Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Data insamling och analys i Brainstem framkallade respons audiometri hos möss

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59200
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 3, 4, 5, 5, 6, 1,7, 1, 1
1Experimental Neuropsychopharmacology, Federal Institute for Drugs and Medical Devices, 2KBRwyle GmbH, 3Cognitive Neurophysiology, Department of Psychiatry and Psychotherapy, Faculty of Medicine, University of Cologne, 4Molecular and Cellular Cognition, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 5Institute of Neurophysiology, Faculty of Medicine, University of Cologne, 6Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM), 7Thescon GmbH

Summary

Brainstem framkallade respons audiometri är ett viktigt verktyg i klinisk neurofysiologi. Numera är hjärnstammen framkallat respons audiometri också tillämpas i grundforskning och prekliniska studier med både farmakologiska och genetiska djurmodeller. Här ger vi en detaljerad beskrivning av hur auditiva hjärnstammen svar kan framgångsrikt registreras och analyseras i möss.

Abstract

Hjärnstammen framkallade Response audiometri (BERA) är av central betydelse i den kliniska neurofysiologin. Som andra framkallat potential (EP) tekniker, såsom visuellt framkallade potentialer (veps) eller somatosensorisk framkallade potentialer (SEPS), den auditiva framkallade potentialer (aeps) utlöses av upprepad presentation av identiska stimuli, elektroencefalographic (EEG) respons som därefter i genomsnitt resulterar i distinkta positiva (p) och negativa (n) avböjelser. Hos människor kan både amplituden och latens av enskilda toppar användas för att karakterisera förändringar i synkronisering och överledning hastighet i de underliggande neuronala circuitries. Viktigt är att AEPs också tillämpas i grundläggande och preklinisk vetenskap för att identifiera och karakterisera hörselfunktionen i farmakologiska och genetiska djurmodeller. Ännu mer, djurmodeller i kombination med farmakologiska tester utnyttjas för att undersöka om potentiella fördelar vid behandling av sensorineural nedsättning hörselnedsättning (t. ex., ålder-eller Bullerorsakad hörselnedsättning). Här ger vi en detaljerad och integrativ Beskrivning av hur man spelar in auditiv brainstem-framkallat svar (ABRs) i möss med Klicka och Tone-burst ansökan. Ett specifikt fokus för detta protokoll är på pre-experimental djur boende, anestesi, ABR inspelning, ABR filtreringsprocesser, automatiserad Wavelet-baserade amplitud tillväxt funktion analys, och latens upptäckt.

Introduction

En central aspekt av hjärnans fysiologi är dess förmåga att bearbeta miljöinformation som resulterar i olika inneboende eller extrinsic produktion, såsom inlärning, minne, känslomässiga reaktioner, eller motoriska svar. Olika experimentella och diagnostiska metoder kan användas för att karakterisera den elektrofysiologiska lyhördhet av enskilda neuronala celltyper eller kluster/ensembler av nervceller inom en stimulans-relaterade neuronala kretsar. Dessa elektrofysiologiska tekniker täcker olika spatiotemporal dimensioner på mikro-, meso-och makro1. Den mikroanalys nivå omfattar spänning och ström klämma närmar sig i olika patch-Clamp lägen med, till exempel, odlade eller akut dissocierade nervceller1. Dessa in vitro-tekniker möjliggör karakterisering av enskilda nuvarande enheter och deras farmakologiska modulering2,3. En viktig nackdel är dock avsaknaden av systemisk information när det gäller mikro-och macrocircuitry-integrering och bearbetning av information. Denna försämring är delvis övervinnas genom in vitro-tekniker av mesoscale, såsom multielektrod arrayer som möjliggör samtidig extracellulära multielektrod inspelningar inte bara i odlade nervceller utan också i akuta hjärn skivor4, 5. mikrocirriteter kan bevaras i hjärn skivorna till en viss grad (t. ex. i hippocampus), långväga sammanlänkningar är typiskt förlorade6. I slutändan, för att studera de funktionella sammanlänkningar inom neuronala circuitries, systemisk in vivo elektrofysiologiska tekniker på makro är metoden för val7. Dessa metoder omfattar bland annat yta (epidural) och djupa (intracerebral) EEG-inspelningar som utförs i både människor och djurmodeller1. EEG-signaler är huvudsakligen baserade på den synkroniserade synaptiska ingången på pyramidala nervceller i olika kortikala skikt som kan vara hämmande eller excitatoriska i huvudmannen, trots den allmänna dominans av excitatoriska ingång8. Vid synkronisering, excitatoriska postsynaptiska potentialbaserade Skift i extracellulära elektriska fält summeras för att bilda en signal av tillräcklig styrka för att registreras i hårbotten med hjälp av ytan elektroder. Särskilt, en detekterbar hårbotten inspelning från en enskild elektrod kräver aktivitet av 10000 pyramidala nervceller och en komplex i av tekniska enheter och verktyg för bearbetning, inklusive en förstärkare, filtrering processer (lågpassfilter, högpassfilter, notch-filter) och elektroder med specifika ledaregenskaper.

I de flesta experimentella djurarter (dvs möss och råttor), den Human-baserade hårbotten EEG-metoden är tekniskt inte tillämplig, eftersom signalen som genereras av den underliggande cortex är för svag på grund av det begränsade antalet synkroniserade pyramidala nervceller9, 10,11. I gnagare, är ytan (hårbotten) elektroder eller subdermala elektroder således allvarligt förorenade av elektrokardiogram och huvudsakligen Elektromyogram artefakter som gör högkvalitativa EEG inspelningar omöjliga9,11, 12. När du använder tre fritt rörliga möss och råttor, är det därför obligatoriskt att direkt registrera antingen från cortex via epidural elektroder eller från den djupa, intracerebral strukturer för att säkerställa direkt fysisk anslutning av Avkännings spetsen av bly/implanterade elektroden till de signalgenererande neuronala cell klustren. Dessa EEG-metoder kan utföras antingen i en begränsande uppbundna systeminstallation eller genom att använda det icke-begränsande implanerbara EEG-radiotelemetrimetoden9,10,11. Båda teknikerna har sina för-och nackdelar och kan vara en värdefull metod i kvalitativ och kvantitativ karakterisering av kramp känslighet/krampanfall aktivitet, dygnsrytm rytmicitet, sömn arkitektur, oscillerande aktivitet, och synkronisering, inklusive tidsfrekvens analys, käll analys, etc.9,10,13,14,15,16,17.

Medan uppbundna system och radio telemetri möjliggör EEG-inspelningar under fasthållnings-/halvspänningeller icke-begränsande förhållanden matchar inte relaterade Försöksförhållanden kraven för ABR-inspelningar. Den senare efterfrågan på definierade akustiska stimuli som presenteras upprepande över tiden med definierade positioner av en högtalare och experimentella djur och kontrollerade ljudtrycksnivåer (SPLs). Detta kan uppnås endera vid Head fixering under att hindra villkorar eller efter anestesi18,19. För att minska den experimentella stressen, är djur normalt sövda under ABR experiment, men det bör övervägas att anestesi kan störa ABRs19,20.

Som en allmän egenskap, är EEG byggs upp av olika frekvenser i ett spänningsområde av 50-100 μV. bakgrunds frekvenser och amplituder beror starkt på det fysiologiska tillståndet hos försöksdjuret. I vakna tillstånd, beta (β) och gamma (γ) frekvenser med lägre amplitud dominerar. När djuren blir dåsig eller somna, alfa (α), theta (θ), och delta (δ) frekvenser uppstår, uppvisar ökad EEG amplitud21. När en sensorisk kanal (t. ex. den akustiska vägen) stimuleras, förmedlas informationsspridningen via neuronala aktivitet genom perifera och centralanervsystemet. Sådan sensorisk (t. ex. akustisk) stimulering utlöser så kallade EPs-eller framkallat svar. Särskilt, händelserelaterade potentialer (ERPs) är mycket lägre i amplitud än EEG (dvs, några mikrovolt endast). Således skulle varje enskilt ERP baserat på en enda stimulans förloras mot den högre amplitud EEG bakgrund. Därför kräver en inspelning av ett ERP repetitiv tillämpning av identiska stimuli (t. ex. klick i ABR-inspelningar) och efterföljande medelvärde för att eliminera alla EEG-bakgrundsaktiviteter och artefakter. Om ABR inspelningar görs i sövda djur, är det lätt att använda subdermala elektroder här.

