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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

脑干中的数据采集与分析 在小鼠中引发响应音频测量

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59200
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 3, 4, 5, 5, 6, 1,7, 1, 1
1Experimental Neuropsychopharmacology, Federal Institute for Drugs and Medical Devices, 2KBRwyle GmbH, 3Cognitive Neurophysiology, Department of Psychiatry and Psychotherapy, Faculty of Medicine, University of Cologne, 4Molecular and Cellular Cognition, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 5Institute of Neurophysiology, Faculty of Medicine, University of Cologne, 6Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM), 7Thescon GmbH

Summary

脑干引起反应听力测定是临床神经生理学的重要工具。如今,脑干引起反应听力学也应用于基础科学和临床前研究,涉及药理学和遗传动物模型。在这里,我们提供了如何成功地记录和分析小鼠的听觉脑干反应的详细描述。

Abstract

脑干引起反应听力测量(BERA)在临床神经生理学中具有中心相关性。由于其他唤起电位 (EP) 技术,如视觉唤起电位 (VE) 或躯体感官唤起电位 (SEP),听觉唤起电位 (AEP) 由重复呈现相同的刺激触发,脑电图 (EEG) 反应随后被平均,导致明显的正 (p) 和负 (n) 偏转。在人类中,单个峰的振幅和延迟都可以用来描述底层神经元电路中同步和传导速度的变化。重要的是,AEP还应用于基础和临床前科学,以识别和表征药理学和遗传动物模型中的听觉功能。此外,还利用动物模型与药理学测试相结合,研究在治疗感觉神经性听力损失(例如,年龄或噪音引起的听力缺陷)方面的潜在益处。在这里,我们提供了如何使用点击和音调爆裂应用程序记录小鼠的听觉脑干反应 (ADR) 的详细和综合描述。该协议的一个具体重点是实验前动物外壳、麻醉、ABR记录、ABR过滤过程、基于小波的自动振幅生长功能分析和延迟检测。

Introduction

大脑生理学的一个中心方面是处理环境信息的能力,从而产生不同的内在或外在输出,如学习、记忆、情绪反应或运动反应。各种实验和诊断方法可用于描述与刺激相关的神经元回路中单个神经元细胞类型或神经元簇/集合的电生理反应。这些电生理技术覆盖了微尺度、中尺度和宏观尺度上不同的时空尺寸。微尺度电平包括不同贴片夹模式的电压和电流钳位方法,例如,使用培养或急性分离神经元1。这些体外技术允许表征单个当前实体及其药理调制2,3。然而,一个基本缺点是缺乏关于微和宏观电路信息集成和处理的系统信息。这种损伤部分克服了体外技术中尺度,如多电极阵列,允许同时细胞外多电极记录不仅在培养神经元,但也在急性脑切片4,5.微电路可以在特定程度(例如,在海马区)中保存在脑切片中,而远距离互连通常损失6。最终,为了研究神经元电路中的功能互连,在宏观上进行系统体内电生理技术是首选方法7。这些方法包括,除其他外,表面(硬膜外)和深(脑内)脑电脑记录,在人类和动物模型1中进行。脑电图信号主要基于不同皮质层中金字塔神经元的同步突触输入,尽管兴奋输入具有普遍优势,但在主体中可以抑制或兴奋。同步时,在细胞外电场中,激发性后视位电位被求和,形成足够强度的信号,使用表面电极记录在头皮上。值得注意的是,从单个电极检测的头皮记录需要一万个金字塔神经元的活动,以及技术设备和加工工具的复杂武器库,包括放大器、过滤过程(低通滤波器、具有特定导体特性的高通滤波器、陷波滤波器和电极。

在大多数实验动物物种(即小鼠和大鼠)中,基于人的头皮 EEG 方法在技术上不适用,因为由于同步金字塔神经元的数量有限,底层皮层产生的信号太弱, 10,11.因此,在啮齿类动物中,表面(头皮)电极或皮下电极受到心电图和主要电图伪影的严重污染,使得高质量的脑电图记录不可能9、1112.因此,当使用未经麻醉的自由移动小鼠和大鼠时,必须通过硬膜外电极或从深层的脑内结构直接从皮层进行记录,以确保传感尖端的直接物理连接铅/植入电极到信号生成神经元细胞簇。这些脑电图方法可以在约束系绳系统设置中进行,也可以使用非约束植入式EEG无线电遥测方法9、10、11。这两种技术都有其优缺点,在癫痫发作易感性/癫痫活动、昼夜节律、睡眠结构、振荡活动和同步的定性和定量表征中,都是有价值的方法,包括时间频率分析、源分析等9、10、13、14、15、16、17。

虽然系绳系统和无线电遥测允许分别在限制/半约束或非约束条件下进行 EEG 记录,但相关的实验条件不符合 ABR 录像的要求。后者对定义的声学刺激的需求,随着时间的推移,通过扬声器和实验动物的固定位置和受控声压水平 (SPL) 重复呈现。这可以通过在限制条件下的头部固定或麻醉后18,19来实现。为了减轻实验压力,动物通常在ABR实验中进行麻醉,但应考虑麻醉会干扰ADR19,20。

