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Biochemistry

प्रोसिटोम एकल अणु स्तर पर लेबलिंग एकरूपता का व्यापक परिमाणन

Published: April 19, 2019 doi: 10.3791/59199
Automatic Translation
1,2, 2, 1,3
1Laboratory for Cell Systems Control, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, RIKEN, 2Laboratoire de Biomatériaux et Bioimagerie, INSERM, 3PRESTO, Japan Science and Technology Agency

Summary

यहाँ, हम एकल अणु स्तर पर एक जटिल प्रोटीन नमूने में प्रत्येक प्रोटीन प्रजातियों के लिए लेबलिंग एकरूपता का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

सेल proteomes अक्सर वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करने की विशेषता है assays हैं, जहां कोशिकाओं में प्रोटीन की सभी प्रजातियों के गैर विशेष रूप से एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल रहे है और एक photodetector द्वारा उनके अलगाव के बाद देखा जाता है । एकल अणु प्रतिदीप्ति इमेजिंग व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट अणुओं visualizing के लिए अपनी क्षमता के साथ ultrasensitive प्रोटीन का पता लगाने प्रदान कर सकते हैं । हालांकि, इस शक्तिशाली इमेजिंग विधि के आवेदन के लिए वैद्युतकणसंचलन assays हैं, तरीकों की कमी से proteome भर में प्रत्येक प्रोटीन प्रजातियों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग की एकरूपता विशेषता के लिए बाधा है । यहाँ, हम एक एकल अणु प्रतिदीप्ति इमेजिंग परख के आधार पर proteome भर में लेबलिंग एकरूपता का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि विकसित की है । हमारी माप में एक HeLa सेल नमूना का उपयोग कर, प्रोटीन का अनुपात कम से एक डाई, जो हम ' करार लेबलिंग (लो) के साथ लेबल, ५०% से ९०% करने के लिए सीमा निर्धारित किया गया था, एकल अणु इमेजिंग के आवेदन की उच्च क्षमता का समर्थन संवेदनशील और सटीक proteome विश्लेषण ।

Introduction

प्रोटियोम विश्लेषण, जिसका उद्देश्य कोशिका में व्यक्त किए गए प्रोटीन अणुओं के पूरे सेट का आकलन करना है, वर्तमान जैविक और औषधीय अध्ययनों में एक मूल्यवान दृष्टिकोण है । यह विश्लेषण सामान्यतः मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर निर्भर करता है, जो प्रोटीन आयनीकरण1,2,3के माध्यम से उत्पन्न स्पेक्ट्रा पर आधारित प्रोटीन प्रजातियों की पहचान करता है | प्रोटोसोम विश्लेषण के लिए एक वैकल्पिक विधि इलेक्ट्रोफोरेसिस है, polyacrylamide जेल सहित इलेक्ट्रोफोरेसिस (पृष्ठ), केशिका वैद्युतशिराजनन और द्वि आयामी (2D) जेल वैद्युतजनन । इस विधि का विश्लेषण कोशिकाओं में सभी प्रोटीन अणुओं के गैर विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग पर निर्भर करता है, electrophoretic जुदाई और पहचान और प्रत्येक प्रोटीन प्रजातियों की मात्रा का पालन द्वारा पीछा किया । आवश्यक गैर विशिष्ट प्रोटीन लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए, एक रणनीति के लिए फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करना है जो इलेक्ट्रोस्टेटिक और हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के माध्यम से प्रोटीन को बांध सकते हैं, जैसे कि coomassie ब्लू और sypro-रूबी4,5,6 . एक वैकल्पिक रणनीति के लिए N-hydroxysuccimide (एनएचएस) एस्टर या maleimide युक्त रंगों के साथ सहसंयोजक लेबलिंग का उपयोग करें, जो प्राथमिक ऐमीन और thiols, जैसे आम अवशेषों के माध्यम से प्रोटीन को covalently क्रमशः7, बांध सकते है ८।

इस बीच, फ्लोरेसेंस डिटेक्शन की संवेदनशीलता कम प्रचुरता वाले प्रोटीन और कोशिकाओं की छोटी संख्या का विश्लेषण करने के लिए आदर्श है । एकल अणु प्रतिदीप्ति इमेजिंग सबसे संवेदनशील तरीकों में से एक है जो व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट रंगों और लेबल वाले प्रोटीनों का विट्रो में पता लगाने की अनुमति देता है और वीवो9,10,11,12, 13,14,15. इस इमेजिंग विधि के इलेक्ट्रोफोरेसिस आधारित proteome विश्लेषण करने के लिए आवेदन करने के लिए सक्षम होने की उंमीद है अत्यधिक संवेदनशील और मात्रात्मक assays हैं, व्यक्तिगत fluorescently-लेबल प्रोटीन की गणना । हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबलिंग सभी प्रोटीन अणुओं के पार काफी सजातीय है, और कैसे इस एकरूपता अलग प्रोटीन प्रजातियों से प्रभावित है (चित्रा 1) । साधारण थोक समाधान मापन का उपयोग ' युग्मन दक्षता '8 या ' लेबलिंग दक्षता ' नामक प्रोटीन के लिए फ्लोरोसेंट रंगों का मोलर अनुपात प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन यह गुण लेबलिंग की एकरूपता के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है प्रोटीन अणु ।