I huvudsak inkluderar AEPs korta svarstider EPs, som normalt är relaterade till ABRs eller BERA, och ytterligare, senare debut potentialer såsom midlatency EPs (midlatens svar [MLR]) och lång latens EPs22. Viktigt är att störningar i informationsbehandlingen av hörsel informationen ofta är ett centralt inslag i neuropsykiatriska sjukdomar (demyelinierande sjukdomar, schizofreni etc.) och förknippade med AEP-förändringar23,24 ,25. Medan beteendemässiga utredningar är endast kapabla att avslöja funktionella nedskrivningar, AEP studier möjliggör exakt spatiotemporal analys av hörsel dysfunktion i samband med specifika neuroanatomiska strukturer26.

ABR så tidigt, kort latens akustiskt EPs upptäcks normalt vid måttlig till högintensiva klick program, och det kan förekomma upp till sju ABR toppar (WI-WVII). De viktigaste vågorna (Wi-wV) är relaterade till följande neuroanatomiska strukturer: Wi till hörselnerven (distala delen, inom innerörat); WII till Cochlear Nucleus (proximala delen av hörselnerven, hjärnstammen uppsägning); WIII till den överlägsna olivary Complex (SOC); WIV till den laterala lemniscus (ll); WV till uppsägning av den laterala lemniscus (ll) inom sämre COLLICULUS (IC) på kontralaterala sidan27 (kompletterande figur 1). Det bör noteras att WII-wV sannolikt kommer att ha mer än en anatomisk struktur i den stigande hörsel väg som bidrar till dem. I synnerhet är den exakta korrelationen mellan toppar och underliggande strukturer i hörsel-tarmkanalen fortfarande inte helt klarlagd.

I audiologi, ABRs kan användas som ett screening-och diagnostiskt verktyg och för kirurgisk övervakning28,29. Det är viktigast för identifieringen av dysacusis, hypacusis och anacusis (t. ex. i åldersrelaterade hörselnedsättning, Bullerorsakad hörselnedsättning, metabolisk och medfödd hörselnedsättning, och asymmetrisk hörselnedsättning och hörselnedsättningar på grund av missbildningar eller missbildningar, skador och neoplasmer)28. ABR är också relevanta som ett screeningtest för hyperaktiva, intellektuellt nedsatt barn eller för andra barn som inte skulle kunna reagera på konventionell audiometri (t. ex. vid neurologiska/psykiatriska sjukdomar som ADHD, MS, autism etc.29 , 30) och i utveckling och kirurgisk montering av cochleaimplantat28. Slutligen, ABR kan ge värdefull insikt i de potentiella ototoxiska biverkningar av neuropsykofarmaka, såsom antiepileptika31,32.

Värdet av översättningen av neurofysiologisk kunskap som erhållits från farmakologiska eller transgena musmodeller till människor har visats i många inställningar, särskilt på nivån av ERPs i auditiva paradigm hos möss och råttor33, 34,35. Ny insikt i förändrade tidiga AEPs och tillhörande förändringar i auditiv informationsbehandling hos möss och råttor kan således översättas till människor och är av central betydelse för karakterisering och endofenotypning av hörsel-, neurologiska-och neuropsykiatriska sjukdomar i framtiden. Här ger vi en detaljerad beskrivning av hur ABR kan registreras och analyseras på möss för grundläggande vetenskapliga, toxikologiska och farmakologiska ändamål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök utfördes enligt riktlinjerna från det tyska rådet för djuromsorg och alla protokoll godkändes av den lokala institutionella och nationella kommittén för djuromsorg (Landesamt für natur, Umwelt, und Verbraucherschutz, State Kontoret för Nordrhein-Westfalen, Institutionen för natur, miljö och konsumism [LANUV NRW], Tyskland). Författarna intygar vidare att alla djur experiment utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur (NIH publications No. 80-23) reviderad 1996 eller brittiska djur (vetenskapliga procedurer) Act 1986 och tillhörande riktlinjer, eller Europeiska gemenskapernas rådsdirektiv av den 24 november 1986 (86/609/EEG) och den 22 september 2010 (2010/63/EU). Särskilda ansträngningar gjordes för att minimera antalet djur som används och deras lidande (3R [ersättning, minskning och förfining] strategi).

1. försöksdjur

  1. Urval av försöksdjur och arter
    1. Utföra ABR studier på gnagare/gnagare modeller (dvs möss eller råttor) som uppfyller kraven i homologi, isomorfism, och förutsägbarhet i samband med en viss sjukdom. Detta är av särskild betydelse när det gäller grundläggande aspekter i translationell neurovetenskap.
      Observera: Tänk på att tillgängliga Diverse möss och råttor stammar kan visa skillnader i grundläggande fysiologiska och patofysiologiska egenskaper36,37,38. Dessa linje-relaterade särdrag för mus/råtta måste beaktas vid experimentell planering.
    2. Överväg att använda mus-och råtta-stamspecifika förändringar i fysiologi och farmakologi som kan påverka elektrofysiologiska experiment (t. ex. förändrad bedövnings känslighet, dygnsrytm rytmicitet, känslighet för krampanfall, ålder, och genetisk bakgrund)39,40,41,42.
    3. Inkludera den könsspecifika stratifieringen i studiens utformning. Kom ihåg att brunstcykeln kan allvarligt påverka anestesi känslighet, centrala rytmicitet, dygns beroende, och beslag aktivitet (auditiva beslag) och sensoriska (auditiv) informationsbehandling43,44 , 45. således genomföra en könsspecifik analys.
      Obs: begränsa till hanmöss om den finansiella och experimentella kapaciteten är begränsad, även om olika neurofysiologiska parametrar från normalt cykling kvinnor verkar inte uppvisar ökad variation jämfört med män46.
  2. Djur boende och hantering
    1. Hus möss eller råttor i individuellt ventilerade burar inuti en djur anläggning.
    2. Flytta försöksdjuren från djuranläggningen till ventilerade skåp som finns i särskilda labb rum avsedda för anestesi, ABR elektrodplacering, och ABR inspelningar.
    3. Se till att djuren är inhysta i ett ventilerat skåp under normala miljöförhållanden (dvs. med en temperatur på 21 ± 2 ° c, 50%-60% relativ fuktighet, och en konventionell 12/12 h ljus/mörker-cykel). Låta djuren acklimatisera sig och anpassa sig till detta dygnsrytm mönster i minst 14 dagar före efterföljande experiment.
    4. Använd klar polykarbonat burar typ II (26,7 cm x 20,7 cm x 14,0 cm, en yta på 410 cm2) för bostäder möss i grupper av 3-4 och använda klar polykarbonat BURAR typ III (42,5 cm x 26,6 cm x 18,5 cm, en yta på 800 cm2) för råttor. Ge AD libitum tillgång till dricksvatten och standard mat pellets.
    5. Undvik separation/isolering av försöksdjuren före och efter ABR-inspelningar som isolering kan utöva svår stress som påverkar experimentella resultat. Sålunda, placera djuren tillbaka in i deras hem bur efter anestesi, ABR elektrodplacering, och ABR inspelningar.
    6. Använd inte öppna boendeförhållanden eftersom de är föremål för en mängd experimentella nackdelar, särskilt i auditiva studier. Ventilerade skåp i stället skydda mot akustisk stress före och mellan experimentella auditiva förfaranden som annars skulle kunna leda till sensorineural nedsättning hörselnedsättning (t. ex., Bullerorsakad hörselnedsättning) och därmed påverka resultaten.
    7. Använda mus-och råtta-specifika sanitära, bedövningsmedel och teknisk utrustning så att varken möss eller råttor kan känna närvaron av varandra som ömsesidig sensorisk uppfattning av rivaliserande arter kan ge upphov till påverkbara confounding faktorer i studierna.