作为一般特征,EEG在50-100 μV的电压范围内由不同频率组成。背景频率和振幅在很大程度上取决于实验动物的生理状态。在醒状态下,以低振幅的β(β)和伽马(+)频率占主导地位。当动物昏昏欲睡或入睡时,α (α)、ta (+) 和增量 (+) 频率出现,显示 EEG 振幅增加 21。一旦感觉通道(例如,声学通路)受到刺激,信息传播通过周围和中枢神经系统的神经元活动进行中介。这种感官(例如,声学)刺激触发所谓的EP或引起反应。值得注意的是,与事件相关的电位 (ERP) 的振幅远低于 EEG(即仅几微伏)。因此,任何基于单个刺激的单个 ERP 都会在高振幅 EEG 背景下丢失。因此,ERP 的录制需要重复应用相同的刺激(例如,ABR 录音中的咔嗒声)和随后的平均值,以消除任何 EEG 后台活动和伪影。如果ABR记录是在麻醉动物中完成的,则在这里很容易使用皮下电极。

主要包括短延迟 EP,通常与 ADR 或 BERA 相关,以及进一步、后期启动的电位,如中延迟 IP(中延迟响应 [MLR])和长期延迟 EP22。重要的是,听觉信息信息处理中的干扰通常是神经精神病(脱骨髓疾病、精神分裂症等)的核心特征,并且与AEP改变23、24有关 ,25.而行为调查只能揭示功能障碍,AEP研究允许对与特定神经解剖学结构相关的听觉功能障碍进行精确的时空分析26。

ABR 早期、短延迟声学 EP 通常在中度到高强度的点击应用中检测到,并且可能发生多达七个 ABR 峰值 (WI-WVII)。最重要的波(W I-WV)与以下神经解剖学结构有关:WI与听觉神经(远端部分,内耳内);WII到耳蜗核(听觉神经的近部,脑干终止);WIII到上级寡物复合物 (SOC);WIV到侧侧耳鸣 (LL);WV端接在侧侧下侧 (IC) 内的侧侧乳管 (LL) 的端接(LL ) (补充图 1)。应该指出,W II-WV可能具有多个解剖结构的上升听觉通路有助于他们。值得注意的是,听觉区域的峰值和基础结构的确切相关性尚未完全澄清。

在听力学中,ADR可用作筛查和诊断工具,以及用于外科监测28,29。它对于识别缺损、子宫内膜炎和厌食症(例如,与年龄相关的听力损失、噪音引起的听力损失、代谢和先天性听力损失,以及畸形引起的不对称听力损失和听力缺陷)至关重要。畸形、损伤和肿瘤)28。ADR 也作为对过度活跃、智力受损的儿童或其他无法对常规听力测量作出反应的儿童(例如,在神经/精神疾病(如多动症、MS、自闭症等)的筛查测试。,30)和在开发和手术安装人工耳蜗28。最后,ADR可以提供宝贵的见解,了解神经精神药物的潜在otois副作用,如抗癫痫药31,32。

从药理学或转基因小鼠模型获得的神经生理学知识翻译给人类的价值在许多环境中得到了证明,特别是在小鼠和大鼠听觉范式中的ERPs水平33。 34,35.因此,对小鼠和大鼠听觉信息处理中改变的早期AEP和相关变化的新见解可以转化为人类,在听觉、神经和听觉的表征和内切分方面具有核心重要性。未来的神经精神病。在这里,我们详细介绍了如何在小鼠中成功记录和分析ADR,以用于基本科学、毒理学和药理学目的。

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Protocol

所有动物程序都按照德国动物护理理事会的准则进行,所有协议都由当地机构和国家动物护理委员会批准(州乌姆韦尔特,恩维尔劳彻舒茨北莱茵-威斯特法伦州自然、环境和消费部办公室(德国LANUV NRW)。)。作者进一步证明,所有动物实验都是根据国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》(NIH出版物第80-23号)修订的1996年或《英国动物(科学程序)法》进行的。1986年及相关准则,或欧洲共同体理事会指令,1986年11月24日(86/609/EEC)和2010年9月22日(2010/63/欧盟)。已作出具体努力,尽量减少使用的动物数量及其痛苦(3R[替换、减少和改良]战略)。