यहां, हम एक परख के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए सेल में सभी प्रोटीन प्रजातियों के लिए लेबलिंग एकरूपता की जांच (चित्रा 2)16। इस परख के दो प्रमुख कदम प्रोटीन शुद्धि और इमेजिंग हैं । पहले चरण में, कोशिकाओं में सभी प्रोटीन fluorescently लेबल और biotinylated कर रहे हैं, तो अलग से जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर निकाला electroelल्यूशन के बाद. दूसरे चरण में, निकाले गए नमूनों में वैयक्तिक प्रोटीन अणुओं के प्रतिदीप्ति गुणों का एकल अणु इमेजिंग के आधार पर मूल्यांकन किया जाता है । इस डेटा से, गिनती विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर, जैसे कि प्रोटीन का प्रतिशत कम एक डाई के साथ लेबल किया गया है, जिसे हम लेबलिंग ऑक्यूपेंसी (LO)16कहते हैं, और एक एकल प्रोटीन अणु से बंधे फ्लोरोसेंट रंगों की औसत संख्या (n̄ डाई), विशेषता हो सकती है । प्रोटोकॉल में, एनएचए एस्टर आधारित सायनिन 3 (Cy3) डाई के साथ वाघेला सेल प्रोटीटोम लेबलिंग के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया को एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और वांछित अनुसंधान लक्ष्यों के अनुसार अन्य लेबलिंग प्रक्रियाओं के साथ संशोधित किया जा सकता है ।

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Protocol

1. सेल तैयारी

  1. HeLa कोशिकाओं को 10 सेमी पकवान में ३७ डिग्री सेल्सियस में 5% के तहत2 Dulbecco संशोधित ईगल के मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त में खेती ।
  2. एक बार वे ७०% प्रवाह तक पहुंच गए हैं, एटीसीसी के निर्देशों का पालन करतेहुए तेजी से बढ़ रहे कक्षों को एकत्र करें ।
    1. 1x फॉस्फेट buffered खारा (PBS) (पीएच ७.४) के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला । PBS निकालें ।
    2. ०.१% trypsin-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 1 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट सेते ।
    3. माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिका वियोजन की प्रगति की निगरानी ।
    4. एक बार कोशिकाओं दौर हो और पकवान से अलग कर रहे हैं, वृद्धि के माध्यम से 4 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और pipetting द्वारा कोशिका ढेर तोड़ ।
    5. किसी कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की संख्या गिनना ।
    6. एक सेंट्रलाइज ट्यूब में 10 मिनट के लिए १५० एक्स जी पर अपकेंद्रित्र । मध्यम निकालें और 1x PBS (पीएच ७.४) के 5 मिलीलीटर के साथ सेल गोली resuspend ।
    7. दोहराएं कदम 1.2.6 । 1x PBS (pH ७.४) में कक्षों को 106 कक्षों की अंतिम सांद्रता में पुन: निलंबित करें/
      ध्यान दें: सेल निलंबन को aliquoted किया जा सकता है और कई महीनों के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । फ्रीज/पिघलना चक्र को दोहराने से बचना चाहिए ।