2. mus anestesi

  1. Utför anestesi med injicerbara anestetika. Förbered en kombination av ketaminhydroklorid (gnagare dosering: 100 mg/kg) och xylazin hydroklorid (gnagare dosering: 10 mg/kg) i 0,9% NaCl eller ringer lösning och injicera djuret intraperitonealt baserat på dess kroppsvikt.
    Anmärkning: Inandning narkos via isofluran rekommenderas inte eftersom ABR förfarandet normalt kräver en ljuddämpning bås och Faraday bur, vilket resulterar i rumsliga begränsningar i inspelningen setup. Även om många bedövningsmedel agera på NMDA-systemet och uppenbarligen påverka ABR inspelning resultat, en icke-bedövnings förbud strategi i ABR inspelningar rekommenderas inte som begränsande procedurer under medvetande framkalla dramatisk stress på djuret, med svår efterföljande artefakt bildning i ABR.
  2. Observera djuren noga för anestesidjupet genom att utföra en svans nypa, fot nypa, och övervakning andningsfrekvens (möss: 150-220 andetag/min). Kontrollera om det går att flämta och motverka vid behov.
    Obs: olika mus linjer eller farmakologiska musmodeller kan uppvisa olika känsligheter för anestesi. Detsamma gäller för muterade musmodeller. Endotrakealintubation är inte ett måste i denna experimentella miljö och rekommenderas inte. Eftersom intubation ökar risken för trauma mot luftstrupen och infektionen, är nytta/risk för endotrakeal intubation under ABR-förfarandet negativt.

3. allmänna aspekter av perianestetikum och instrumentering

  1. Applicera extra värme under och efter ABR inspelningar med hjälp av en homeothermic värme filt för att bibehålla djurets kroppstemperatur. Bibehålla den senare vid 36,5-38,0 ° c (98.6-100.4 ° f).
    Anmärkning: hypotermi är en riskfaktor i små gnagare på grund av deras höga förhållande av kroppsyta (mus kroppen yta = 10,5 x (vikt i g)2/3; råtta kroppsyta = 10,5 x (vikt i g)2/3) till kropps volymen.
  2. Täck djurets ögon med petroleumbaserade konstgjorda tår salva eller 5% Dexpantenol under hela ABR inspelningsprocessen för att undvika korneal uttorkning. Fortsätt med den här proceduren tills den blinkande reflexen är helt återställd.
  3. Sterilisera experimentella instrument (se tabellen av material) med hjälp av en autoklav eller desinfektionsmedel.
    Anmärkning: användning av en värmebaserad kirurgisk instrument autoklav med glaspärlor rekommenderas.
  4. För exakt ABR elektrodplacering, Använd en binokulär kirurgisk förstoring Mikroskop med en kall ljuskälla för intensiv belysning via flexibla eller självbärande rörliga ljus guider.
  5. Använd en ren laboratorie kappa, en ansiktsmask, en huvudkåpa, och sterila handskar under experimentell djurhantering och experiment.
    Obs: optimala instrument och tillbehör kan variera mellan labb och måste uppfylla Lab-specifika och institutionella standarder.

4. ABR inspelningar

Anmärkning: det protokoll som beskrivs här är baserat på ett kommersiellt tillgängligt ABR-system för mono-och binaural inspelningar. Viktigast av allt är att den vetenskapliga fråga som ska behandlas måste uppfylla de tekniska specifikationerna för det ABR-system som används. ABR analys av binaural inspelningar, till exempel, kan användas för att undersöka den laterala kodning av hörsel stimuli i hörselgången och att studera perifer lateral asymmetri i neuropsykiatriska sjukdomar.

