для поддержания больших манжет в реципиента для облегчения донорского импланта сердца. Для этого, раздел аорты и легочной артерии проксимально, близко к своим корням. Аналогичным образом, левое и правое предсердий должны быть сохранены с большими манжетами. Оставьте правые и левые предсердий придатки в манжетах получателя, которые могут потребоваться во время анастомоза.
- Подготовьте донорское сердце к имплантации.
- Расчлените легочную артерию от левого предсердия и полностью отделите легочную артерию от аорты. Оставьте не менее 2-3 см каждого сосуда для подстриженности во время имплантации по мере необходимости. Ligate обе вены cava с Шелковым галстуком O. Объедините все легочные вены, создавая одну левую манжету предсердий, чтобы быть анастомозом.
- Сравните оставленные размеры предсердий (донор и реципиент) и обрезать каждый по мере необходимости, чтобы стать похожими размерами. Левый предсердий придаток реципиента может быть сокращен, или оставленная донором предсердная крыша и придаток могут быть открыты для этого.
- Доставьте первую дозу кардиоплегии донору, используя ранее размещенную канюлу кардиоплегии, описанную в шаге 1.2.6. Кардиоплегический защитный раствор состоит из 500 мл смеси крови 2:1: кристаллоида, содержащего 24 мэк калия и доставляемого при 10 градусах Цельсия. Достичь желаемой концентрации калия, добавив хлорид калия в кардиоплегическую смесь.
- После завершения каждого анастомоза, доставить дополнительную дозу 300 мл кардиоплегии на 10 градусов, содержащих 8 мк калия.
- После всех анастомозов и перед удалением аортального крестового зажима, вводят дополнительную дозу 500 мл теплой (37 градусов по Цельсию) кардиоплегии крови с 8 мк калия.
- Удалить донорское сердце из хранения и имплантировать со стандартной анастомотической техникой биатрии в следующей последовательности: левое предсердие, правое предсердие, легочная артерия и аорта. Используйте 4-0 prolene шов с иглой SH для левого и правого предсердия, и аорты и 5-0 пролен шов с иглой BB для легочной артерии.
- Левое предсердие: поместите 4-0 пролен шов на стыке левого предсердия и IVC (правый нижний край) и другой на 180 "от первого, соединяя донора и получателя манжеты. Завершите заднюю стенку анастомоз. Завершите анастомоз передней стены. Это выполняется от верхнего шва до нижнего шва.
- Правое предсердие: откройте правое атриум донора от придатка к IVC, создавая донорскую манжету, которая соответствует размеру манжеты реципиента. Начиная с нижнего угла (соединение между IVC и правым атриумом), завершить внутреннюю стену анастомоз, а затем боковую стену.
- Легочная артерия: обрезать края как реципиента, так и донорских легочных артерий, чтобы создать соответствующие размеры. Поместите шов 5-0 prolene на левую боковую стену, объединяющую сосуды донора и реципиента, а другой на правом боковом краю. Завершить нижнюю стенку анастомоз, а затем передней стены анастомоз.
- Аорта: отделка, как описано с легочной артерией. Поместите шов на левой боковой стенке, соединяющей сосуды донора и реципиента. Завершите нижнюю стену, а затем переднюю стенку анастомоз.
- Выполните однослойные анастомозы, за исключением легочной артерии, где требуется двухслойный анастомоз. Свиная ткань чрезвычайно хрупкая и должна быть обработана тщательно, чтобы избежать слез. Важно отметить, что анастомоз легочной артерии является самым деликатным шагом имплантата и должен быть сделан с крайней осторожностью. Техника имплантата может быть изменена в соответствии с предпочтениями хирургов и экспериментальной конструкцией.
- После завершения всех анастомозов и теплой доза кардиоплегии доставки, как описано выше, удалить аортальный кросс-зажим. Осмотрите все анастомомы на наличие мест кровотечения, они должны быть исправлены в этот момент.
- Реперфы донорское сердце в течение 60 минут на CPB. Желудочковую аритмию можно лечить с помощью внутренней дефибрилляции (20-50 Дж). При необходимости желудочковый темп может быть использован для поддержания частоты сердечных приступов 100 ударов на мин. Антиаритмические препараты (например, амиодарон, лидокаин или сульфат магния) могут быть использованы по усмотрению следователей, если это необходимо.