1. 实验动物

  1. 实验动物和物种的选择
    1. 在啮齿动物/啮齿动物模型(即小鼠或大鼠)中执行 ABR 研究,以满足与特定人类疾病相关的同源性、同构性和可预测性的要求。这在翻译神经科学的基本方面具有特别重要的意义。
      注:考虑现有的杂鼠和大鼠菌株可以显示基本生理和病理生理特征36,37,38的差异。在实验规划中必须考虑到这些与小鼠/鼠线相关的细节。
    2. 考虑对电生理和药理学可能影响的小鼠和大鼠菌株特异性变化(例如,麻醉敏感性、昼夜节律、[音频]发作易感性、年龄、和遗传背景)39,40,41,42。
    3. 在研究设计中纳入性别特定的分层。请记住,麻醉周期可以严重影响麻醉易感性、中央节律、昼夜依赖和癫痫活动(听觉发作)和感觉(听觉)信息处理43,44,45. 因此,进行针对性别的分析。
      注:限制雄性小鼠,如果财务和实验能力有限,虽然各种神经生理学参数从正常骑自行车的雌性似乎没有表现出增加的变异性相比,男性46。
  2. 动物外壳和搬运
    1. 将老鼠或老鼠放在动物设施内单独通风的笼子里。
    2. 将实验动物从动物设施移到专用实验室的通风柜中,用于麻醉、ABR 电极放置和 ABR 记录。
    3. 确保动物在标准环境条件下(即温度为 21 ± 2 °C、50%-60% 相对湿度和常规 12/12 小时光/暗周期)被安置在通风柜中。在后续实验之前,让动物适应和适应这种昼夜模式至少14天。
    4. 使用透明聚碳酸酯笼II型(26.7厘米x20.7厘米x14.0厘米,面积410厘米2)为3-4组小鼠,并使用透明聚碳酸酯笼类型III(42.5厘米x26.6厘米x18.5厘米,面积800厘米2)的老鼠。提供饮用水和标准食品颗粒。
    5. 避免在ABR记录前后对实验动物进行分离/分离,因为分离会产生影响实验结果的严重应力。因此,在麻醉、ABR电极放置和ABR记录后,将动物放回家中笼子。
    6. 不要应用开放式住房条件,因为它们有各种实验性缺陷,特别是在听觉研究中。相反,通风柜在实验听觉程序之前和之间保护免受声学应力的影响,否则可能导致感觉神经性听力损失(例如,噪音引起的听力损失),从而影响结果。
    7. 利用小鼠和大鼠特有的卫生、麻醉和技术设备,使小鼠和大鼠都无法感知彼此的存在,因为对手物种的相互感官感知可能导致研究中可避免的混淆因素。

2. 小鼠麻醉

  1. 使用注射麻醉剂进行麻醉。在 0.9% NaCl 或 Ringer 溶液中制备盐酸氯胺酮(啮齿动物剂量:100 毫克/千克)和盐酸西兰辛(10 mg/kg)的组合,并根据其体重在内注射动物。
    注: 不建议通过离极胶吸入麻醉,因为 ABR 程序通常需要声音衰减隔间和法拉第保持架,导致录制设置中的空间限制。虽然许多麻醉剂作用于NMDA系统,并明显影响ABR记录结果,但ABR录音中的非麻醉抑制方法不建议作为意识下的限制程序,诱导动物的剧烈压力,ADR 中严重的后续伪影形成。
  2. 通过执行尾部捏合、脚捏和监测呼吸速率(小鼠:150-220 次呼吸/分钟),仔细观察动物的麻醉深度。检查是否有可能的喘息,并在必要时进行抵消。
    注:不同的小鼠线或药理学小鼠模型对麻醉可能表现出不同的敏感。突变小鼠模型也是如此。内切管插管不是这个实验环境中的必须,不推荐。由于插管会增加气管创伤和感染的风险,在ABR手术期间内切管插管的好处/风险是负的。

3. 围感安排和仪器的一般方面

  1. 在ABR记录期间和之后使用温热毯应用补充温暖,以保持动物的体核心温度。将后者保持在 36.5-38.0 °C (98.6-100.4 °F)。
    注:体温过低是小啮齿动物的危险因素,因为它们的身体表面(小鼠身体表面 = 10.5 x(重量在 g)2/3;大鼠体表面 = 10.5 x(重量(g)2/3)与体体积。
  2. 在整个ABR记录过程中,用石油基人工泪膏或5%的dexpanthenol覆盖动物的眼睛,以避免角膜干燥。继续此过程,直到完全恢复闪烁反射。
  3. 使用高压灭菌器或消毒剂对实验仪器进行消毒(见材料表)。
    注:建议使用带玻璃珠的热质手术器消毒器。
  4. 要精确放置 ABR 电极,请使用带冷光源的双目手术放大显微镜,通过灵活或自支撑的可移动光导器进行强光照明。
  5. 在实验动物处理和实验过程中,使用干净的实验室外套、面罩、头罩和无菌手套。
    注:最佳仪器和耗材可能因实验室而异,必须符合实验室特定和机构标准。

4. ABR 录音

注: 此处描述的协议基于商用的用于单声道和双耳录音的 ABR 系统。重要的是,要解决的科学问题必须符合所使用的ABR系统的技术规格。例如,双耳记录的ABR分析可用于研究听觉通路听觉刺激的横向编码,研究神经精神病的外周侧对称性。