2. सेल lysis और फ्लोरोसेंट लेबलिंग

  1. Lysing बफर के 10 मिलीलीटर (०.१ मीटर बोरेट, 1% सोडियम डोडेरिल सल्फेट (एसडीएस) और 1% बीच 20) बनाओ । पीएच 12 को समायोजित 2 एम NaOH का उपयोग कर ।
    चेतावनी: ध्यान केंद्रित NaOH संक्षारक है । इस घोल को तैयार करते समय उपयुक्त दस्ताने और चश्मा पहनें ।
    नोट: Lysing बफर कमरे के तापमान पर अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है ।
  2. 1-----------------------------------------------------------------------------५० १००
  3. चरण २.२ से मिश्रित lysing बफर के साथ सेल संस्कृति (लगभग १,००० कोशिकाओं) के 1 μL मिक्स । धीरे से बुलबुले से बचने के pipetting द्वारा समाधान homogenize । कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट । धीरे pipetting द्वारा समाधान फिर से homogenize ।
  4. 2 μg/mL Cy3 एनएचएस-एस्टर डाई के 1 μL जोड़ें । धीरे से बुलबुले से बचने के pipetting द्वारा समाधान homogenize । कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर अंधेरे में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    नोट: इस बफर के उच्च पीएच का कारण बनता है प्रोटीन में lysine अवशेषों के बेअसर, एक उच्च अभिक्रियाशीलता के लिए अग्रणी ।
  5. 2 माइक्रोग्राम/एमएल Cy3 एनएचएस-एस्टर डाई के 1 μL के अलावा दोहराएं । धीरे से बुलबुले से बचने के pipetting द्वारा समाधान homogenize । कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए सेक्यूबेट ।
    नोट: राष्ट्रीय राजमार्गों के इस बार इसके अलावा-एस्टर डाई लेबलिंग दक्षता में वृद्धि कर सकते हैं क्योंकि कुछ Cy3 NHS-एस्टर डाई hydrolyzed और प्रतिक्रिया बफर के उच्च पीएच द्वारा निष्क्रिय है ।
  6. ०.८ मीटर 4 के १०० μL जोड़कर पीएच ७.२ को समायोजित-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES)-NaOH पीएच ७.२ प्रतिक्रिया बुझाने के लिए । धीरे से बुलबुले से बचने के pipetting द्वारा समाधान homogenize ।
  7. 19 मिलीग्राम/एमएल बायोटिन की 20 μL जोड़ें-(पॉलिएथिलीन ग्लाइकोल (पीईजी))2-एमाइन और 20 मिलीग्राम/एमएल 1-एथिल-3-(3-डाइमेथीलैनोप्रोपोल) कार्बोडाइइमाइड (ईडीसी) की 5 μl । धीरे से बुलबुले से बचने के pipetting द्वारा समाधान homogenize । कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर अंधेरे में 1 ज के लिए सेते ।
    नोट: यह biotinylation कदम एक निश्चित घनत्व पर एक माइक्रोस्कोप coverslip पर प्रोटीन अणुओं को ठीक करने के लिए और प्रोटीन प्रजातियों के लिए कोई पूर्वाग्रह के साथ आवश्यक है ।
  8. Unreacted लेबलिंग अभिकर्मकों निकालें और निर्माता के निर्देशों का पालन, 10 केडीए कट बंद के साथ एक ultraनिस्यंदन स्तंभ का उपयोग कर नमूना ध्यान केंद्रित ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । नमूना कई हफ्तों के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

3. प्रोटोम जुदाई और वसूली

  1. 4x एसडीएस नमूना बफर जोड़ें (२०० मिमी Tris-HCl पीएच ६.८, 4% एसडीएस, 4% ग्लिसरॉल और ०.४% ब्रोमोफीनॉल नीला) ।
    नोट: डाई क्षति से बचने के लिए, प्रोटीन नमूना मानक SDS-पृष्ठ में किया के रूप में गर्म नहीं किया जाना चाहिए, और कमरे के तापमान पर रखा जाना चाहिए ।
  2. प्रोटीन नमूना और एक आणविक सीढ़ी के लिए मानक एसडीएस-पृष्ठ प्रदर्शन, 20% एक्रिलामाइड जेल का उपयोग. एक स्थिर वोल्टेज पर जेल में नमूना माइग्रेट (१६० V) जब तक माइग्रेशन सामने बस जेल से बाहर निकालता है ।
  3. छवि जेल प्रोटीन बैंड के स्थान की पहचान करने के लिए (चित्रा 3) ।
  4. बैंड स्थानों पर आधारित, एक तेज ब्लेड का उपयोग कर ब्याज के प्रोटीन भागों सहित जेल भागों में कटौती । 16, 23, ५५ और १२० केडीए चोटियों पर प्रभातफेशनिंग, और 19-25, 25 – 32, 32 – 42, 42 – 54, 54 – 69, 69 – 97, 97 – 136 और 136 – 226 केडीए क्षेत्रों में चित्र 3में दिखाया गया है ।
  5. 6 – 8 केडीए के ताकना आकार के साथ electroelution द्वारा एक अपोहक का उपयोग कर प्रोटीन निकालने, निर्माता के निर्देशों का पालन.
    नोट: निकाले गए नमूने-८० डिग्री सेल्सियस पर कई हफ्तों के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।