  1. Utför en kalibrering av stimuleringfrekvenser på varje inspelnings dag genom att placera en mikrofon som är ansluten till en förförstärkare och bearbetningssystemet (se tabellen med material) inuti ljuddämpnings skåpet på den plats där rätt den experimentella murina örat kommer att placeras.
    1. Slå på för förstärkaren ansluten till mikrofonen minst 5 min före kalibreringen för att möjliggöra en jämning av systemet.
    2. Slå på oscilloskopet.
    3. Placera mikrofonen ansluten till en förförstärkare inuti ljuddämpningen bås för att efterlikna den experimentella murina örat.
    4. Öppna den kommersiellt tillgängliga programvaran för bearbetning och förvärv (se tabell över material).
    5. Välj kalibrerings Cal200K -filen i programvaran för att aktivera kalibrerings konfigurationsläget och välj parametrar enligt försöks förhållandena.
    6. Använd processor systemet för att utföra Kalibreringsproceduren. Se till att de tekniska specifikationerna för mikrofonen och högtalaren i termer av SPL gränser, frekvensomfång och distribution harmoniserar.
    7. Välj och starta det fördefinierade klick stimuleringsprotokollet.
    8. Kör ett enda klick SPL (helst, den maximala SPL) för att kontrollera att spektrumet av ljud stimuli som analyseras av online Fast Fourier Transformation (FFT) av oscilloskop matcher krav (betydande energiområde).
    9. Välj och starta det fördefinierade protokollet för ton-burst-stimulering inom ett intervall av intresse (t. ex. 1-42 kHz).
    10. Bekräfta frekvensspektrumet för de inspelade akustiska test stimuli med hjälp av ett oscilloskop och online FFT.
      Obs: daglig kalibrering av systemet och stimulering frekvenser är nödvändigt för att garantera att stimulering frekvenser och SPLs är inom acceptabla arbetsområden.
  2. Placera den sövda musen inuti ett ljuddämpande bås som kantas av akustiskt skum.
    Obs: hela bås bör täckas av en Faraday bur (skräddarsydd med kvadratiska maskor metall eller en kommersiell en) för att skydda ABR inspelningar från yttre elektriska störningar och skydda dem från buller.
  3. För inspelning av mono hjärnstammen-framkallade auditiva potentialer, infoga subdermala rostfrittstål elektroder vid vertex, axiella av pinnae (positiv [+] elektrod) och ventrolaterala av höger eller vänster Pinna (negativ [-] elektrod) beroende på örat som ska mätas. För binaural inspelningar, placera de negativa elektroderna på både höger och vänster pinnae. Placera jordelektroden i djurets höft (kompletterande figur 1).
    1. Före införandet, bilda en krok form på spetsen av rostfrittstål elektrod så att subdermala fixering av elektroderna garanteras47.
  4. Utför impedansmätningar av alla elektroder före varje inspelning för att verifiera korrekt elektrod positionering/ledningsförmåga. Använd impedansknappen på fyr kanals headstage för att kontrollera varje elektroimpedansnivå.
    Obs: impedansen bör vara mindre än 5 kΩ.
  5. Registrera ABRs under Free-Field villkor med hjälp av en enda högtalare (frekvens bandbredd, till exempel vid 1-65 kHz) placerad 10 cm motsatt till talarstol av djuren (högtalarens framkant vinkelrätt mot musens interaural axel). Se till att positionen för mus huvudet/mus öronen är den av kalibrerings mikrofonen, beroende på det valda specifika avståndet mellan högtalaren och mikrofonen under kalibreringen.
    Observera: i stället för frifältsförhållanden kan öron slangen också användas. Särskilda försiktighetsåtgärder och tester är dock nödvändiga för att bestämma SPLs i dessa inställningar.
  6. Programmera stimulans protokollen för klick och ton skurar med hjälp av självprogrammerad eller kommersiellt tillgänglig programvara (se tabell över material). De enskilda stimulans parametrarna som listas nedan måste läggas till det relaterade grafiska användargränssnittet.
    1. Börja med konfigurationen av Klicka stimulus entitet (dvs., en 100 μs varaktighet stimulans med omväxlande polaritet [Växla mellan kondensation och rarefaction] och den definierade betydande energi. Använd denna stimulans enhet för att analysera och bestämma klick trösklar, ABR symmetri vänster och höger öra, ABR W (I-IV) amplituder, och W (I-IV) latenser senare.
    2. Initiera programvaran och Använd konfigurationsfönstret för att lägga till klick stimulans parametrarna. Kör protokollet genom att klicka på Kör .
    3. Fortsätt med konfigurationen av den andra stimulans enheten, som är en 4,5 MS Tone burst (övergående sinusformad puls) av omväxlande polaritet med hann kuvert uppgång och fall tider på 1,5 MS vardera (Gate/ramp tid varaktighet). Överväg en minsta ton burst varaktighet 3 MS, särskilt för lågfrekventa tonen skurar. Använd denna stimulans för att analysera och identifiera frekvensspecifika hörsel trösklar i alla genotyper.
    4. I likhet med steg 4.6.2 använder du konfigurationsfönstret för att lägga till Tone burst-stimulansparametrar och klickar på Kör för att köra protokollet (enligt tillverkarens48).
    5. För Tone burst Studies, programmera lämpligt frekvensområde som ska testas beroende på den vetenskapliga frågan (t. ex. från 1-42 kHz i 6 kHz steg). Se till att de frekvensområden som ska tillämpas uppfyller de tekniska funktionerna i högtalaren (i detta fall en multifield magnetisk högtalare med en frekvens bandbredd på 1-65 kHz för fri-eller stängda fältvillkor).
    6. För medelvärdes, ange antalet sekventiella akustiska stimuli (klick eller ton skurar), till exempel, vid 300x med en hastighet av 20 Hz.
    7. Öka SPLs i 5 dB steg för klick och 10 dB steg för ton skurar, från 0 dB upp till 90 dB (öka SPL-läge).
      Anm.: både ökande och minskande SPL-lägen har beskrivits i litteraturen. SPL steg storlek kan anpassas på grund av vetenskapliga frågor.
  7. Fastställa en ABR-varaktighet för datainsamling på 25 MS, som inleds med en 5 MS-baslinjeperiod före den individuella akustiska stimulansen (pre-ABR baseline) och som överskrider en 10 MS ABR-sektion med ytterligare 10 MS baseline (post-ABR-baslinje) (kompletterande figur 1 ).
  8. Använd en lämplig samplingsfrekvens för ABR datainsamling (t. ex. 24,4 kHz) och bandpass filter (hög pass: 300 Hz, Low pass: 5 kHz) med hjälp av ett 6-poligt Butterworth-filter. Aktivera Hack filtret vid behov.
    Anm.: provtagnings hastighet och filteregenskaper kan anpassas på grund av experimentella krav.
  9. Överför de resulterande bioelektriska signalerna som spelats in från subdermala elektroder till en huvudscen och vidare fram till en förförstärkare med lämplig förstärkning (t. ex. 20-faldigt).
  10. Använd en specifik ABR system bearbetning programvara för att samordna högtalar kontroll och ABR förvärv, bearbetning, medelvärdes-och datahantering.
  11. Försök att utföra hela ABR protokoll (för Klicka-och tonen burst-framkallat hörsel trösklar, Peak amplitud, och Peak latency analys, etc.) inom ca 45 min. Detta motsvarar tiden för djup narkos med 100/10 mg ketamin/xylazin intraperitonealt.
  12. Se till att kalibrering, programmering/justeringar för stimulans presentation och förvärv, filterinställningar, etc. fungerar som förväntat innan anesthetizing djuret och utföra den faktiska inspelningen.

5. ABR-analys

  1. Click-och Tone burst-evoked ABR hörsel tröskel analys
    1. Utföra automatisk tröskel detektering baserat på tidigare publikationer för att undvika eventuella inkonsekvenser i gränsvärdet för ABR-tröskel genom visuell inspektion/uppskattning49,50,51,52.
    2. Definiera tre distinkta tidsfönster (TWs) för att beräkna signal-brus-förhållandet (SNR): TW1 (0-5 ms), TW2 (5-15 MS) och TW3 (15-25 MS) (kompletterande figur 1).
    3. Beräkna bullerstandard avvikelsen för baslinjen inom de två distinkta TWs (dvs., TW1 och TW3) där inga aeps observeras. Denna beräkning kan göras med hjälp av självprogrammerad programvara.
    4. Beräkna för varje SPL-mätning inom en ABR-postinställning både medelvärdet och standardavvikelsen för poolade data för TW1 och TW3.
    5. Återställ alla inspelnings exempel individuellt med motsvarande beräknat medelvärde för att ta bort eventuell DC-förskjutning.
    6. För bestämning av hörsel tröskel, identifiera den lägsta SPL (dB) där minst ett vågamplitudvärde (wi-WIV) i fönstret för svarstid för ABR (TW2) överskred fyrdubblats av den tidigare beräknade standardavvikelsen.
      Anmärkning: om ingen ABR våg upptäcktes för klick och frekvens tröskel analys vid högsta SPL, en nominell tröskelnivå på 100dB tilldelas örat.
  2. ABR Wave amplitud och Wave latens analys
    1. Genomföra en Wavelet-baserade tillvägagångssätt med hjälp av den mexikanska hatten Wavelet att bestämma temporala-sekventiella arrangemang av positiva (p) vågor (toppar) samt de negativa (n) vågor (gropar) med en standard Wavelet av kontinuerlig Wavelet Transform (CWT)-baserade mönstermatchningsalgoritm52 (kompletterande figur 1).
      1. Matematiskt representeras CWT enligt följande53.
        Equation
        Här är s (t) signalen, a är skalan, b är översättningen, ψ(t) är mamman Wavelet, ψa, b(t) är den skalade och översatta Wavelet, och C är 2D matris av Wavelet koefficienter.
    2. Använd inledningsvis 55-dB mätning av varje ABR-körning för att identifiera de bästa skalnings parametrarna för varje våg som ska överföras till CWT, vilket resulterar i tre klasser: skalor 0.5-4 för alla n-vågor, 0.5-6 för alla p-vågor, och 0.5-12 för WIV eftersom detta är den bredaste våg inom proverna.
      Obs: 55 dB SPL valdes som vågor är i allmänhet mest framträdande här och kan tillförlitligt detekteras.
    3. Bevisa alla klasser för att tillförlitligt upptäcka korrekt temporala samlokalisering av WI-WIV inom alla 55 dB mätningar.
    4. För att bestämma ABRw i-wIV i exakt temporala ordning inom 55 dB mätning, p-toppar och n-toppar (gropar) identifieras i en fast sekvens med hjälp av relativa positioner av tidigare identifierade toppar för att begränsa tidsfönstret för efterföljande skanningar.
    5. När alla nio toppar identifieras på 55 dB, använda relaterade värden som utgångspunkter för temporala Sök ramen för intilliggande ljud trycks mätningar (50 dB och 60 dB) innan identifieringen av toppar 1-9 upprepas.
    6. På detta sätt, fastställa p-och n-toppar av alla dB nivåer (55-0 dB och 60-90 dB) om möjligt. När en p-och n-topp inte längre identifieras av Wavelet-analys, är dess temporala arrangemang fastställs genom att beräkna den tidsmässiga förskjutningen av toppen till någon annan topp som identifierats i den tidigare dB-nivån.
    7. Att tillämpa den tidsmässiga förskjutningen till toppar till någon annan p-och n-topp inom den nuvarande decibelnivån resulterar i högst åtta bestämda temporala positioner för de odefinierade topparna varav medelvärdet tas som närmast tillnärmning.
    8. För att utvärdera amplitud tillväxt funktion och latens jämförelse av alla vågor (WI-WIV), karakterisera den maximala amplituder och genomsnittlig fördröjning av varje p-toppar inom tidsramen för de relaterade n-toppar.
    9. Kontrollera visuellt alla resultat baserat på det självprogrammerade automatiska Wavelet-verktyget efteråt och, om nödvändigt, utesluta enskilda ABR-körningar från statistiken om de inte uppfyller de strikta kriterierna för inkludering/kvalitet.
      Anmärkning: i både automatiserad analys och visuell inspektion av ABR, rekommenderas en dubbelblind metod.