  1. 将连接到前置放大器和处理系统的麦克风(参见材料表)放置在声音衰减隔间内,从而在正确的位置放置一个麦克风,在录音的每一天执行刺激频率的校准方向,实验鼠耳将定位。
    1. 在校准前至少 5 分钟打开连接到麦克风前前置放大器,以便对系统进行平衡。
    2. 打开示波器。
    3. 将连接到前置放大器的麦克风放置在声音衰减隔间内,以模仿实验鼠耳。
    4. 打开市售的处理和采集软件(参见材料表)。
    5. 在软件中选择校准Cal200K文件以激活校准配置模式,并根据实验条件选择参数。
    6. 使用处理器系统执行校准过程。确保麦克风和扬声器在 SPL 限制、频率范围和分布方面的技术规格协调一致。
    7. 选择并启动预定义的点击刺激协议。
    8. 运行一次单击 SPL(最好是最大 SPL),以验证由示波器的在线快速傅立叶变换 (FFT) 分析的声音刺激频谱是否与要求(大量能量范围)匹配。
    9. 在感兴趣的范围内(例如,1-42 kHz)选择并启动预定义的音调突发刺激方案。
    10. 使用示波器和在线 FFT 确认录制的声学测试刺激的频谱。
      注:系统每日校准和刺激频率是必要的,以确保刺激频率和SPL在可接受的工作范围内。
  2. 将麻醉鼠标放在一个声音衰减的隔间内,里面衬着声学泡沫。
    注:整个隔间应覆盖法拉第笼(定制网状金属或商用网箱),以保护 ABR 录像免受外部电气干扰,并保护它们免受噪音影响。
  3. 对于记录单声道脑干引起的听觉电位,根据耳朵要测量。对于双耳录音,将负极放在左右两个固定处。将接地电极放置在动物臀部(补充图1)。
    1. 在插入之前,在不锈钢电极的尖端形成一个钩形,这样电极的皮下固定得到保证47。
  4. 在每次记录之前对所有电极执行阻抗测量,以验证正确的电极定位/电导率。使用四通道头级上的阻抗检查按钮验证每个电极阻抗电平。
    注:阻抗应小于5 kΩ。
  5. 使用单个扬声器(例如,频率带宽,在 1-65 kHz)放置在与动物讲台相对 10 厘米(扬声器的领先边缘垂直于小鼠的耳间轴)的自由场条件下录制 AVR。确保鼠标头/鼠标耳的位置是校准麦克风的位置,具体取决于校准期间扬声器和麦克风之间选择的特定距离。
    注:也可以使用耳管,而不是自由场条件。但是,特殊的预防措施和测试是必要的,以确定这些设置中的 SPL。
  6. 使用自编程或商用软件对咔嗒声和音调突发的刺激协议进行编程(参见材料表)。下面列出的单个刺激参数需要添加到相关的图形用户界面中。
    1. 从点击刺激实体的配置开始(即,具有交替极性[冷凝和稀有性之间切换]的 100 μs 持续时间刺激)和定义的大量能量。使用此刺激实体分析和确定点击阈值、左耳和右耳的 ABR 对称性、ABR W (I - IV) 振幅以及稍后的 W (I - IV) 延迟。
    2. 启动软件并使用配置窗口添加单击刺激参数。单击"执行"以运行协议。
    3. 继续配置第二个刺激实体,即 4.5 ms 的音调突发(瞬态正弦脉冲),交替极性,汉恩包络上升和下降时间各 1.5 ms(门/斜坡持续时间)。考虑最小音调突发持续时间为 3 毫秒,尤其是低频音调突发。使用此刺激来分析和识别所有基因型中频率特定的听力阈值。
    4. 与步骤 4.6.2 类似,使用配置窗口添加音调突发刺激参数,然后单击"执行"以运行协议(如制造商48所述)。
    5. 对于音调突发研究,根据科学问题(例如,在 6 kHz 步长中从 1-42 kHz) 编程要测试的适当频率范围。确保应用的频率范围符合扬声器的技术能力(在本例中,对于自由场或闭场条件,频率带宽为 1-65 kHz 的多场磁性扬声器)。
    6. 例如,对于平均值,将连续声学刺激(咔嗒声或音调突发)的数量设置为 300 倍,速率为 20 Hz。
    7. 在 5 dB 步长中增加 SPL,用于咔嗒声,将 10 dB 步长用于音调突发,从 0 dB 到 90 dB(增加 SPL 模式)。
      注: 增加和减少 SPL 模式已在文献中描述。SPL 步长大小可能由于科学问题而得到调整。
  7. 确定 ABR 数据采集持续时间为 25 毫秒,从单个声学刺激启动前的 5 毫秒基线周期(ABR 前基线)开始,再将 10 毫秒 ABR 部分再增加 10 毫秒基线(后 ABR 基线)(补充图 1)).
  8. 使用 6 极巴特沃斯滤波器为 ABR 数据采集(例如 24.4 kHz)和带通滤波器(高通:300 Hz、低通:5 kHz)应用适当的采样率。如有必要,激活凹槽过滤器。
    注:采样率和滤波器特性可能会因实验要求而得到调整。
  9. 将记录从皮下电极记录的生物电信号传输到头部级,并进一步向前转移到具有适当放大(例如 20 倍)前置放大器。
  10. 使用特定的 ABR 系统处理软件来协调扬声器控制和 ABR 采集、处理、平均和数据管理。
  11. 尝试在大约 45 分钟内执行整个 ABR 协议(用于点击和音调突发引发听力阈值、峰值振幅和峰值延迟分析等)。这对应于使用100/10毫克氯胺酮/木氨酸的腹肌内深麻醉的时间。
  12. 在麻醉动物并执行实际记录之前,请确保刺激演示和采集的校准、编程/调整、滤波器设置等按预期工作。