- После 60 мин реперфузии вводят 1 г хлорида кальция. Инициировать отляге от CPB, уменьшая поток до половины, затем на одну четверть, а затем выключен. Центральная венозная линия может использоваться для мониторинга центрального венозного давления, ориентируясь на 10 мм рт. ст. Инициировать вливание вазоактивных и инотропных препаратов (например, добутамин, эпинефрин, норадреналин и вазопрессин) в соответствии с экспериментальной конструкции или усмотрению исследователей.
- Отлятие считается успешным, если животное поддерживает систолическое артериальное давление выше 60 мм рт. ст. после прекращения CPB. Поскольку это не модель выживания, не меняйте гепарина; непрерывное кровотечение может происходить из отверстий иглы и вскрытых структур (например, грудины). Донор сердца хорошо реагируют на небольшие и повторяющиеся дозы объемзамены с помощью системы CPB. Кроме того, свиная модель хорошо реагирует на добутамин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Управление получателем должно быть адаптировано к опыту исследователей и экспериментальному дизайну. Сердечный анестезиолог может помочь таким образом.
3. Оценка трансплантата:
- Функциональная оценка:
- Эта большая модель животных имеет то преимущество, что открытый подход груди во все времена, что облегчает прямую функциональную оценку. Для измерения сердечной контрактности используйте анализ петли давления (PV), эхокардиографию и/или правостороннюю катетеризацию.
- Давление объем петли10: Поместите пупочной ленты вокруг IVC, и вставить PV провода катетер в левый желудочек через небольшой апикальной желудочковой, чтобы позволить непрерывные измерения левого желудочка PV отношений. Получение устойчивых записей состояния для генерации зависящих от объема параметров (например, развитой работы по давлению и инсульту), а затем получить записи окклюзии в тройном режиме, окклюзии IVC для генерации параметров, не зависящих от объема (например, преднагрузка, рекрутируемые инсульта работы).
- Эхокардиография: у кардиологических анестезиологов получить эпикардиальные изображения с помощью стандартного трансэзофагеального зонда.
- Правосторонней катетеризации: Вставьте лебедей-ганц катетер через венозную оболочку, помещенную в начале процедуры и подстегнув к легочной артерии. Это позволяет измерять центральное венозное давление, давление правого желудочка, давление легочной артерии, давление клапана легочной капиллярной клина, и выход сердца используя метод терморазбавления.
- Провести обследование контрактов на базовом уровне и после 2 и 3 ч после реперфузии донорского сердца у реципиента. Это может быть изменено следователями в соответствии с экспериментальной конструкцией.
- Метаболическая оценка:
- Для метаболических оценок собирайте артериальные и венозные (альтернативно: смешанные венозные) образцы крови и храните плазму для последующего анализа. Следует также получить анализы газа крови в режиме реального времени и уровни лактата.
- Соберите эти образцы на исходном уровне у донора, перед закупкой у донора, на базовом уровне у реципиента и в 15, 30 и 60 минутре реперфузии донорского сердца (после удаления перекрестного зажима). Это может быть изменено в соответствии с экспериментальной конструкцией.
- Окончание эксперимента и эвтаназия:
- После того, как все оценки закончены, exsanguinate получателя животных в венозный резервуар цепи CPB, открыв венозной линии зажима. Кроме того, экссангинация может быть достигнута путем сбора сердечного алотрансплантата для сбора образцов (т.е. биопсии миокарда).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эта доклиническая модель успешно используется с1994 года 5,6,8,9. В таблице 1 показаны репрезентативные результаты отношений между давлением и эхокардиографическими параметрами, взятыми на базовом уровне, и 3 ч после трансплантации в наборе из 5 экспериментов. Хотя мы видим снижение миокардиальной контрактности после трансплантации, это не было статистически значимым.