6. postoperativ vård och post-ABR-behandling

  1. Kontinuerligt övervaka djuren tills de har återfått medvetandet och kan upprätthålla sternala recumbency.
  2. Returnera inte ett djur som har genomgått ABR-inspelningar till företaget med andra djur förrän det har återhämtat sig helt.
  3. Injicera karprofen (mus: 1x 5-10 mg/kg, subkutant; råtta: 1x 2.5-5.0 mg/kg, subkutant) för postoperativ smärtbehandling.
    Obs: långvarig smärtbehandling krävs inte eftersom ABR-inspelningelektroder sätts in subkutant.
  4. Postoperativt, foder fuktad pellets för att underlätta upptaget av livsmedel. Noggrant Observera mat (~ 15 g/100 g kroppsvikt/dag, ~ 5 g/24 h) och vatten (~ 15 mL/100 g kroppsvikt/dag; ~ 5 mL/24 h) konsumtion.
  5. Övervaka djuren noga för återlämnande av deras normala ställningar och beteende.
    Anmärkning: systemisk administrering av antibiotika såsom enrofloxacin eller trimetoprim-sulfonamid rekommenderas inte här, eftersom subdermala elektrodplacering endast är minimal invasivitet. Tillämpningen av antibiotika bör begränsas om inte tecken på lokal eller generaliserad inflammation uppstår.
  6. Uppföljning postexperimentell återhämtning efter ABR inspelningar genom att kontrollera djurets kroppsvikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Click-och Tone burst-evoked ABR inspelningar kan användas för att utvärdera hörsel tröskel skillnader, amplitud tillväxt funktion och latens jämförelse. Klick-framkallat ABRs i SPL ökande läge avbildas i figur 1 för kontroller och två exemplariska Mutant mus linjer som är bristfällig för cav3,2 T-typ spännings-gated ca2 + kanal (dvs., cav3,2+/- och ca v3,2 null mutanter [Cav3,2-/-]). Som beskrivits ovan, en könsspecifik undersökning är allmänt rekommenderas, på grund av könsspecifika skillnader i hörsel parametrar hos människor54,55 och möss56,57. ABR till Free-Field klicka (0,1 MS) och Tone burst (1 – 42 kHz i 6 kHz steg, 4,5 MS totalt med en 1,5 MS Ramptid) akustiska stimuli registrerades enligt beskrivningen i protokollet. Observera att de vertex-positiva potentialerna ritas upp som uppåtgående avböjningar som avbildas i representativa Klicka-framkallade inspelningar för kvinnlig cav3,2+/+ (figur 1a), cav3,2+/- (figur 1b ) och cav3,2-/- möss (figur 1c). I denna inställning, representativa ABRs hos kvinnor föreslog en ökad klick-evoked ABR hörsel tröskel och förändrad amplitud tillväxt funktion i kvinnliga cav3,2-/- möss jämfört med cav3,2+/+ och cav 3,2+/- djur. Samma tendens observerades för män som föreslog en ökad klick-evoked ABR trösklar och reducerade amplituder i cav2,3-/- jämfört med kontroller och heterozygot cav3,2+/- möss. Exemplarisk Tone burst-framkallat ABRs avbildas i figur 2 för kvinnliga Cav3,2+/+, cav3,2+/-, och cav3,3-/- möss (alla djur var 20 veckors ålder).

Som ett första steg i analysen av allmänna hörsel prestanda undersöktes ABRs för olika SPLs (0 – 90 dB) med hjälp av det automatiserade systemet för detektering av ABR-trösklar som beskrivs i avsnitt 5 i protokollet (figur 3). De analyserade djuren ålder matchas som åldrande kan ha en dramatisk inverkan på sensorineural nedsättning hörselnedsättning58,59. Därefter analyserades potentiella förändringar i ABR-tröskelnivåer som frammanades av olika ton burst-frekvenser (1 – 42 kHz, figur 4). I den exemplariska mus linjer, cav2,3+/- och cav3,2-/- uppvisade ökad klick-och Tone burst-relaterade hörsel trösklar jämfört med kontroller (alla djur var 20 veckors ålder).

Med hjälp av Wavelet-baserade metod som beskrivs ovan, klicka-evoked ABR amplitud tillväxt funktion och ABR vågform latens analys genomfördes (FigUre 5 och FigUre 6, respektive). Den senare ger insikt i den eventuella spatiotemporal påverkan av genen av intresse på auditiv informationsbehandling inom innerörat och hjärnstammen.