5. ABR分析

  1. 点击和音调突发引发 ABR 听力阈值分析
    1. 根据较早的出版物执行自动阈值检测,以避免通过目视检查/估计 49、50、51、52 来避免 ABR 阈值确定中的潜在不一致。
    2. 定义三个不同的时间窗 (TW) 以计算信噪比 (SNR):TW1 (0-5 ms)、TW2 (5-15 毫秒)和 TW3 (15-25 ms) (补充图 1)。
    3. 计算未观察到 AEP 的两个不同 T(即 TW1和 TW3)内基线的噪声标准偏差。此计算可以使用自编程软件完成。
    4. 计算 ABR 记录中的每个 SPL 测量值,设置 TW1和 TW3的池化数据的平均值和标准差。
    5. 按相应的计算均值单独重置所有记录样本,以删除任何直流偏移量。
    6. 对于听力阈值确定,请确定 ABR 响应时间窗口 (TW 2) 中至少一个波振幅值 (WI-WIV)超过先前计算的标准差的四倍时的最低 SPL (dB)。
      注: 如果在最大 SPL 处检测到振击和频率阈值分析的 ABR 波,则向耳朵分配 100dB 的标称阈值级别。
  2. ABR 波振幅和波延迟分析
    1. 使用墨西哥帽小波使用小波进行基于小波的方法,通过连续小波变换 (CWT) 确定正 (p) 波(峰值)以及负 (n) 波 (坑) 的时间顺序排列模式匹配算法52 (补充图 1.
      1. 在数学上,CWT 的表示方式如下53。
        Equation
        此处,s(t) 是信号,a 是刻度,b 是平移,α (t)是母小波,μa、b (t)是缩放和翻译的小波,C 是小波系数。
    2. 最初,使用每个 ABR 运行的 55 dB 测量来确定要传递到 CWT 的每个波的最佳比例参数,这分为三个类别:所有 n 波的刻度 0.5-4,所有 p 波的 0.5-6,WIV的 0.5-12,因为这是最广泛的波在样品。
      注: 选择 55 dB SPL 是因为波通常在这里最为突出,可以可靠地检测到。
    3. 在所有 55 dB 测量值中,证明所有类可可靠地检测 W I-WIV的正确时间搭配。
    4. 为了在 55 dB 测量中以精确的时间顺序确定 ABR WI-W IV,p 峰和 n 峰(坑)在固定序列中标识,使用以前标识的峰值的相对位置来限制后续扫描。
    5. 在 55 dB 下识别所有九个峰值后,在重复识别峰值 1-9 之前,使用相关值作为相邻声压测量值(50 dB 和 60 dB)的时间搜索帧的起点。
    6. 通过这种方式,确定所有 dB 电平(55-0 dB 和 60-90 dB)的 p 和 n 峰值(如果可能)。一旦小波分析不再识别 p 和 n 峰值,则通过计算峰值的时间偏移量到先前 dB 级别中标识的任何其他峰值来设置其时间排列。
    7. 将时序偏移应用于当前分贝水平内的任何其他 p 和 n 峰值,为未定义的峰值最多确定八个确定的时间位置,其中平均值被视为最接近的近似值。
    8. 要评估所有波(WI-W IV)的振幅增长函数和延迟比较,描述相关n峰的时间范围内每个p峰的最大振幅和平均延迟。
    9. 之后,根据自编程的自动小波工具目视检查所有结果,如有必要,如果单个 ABR 不符合严格的包含/质量标准,则从统计信息中排除这些结果。
      注:在 ADR 的自动分析和目视检查中,建议采用双盲方法。

6. 术后护理和ABR后治疗

  1. 持续监测动物,直到它们恢复知觉,并能够保持胸腔。
  2. 在动物完全康复之前,不要将经过 ABR 记录的动物归还给其他动物的公司。
  3. 注射卡罗芬(小鼠:1x 5-10毫克/千克,皮下;大鼠:1x 2.5-5.0毫克/千克,皮下),用于术后疼痛治疗。
    注:由于ABR记录电极被分皮插入,因此不需要长期疼痛治疗。
  4. 术后,喂食滋润的颗粒,以方便食物吸收。仔细观察食物(约15克/100克体重/天;+5 g/24 h)和水(+15 mL/100克体重/天;±5 mL/24 h)的消耗量。
  5. 密切监视动物的正常姿势和行为。
    注:此处不建议对抗生素(如苯甲酰胺或三聚氰胺)进行系统给给,因为皮下电极放置只有微小侵入性。抗生素的应用应受到限制,除非出现局部或普遍炎症的迹象。
  6. 通过控制动物的体重,在ABR记录后进行实验后恢复。