На рисунке 1 показаны репрезентативные петли объемов давления, собранные в ходе одного эксперимента, в одни и те же временные точки. Во время "стабильных государственных" оценок(рисунок1, верхний ряд). регистрируются зависящие от объема параметры, такие как максимальная и минимальная скорость развитого давления. Объемно-независимые параметры получаются прерывистым окклюзией IVC. При этом объем левого желудочка постепенно уменьшается и можно рассчитать разные отношения. В среднем ряду рисунка 1мы видим, что регистрируются конечные систолические и конечные диастолические отношения давления и объема, которые представляют связь между конечным систолическим или конечным диастолическим давлением, соответственно, с соответствующими конечный диастолический объем. В нижнем ряду OD Рисунок 1, мы видим запись преднагрузки рекрутируемых инсульта работы, которая является связь между работой инсульта и соответствующего конечного диастолического объема.
Наконец, как видно на рисунке 2, различные другие метаболические (например, уровни лактата и рН) и функциональные параметры (например, выход сердца) могут быть измерены с помощью этой модели для проверки различных гипотез.
Рисунок 1 . Представитель давления объем петли в устойчивом состоянии, во время интерьера Vena Cava (IVC) окклюзии, и отношения (преднагрузка вербовка инсульта работы). (A) Один эксперимент на базовом уровне. (B) Один эксперимент после 3 ч реперфузии. PRSW - предзагрузка рекрутинговой работы инсульта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 . Тенденции лактата и рН при протоколе трансплантации сердца. После реперфузии наблюдается значительное увеличение лактата и снижение рН. Этим можно управлять путем поддержания адекватного перфузионного давления при надлежащей замене объема и вазоактивном употреблении наркотиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Базовой линии | 3 часа после трансплантации | р-значение | |
| Катетер легочной артерии | |||
| Сердечный индекс (L/min) | 3,7 и 0,8 | 2,8 и 0,3 | 0,485 |
| Анализ объемов давления | |||
| PRSW (эрг-см-3х 103) Макс dP/dt (ммГгс-1) Мин дП/дт (ммГгс-1) |
62,1 и 7 2500 и 425 -1537 и 238 |
53,8 и 10 1815 г. и 410 -1427 и 317 |
0,841 0,309 0,547 |
| Эхокардиография | |||
| LV EF (%) LV FAC (%) RV FAC (%) |
47,3 и 3,0 53,8 и 3,6 39,2 и 1,3 |
37.0 и 4.2 46,4 х 2,9 32,8 и 3,6 |
0,095 0,222 0,309 |
Таблица 1. Представительные отношения давления и объема и эхокардиографические параметры из набора из 5 трансплантаций, выполняемых на базовом уровне и после 3 ч реперфузии. Данные, представленные как средняя ошибка стандарта и по сравнению с использованием Уилкоксон Подпись ранга тест. EF и выброс фракции. FAC - изменение дробной области. LV - левый желудочек. Max dP/dt - максимальная скорость изменения давления в левом желудочке. Min dP/dt - минимальная ставка PF изменение давления в левом вентиляционном отверстии. PRSW - предзагрузка рекрутинговой работы инсульта. Р.В. и правый желудочек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Данная рукопись описывает доклиническую модель ортотопической трансплантации сердца. Различные малые животные модели гетеротопической трансплантации сердца были успешно использованы для изучения влияния новых методов лечения для улучшения сохранения органов и уменьшения ишемии-реперфузии травмы11,12, 13. Кроме того, небольшие модели животных позволяют модели выживания и долгосрочного наблюдения для исследования развития отторжения и сердечного аллотрансплантата васкулопатии11,12,13. Тем не менее, большинство из этих новых методов лечения не в или никогда не сделать его клинических испытаний. Для облегчения и рационализации клинического перевода необходима надежная и клинически актуальная модель крупного животного.
Этот протокол был разработан для изучения различных стратегий лечения и сохранения органов для предотвращения или уменьшения первичной дисфункции трансплантата и травмы ишемии-реперфузии. Как уже упоминалось выше, эта модель используется с 1994 года. Ранее авторы продемонстрировали благотворное влияние гипертонического сольника в донора8 или реципиента9 до закупки органов или имплантата, соответственно. Кроме того, авторы исследовали различные протоколы сохранения и стратегии, такие как использование донорской пролитой крови инфузий во время холодного хранения6 и эффект добавок инсулина в кардиоплегический раствор5.