4. माइक्रोस्कोप coverslip तैयारी

  1. प्रत्येक नमूने के लिए avidin बफर के २०० μl (5 मिमी hepes-naoh पीएच ७.२, 10 एनजी/एमएल avidin और 2 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA)) तैयार करते हैं ।
  2. 22 मिमी x 22 मिमी और ०.१५ मिमी मोटाई के coverslips तैयार करते हैं. हवा प्लाज्मा के लिए coverslips 1 मिनट के लिए एक प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग करने के लिए साफ और उनके सतहों को सक्रिय करें ।
  3. कोट avidin के साथ स्पिन-कोटिंग २०० μl avidin बफर के साथ 5 सेकंड के लिए ५०० rpm पर एक स्पिन विलेपक का उपयोग कर, १,००० rpm पर 30 सेकंड के बाद । कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए coverslips सेते उंहें सूख जाने के लिए ।
  4. प्रोटीन के नमूने के लिए coverslips तैयार करते हैं ।
    1. 5 मिमी HEPES-NaOH पीएच ७.२ में (३.५ से) १०० बार प्रोटीन के नमूने पतला ।
    2. जगह १०० (चरण ४.३ से) avidin लेपित coverslip के केंद्र में सतह पर पतला नमूना के μL ।
    3. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अंधेरे में सेते ।
  5. सकारात्मक नियंत्रण तैयार करें ।
    1. प्लेस १०० μl की 10 एनजी/एमएल शुद्ध फ्लोरोसेंट बायोटिन में 5 मिमी hepes-naoh पीएच ७.२ avidin लेपित coverslip के केंद्र में (से कदम ४.३) ।
    2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अंधेरे में सेते ।
      नोट: यह सकारात्मक नियंत्रण coverslip avidin बाध्यकारी धब्बे, जो लो की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है के घनत्व प्रदान करता है ।
  6. नेगेटिव कंट्रोल की तैयारी करें ।
    1. स्पिन-कोट प्लाज्मा 5 मिमी HEPES की २०० μL के साथ coverslip साफ-NaOH और 2 मिलीग्राम/
    2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेक्यूबेट शुष्क करने के लिए ।
    3. 5 मिमी HEPES-NaOH पीएच ७.२ में 10 एनजी/एमएल शुद्ध फ्लोरोसेंट बायोटिन के १०० μL जोड़ें ।
    4. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अंधेरे में सेते ।
      नोट: इस नकारात्मक नियंत्रण coverslip avidin बिना coverslip के लिए फ्लोरोसेंट बायोटिन की गैर विशिष्ट बाध्यकारी की राशि प्रदान करता है ।
  7. Coverslip के किनारों पर pipetting द्वारा आसुत जल के २०० μL के साथ प्रत्येक coverslip कुल्ला ताकि टिप के साथ coverslip के बीच में स्पर्श नहीं है । इस वॉश को तीन बार दोहराएं ।
    ध्यान दें: coverslip पर पानी aspirating के बाद, पानी तुरंत वापस करने के लिए यह पूरी तरह से बाहर सुखाने से रोकने के लिए coverslip पर रखा जाना चाहिए ।
  8. ४.२ कदम के रूप में coverslips की एक ही संख्या के लिए हवा प्लाज्मा बेनकाब ।
  9. सुखाने से बचने के लिए चरण ४.७ से नमूना-बाउंड coverslip पर साफ coverslip रखें ।

5. एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ अवलोकन

  1. एक चौड़े क्षेत्र या शीघ्रलोपी क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप शुरू करो ।
    चेतावनी: प्रत्यक्ष या बिखरे हुए लेजर विकिरण आंख या त्वचा के नुकसान का कारण बन सकता है । उपयुक्त सुरक्षात्मक चश्में पहनें और लेजर प्रकाश पथ ढाल ।
    नोट: माइक्रोस्कोप सेटअप के लिए, कृपया हमारे पिछले प्रकाशन16को देखें । संक्षेप में, एक व्यापक क्षेत्र या शीघ्रलोपी क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप एक उच्च शक्ति के साथ सुसज्जित ४८८ एनएम लेजर उत्तेजना, एक उच्च संख्यात्मक छिद्र उद्देश्य लेंस और एक उच्च संवेदनशीलता कैमरा इस माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, एक स्वचालित मापन के लिए, एक कंप्यूटर नियंत्रित XY स्थानांतरीय नमूना चरण, लेजर excitations के लिए यांत्रिक बंद और एक ऑटो-फोकसन प्रणाली स्थापित करने के लिए सिफारिश की है ।
  2. कोवर्लिप को माइक्रोस्कोप पर सेट करें और फ़ोकस ढूंढें ।
  3. न्यूनतम १०० छवियां प्राप्त करने के लिए एक टाइल स्कैन निष्पादित करें ।
    नोट: लेजर रोशनी यांत्रिक शटर के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए केवल जब कैमरे के साथ छवियों की रिकॉर्डिंग, photobleaching को कम करने के लिए नमूने को उजागर किया जाना है । कई नमूने हैं, तो माइक्रोस्कोप उपकरणों को नियंत्रित करने के लिए एक कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग कर स्वचालित माप की सिफारिश की है । प्रत्येक छवि आमतौर पर 100-500 एकल अणु स्पॉट जब एक 60x उद्देश्य लेंस का उपयोग भी शामिल है ।