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Representative Results

点击和音调突发引起的ABR记录可用于评估听力阈值差异、振幅增长函数和延迟比较。图 1中描述了 SPL 增加模式下的点击调用 ADR,用于控制装置和两条示例性突变鼠标线,这些线路在 Cav3.2 T 型电压门控 Ca2+通道(即 Cav3.2+/-和 Ca) 中存在缺陷v3.2 空突变体 [Cav3.2-/-])。如上所述,由于人类54、55和小鼠56、57的听觉参数存在性别差异,通常建议进行针对性别的调查。ADR 到自由场咔嗒声 (0.1 ms) 和音调突发 (1⁄42 kHz 在 6 kHz 步长, 4.5 ms 共与 1.5 ms 斜坡时间) 声学刺激记录在协议中所述。请注意,顶点正极位绘制为向上偏转,如女性 Cav3.2+/*(图 1A)、Cav3.2+/-(图 1B)中所示的代表性点击唤起记录)和 Cav3.2-/-鼠标 (图 1C)。在此设置中,女性代表性的 ABR 建议增加点击引起的 ABR 听力阈值和改变的振幅增长函数在女性 Cav3.2-/-小鼠相比 Cav3.2+/+和 Cav3.2+/-动物。与对照组和杂音Cav3.2+/-小鼠相比,在Cav2.3-/-中,观察到同样的趋势,表明点击引起的ABR阈值增加,振幅减小。图 2中描述了典型音爆 ADR,用于女性 Cav3.2+/*、Cav3.2+/-和 Cav3.3-/-小鼠(所有动物的年龄为 20 周)。

作为分析一般听力性能的第一步,使用协议第5节(图3)中描述的自动ABR阈值检测系统,对不同SPL(0~90 dB)的点击唤起ABR进行了研究。被分析的动物的年龄与年龄相匹配,因为衰老会对感觉神经性听力损失产生巨大影响58,59。接下来,分析了由不同音调突发频率(1~42 kHz,图4)引起的ABR阈值电平的潜在变化。在示例鼠标行中,与对照组相比,Cav2.3+/-和 Cav3.2-/-表现出与对照组相比,与点击和音调爆裂相关的听力阈值增加(所有动物的年龄为 20 周)。

采用上述小波方法,进行了点击唤起ABR振幅增长函数和ABR波形延迟分析(图5和图6分别)。 后者允许深入了解兴趣基因对内耳和脑干中听觉信息处理的可能时空影响。

Figure 1
图 1:在对照组和突变小鼠中单击调用 ADR (Cav3.2+/-,Cav3.2-/-)。代表 AR 从 (A) Cav3.2+/+, (B) Cav3.2+/-和 (C) Cav3.2-/-在增加 SPL 模式下的刺激时获得(从 0+90 dB,带 5 个 dB SPL 步长)。对于平均值,每个刺激实体在 20 Hz 下应用 300 次。声学刺激的开始用垂直红线表示。这个数字是从Lundt等人60修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:对照组和突变小鼠中的音调突发引起ADR(Cav3.2+/-,Cav3.2--)。代表 AR (A) Cav3.2+/+, (B) Cav3.2+/-和 (C) Cav3.2- /-在 SPL 为 80 dB 时,在 1~42 kHz (6 kHz 步长) 下出现 1~42 kHz (6 kHz 步长) 的母小鼠。对于平均值,每个刺激实体在 20 Hz 时呈现 300 次。声学刺激的开始用垂直红线表示。这个数字是从Lundt等人60修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:在对照组和突变小鼠中点击唤起基于ABR的听力阈值(Cav3.2+/-,Cav3.2--)。点击唤起的音频听力阈值 (A) 女性和 (B) 男性 Cav3.2+/* (女性: n = 12; 男性: n = 13), Cav3.2+/- (女性: n = 10; 男性: n= 9)和 Cav3.2-/-小鼠(母: n = 10;雄: n = 9)。数据绘制为均值 = SEM。统计显著性是使用 * 水平 = 0.05 和 p 值定义的 p 值定义的 =p < 0.05;*p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001.这个数字是从Lundt等人60修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:在对照组和突变小鼠中,音调爆裂引发基于ABR的听力阈值(Cav3.2+/-,Cav3.2-/-)。1~42 kHz(6 kHz 步长)音爆裂引起基于ABR的音频听力阈值,为Cav3.2+/+(女性:n = 12;男性:n = 12;+),Cav3.2+/- (女性: n = 10; 男性: n = 8; +), 和 Cav3.2-/-动物 (女性: n = 10; 男性: n = 9;[] 数据绘制为均值 = SEM.统计显著性是使用 * 水平 = 0.05 和p 值定义的 p < 0.05;*p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001.这个数字是从Lundt等人60修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:在对照组和突变小鼠中基于点击的ABR记录振幅增长函数(Cav3.2+/-,Cav3.2--)。WI=WIV振幅(以微伏为单位),针对卡v3.2+/*(母:n = 12;公: n = 11;表示的黑线)的点击调用 ABR 波分析绘制近似控制曲线,包括灰色 95% 置信区间,Cav3.2+/- (女性: n = 8;男性: n = 7; +), 和 Cav3.2-/-动物 (女性: n = 7; 男性: n = 9;[ ] Av3.2-/-雌性小鼠和雄性小鼠在 (A 和 B ) WI、 (C和D) WII的幅度增加方面表现出显著延迟的增幅增长,和 (G和H) WIV与 Cav3.2+/+和 Cav3.2+/-小鼠相比。(E和F)对于WIII,只有Cav3.2-/-雄性小鼠在增加的SPL中表现出显著延迟的振幅增长,而雌性Cav3.2-/-动物则明显延迟。数据以均值 = SEM 形式呈现。 统计显著性是使用 ± 水平 = 0.05 和 p 值定义的 p 值确定的,这些值定义为 =p < 0.05;*p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001.这个数字是从Lundt等人60修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图 6:在控件和突变小鼠中单击调用 ABR 记录时的延迟分析 (Cav3.2+/-,Cav3.2--)。在 65 dB SPL 时,每个 ABR 波 (WI+ WIV) 的延迟(以毫秒为单位)为 Cav3.2+/* (女性: n = 12; 男性: n = 11), Cav3.2+/- (女性: n = 8; 男性:n = 7),Cav3.2-/-小鼠(母: n = 8;雄: n = 9)。请注意,延迟分析也可以在特定的感觉级别执行。数据被描述为均值 = SEM. 统计显著性是使用 + 水平 = 0.05和 p 值定义的 p < 0.05;*p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001.这个数字是从Lundt等人60修改。请点击此处查看此图的较大版本。

补充图1:ABR架构和电极定位。(A) 代表 ABR 记录在 65 dB SPL.初始基线(TW1,5 ms)后跟测试刺激(点击或音调爆裂)和TW 2(10毫秒),其中包含早期脑干诱发电位。TW2紧随其后的是另一个基线(TW 3,10 ms)。基准期间用于计算基准噪声的 SD。当单个 ABR 波 (WI+WIV) 振幅以四倍超过基线噪声的 SD 时,就达到听觉阈值。对于波振幅和延迟比较,采用了基于"墨西哥帽子"的波小波方法,以自动检测负峰(蓝黄色条纹线)和正峰(红灰色条纹线)。绿色十字表示绝对最大 ABR 波幅,不显示基于小波方法的近似值。(B) 对于ABR记录,使用带钩形尖端的子皮不锈钢电极。参考电极位于左臀部,正极(+)电极位于顶点(平顶的轴),负极(-)电极插入右针脚的通风侧,具体取决于单声或双耳记录是否进行。这个数字是从Lundt等人60修改。请点击此处下载此文件。

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Discussion

该协议提供了关于如何记录小鼠听觉引起脑干反应的详细和综合描述。它特别侧重于动物预处理、麻醉和潜在的方法混淆因素。后者包括性别、小鼠线、年龄和住房条件。需要注意的是,所有这些因素都会对感觉神经性听力损失和听觉信息处理的基本方面产生影响。因此,听觉特征分析研究的适当分层是强制性的。

AEP 录音的仪器在过去 50-60 年中发生了巨大的变化,如今,商用 ABR 录音系统已经具备了增强和简化该技术应用的方法,但也带来了新的缺陷。此处将讨论其中一些方面。首先,用户应该习惯ABR系统,即由台式或笔记本电脑、前置放大器、放大器、电极输入盒和电位传感器(例如,扬声器、插入耳机、超听觉)组成的仪器耳机和骨振荡器)。值得注意的是,记录条件至关重要。由于其高易感性,ABR 录像需要屏蔽,以保护它们免受外部电气噪声的污染,并保证适当的信噪比。

另一个重要方面是仪表本身(例如,刺激发生器、传感器和触发器)。小鼠中最常用的刺激类型是 100 μs 咔嗒声和具有调制振幅和/或频率属性的短持续时间音调突发。传感器可以向一只耳朵或双耳显示各种声学刺激。在这里,我们向实验动物展示了ABR结果。然而,其他方法也是可能的,包括输卵管式插入耳机在一只耳朵或双耳。在小鼠中,用于人类的超耳耳耳机是不可行的。文献表明,不同的方法可以成功,它们应该根据实验需要进行调整。必须特别注意触发器的准确度,这是信号平均所必需的,因为此数字脉冲决定了每次单独刺激的呈现时间。对于正确的记录,触发器和刺激开始必须是同步的,表示时间点零。商用 ABR 记录系统通常在显示单个刺激时包含自包含触发器。在许多系统中,有外部输入允许来自外部刺激生成器和相关触发器的连接。在这两种情况下,使用外部示波器控制刺激和触发特性都很有价值。还必须特别注意采集参数(例如,差分放大、滤波、模拟滤波器与数字滤波器、滤波器设计和信号平均参数)。值得注意的是,此处介绍的协议中提供的参数符合上述示范性结果的实验要求。然而,根据实验设置,可能需要进行适应,例如在采样率、用于平均应用的刺激次数及其应用频率方面。