Figure 1
Figur 1: Klicka-evoked ABRs i kontroller och muterade möss (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Representativa ABRs erhålls från (a) cav3,2+/+, (B) cav3,2+/-, och (C) cav3,2-/- honmöss vid klick stimulering i den ökande SPL-läge (från 0 – 90 dB med 5 dB SPL steg). För medelvärdes, varje stimulans enhet tillämpades 300 gånger vid 20 Hz. Den akustiska stimulus debut indikeras av en vertikal röd linje. Denna siffra är ändrad från Lundt et al.60. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Tone burst-framkallade ABRs i kontroller och muterade möss (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Representativa ABR från (a) cav3,2+/+, (B) cav3,2+/-, och (C) cav3,2-/- honmöss efter ton skurar på 1 – 42 kHz (6 kHz steg) vid en SPL på 80 dB. För medelvärdes, varje stimulans enhet presenterades 300 gånger vid 20 Hz. Den akustiska stimulus debut indikeras av en vertikal röd linje. Denna siffra är ändrad från Lundt et al.60. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: klick-evoked ABR-baserade hörsel trösklar i kontroller och muterade möss (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Klick-evoked audiometrisk hörsel tröskel av (a) hona och(B) hane cav3,2+/+ (hona: n = 12; hane: n = 13), cav3,2+/- (hona: n = 10; hane: n = 9), och cav3,2-/- möss (hona: n = 10; hane: n = 9). Data ritas som medelvärde ± SEM. statistiska signifikans fastställdes med hjälp av α-nivå = 0,05 och p-värden definierade som *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Denna siffra är ändrad från Lundt et al.60. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Tone burst-framkallade ABR-baserade hörsel trösklar i kontroller och muterade möss (cav3,2+/-, cav3,2-/-). 1 – 42 kHz (6 kHz steg) ton burst-evoked ABR-baserade audiometriska hörsel trösklar för cav3,2+/+ (hona: n = 12; hane: n = 12; ▲), cav3,2+/- (hona: n = 10; hane: n = 8; ■), och cav3,2-/- djur (hona: n = 10; hane: n = 9; ○). Data ritas som medelvärde ± SEM. statistiska signifikans fastställdes med hjälp av α-nivå = 0,05 och p-värden definierade som *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Denna siffra är ändrad från Lundt et al.60. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: amplitud tillväxt funktion på Click-baserade ABR inspelningar i kontroller och muterade möss (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Wi – wIV amplitud (i mikrovolt) PLOTTAS mot en ökande SPL (i decibel) för Klicka-evoked ABR wave analys i cav3,2+/+ (hona: n = 12; hane: n = 11; svart linje som representerar Approximerad styr kurva inklusive 95% konfidensintervall i grått), cav3,2+/- (hona: n = 8; hane: n = 7; ■), och cav3,2-/- djur (hona: n = 7; hane: n = 9 ; ○). Både cav3,2-/- hona och hanmöss uppvisar en signifikant fördröjd ökning av amplitudtillväxten över de ökande SPLs för (a och B) wI, (C och D) wII, och (G och H) WIV jämfört med cav3,2+/+ och cav3,2+/- möss. (E och F) För WIII, endast Cav3,2-/- manliga möss visade en signifikant fördröjning i AMPLITUD tillväxt över den ökande SPL jämfört med kvinnliga cav3,2-/- djur. Data presenteras som medelvärdet ± SEM. statistiska signifikans fastställdes med hjälp av α-nivå = 0,05 och p-värden definierade som *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Denna siffra är ändrad från Lundt et al.60. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Bild 6: latens analys vid Click-evoked ABR-inspelningar i kontroller och muterade möss (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Latenser (i millisekunder) för varje ABR-våg (wI–w IV) vid 65 dB SPL avbildas för cav3,2+/+ (hona: n = 12; hane: n = 11), cav3,2+/- (hona: n = 8; hane: n = 7), och Cav3,2-/- möss (hona: n = 8; hane: n = 9). Observera att latens analys kan också utföras på specifika sensation nivåer. Data avbildas som medelvärdet ± SEM. statistiska signifikans fastställdes med hjälp av α-nivå = 0,05 och p-värden definierade som *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Denna siffra är ändrad från Lundt et al.60. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: ABR-arkitektur och elektrod positionering. (A) representativ ABR-inspelning vid 65 dB SPL. Den initiala baslinjen (TW1,5MS) följdes av test stimulansen (klick eller ton burst) och TW2 (10 ms) som innehåller de tidiga hjärnstammen-framkallade potentialerna. TW2 följdes av en annan baslinje (TW3, 10 ms). Baslinje perioderna användes för att beräkna SD för baslinje brus. När en enskild ABR våg (WI-WIV) amplitud överskred SD av baslinjen buller i fyrfaldigt, förhandlingen tröskeln nåddes. Vid jämförelse av vågamplitud och latens genomfördes en "mexikansk hatt"-baserad Wavelet-metod för att automatiskt upptäcka negativa toppar (blågula randiga linjer) och positiva toppar (röd-gråfärgade randiga linjer). Gröna kors anger de absoluta maximala ABR vågamplituderna och visar inte approximerade värden baserade på Wavelet-metoden. Bför ABR-inspelningarna användes subdermala elektroder av rostfrittstål med en krok-formad spets. Referenselektroden placerades vid vänster höft, den positiva (+) elektroden var placerad vid knutpunkt (axiell av pinnae), och den negativa (-) elektroden sattes in ventrolaterala av höger Pinna beroende på om en mono-eller binaural inspelning var Utförs. Denna siffra är ändrad från Lundt et al.60. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll ger en detaljerad och integrativ Beskrivning av hur man spelar in auditiv framkallade hjärnstammen svar på möss. Det sätter särskild fokus på djur förbehandling, anestesi, och potentiella metodologiska confounding faktorer. Den senare omfattar bland annat kön, mus linje, ålder och boendeförhållanden. Det bör noteras att alla dessa faktorer kan påverka sensorineural nedsättning hörselnedsättning och grundläggande aspekter av auditiv informationsbehandling. Därför är lämplig stratifiering av auditiva profilerings studier obligatorisk.

Instrumenteringen av AEP inspelningar har oerhört utvecklats under de senaste 50-60 år, och numera kommersiella ABR inspelningssystem finns tillgängliga som har förbättrat och förenklat tillämpningen av tekniken men har också infört nya fallgropar. Några av dessa aspekter diskuteras här. Först bör användaren vänja sig ABR-systemet, det vill, instrumenteringen består av stationär eller bärbar dator, förförstärkare, förstärkaren, elektroden inmatningslåda, och potentiella givare (t. ex. högtalare, infoga hörlurar, Supra-fonetiska hörlurar och ben oscillatorer). Inspelningsförhållandena är i synnerhet av central betydelse. På grund av sin höga känslighet måste ABR-inspelningar vara avskärmade för att skydda dem från kontaminering med externt elektriskt brus och för att garantera ett adekvat signal-brus-förhållande.

En annan viktig aspekt är instrumenteringen själv (t. ex. stimulus generator, givare och triggers). De vanligaste typerna av stimuli hos möss är 100 μs klick och kortvariga ton skurar med en modulerad amplitud och/eller frekvens egenskaper. Transducers kan presentera en mängd olika akustiska stimuli antingen till ena örat eller till båda öronen. Här har vi presenterat ABR resultat med hjälp av en enda högtalare rostralt till försöksdjuret. Men andra metoder är också möjligt, inklusive Tubal-stil infoga hörlurar antingen i ena örat eller båda öronen. Supra-fonetiska hörlurar som används på människa är inte genomförbara hos möss. Som litteratur illustrerar kan olika tillvägagångssätt vara framgångsrika, och de bör anpassas beroende på de experimentella behoven. Särskild uppmärksamhet måste ägnas åt den noggrannhet av avtryckaren som är avgörande för signalen medelvärdes som denna digitala puls avgör när varje individuell stimulans presenteras. För korrekt inspelningar måste utlösaren och stimulus debut vara synkron, vilket motsvarar Time Point Zero. Kommersiellt tillgängliga ABR-inspelningssystem inkluderar normalt självförsörjande utlösare när de enskilda stimuli presenteras. I många system, det finns externa ingångar som tillåter en anslutning från en extern stimulus Generator och en tillhörande trigger. I båda fallen visade det sig vara värdefullt att kontrollera stimulans och utlösa egenskaper med hjälp av ett externt oscilloskop. Särskild uppmärksamhet måste också ägnas åt förvärvs parametrarna (t. ex. differentiell amplifiering, filtrering, analoga kontra digitala filter, filterkonstruktioner och parametrar för signal medelvärdet). Särskilt parametrar som presenteras i det protokoll som presenteras här passar de experimentella kraven i de exemplariska resultat som beskrivs ovan. Anpassningar, till exempel i samplingsfrekvensen, antal stimuli som används för medelvärdes ökning, och deras applikations frekvens, kan dock behövas beroende på de experimentella inställningarna.