6. छवि विश्लेषण और जानकारी के निष्कर्षण

  1. छवि लेजर रोशनी पैटर्न के कारण विषमता है, तो यह18सही करने के लिए छवि प्रसंस्करण बाहर ले ।
    1. कदम ५.३ के रूप में एक ही सेटिंग का उपयोग कर एक समान रूप से फैले रंगों से मिलकर एक coverslip नमूना के साथ मापने के द्वारा एक संदर्भ छवि प्राप्त.
    2. एक ही कैमरा सेटिंग का उपयोग कर कोई लेज़र उत्तेजना के साथ मापने के द्वारा एक ऑफसेट छवि प्राप्त.
    3. प्रत्येक नमूना छवि और ऑफ़सेट छवि के मान के साथ संदर्भ छवि में प्रत्येक पिक्सेल मान घटाएं ।
    4. प्रत्येक पिक्सेल मान को घटाया गया संदर्भ छवि के मान द्वारा घटाया गया नमूना चित्रों में विभाजित कर दें.
  2. ठीक से अधिग्रहीत छवियों को इकट्ठा करने और छवि पृष्ठभूमि को हटा दें ।
    1. मैंयुअल रूप से बड़े फ्लोरोसेंट समुच्चय युक्त छवियों को हटा दें ।
    2. ImageJ20का उपयोग कर ५० पिक्सेल की एक गेंद त्रिज्या के साथ रोलिंग-बॉल एल्गोरिथ्म19 लागू करने से छवि पृष्ठभूमि निकालें ।
    3. ImageJ (छवि समारोह पैनापन) का उपयोग कर धुंधला छवियों को घटाकर छवियों पैनापन ।
  3. ढूंढें और छवियों में एकल अणु धब्बे का विश्लेषण ।
    1. ImageJ का उपयोग कर येन दहलीज एल्गोरिथ्म21 के साथ एकल अणु स्थानों की पहचान ।
    2. ImageJ (ROI प्रबंधक) का उपयोग करके प्रोटीन की एग्रीगेटर को बाहर करने के लिए कैमरे के गहरे शोर को बाहर करने के लिए दो पिक्सेल से कम और 20 पिक्सेल से अधिक वाले धब्बे फ़िल्टर करें ।
    3. प्रत्येक छवि में स्थानों की संख्या की गणना । रोशनी सही छवियों का उपयोग (कदम 6.1.4), हर जगह ImageJ प्रयोग के लिए पिक्सल के भीतर कुल तीव्रता का विश्लेषण ।
  4. निम्न सूत्र का उपयोग करके लेबलिंग ऑक्यूपेंसी (LO) की गणना करें:
    LO = (नमूने में गिना जाता है की संख्या/सकारात्मक नियंत्रण में गिनती की संख्या) x १००
  5. एक ही प्रोटीन अणु (n̄रंजक) से बंधे फ्लोरोसेंट रंगों की औसत संख्या की गणना ।
    1. प्रत्येक स्थान की तीव्रता के हिस्टोग्राम का विश्लेषण करें ।
      नोट: हिस्टोग्राम आमतौर पर कई चोटियों है, और हर चोटी डाई एक प्रोटीन के लिए बाध्य अणुओं की एक अलग संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । हिस्टोग्राम में पहली, दूसरी और तीसरी चोटी क्रमशः 1, 2 और 3 अणुओं से मेल खाती है ।
    2. हिस्टोग्राम से औसत तीव्रता परिकलित करें । इसके अलावा एक गाऊसी फिटिंग लागू करने से पहली चोटी की चोटी की तीव्रता की गणना ।
    3. शीर्ष तीव्रता के साथ औसत तीव्रता विभाजित करके n̄डाई की गणना ।

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Representative Results

4 चित्रा HeLa सेल lysate से प्रोटीन के विभिंन आणविक वजन भागों के लिए कच्चे छवि डेटा का प्रतिनिधित्व करता है, साथ ही साथ सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण । जबकि दोनों प्रोटीन नमूना और सकारात्मक नियंत्रण प्रदर्शनी प्रति छवि 100-500 स्पॉट, नकारात्मक नियंत्रण प्रदर्शित करता है कि प्रोटोकॉल पर्याप्त coverslip सतह के लिए रंग की गैर विशिष्ट बंधन को रोकता है कि कोई भी या कुछ स्थानों, दिखा रहा है । हाजिर प्रोटीन नमूनों के लिए तीव्रता histograms और सकारात्मक नियंत्रण कई चोटियों वर्तमान, प्रोटीन और avidin tetramer संरचनाओं22में प्राथमिक ऐमीन को रंगों के प्रसंभाव्य बंधन का प्रतिनिधित्व, क्रमशः । सभी स्पॉट निरंतर लेजर उत्तेजना के साथ निमिष और पदश: photobleaching दिखाया, एकल अणु स्तर पर अवलोकन पर प्रकाश डाला (चित्रा 5a, बी).

LO सकारात्मक नियंत्रण में है कि हर प्रोटीन के नमूने में धब्बे की संख्या के अनुपात से गणना की है । वाघेला सेल lysate नमूने से मापा लो उच्च आणविक वजन (१२० केडीए) अंश के लिए ९०% करने के लिए छोटे आणविक वजन (16 केडीए) अंश के लिए ५०% से लेकर और जुदाई के बिना पूरे proteome नमूने के लिए ७२% था (चित्रा 6) । तदनुसार, n̄डाई बढ़ते आणविक वजन के साथ वृद्धि करने के लिए खड़ा है । इन बढ़ती प्रवृत्तियों lysine अवशेषों की अधिक संख्या के कारण होने के लिए माना जाता है, बढ़ एनएचएस-एस्टर डाई बाइंडिंग के लिए अग्रणी । उदाहरण के लिए, 23 केडीए अंश इस अंश में निहित हिस्टोन प्रोटीन में lysine अवशेषों की बड़ी संख्या की वजह से एक उच्च लो मूल्य है ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटीन संख्या गिनती पर proteome लेबलिंग एकरूपता का प्रभाव । प्रोटीन गिनती संख्या पर अत्यधिक निर्भर है कि कैसे दृढ़ता से और homogeneously प्रोटीन अणुओं, बजाय रंगों को प्रोटीन की संख्या अनुपात लेबल रहे हैं । एकरूपता एक पैरामीटर का उपयोग कर बनाया जा सकता है लेबलिंग आक्यूपेंसी (लो) है, जो कुल प्रोटीन अणुओं के खिलाफ लेबल प्रोटीन अणुओं की संभावना को परिभाषित करता है । यह मान प्रोटीन गिनती की दक्षता प्रदान करता है (यानी, उच्च लो पैदावार उच्च गिनती संख्या (बाएं) और इसके विपरीत (दाएं)). जबकि १००% की एक LO मूल्य आदर्श है, के लो < 100% निरपेक्ष प्रोटीन संख्या का अनुमान लगाने के लिए एक क्षीणन कारक प्रदान कर सकते हैं । यह आंकड़ा Leclerc एट अल.16 कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कार्यप्रवाह परख । पहला, एक निश्चित घनत्व प्राप्त करने के लिए coverslips (ए) और (बी) avidin के साथ इलाज कर रहे हैं । दूसरे, fluorescently-लेबल नमूना प्रोटीन biotinylated और coverslip के लिए संलग्न कर रहे हैं (ए) avidin-biotin बातचीत के माध्यम से. समानांतर, लगभग १००% fluorescently-लेबल शुद्ध बायोटिन coverslip पर immobilized है (ख). तीसरा, प्रतिदीप्ति धब्बों की संख्या और चमक वितरण को प्राप्त करने के लिए coverslips एकल अणु फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged हैं । अंत में, एकरूपता पैरामीटर, लो, (ख) में (क) में हाजिर संख्या के अनुपात से गणना की है । यह आंकड़ा Leclerc एट अल.16 कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक HeLa सेल proteome नमूना का पृथक्करण एसडीएस-पृष्ठ का उपयोग कर । Fluorescently लेबल और biotinylated सेल lysate दो अलग जैल पर चले गए थे (20% acrylamide), और प्रोटीन जेल दर्शक का उपयोग कल्पना, एक 5 मिनट और जेल 1 और जेल 2, क्रमशः के लिए 10 मिनट जोखिम समय के साथ । लाल बक्से जेल क्षेत्रों है कि बाहर काट रहे थे और निकाले प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा Leclerc एट अल.16 कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 प्रोटोम नमूनों की एकल अणु छवियों. प्रतिदीप्ति स्थान छवियां (बाएं) और स्पॉट तीव्रता के histograms (दाएं) अलग आणविक वजन proteome भागों से प्राप्त की । स्केल बार 10 μm है । सकारात्मक नियंत्रण में तीर avidin के विभिन्न लेबलिंग कदम से संकेत मिलता है । यह आंकड़ा Leclerc एट अल.16 कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: फ्लोरोसेंट स्पॉट्स का फोटोब्लीचिंग । (क) सतत लेजर उत्तेजन के अंतर्गत फ्लोरोसेंट स्पॉट्स की समय-व्यतीत छवियां । (ख) विभिन्न स्थानों पर प्रतिदीप्ति तीव्रताओं के समय के निशान । निशान या तो एक या दो कदम photobleaching दिखाने के लिए, रंगों की संबंधित संख्या का संकेत शुद्ध बीएसए नमूने के स्थान पर प्रोटीन को युग्मित थे । यह आंकड़ा Leclerc एट अल.16 कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: प्रोटोम नमूनों की लेबलिंग एकरूपता । लो (नीला) और n̄डाई (गहरे लाल) विभिन्न आणविक वजन भागों से प्राप्त की । आंकड़े ± एसई ९८ मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, ४६, 27, ७७, ४४, ३९, ६२, १०१, ६५, ६२, ८२, ६१ और ७० छवियों पूरे सेल lysate के लिए विश्लेषण किया गया, 16, 23, ५५, १२०, 19 – 25, 25 – 32, 32 – 42, 42 – 54, 54 – 69, 69 – 97, 97 – 136 और 136 – 226 केडीए भिंनों क्रमशः. यह आंकड़ा Leclerc एट अल.16 कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह कागज SDS-PAGE (चरण 3) के साथ अलगाव के बाद कोशिकाओं में प्रत्येक लेबल प्रोटीन प्रजातियों की लेबलिंग एकरूपता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । पृथक्करण पद्धति को तरल क्रोमेटोग्राफी या केशिका वैद्युतजनन के रूप में अन्य विधियों से प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जो उच्च विभेदन के साथ सेलुलर प्रोटीनों के पृथक्करण और प्रभाजनकी अनुमति देते हैं, जबकि विशेष उपस्कर की आवश्यकता होती है । वर्तमान प्रोटोकॉल में एनएचएस-एस्टर का उपयोग करते हुए लेबलिंग विधि को maleimide-एस्टर या एंटीबॉडी, उदाहरण के लिए, का उपयोग करके अन्य विधियों से प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।

लेबलिंग एकरूपता विश्लेषण के लिए आवश्यकता पर निर्भर करता है कितना लेबलिंग एक सरल यादृच्छिक प्रक्रिया से भटक, के रूप में युग्मन दक्षता विश्लेषण में माना जाता है । हमारे हाल के अध्ययन16 संकेत दिया है कि एन एच एस-एस्टर प्रोटीन की लेबलिंग एक यादृच्छिक प्रक्रिया जैसे पीएच और डिटर्जेंट के रूप में प्रतिक्रिया की स्थिति पर निर्भर करता है से भटक । हमने देखा है कि कुछ शर्तों प्रोटीन के लिए रंजक के सहकारी बंधन या अधूरा घुलनशीलता के कारण गैर-प्रतिक्रियाशील प्रोटीन के एक अंश के अस्तित्व या डाई के लिए लगाव कम करने से विषमता प्रेरित । इसके विपरीत, अंय शर्तों को डाई करने के लिए एक प्रोटीन के भीतर प्रतिक्रियाशील अवशेषों की पूरी बंधन द्वारा विषमता कम ।

हम मानते है कि पीएच लेबलिंग homogeneity पर सबसे प्रभावशाली कारकों में से एक है । उच्च पीएच प्रोटीन में lysine अवशेषों के बेअसर कारण, एनएचएस एस्टर डाई के साथ एक उच्च अभिक्रियाशीलता के लिए अग्रणी कर सकते हैं । इसके अलावा, उच्च पीएच कोशिका lysis पैदा कर सकते है और प्रोटीन denature कर सकते हैं । हालांकि, के बाद से उच्च पीएच प्रोटीन का आरोप नकारात्मक बनाता है और कुछ प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं है जैसे समविभव इलेक्ट्रोफोरेसिस या 2d वैद्युतकणसंचलन, पीएच हालत ध्यान से अनुसंधान के उद्देश्य के आधार पर विचार करने की जरूरत है ।

ठीक परख में लेबलिंग एकरूपता को मापने के लिए, यह पर्याप्त biotinylated प्रोटीन नमूने का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह इसलिए है क्योंकि परख मान लिया गया है कि संतृप्तता coverslip पर हर avidin अणु को संतृप्ति के साथ बांध, और लो के कम अनुमान में अपर्याप्त प्रोटीन एकाग्रता परिणाम है । हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि आम तौर पर अधिक से अधिक 10 प्रोटीन के स्नातकोत्तर संतृप्त बाध्यकारी के लिए आवश्यक है, और यह चारों ओर से प्राप्त किया जा सकता है १,००० HeLa कोशिकाओं24, यहां तक कि fractionation के बाद । यह प्रोटीन के नमूने के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला बनाने के avidin धब्बे की संतृप्ति की पुष्टि की सिफारिश की है । हम यह भी ध्यान दें कि coverslip पर avidin घनत्व इतनी के रूप में दर्ज की छवियों में धब्बे के बीच overlaps कारण नहीं करने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है, जबकि सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त स्थान संख्या दे रही है ।

यह परख मानता है कि coverslip पर एक tetravalent avidin अणु22 एक प्रोटीन बांध कर सकते हैं । दरअसल, हमारे पिछले अध्ययन में सकारात्मक नियंत्रण डेटा ने संकेत दिया कि एक avidin अणु अप करने के लिए बाध्य कर सकते है चार fluorescently लेबल biotins, लेकिन बहुमत (५५%) एविदीन अणु केवल एक या दो बायोटिन के अणुओं को बाँध देते हैं । चूंकि प्रोटीन बायोटिन से बड़े होते हैं, इसलिए उनके स्टेरिक प्रभावों के परिणामस्वरूप कम प्रोटीन एक एविडिन से अधिक होता है । हमारी धारणा आगे तथ्य यह है कि n̄डाई लगातार रहता है जब अलग अनुपात16में लेबल और बिना लेबल प्रोटीन के मिश्रित नमूनों को मापने द्वारा समर्थित है ।

प्रोटीन प्रजातियों के आधार पर, coverslip के लिए प्रोटीन की अविशिष्ट बाध्यकारी भी एक BSA कोटिंग के साथ काफी हो सकता है । यदि यह मामला है, एक विकल्प है जहां biotinylated प्रोटीन avidin बिना coverslip पर लेपित रहे है एक नियंत्रण को मापने के लिए, बजाय 4.6.3 कदम पर फ्लोरोसेंट बायोटिन की हो सकती है । लो पर अविशिष्ट जिल्द के प्रभाव को गणितीय रूप से इस नियंत्रण के धब्बे की संख्या को घटाकर प्रोटीन प्रतिदर्श से समाप्त किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल proteome व्यापक एकल अणु प्रोटीन गिनती विश्लेषण के लिए अमूल्य होगा । एकल अणु संवेदनशीलता प्रत्येक प्रोटीन प्रजातियों के लिए प्रोटीन की मात्रा के विश्लेषण की अनुमति देता है, चाहे वे25सेल में उनकी बहुतायत हो । यह प्रोटीम पृथक्करण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है और इसके बाद प्रोटीन के साथ मिलकर प्रतिदीप्ति धब्बों की संख्या का परिमाण निर्धारित कर सकते हैं । इसके अलावा, उच्च संवेदनशीलता भी एकल कोशिका विश्लेषण की अनुमति देगा, शोधकर्ताओं को सक्षम करने के लिए कोशिका आबादी में विषमता की जांच करने के लिए और सेलुलर राज्यों के क्लस्टरिंग करने के लिए25,26.

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Disclosures

लेखक निंनलिखित प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित (s) की घोषणा: RIKEN एस. एल. के साथ इन परिणामों पर एक पेटेंट आवेदन दायर किया है और सह के रूप में नाम-अंवेषकों Y.T. ।

Acknowledgments

लेखक प्रयोगात्मक सहायता और सलाह के लिए Masae Ohno और Kazuya निशिमुरा धंयवाद । यह काम PRESTO (JPMJPR15F7), जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी द्वारा समर्थित किया गया था, युवा वैज्ञानिकों के लिए सहायता अनुदान (ए) (२४६८७०२२), चुनौतीपूर्ण अन्वेषणात्मक अनुसंधान (२६६५००५५), और अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान (२३११५००५), जापान समाज के लिए विज्ञान के संवर्धन, और Takeda विज्ञान फाउंडेशन और चिकित्सा और औषधीय अनुसंधान के लिए Mochida मेमोरियल फाउंडेशन से अनुदान द्वारा । एसएल RIKEN अंतर्राष्ट्रीय कार्यक्रम एसोसिएट (आईपीए) कार्यक्रम से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22x22x0.15 mm coverslip VWR 470019-004
488 nm Argon laser Coherent Innova 70C
488 nm dichroic mirror Semrock FF495-Di03
488 nm emission filter Semrock FF02-520/28
560 nm dichroic filter Semrock Di02-R561
560 nm emission filter Semrock FF02-617/73
560 nm fiber laser MBP Communications F-04306-2
60x oil immersion lens Olympus PLAPON 60x
Avidin Nacalai-tesque 03553-64
Biotin-PEG-amine Thermo Scientific 21346
Biotinylated Alexa Fluor 488 Nanocs
Borate Nacalai-tesque
BSA Sigma-Aldrich A9547
CHAPS Dojindo C008-10
Cy3 NHS-ester dye GE Healthcare PA13101
Dialyzer  - D-tube, 6-8 kDa Merck Millipore 71507-M
DMEM Sigma-Aldrich
DTT Nacalai-tesque 14112-94
EDC Nacalai-tesque
EMCCD camera Andor IiXon 897
Epi fluorescence microscope Olympus IX81
Gel viewer GE Healthcare ImageQuant LAS 4000
Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix Gibco
Plasma cleaner Diener Electronic
SDS Wako NC0792960
Size purification column 10K Merck Millipore UFC5010
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416

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References

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Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level. J. Vis. Exp. (146), e59199, doi:10.3791/59199 (2019).

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