最后,对电极阻抗、电极类型和电极放置问题进行简要的介绍。电极就像天线一样,从皮肤下面拾取电压变化。皮下电极放置是强制性的,因为仅仅在皮肤或头皮上应用电极是不适合的,因为外皮层(即角膜层)的阻力。在人类中,电导率通常通过磨蚀死皮细胞和电解质凝胶或糊状物的应用来提高,而这通常不适合使用皮下电极的小鼠。电极和皮肤的接口形成电极阻抗,包括导体的总电气特性。导体特性包括电极的材料特性和接触电极的表面面积、组织(包括碎屑(油、污垢、汗液等))和电解质溶液)的特性。电极材料包括银、金、铂、铅、锡和不锈钢,阻抗低,电极电位低。必须注意电极材料在记录条件下是惰性的。使用银,这是通过使用所谓的复杂电极(即氯化银 [Ag-AgCl] 电极) 来实现的。在这种情况下,电气双层允许离子的自由交换,从而进一步减少阻抗。通常建议电极阻抗不应超过 5 kΩ,并且单个电极的阻抗(至少三个)具有可比性。还建议电极间阻抗应低于 2 kΩ。记录电极代表带有绝缘涂层的长金属丝。导线电极通过插头连接到录音设备,在大多数情况下,前置放大器/放大器。在小鼠中,电极线的另一端通常是针电极的积筑,该电极可能留直或"更好"。其他电极类型,如圆盘或杯形的,无论是重复使用还是预盖一次性电极,都仅限于在人类中使用,不适用于小鼠。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者要感谢克里斯蒂娜·科尔布博士(德国神经退行性疾病中心[DZNE])和罗伯特·斯塔克博士(DZNE)在动物育种和动物保健方面给予的帮助。这项工作得到了联邦药品和医疗器械研究所的财政支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AEP/OAE Software for RZ6 (BioSigRZ software) Tucker-Davis Technologies (TDT) BioSigRZ
Binocular surgical magnification microscope Zeiss Stemi 2000 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
Cages (Macrolon) Techniplast 1264C, 1290D
Carprox vet, 50mg/ml Virbac Tierarzneimittel GmbH PZN 11149509
Cold light source Schott KL2500 LCD 9.705 202
Cotton tip applicators (sterile) Carl Roth EH12.1
Custom made meshed metal Faraday cage (stainless steel, 2 mm thickness, 1 cm mesh size) custom made custom made
5% Dexpanthenole (Bepanthen eye and nose creme) Bayer Vital GmbH PZN: 01578681
Disposable Subdermal stainless steel Needle
electrodes, 27GA, 12mm		 Rochester Electro-Medical, Inc. S03366-18
Surgical drape sheets (sterile) Hartmann PZN 0366787
Ethanol, 70% Carl Roth 9065.5
1/4'' Free Field Measure Calibration Mic Kit Tucker-Davis Technologies (TDT) PCB-378C0
Gloves (sterile) Unigloves 1570
Graefe Forceps-curved, serrated FST 11052-10
GraphPad Prism 6 Software, V6.07 GraphPad Prism Software, Inc. https://www.graphpad.com/
Heat-based surgical instrument sterilizer FST 18000-50
Homeothermic
heating blanked		 ThermoLux 461265 / -67
Ketanest S (Ketamine), 25mg/ml Pfizer PZN 08707288
Ringer’s solution (sterile) B.Braun PZN 01471434
Matlab software MathWorks, Inc. https://de.mathworks.com/products/matlab.html
Medusa 4-Channel Low Imped. Headstage Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4LI
Medusa 4-Channel Pre-Amp/Digitizer Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4PA
Microphone PCB Pieztronics 378C01
Multi Field Speaker- Stereo Tucker-Davis Technologies (TDT) MF1-S
Oscilloscope Tektronix DPO3012
Optical PC1 express card for Optibit Interface) Tucker-Davis Systems (TDT) PO5e
Askina Braucel pads (cellulose absorbet pads) B.Braun PZN 8473637
Preamplifier PCB Pieztronics 480C02
RZ6 Multi I/O Processor system (BioSigRZ) Tucker-Davis Technologies (TDT) RZ6-A-PI
0.9% saline (NaCl, sterile) B.Braun PZN:8609255
SigGenRZ software Tucker-Davis Technologies (TDT) https://www.tdt.com/
Software R (version 3.2.1) + Reshape 2 (Version 1.4.1) + ggplot 2 (version 1.0.1) + datatable (version 1.9.4), + gdata (version 2.13.3), + pastecs (version 1.3.18), + waveslim (version 1.7.5), + MassSpecWavelet (version 1.30.0) The R Foundation, R Core Team 2015 Open Source Software (freely distributable)
Sound attenuating cubicle Med Associates Inc. ENV-018V
Standard Pattern Forceps, 12cm and 14.5 cm length FST 11000-12, 11000-14
Leukosilk tape BSN medical GmbH & Co. KG PZN 00397109
Tissue Forceps- 1x2 Teeth 12 cm FST 11021-12
Uniprotect ventilated cabinet Bioscape THF3378
Ventilated cabinet Tecniplast 9AV125P
Xylazine (Rompun), 2% Bayer Vital GmbH PZN 1320422

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本月在JoVE 问题 147 振幅 听觉系统 平均 双耳 脑干 点击 听力阈值 延迟 单声道 全身神经生理学 音调爆裂 小波
脑干中的数据采集与分析 在小鼠中引发响应音频测量
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Lundt, A., Soos, J., Henseler, C., Arshaad, M. I., Müller, R., Ehninger, D., Hescheler, J., Sachinidis, A., Broich, K., Wormuth, C., Papazoglou, A., Weiergräber, M. Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice. J. Vis. Exp. (147), e59200, doi:10.3791/59200 (2019).

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