Основным ограничением описанного здесь метода является краткосрочная последующая деятельности. Долгосрочная модель пересадки свиного сердца для выживания будет обнаживать ресурсы и сопряжена с высокими издержками. Описанная здесь процедура фокусируется на острой травме ишемии и реперфузии и является надежным доклиническим методом для исследования новых вмешательств, которые были протестированы и проверены в небольших экспериментальных моделях, таких как модель мурина. Кроме того, этот метод может легко адаптироваться для долгосрочных последующих экспериментов. Это будет включать в себя адекватный разворот гепарина, деканирование животных, адекватный гемостаз и закрытие груди.
Свиное сердце часто считается наиболее анатомически похожим на сердце человека при использовании моделей большого животного. Таким образом, это идеальная платформа для проведения кардиологических хирургических исследований. Тем не менее, важно отметить, что ткань, как правило, описывается как хрупкие и рыхлые, особенно в правом предсердии и легочной артерии, будучи склонны к слезам14. Кроме того, свиное сердце считается чувствительным к манипуляциям и подвержено аритмии, поэтому сульфат магния должен регулярно вводиться каждому животному в начале эксперимента. Важным отличием от свиной модели и клинической трансплантации сердца является левая гемиазиготная вена в свиней, которая стекает непосредственно в коронарную синус. Это должно быть ligated во время процедуры реципиента, чтобы избежать непрерывного кровотечения. Наконец, свиная модель очень чувствительна к ишемии, которая кажется подходящей для острых исследований при пересадке сердца15.
Управление получателями после трансплантации может быть сложной задачей в разы. Важно пересмотреть все анастомозы и не добыть кровотечения. Особенно хлопотно область вокруг задней легочной артерии. Как уже упоминалось выше, свиные ткани и хрупкие и может легко разорвать; если это произойдет, хирург может быстро вернуться на CPB, чтобы исправить проблему и попытаться отлужели еще раз. Фибрилляция желудочков обычно происходит во время первоначального реперфузии; если это не решается с простой дефибрилляции, фармакологические вмешательства, такие как 2 г сульфата магния или 1 мг/кг лидокаина, могут быть введены и следующие дефибрилляции должны быть применены. Нормальный синусовый ритм может быть легко достигнут менее чем за 3 мин.
Эта процедура требует, по крайней мере один обученный хирург, который будет выполнен; кроме того, для оптимизации протокола в каждой исследовательской группе требуется от 3 до 5 экспериментов. Кроме того, команда должна выделить одного члена для исключительного выполнения анестезии животных и управления получателем по мере необходимости (например, инотропическая поддержка). В связи с важными соображениями, касающимися описанной выше модели свинины, в этой процедуре критически важны следующие шаги: анестетик индукции и интубации (важно, чтобы избежать продления гипоксемиических периодов), сердечные манипуляции во время оценки, канистру при сердечно-легочной шунтировании, а также в правой манипуляции предсердий и легочной артерии и анастомозом. Однако, поскольку это обычные шаги, выполняемые в клинической практике, они должны осуществляться с осторожностью и вниманием к деталям. Последовательность и повторение приведет к оптимизированной и надежной модели для различных целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы не имеют подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiodarone | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Angiocath 20G | BD | 381704 | |
| Calcium Chloride 1g/10ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Cardioplegia solution | This should be chosen at the investigators discretion. | ||
| Cautery Pencil | Covidien | E2515H | |
| Central Venous Catheter double-lumen | Cook Medical | C-UDLM-501J-LSC | |
| CPB pack | Medtronic | Custom-made cardiopulmonary bypass perfusion circuit. | |
| D5W 5% 250ml | Baxter | JB1064 | |
| DLP Aortic Root Cannula/stabber | Medtronic | 12218 | |
| DLP single-lumen venous cannula (24F or 28F) | This should be chosen at the investigators discretion. | ||
| Dobutamine | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Electrode Polyhesive | Covidien | E7507 | |
| EOPA arterial cannula (17F or 21F) | This should be chosen at the investigators discretion. | ||
| Epinephrine | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Gloves, nitrile, medium | Fischer | 27-058-52 | |
| Heparin 1000 IU/ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Ketalean (Ketamine) inj. 100mg/ml, 50ml/vial | Health Canada | Requires health canada approval | |
| Lidocaine/Xylocaine 1% | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Magnesium Sulfate 5g/10ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Midazolam inj. USP 5mg/ml vial/10ml | Health Canada | Requires Health canada approval | |
| MPS Quest delivery disposable pack | Quest medical | 5001102-AS | |
| NACL 0.9% 1L | Baxter | JB1324 | |
| Organ Bag | CardioMed | 2990 | |
| Pipette Tips, 1 mL | Fisherbrand | 02-707-405 | |
| Propofol 1mg/ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Rocuronium | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Set Admin Prim NF PB W/Checkvalve | Smith Medical | 21-0442-25 | Intravenous infusion pump line. Researchers should choose infusion lines compatible with the infusion pump available at their facilities |
| Set Intro Sheath 8.5FRx 10CM | Arrow | SI-09880 | |
| Sofsilk 0 wax coated | Covidien | S316 | |
| Solumedrol 500mg/5ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Suction tip | Covidien | 8888501023 | |
| Suction Tubing 1/4" x 120" | Med-Rx | 70-8120 | |
| Suture 5.0 Prolene BB | Ethicon | 8580H | |
| Suture Prolene Blum 4-0 SH 36 | Ethicon | 8521H | |
| Sutures 2.0 Prolene Blu M SH | Ethicon | 8523H | |
| Sutures BB 4.0 Prolene | Ethicon | 8881H | |
| Tracheal Tube, 6.5mm | Mallinckrodt | 86449 |
References
- Lund, L. H., Edwards, L. B., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-third Adult Heart Transplantation Report-2016; Focus Theme: Primary Diagnostic Indications for Transplant. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1158-1169 (2016).
- Lund, L. H., Edwards, L. B., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation_ Thirty-first Official Adult Heart Transplant Report-2014; Focus Theme_ Retransplantation. The. Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 996-1008 (2014).
- Cosío Carmena, M. D. G., Gómez Bueno, M., et al. Primary graft failure after heart transplantation: characteristics in a contemporary cohort and performance of the RADIAL risk score. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 32 (12), 1187-1195 (2013).
- Fedak, P. W. M., Rao, V., et al. Combined endothelial and myocardial protection by endothelin antagonism enhances transplant allograft preservation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129 (2), 407-415 (2005).
- Ramzy, D., Rao, V., et al. Cardiac allograft preservation using donor-shed blood supplemented with L-arginine. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (10), 1665-1672 (2005).
- Rao, V., Feindel, C. M., Weisel, R. D., Boylen, P., Cohen, G. Donor blood perfusion improves myocardial recovery after heart transplantation. Journal of Heart and Lung Transplantation. 16 (6), 667-673 (1997).
- Wicomb, W. N., Cooper, D. K., Barnard, C. N. Twenty-four-hour preservation of the pig heart by a portable hypothermic perfusion system. Transplantation. 34 (5), 246-250 (1982).
- Badiwala, M. V., Ramzy, D., et al. Donor pretreatment with hypertonic saline attenuates primary allograft dysfunction: a pilot study in a porcine model. Circulation. 120, 11 Suppl 206-214 (2009).
- Ribeiro, R. V. P., Badiwala, M. V., Ramzy, D., Tumiati, L. C., Rao, V. Recipient Hypertonic Saline Infusion Prevents Cardiac Allograft Dysfunction. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. , (2018).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810 (2016).
- Ratschiller, T., Deutsch, M. -A., et al. Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice. Journal of Visualized Experiments. (102), e52907 (2015).
- Fukunaga, N., Bissoondath, V., Rao, V. Submandibular Gland-preserving Technique for Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice. Transplantation. 1, (2018).
- Gong, W. Mouse Heterotopic Abdominal Heart Transplant Model. Rodent Transplant Medicine. , Chapter 11 107-118 (2014).
- Robinson, N., Souslian, L., Gallegos, R. P., Rivard, A. L., Dalmasso, A. P., Bianco, R. W. Animal Models for Cardiac Research. Handbook of Cardiac Anatomy, Physiology, and Devices. , Chapter 27 469-491 (2015).
- Bianco, R. W., Gallegos, R. P., Rivard, A. L., Voight, J., Dalmasso, A. P. Animal Models for Cardiac Research. Handbook of Cardiac Anatomy, Physiology, and Devices. , Chapter 25 393-410 (2009).