Slutligen, några korta kommentarer bör göras på elektrodens impedans, elektrodtyper, och elektrodplacering. Elektroderna fungerar som antenner, plocka upp spänningsförändringar underifrån huden. Subkutan elektrodplacering är obligatoriskt eftersom enbart applicering av elektroder på huden eller hårbotten är inte lämplig på grund av motståndet i det yttre hudlagret (dvs., stratum corneum). I människor den elektriska ledningsförmågan normalt förbättras genom att slipa döda hudceller och tillämpningen av en elektrolyt gel eller pasta, detta är oftast inte gjort och lämpar sig för möss där subdermala elektroder används. Gränssnittet av elektrod och hud bildar elektroden impedans som inkluderar de elektriska egenskaperna hos ledaren totalt. Ledaren egenskaper inkluderar de materiella egenskaperna hos elektroden och ytan av kontakt elektrod, egenskaper hos vävnaden inklusive skräp (olja, smuts, svett, etc.), och elektrolytlösning. Elektrod materialet innehåller silver, guld, platina, bly, tenn och rostfrittstål med låg impedans och låg elektrod potentialer. Försiktighet måste iakttas att elektrod materialet är inert under inspelningsförhållanden. Med silver, detta uppnås genom att använda så kallade komplexa elektroder (dvs, Silver-Silver klorid [AG-AgCl] elektroder). I detta fall möjliggör det elektriska dubbla skiktet för ett fritt utbyte av joner som ytterligare minskar impedansen. Det rekommenderas ofta att elektrodens impedans inte får överstiga 5 kΩ och att impedansen hos de enskilda elektroderna (minst tre) är jämförbar. Det rekommenderas också att impedansen mellan elektroden bör vara under 2 kΩ. Inspelnings elektroden representerar en lång metalltråd med en isolerande beläggning. Tråd elektroden ansluts via en kontakt till inspelningsutrustningen, i de flesta fall för förstärkaren/förstärkaren. I möss, den andra änden av elektrod tråden är vanligtvis uppbyggd av en nål elektrod som kan lämnas rakt eller — bättre — arcuated. Andra elektrodtyper, såsom disk-eller skålformade sådana, oavsett om de är för återanvändning eller pregelled disponibel, är begränsade till användning hos människor och inte tillämpas på möss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr Christina Kolb (tyska centrum för neurodegenerativa sjukdomar [DZNE]) och Dr Robert stark (DZNE) för deras hjälp i djuruppfödning och djur hälsovård. Detta arbete stöddes finansiellt av det federala institutet för droger och medicintekniska produkter (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM, Bonn, Tyskland).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AEP/OAE Software for RZ6 (BioSigRZ software) Tucker-Davis Technologies (TDT) BioSigRZ
Binocular surgical magnification microscope Zeiss Stemi 2000 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
Cages (Macrolon) Techniplast 1264C, 1290D
Carprox vet, 50mg/ml Virbac Tierarzneimittel GmbH PZN 11149509
Cold light source Schott KL2500 LCD 9.705 202
Cotton tip applicators (sterile) Carl Roth EH12.1
Custom made meshed metal Faraday cage (stainless steel, 2 mm thickness, 1 cm mesh size) custom made custom made
5% Dexpanthenole (Bepanthen eye and nose creme) Bayer Vital GmbH PZN: 01578681
Disposable Subdermal stainless steel Needle
electrodes, 27GA, 12mm		 Rochester Electro-Medical, Inc. S03366-18
Surgical drape sheets (sterile) Hartmann PZN 0366787
Ethanol, 70% Carl Roth 9065.5
1/4'' Free Field Measure Calibration Mic Kit Tucker-Davis Technologies (TDT) PCB-378C0
Gloves (sterile) Unigloves 1570
Graefe Forceps-curved, serrated FST 11052-10
GraphPad Prism 6 Software, V6.07 GraphPad Prism Software, Inc. https://www.graphpad.com/
Heat-based surgical instrument sterilizer FST 18000-50
Homeothermic
heating blanked		 ThermoLux 461265 / -67
Ketanest S (Ketamine), 25mg/ml Pfizer PZN 08707288
Ringer’s solution (sterile) B.Braun PZN 01471434
Matlab software MathWorks, Inc. https://de.mathworks.com/products/matlab.html
Medusa 4-Channel Low Imped. Headstage Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4LI
Medusa 4-Channel Pre-Amp/Digitizer Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4PA
Microphone PCB Pieztronics 378C01
Multi Field Speaker- Stereo Tucker-Davis Technologies (TDT) MF1-S
Oscilloscope Tektronix DPO3012
Optical PC1 express card for Optibit Interface) Tucker-Davis Systems (TDT) PO5e
Askina Braucel pads (cellulose absorbet pads) B.Braun PZN 8473637
Preamplifier PCB Pieztronics 480C02
RZ6 Multi I/O Processor system (BioSigRZ) Tucker-Davis Technologies (TDT) RZ6-A-PI
0.9% saline (NaCl, sterile) B.Braun PZN:8609255
SigGenRZ software Tucker-Davis Technologies (TDT) https://www.tdt.com/
Software R (version 3.2.1) + Reshape 2 (Version 1.4.1) + ggplot 2 (version 1.0.1) + datatable (version 1.9.4), + gdata (version 2.13.3), + pastecs (version 1.3.18), + waveslim (version 1.7.5), + MassSpecWavelet (version 1.30.0) The R Foundation, R Core Team 2015 Open Source Software (freely distributable)
Sound attenuating cubicle Med Associates Inc. ENV-018V
Standard Pattern Forceps, 12cm and 14.5 cm length FST 11000-12, 11000-14
Leukosilk tape BSN medical GmbH & Co. KG PZN 00397109
Tissue Forceps- 1x2 Teeth 12 cm FST 11021-12
Uniprotect ventilated cabinet Bioscape THF3378
Ventilated cabinet Tecniplast 9AV125P
Xylazine (Rompun), 2% Bayer Vital GmbH PZN 1320422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sporns, O., Tononi, G., Kotter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLOS Computational Biology. 1 (4), e42 (2005).
  2. Bebarova, M. Advances in patch clamp technique: towards higher quality and quantity. General Physiology and Biophysics. 31 (2), 131-140 (2012).
  3. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  4. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  5. Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
  6. Heuschkel, M. O., Fejtl, M., Raggenbass, M., Bertrand, D., Renaud, P. A three-dimensional multi-electrode array for multi-site stimulation and recording in acute brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 135-148 (2002).
  7. Kimiskidis, V. K. Transcranial magnetic stimulation (TMS) coupled with electroencephalography (EEG): Biomarker of the future. Reviews in Neurology. 172 (2), 123-126 (2016).
  8. Nunez, P. L. Toward a quantitative description of large-scale neocortical dynamic function and EEG. Behavioral Brain Science. 23 (3), 371-437 (2000).
  9. Lundt, A., et al. EEG Radiotelemetry in Small Laboratory Rodents: A Powerful State-of-the Art Approach in Neuropsychiatric, Neurodegenerative, and Epilepsy Research. Neural Plasticity. 2016, 8213878 (2016).
  10. Papazoglou, A., et al. Non-restraining EEG Radiotelemetry: Epidural and Deep Intracerebral Stereotaxic EEG Electrode Placement. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), e54216 (2016).
  11. Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Research Brain Research Protocols. 14 (3), 154-164 (2005).
  12. Kallstrand, J., Nehlstedt, S. F., Skold, M. L., Nielzen, S. Lateral asymmetry and reduced forward masking effect in early brainstem auditory evoked responses in schizophrenia. Psychiatry Research. 196 (2-3), 188-193 (2012).
  13. Muller, R., et al. Automatic Detection of Highly Organized Theta Oscillations in the Murine EEG. Journal of Visualized Experiments. (121), e55089 (2017).
  14. Papazoglou, A., et al. Gender specific hippocampal whole genome transcriptome data from mice lacking the Cav2.3 R-type or Cav3.2 T-type voltage-gated calcium channel. Data in Brief. 12, 81-86 (2017).
  15. Papazoglou, A., et al. Gender-Specific Hippocampal Dysrhythmia and Aberrant Hippocampal and Cortical Excitability in the APPswePS1dE9 Model of Alzheimer's Disease. Neural Plasticity. 2016, 7167358 (2016).
  16. Papazoglou, A., et al. Motor Cortex Theta and Gamma Architecture in Young Adult APPswePS1dE9 Alzheimer Mice. PLOS ONE. 12 (1), e0169654 (2017).
  17. Siwek, M. E., et al. Altered theta oscillations and aberrant cortical excitatory activity in the 5XFAD model of Alzheimer's disease. Neural Plasticity. , 781731 (2015).
  18. Welch, T. M., Church, M. W., Shucard, D. W. A method for chronically recording brain-stem and cortical auditory evoked potentials from unanesthetized mice. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 60 (1), 78-83 (1985).
  19. Church, M. W., Gritzke, R. Effects of ketamine anesthesia on the rat brain-stem auditory evoked potential as a function of dose and stimulus intensity. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 67 (6), 570-583 (1987).
  20. van Looij, M. A., et al. Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice. Hearing Research. 193 (1-2), 75-82 (2004).
  21. Schomer, D. L., da Silva, F. L. Niedermeyer's Electroencephalography: Basic Principles, Clinical Applications, and Related Fields. , Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
  22. De Cosmo, G., Aceto, P., Clemente, A., Congedo, E. Auditory evoked potentials. Minerva Anestesiology. 70 (5), 293-297 (2004).
  23. Rosburg, T. Auditory N100 gating in patients with schizophrenia: A systematic meta-analysis. Clinical Neurophysiology. 129 (10), 2099-2111 (2018).
  24. DiLalla, L. F., McCrary, M., Diaz, E. A review of endophenotypes in schizophrenia and autism: The next phase for understanding genetic etiologies. American Journal of Medical Genetics Part C Seminar in Medical Genetics. 175 (3), 354-361 (2017).
  25. Walsh, P., Kane, N., Butler, S. The clinical role of evoked potentials. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 76 Suppl 2, ii16-ii22 (2005).
  26. Opgen-Rhein, C., Neuhaus, A., Urbanek, C., Dettling, M. New strategies in schizophrenia: impact of endophentotypes. Psychiatrische Praxis. 31 Suppl 2, S194-S199 (2004).
  27. Knipper, M., Van Dijk, P., Nunes, I., Ruttiger, L., Zimmermann, U. Advances in the neurobiology of hearing disorders: recent developments regarding the basis of tinnitus and hyperacusis. Progress in Neurobiology. 111, 17-33 (2013).
  28. Miller, C. A., Brown, C. J., Abbas, P. J., Chi, S. L. The clinical application of potentials evoked from the peripheral auditory system. Hearing Research. 242 (1-2), 184-197 (2008).
  29. Manouilenko, I., Humble, M. B., Georgieva, J., Bejerot, S. Brainstem Auditory Evoked Potentials for diagnosing Autism Spectrum Disorder, ADHD and Schizophrenia Spectrum Disorders in adults. A blinded study. Psychiatry Research. 257, 21-26 (2017).
  30. Talge, N. M., Tudor, B. M., Kileny, P. R. Click-evoked auditory brainstem responses and autism spectrum disorder: A meta-analytic review. Autism Research. 11 (6), 916-927 (2018).
  31. Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion in Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
  32. Ismi, O., et al. The Effect of Methylphenidate on the Hearing of Children with Attention Deficit Hyperactivity Disorder. International Archive in Otorhinolaryngology. 22 (3), 220-224 (2018).
  33. Michna, M., et al. Cav1.3 (alpha1D) Ca2+ currents in neonatal outer hair cells of mice. Journal of Physiology. 553 (Pt 3), 747-758 (2003).
  34. Platzer, J., et al. Congenital deafness and sinoatrial node dysfunction in mice lacking class D L-type Ca2+ channels. Cell. 102 (1), 89-97 (2000).
  35. Willaredt, M. A., Ebbers, L., Nothwang, H. G. Central auditory function of deafness genes. Hearing Research. 312, 9-20 (2014).
  36. Yee, B. K., Singer, P. A conceptual and practical guide to the behavioural evaluation of animal models of the symptomatology and therapy of schizophrenia. Cell Tissue Research. 354 (1), 221-246 (2013).
  37. Fahey, J. R., Katoh, H., Malcolm, R., Perez, A. V. The case for genetic monitoring of mice and rats used in biomedical research. Mammalian Genome. 24 (3-4), 89-94 (2013).
  38. Hunsaker, M. R. Comprehensive neurocognitive endophenotyping strategies for mouse models of genetic disorders. Progress in Neurobiology. 96 (2), 220-241 (2012).
  39. Turner, J. G., Parrish, J. L., Hughes, L. F., Toth, L. A., Caspary, D. M. Hearing in laboratory animals: strain differences and nonauditory effects of noise. Computational Medicine. 55 (1), 12-23 (2005).
  40. Neumann, P. E., Collins, R. L. Genetic dissection of susceptibility to audiogenic seizures in inbred mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5408-5412 (1991).
  41. Meier, S., Groeben, H., Mitzner, W., Brown, R. H. Genetic variability of induction and emergence times for inhalational anaesthetics. European Journal of Anaesthesiology. 25 (2), 113-117 (2008).
  42. Majewski-Tiedeken, C. R., Rabin, C. R., Siegel, S. J. Ketamine exposure in adult mice leads to increased cell death in C3H, DBA2 and FVB inbred mouse strains. Drug Alcohol Dependence. 92 (1-3), 217-227 (2008).
  43. Bonthuis, P. J., et al. Of mice and rats: key species variations in the sexual differentiation of brain and behavior. Frontiers in Neuroendocrinology. 31 (3), 341-358 (2010).
  44. Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
  45. Jonasson, Z. Meta-analysis of sex differences in rodent models of learning and memory: a review of behavioral and biological data. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 28 (8), 811-825 (2005).
  46. Prendergast, B. J., Onishi, K. G., Zucker, I. Female mice liberated for inclusion in neuroscience and biomedical research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 40, 1-5 (2014).
  47. Ingham, N. J., Pearson, S., Steel, K. P. Using the Auditory Brainstem Response (ABR) to Determine Sensitivity of Hearing in Mutant Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 1 (2), 279-287 (2011).
  48. Tucker-Davis Technologies. SigGenRZ Manual. , Available from: https://www.tdt.com/files/manuals/SigGenRZ_Manual.pdf (2012).
  49. Bogaerts, S., Clements, J. D., Sullivan, J. M., Oleskevich, S. Automated threshold detection for auditory brainstem responses: comparison with visual estimation in a stem cell transplantation study. BMC Neuroscience. 10, 104 (2009).
  50. Probst, F. J., et al. A point mutation in the gene for asparagine-linked glycosylation 10B (Alg10b) causes nonsyndromic hearing impairment in mice (Mus musculus). PLOS ONE. 8 (11), e80408 (2013).
  51. Alvarado, J. C., Fuentes-Santamaria, V., Gabaldon-Ull, M. C., Blanco, J. L., Juiz, J. M. Wistar rats: a forgotten model of age-related hearing loss. Frontiers in Aging Neuroscience. 6, 29 (2014).
  52. Du, P., Kibbe, W. A., Lin, S. M. Improved peak detection in mass spectrum by incorporating continuous wavelet transform-based pattern matching. Bioinformatics. 22 (17), 2059-2065 (2006).
  53. Daubechies, I. Ten lectures on wavelets. , Society for Industrial and Applied Mathematics. Philadelphia, PA. (1992).
  54. Pearson, J. D., et al. Gender differences in a longitudinal study of age-associated hearing loss. Journal of the Acoustical Society of America. 97 (2), 1196-1205 (1995).
  55. Murphy, M. P., Gates, G. A. Hearing Loss: Does Gender Play a Role? Medscape Womens Health. 2 (10), 2 (1997).
  56. Henry, K. R. Males lose hearing earlier in mouse models of late-onset age-related hearing loss; females lose hearing earlier in mouse models of early-onset hearing loss. Hearing Research. 190 (1-2), 141-148 (2004).
  57. Ison, J. R., Allen, P. D., O’Neill, W. E. Age-related hearing loss in C57BL/6J mice has both frequency-specific and non-frequency-specific components that produce a hyperacusis-like exaggeration of the acoustic startle reflex. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 8 (4), 539-550 (2007).
  58. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hearing Research. 130 (1-2), 94-107 (1999).
  59. Zhou, X., Jen, P. H., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
  60. Lundt, A., et al. Cav3.2 T-Type Calcium Channels Are Physiologically Mandatory For The Auditory System. Neuroscience. , In Press (2019).

Tags

Denna månad i JoVE amplitud auditiva system medelvärdes binaural hjärnstammen klicka hörsel tröskel latens mono systemisk neurofysiologi Tone burst Wavelet
Data insamling och analys i Brainstem framkallade respons audiometri hos möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lundt, A., Soos, J., Henseler, C.,… More

Lundt, A., Soos, J., Henseler, C., Arshaad, M. I., Müller, R., Ehninger, D., Hescheler, J., Sachinidis, A., Broich, K., Wormuth, C., Papazoglou, A., Weiergräber, M. Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice. J. Vis. Exp. (147), e59200, doi:10.3791/59200 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter