Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Data opsamling og-analyse i hjernestammen fremkaldte respons audiometri i mus

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59200
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 3, 4, 5, 5, 6, 1,7, 1, 1
1Experimental Neuropsychopharmacology, Federal Institute for Drugs and Medical Devices, 2KBRwyle GmbH, 3Cognitive Neurophysiology, Department of Psychiatry and Psychotherapy, Faculty of Medicine, University of Cologne, 4Molecular and Cellular Cognition, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 5Institute of Neurophysiology, Faculty of Medicine, University of Cologne, 6Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM), 7Thescon GmbH

Summary

Hjernestammen fremkaldte respons audiometri er et vigtigt redskab i klinisk Neuro fysiologi. I dag, hjernestammen fremkaldte respons audiometri anvendes også i den grundlæggende videnskab og prækliniske undersøgelser, der involverer både farmakologiske og genetiske dyremodeller. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af, hvordan auditive Brain EM svar kan registreres og analyseres i mus.

Abstract

Hjernestammen fremkaldte respons audiometri (BERA) er af central relevans i den kliniske neurofysiologi. Som andre fremkaldte potentielle (EP) teknikker, såsom visuelt fremkaldte potentialer (veps) eller somatosensoriske fremkaldte potentialer (SEPS), er de auditive fremkaldte potentialer (AEPS) udløst af den gentagne præsentation af identiske stimuli, elektro encephalographic (EEG) respons, som efterfølgende gennemsnitligt resulterer i markante positive (p) og negative (n) deflections. Hos mennesker kan både amplituden og Latensen af individuelle toppe bruges til at karakterisere ændringer i synkronisering og lednings hastighed i de underliggende neuronale kredsløb. Det er vigtigt, at AEPs også anvendes i grundlæggende og præklinisk videnskab til at identificere og karakterisere den auditive funktion i farmakologiske og genetiske dyremodeller. Endnu mere, dyremodeller i kombination med farmakologiske test er udnyttet til at undersøge for potentielle fordele i behandlingen af sensorineuralt høretab (f. eks, alder-eller støj-induceret hørelse underskud). Her giver vi en detaljeret og Integrativ beskrivelse af, hvordan man optager auditive brainstorm-fremkaldte responser (ABRs) i mus ved hjælp af Click og tone-burst applikation. Et specifikt fokus i denne protokol er på præ-eksperimentel dyre bolig, anæstesi, ABR optagelse, ABR filtreringsprocesser, automatiseret Wavelet-baseret amplitude vækst funktion analyse, og ventetid afsløring.

Introduction

Et centralt aspekt af hjernens fysiologi er dens evne til at behandle miljøoplysninger resulterer i forskellige iboende eller ydre output, såsom læring, hukommelse, følelsesmæssige reaktioner, eller motoriske svar. Forskellige eksperimentelle og diagnostiske tilgange kan bruges til at karakterisere den elektrofysiologiske reaktionsevne af individuelle neuronal celletyper eller klynger/ensembler af neuroner inden for en stimulus-relaterede neuronal kredsløb. Disse elektrofysiologiske teknikker dækker forskellige rumlige dimensioner på mikro-, Meso-og makro skalaen1. Mikroskala niveauet omfatter spænding og strøm klemme tilgange i forskellige patch-clamp modes ved hjælp af f. eks kultiverede eller akut dissocierede neuroner1. Disse in vitro-teknikker giver mulighed for karakterisering af individuelle nuværende enheder og deres farmakologiske graduering2,3. En væsentlig ulempe er imidlertid manglen på systemiske oplysninger vedrørende integration og behandling af oplysninger om mikro-og makrokredsløb. Denne svækkelse er delvist overvundet af in vitro-teknikker af mesoscale, såsom multielektrode systemer, som giver mulighed for samtidige ekstracellulære multielektrode optagelser ikke kun i dyrkede neuroner, men også i akutte hjerne skiver4, 5. der henviser til, at mikrokredsløb kan bevares i hjerne skiver i et bestemt omfang (f. eks. i hippocampus), er langtrækkende sammenkoblinger typisk tabt6. I sidste ende, for at studere de funktionelle sammenkoblinger inden for neuronal kredsløb, systemiske in vivo elektrofysiologiske teknikker på makro skalaen er den metode til valg7. Disse tilgange omfatter blandt andet overflade (epidural) og dybe (intracerebral) EEG-optagelser, som udføres i både mennesker og dyremodeller1. EEG signaler er overvejende baseret på synkroniseret synaptisk input på pyramide neuroner i forskellige kortikale lag, der kan være hæmmende eller excitatoriske i Principal, på trods af den generelle overvægt af excitatoriske input8. Ved synkronisering, excitatoriske postsynaptiske potentielle-baserede forskydninger i ekstracellulære elektriske felter opsummeres til at danne et signal af tilstrækkelig styrke til at blive optaget på hovedbunden ved hjælp af overflade elektroder. Især en detekterbar hovedbund optagelse fra en individuel elektrode kræver aktiviteten af 10000 af pyramidale neuroner og et komplekst armamentarium af tekniske anordninger og forarbejdnings værktøjer, herunder en forstærker, filtreringsprocesser (low-pass filter, højpasfilter, hak filter), og elektroderne med specifikke lederegenskaber.

I de fleste eksperimentelle dyrearter (dvs. mus og rotter), er den menneske baserede hovedbund EEG-metoden teknisk set ikke anvendelig, da signalet genereret af den underliggende cortex er for svagt på grund af det begrænsede antal synkroniserede pyramideformede neuroner9, 10,11. I gnavere er overflade-eller subdermal elektroder således alvorligt forurenet af elektrokardiogram og hovedsageligt elektromyogram artefakter, der gør EEG-optagelser af høj kvalitet umulig9,11, 12. ved brug af ubedøvelse frit bevægelige mus og rotter er det derfor obligatorisk at registrere enten fra cortex via epiduralelektroder eller fra de dybe, intracerebral strukturer for at sikre den direkte fysiske tilslutning af sensor spidsen af den ledende/implanterede elektrode til de signal genererende neuronal celle klynger. Disse EEG tilgange kan udføres enten i en fastholdelsesanordninger tøjret System Setup eller ved hjælp af ikke-begrænsende implantabelt udstyr EEG radio telemetri tilgang9,10,11. Begge teknikker har deres fordele og ulemper og kan være en værdifuld tilgang i den kvalitative og kvantitative karakterisering af beslaglæggelse følsomhed/beslaglæggelse aktivitet, cirkadiske rytmisk, søvn arkitektur, oscillerende aktivitet, og synkronisering, herunder tidsfrekvens analyse, kilde analyse osv.9,10,13,14,15,16,17.

Der henviser til, at tøjret systemer og radio telemetri muliggør EEG-optagelser under henholdsvis fastholdelses-/halv fastholdelses-eller ikke-fastholdelses betingelser, og at relaterede forsøgsbetingelser ikke svarer til kravene til ABR-optagelser. Sidstnævnte krav om definerede akustiske stimuli, som præsenteres gentagne gang med definerede positioner af en højttaler og forsøgsdyr og kontrollerede lydtrykniveauer (Spl'er). Dette kan opnås enten ved hoved fiksering under fastholdelses betingelser eller efter anæstesi18,19. For at reducere den eksperimentelle stress, dyr er normalt bedøvet under ABR eksperimenter, men det bør overvejes, at anæstesi kan forstyrre abrs19,20.

Som en generel egenskab er EEG opbygget af forskellige frekvenser i et spændingsområde på 50-100 μV. baggrunds frekvenser og amplituder er stærkt afhængige af det eksperimentelle dyrs fysiologiske tilstand. I vågen tilstand dominerer Beta (β) og gamma (γ) frekvenser med lavere amplitude. Når dyr bliver døsig eller falder i søvn, opstår Alpha (α), theta (ε) og Delta (δ) frekvenser, udviser øget EEG amplitude21. Når en sensorisk kanal (f. eks. den akustiske vej) stimuleres, formidles informationsudbredelse via neuronal aktivitet gennem det perifere og centrale nervesystem. En sådan sensorisk (f. eks. akustisk) stimulering udløser såkaldt EPs eller fremkaldt respons. Især, Event-relaterede potentialer (ERPs) er meget lavere i amplitude end EEG (dvs. et par mikrovolt kun). Således, enhver individuel ERP baseret på en enkelt stimulus ville gå tabt mod højere amplitude EEG baggrund. Derfor kræver en registrering af en ERP gentagen anvendelse af identiske stimuli (f. eks. Klik i ABR-optagelser) og efterfølgende gennemsnit for at eliminere enhver EEG-baggrundsaktivitet og artefakter. Hvis ABR optagelser er udført i bedøvet dyr, er det nemt at bruge subdermal elektroder her.

Primært, AEPs omfatter kort ventetid EPs, som normalt er relateret til ABRs eller BERA, og yderligere, senere debut potentialer såsom mellemventetid EPs (midlatency responser [MLR]) og lang ventetid EPs22. Det er vigtigt, at forstyrrelse i informationsbehandlingen af de auditive oplysninger ofte er et centralt element i neuropsykiatriske sygdomme (demyelinerende sygdomme, skizofreni osv.) og forbundet med aep's ændringer23,24 ,25. Mens adfærdsmæssige undersøgelser kun er i stand til at afsløre funktionel svækkelse, giver AEP undersøgelser mulighed for præcis spatiotemporale analyse af auditiv dysfunktion relateret til specifikke neuroanatomiske strukturer26.

ABRs som tidlige, kort ventetid akustisk EPs er normalt detekteres ved moderat til høj-intens Click ansøgning, og der kan forekomme op til syv ABR toppe (WI-wVII). De vigtigste bølger (Wi-wV) er relateret til følgende neuroanatomiske strukturer: Wi til auditiv nerve (distal del, inden for det indre øre); BII til cochlear Nucleus (proksimal del af Auditive nerve, brainstorm opsigelse); WIII til det overlegne olivary-kompleks (SOC); WIV til den laterale lemniscus (LL); WV til afslutning af den laterale lemniscus (LL) inden for det ringere colliculus (IC) på den kontralaterale side27 (supplerende figur 1). Det skal bemærkes, at WII-wV sandsynligvis vil have mere end én anatomisk struktur af den stigende auditive pathway, der bidrager til dem. Navnlig er den nøjagtige korrelation mellem toppe og underliggende strukturer i den auditive kanal stadig ikke fuldt afklaret.

I Audiology kan abrs bruges som et screenings-og diagnoseværktøj og til kirurgisk overvågning28,29. Det er vigtigst for identifikationen af dysacusis, hypacusis og anacusis (f. eks. i aldersrelateret høretab, høretab forårsaget af hørelse, metabolisk og medfødt høretab, og asymmetrisk høretab og høre underskud på grund af deformiteter eller misdannelser, skader og neoplasmer)28. ABRs er også relevant som en screening test for hyperaktive, intellektuelt svækkede børn eller for andre børn, der ikke ville være i stand til at reagere på konventionelle audiometri (f. eks. i neurologiske/psykiatriske sygdomme som ADHD, MS, autisme osv.29 , 30) og i udvikling og kirurgisk montering af cochlear-implantater28. Endelig kan abrs give værdifuld indsigt i de potentielle ototoksiske bivirkninger af neuropsykolæge midler, såsom antiepileptika31,32.

Værdien af oversættelsen af neurofysiologisk viden opnået fra farmakologiske eller transgene musemodeller til mennesker er blevet påvist i talrige miljøer, især på niveauet af Erp'er i auditive paradigmer hos mus og rotter33, 34af35. Ny indsigt i ændrede tidlige AEPs og tilhørende ændringer i auditiv informationsbehandling i mus og rotter kan således oversættes til mennesker og er af central betydning for karakterisering og endophenotypning af auditive, neurologiske og neuropsykiatriske sygdomme i fremtiden. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af, hvordan ABRs kan registreres og analyseres i mus til grundlæggende videnskabelige, toksikologiske og farmakologiske formål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra det tyske råd om dyrepasning, og alle protokoller blev godkendt af den lokale institutionelle og nationale Komité for dyrepasning (Landesamt für natur, Umwelt, und Verbraucherschutz, State Kontor i Nordrhein-Westfalen, departementet for natur, miljø og forbrugerisme [LANUV NRW], Tyskland). Forfatterne bekræfter endvidere, at alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr (NIH publikationer nr. 80-23) revideret 1996 eller den britiske dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986 og tilhørende retningslinjer, eller de Europæiske Fællesskabers rådsdirektiv af november 24, 1986 (86/609/EØF) og af september 22, 2010 (2010/63/EU). Der blev gjort en særlig indsats for at minimere antallet af anvendte dyr og deres lidelser (3R [udskiftnings-, reduktions-og raffinerings strategi]).

1. forsøgsdyr

  1. Udvælgelse af forsøgsdyr og arter
    1. Udføre ABR-undersøgelser i gnavere/gnaver modeller (dvs. mus eller rotter), der opfylder kravene til homologi, isomorfi og forudsigelighed i forbindelse med en bestemt sygdom hos mennesker. Dette er af særlig betydning med hensyn til grundlæggende aspekter i translationel neurovidenskab.
      Bemærk: Overvej, at tilgængelige diverse mus og rotte stammer kan vise forskelle i grundlæggende fysiologiske og patofysiologiske egenskaber36,37,38. Disse særlige forhold mellem mus og rotte line skal tages i betragtning i forbindelse med eksperimentel planlægning.
    2. Overvej muse-og rotte stamme-specifikke ændringer i fysiologi og farmakologi, der kan have indflydelse på elektrofysiologiske eksperimenter (f. eks. ændrede anæstesi følsomhed, cirkadiske rytmisk, [audiogen] krampe følsomhed, alder, og genetisk baggrund)39,40,41,42.
    3. Inkluder den kønsspecifikke stratificering i undersøgelsens design. Husk, at estrous cyklus kan alvorligt påvirke anæstesi følsomhed, central rhythmicity, cirkadiske afhængighed, og beslaglæggelse aktivitet (auditive anfald) og sensorisk (auditiv) information Processing43,44 , 45. Udfør således en kønsspecifik analyse.
      Bemærk: Begræns til hanmus, hvis den finansielle og eksperimentelle kapacitet er begrænset, selv om forskellige neurofysiologiske parametre fra normalt cykling hunner ikke synes at udvise øget variation i forhold til mænd46.
  2. Stalde og håndtering af dyr
    1. House mus eller rotter i individuelt ventilerede bure inde i et dyr facilitet.
    2. Flyt forsøgsdyr fra dyre faciliteten til ventilerede kabinetter placeret i særlige laboratorielokaler beregnet til anæstesi, ABR-elektrodeplacering og ABR-optagelser.
    3. Sørg for, at dyrene er anbragt i et ventileret kabinet under normale miljøforhold (dvs. med en temperatur på 21 ± 2 °C, 50%-60% relativ luftfugtighed og en konventionel 12/12 h lys/mørk cyklus). Lad dyrene akklimatisere og tilpasse sig dette cirkadiske mønster i mindst 14 dage før efterfølgende eksperimenter.
    4. Brug klare polycarbonat bure type II (26,7 cm x 20,7 cm x 14,0 cm, et areal på 410 cm2) til boliger mus i grupper af 3-4 og bruge klare polycarbonat bure type III (42,5 cm x 26,6 cm x 18,5 cm, et område på 800 cm2) for rotter. Give ad libitum adgang til drikkevand og standard mad pellets.
    5. Undgå adskillelse/isolering af forsøgsdyr før og efter ABR-optagelser, da isolation kan øve alvorlig stress, der påvirker forsøgsresultaterne. Placer derfor dyrene tilbage i deres hjem bur efter anæstesi, ABR elektrodeplacering og ABR optagelser.
    6. Anvend ikke åbne boligforhold, da de er genstand for en række eksperimentelle ulemper, især i auditive undersøgelser. Ventilerede kabinetter beskytter i stedet mod akustisk stress før og i mellem eksperimentelle auditive procedurer, som ellers kunne føre til sensorineuralt høretab (f. eks. støj-induceret høretab) og dermed påvirke resultaterne.
    7. Udnyt mus-og rotte-specifikke sanitære, anæstetika, og teknisk udstyr, således at hverken mus eller rotter kan fornemme tilstedeværelsen af hinanden som gensidig sensorisk opfattelse af rivaliende arter kan give anledning til undgåelige forstyrrende faktorer i undersøgelserne.

2. mus bedøvelse

  1. Udføre anæstesi ved hjælp af injicerbare anæstetika. Forbered en kombination af ketamin hydrochlorid (gnaver dosis: 100 mg/kg) og xylazinhydrochlorid (gnaver dosering: 10 mg/kg) i 0,9% NaCl eller ringer løsning og injicere dyret intraperitonealt baseret på sin kropsvægt.
    Bemærk: inhalations narkose via isofluran anbefales ikke, da ABR-proceduren normalt kræver en lyddæmpende kabine og Faraday Cage, hvilket resulterer i rumlige begrænsninger i optagelses opsætningen. Selv om mange anæstetika handle på NMDA-systemet og naturligvis påvirke ABR optagelse resultater, en ikke-anæstesi begrænsende tilgang i ABR optagelser anbefales ikke som fastholdelses procedurer under bevidsthed fremkalde dramatisk stress til dyret, med svær efterfølgende artefakt dannelse i ABRs.
  2. Observere dyrene omhyggeligt for dybden af anæstesi ved at udføre en hale knivspids, fod knivspids, og overvågning respiration sats (mus: 150-220 åndedrag/min). Kontrollér, om det er muligt at gise og modvirke.
    Bemærk: forskellige muse linjer eller farmakologiske musemodeller kan udvise forskellige følsomheder til anæstesi. Det samme gælder for muterede musemodeller. Endotracheal intubation er ikke et must i denne eksperimentelle indstilling og anbefales ikke. Da intubation øger risikoen for traumer for luftrøret og infektionen, er benefit/risk-forholdet for endotracheal tubus intubation under ABR-proceduren negativt.

3. generelle aspekter af perianesthetic arrangementer og instrumentering

  1. Anvend supplerende varme under og efter ABR optagelser ved hjælp af en homeothermic varmetæppe til at opretholde dyrets krop kernetemperatur. Opretholde sidstnævnte ved 36,5-38.0 °C (98.6-100.4 °F).
    Bemærk: hypotermi er en risikofaktor i små gnavere på grund af deres høje forhold mellem legemsoverflade (muse legemens overflade = 10,5 x (vægt i g)2/3; rotte legemsoverflade = 10,5 x (vægt i g)2/3) til krops volumenet.
  2. Dæk dyrets øjne med oliebaseret kunstig tåre salve eller 5% Dexpanthenol under hele ABR-optagelsesprocessen for at undgå cornea-udtørring. Fortsæt denne procedure, indtil den blinkende refleks er helt genoprettet.
  3. Steriliser de eksperimentelle instrumenter (Se tabellen over materialer) ved hjælp af en autoklave eller desinficerende midler.
    Bemærk: brugen af en varme baseret kirurgisk instrument sterilisator med glasperler anbefales.
  4. For nøjagtig ABR-elektrodeplacering skal du bruge et Binokulært kirurgisk forstørrelses mikroskop med en kold lyskilde til den intense belysning via fleksible eller selvbærende bevægelige lysstyrer.
  5. Brug en ren laboratorie frakke, en ansigtsmaske, et hoved dæksel og sterile handsker under eksperimentel dyre håndtering og eksperimenter.
    Bemærk: optimale instrumenter og forsyninger kan variere mellem laboratorier og skal opfylde Lab-specifikke og institutionelle standarder.

4. ABR-optagelser

Bemærk: den protokol, der er beskrevet her, er baseret på et kommercielt tilgængeligt ABR-system til mono og binaural optagelser. Det er vigtigt, at det videnskabelige spørgsmål, der skal behandles, skal opfylde de tekniske specifikationer for det anvendte ABR-system. ABR analyse af binaural optagelser, for eksempel, kan bruges til at undersøge den laterale kodning af auditive stimuli i auditive pathway og til at studere perifer lateral asymmetri i neuropsykiatriske sygdomme.

  1. Udfør en kalibrering af stimulations frekvenserne på hver optagelsesdag ved at placere en mikrofon, der er sluttet til en forforstærker, og behandlingssystemet (Se tabellen over materialer) inde i den lyddæmpende kabine på det sted, hvor den korrekte retning, hvor det eksperimentelle murine øre vil blive placeret.
    1. Tænd forforstærkeren, som er sluttet til mikrofonen, mindst 5 min før kalibreringen for at give mulighed for ligevægt i systemet.
    2. Tænd for Oscilloscope.
    3. Placer mikrofonen tilsluttet en forforstærker inde i den lyddæmpende kabine for at efterligne det eksperimentelle murine øre.
    4. Åbn den kommercielt tilgængelige software til behandling og anskaffelse (Se tabellen over materialer).
    5. Vælg kalibrerings Cal200K filen i softwaren for at aktivere kalibrerings konfigurationstilstanden, og vælg parametre i henhold til forsøgsbetingelserne.
    6. Brug processor systemet til at udføre kalibreringsproceduren. Sørg for, at de tekniske specifikationer for mikrofonen og højttaleren i form af SPL-grænser, frekvensområde og fordeling harmoniseres.
    7. Vælg og start den foruddefinerede Klik stimulerings protokol.
    8. Kør et enkelt klik SPL (helst den maksimale SPL) for at kontrollere, at spektret af lyd stimuli som analyseret af online Fast Fourier transformation (FFT) af oscilloskop matcher krav (betydelige energiområde).
    9. Vælg og start den foruddefinerede tone-burst-stimulerings protokol inden for rækkevidde af interesse (f. eks. 1-42 kHz).
    10. Bekræft frekvensspektret af de indspillede akustiske test stimuli ved hjælp af en oscilloskop og online FFT.
      Bemærk: den daglige kalibrering af systemet og stimulations frekvenserne er nødvendig for at sikre, at stimulations frekvenserne og Spl'erne er inden for acceptable arbejds intervaller.
  2. Placer den bedøvede mus i et lyddæmpende kabinet foret med akustisk skum.
    Bemærk: hele kabinen skal dækkes af et Faraday-bur (specialfremstillet, maskeret metal eller en kommerciel) for at beskytte ABR-optagelserne mod ekstern elektrisk interferens og beskytter dem mod støj.
  3. Til optagelse af mono hjernestammen-fremkaldte auditive potentialer, Indsæt subdermal rustfrit stål elektroderne ved knudepunkt, aksial af pinnae (positiv [+] elektrode) og ventrolaterale af højre eller venstre Pinna (negativ [-] elektrode) afhængigt af øre, der skal måles. For binaural optagelser, Placer de negative elektroderne på både højre og venstre pinnae. Anbring jordelektroden i dyrets hofte (supplerende figur 1).
    1. Før indsættelsen dannes en krog form ved spidsen af elektroden af rustfrit stål, således at subdermal fiksering af elektroderne er garanteret47.
  4. Foretag impedans målinger af alle elektroderne før hver optagelse for at verificere korrekt elektrode positionering/ledningsevne. Brug impedans check knappen på fire-kanals headstage for at verificere hvert elektrode impedans niveau.
    Bemærk: impedans skal være mindre end 5 kΩ.
  5. Optag abrs under frie feltforhold ved hjælp af en enkelt højttaler (frekvensbånd bredde, for eksempel ved 1-65 kHz) placeret 10 cm modsat af dyrenes talerstol (højttalerens forkant vinkelret på musens Interaural akse). Sørg for, at placeringen af musen hoved/mus ører er, at kalibrerings mikrofonen, afhængigt af den valgte specifikke afstand mellem højttaleren og mikrofonen under kalibrering.
    Bemærk: i stedet for frie feltforhold kan øreslanger også anvendes. Men, særlige forholdsregler og tests er nødvendige for at bestemme SPLs i disse indstillinger.
  6. Programmér stimulus protokollerne for klik og tone udbrud ved hjælp af selv programmeret eller kommercielt tilgængelig software (Se tabellen over materialer). De enkelte stimulus parametre, der er anført nedenfor, skal føjes til den relaterede grafiske brugergrænseflade.
    1. Start med konfigurationen af Click stimulus-enheden (dvs. en 100 μs varighed stimulus med vekslende polaritet [Skift mellem kondensation og rarefaction] og den definerede betydelige energi. Brug denne stimulus-enhed til at analysere og bestemme Klik tærskler, ABR symmetri af venstre og højre øre, ABR W (I-IV) amplituer, og W (I-IV) latencer senere.
    2. Start softwaren, og brug konfigurationsvinduet til at tilføje Klik stimulerings parametrene. Klik på Udfør for at køre protokollen.
    3. Fortsæt med konfigurationen af den anden stimulus-enhed, som er en 4,5 MS tone burst (forbigående sinusformet puls) af alternerende polaritet med Hann konvolut stigning og fald tider på 1,5 MS hver (Gate/rampe tid varighed). Overvej en minimal tone burst varighed af 3 MS, især for lavfrekvente tone udbrud. Brug denne stimulus til at analysere og identificere frekvens specifikke høre tærskler i alle genotyper.
    4. Svarende til trin 4.6.2 skal du bruge konfigurationsvinduet til at tilføje parametre for tone burst-stimulus og klikke på Udfør for at køre protokollen (som angivet af producenten48).
    5. For tone burst-studier skal du programmere det relevante frekvensområde, der testes, afhængigt af det videnskabelige spørgsmål (f. eks. fra 1-42 kHz i 6 kHz trin). Sørg for, at de frekvensintervaller, der skal anvendes, opfylder højttalerens tekniske muligheder (i dette tilfælde en magnetisk multifield-højttaler med en frekvens båndbredde på 1-65 kHz til frie eller lukkede feltforhold).
    6. For gennemsnit, indstille antallet af sekventielle akustiske stimuli (klik eller tone brister), for eksempel, ved 300x med en hastighed på 20 Hz.
    7. Forøg Spl'erne i 5 dB trin for klik og 10 dB trin for tone brister, startende fra 0 dB op til 90 dB (stigende SPL-tilstand).
      Bemærk: både stigende og faldende SPL-tilstande er beskrevet i litteraturen. SPL-trin størrelsen kan tilpasses på grund af videnskabelige spørgsmål.
  7. Bestemme en ABR-data anskaffelsestid på 25 MS, begyndende med en 5 MS baseline-periode forud for den enkelte akustiske stimulans debut (præ-ABR baseline) og overskrider en 10 MS ABR-sektion med en anden 10 MS baseline (post-ABR baseline) (supplerende figur 1 ).
  8. Anvend en passende samplingfrekvens for ABR-dataopsamling (f. eks. 24,4 kHz) og båndpas-filter (High Pass: 300 Hz, low pass: 5 kHz) ved hjælp af et 6-polet Butterworth-filter. Aktivér eventuelt hakket filter.
    Bemærk: prøveudtagnings hastigheden og filteregenskaberne kan tilpasses på grund af eksperimentelle krav.
  9. De resulterende bioelektriske signaler, der optages fra subdermal elektroder, overføres til et hoved stadie og videre frem til en forforstærker med passende forstærkning (f. eks. 20 gange).
  10. Brug en specifik ABR-system behandlings software til at koordinere højttaler styring og ABR-anskaffelse,-behandling,-gennemsnit og dataadministration.
  11. Prøv at udføre hele ABR protokollerne (for klik-og tone burst-fremkaldte høre tærskler, Peak amplitude, og Peak latency analyse, etc.) inden for omkring 45 min. Dette svarer til tidspunktet for dyb narkose ved hjælp af 100/10 mg ketamin/xylazine intraperitoneally.
  12. Sørg for, at kalibrering, programmering/justeringer for stimulus præsentation og erhvervelse, filterindstillinger, etc. fungerer som forventet forud for bedøvelsesmidlet dyret og udfører den faktiske optagelse.

5. ABR-analyse

  1. Klik-og tone burst-fremkaldte ABR-høre tærskelværdi analyse
    1. Udfør automatiseret tærskel registrering baseret på tidligere publikationer for at undgå potentielle uoverensstemmelser i ABR-tærskel bestemmelsen ved visuel inspektion/estimering49,50,51,52.
    2. Definer tre særskilte tidsvinduer (TWs) for at beregne signal-støj-forholdet (SNR): TW1 (0-5 MS), TW2 (5-15 MS) og tw3 (15-25 ms) (supplerende figur 1).
    3. Beregning af støj standardafvigelsen for basislinjen inden for de to særskilte TWs (dvs. TW1 og tw3), hvor der ikke observeres nogen AEPS. Denne beregning kan foretages ved hjælp af selv programmeret software.
    4. Beregn for hver SPL-måling i en ABR-post indstilling både middelværdien og standardafvigelsen for de samlede data for TW1 og tw3.
    5. Nulstil alle optagelsesprøver enkeltvis med den tilsvarende beregnede middelværdi for at fjerne en JÆVNSTRØMS forskydning.
    6. For bestemmelse af høretærsklen identificeres den laveste SPL (dB), hvor mindst én bølge amplitude værdi (Wi-wIV) i vinduet ABR-Svartid (TW2) overskred den firedobbelte af den tidligere beregnede standardafvigelse.
      Bemærk: Hvis der ikke blev fundet ABR Wave for klik-og frekvens tærskel analyse ved den maksimale SPL, tildeles øret et nominelt tærskelniveau på 100dB.
  2. Analyse af ABR bølge amplitude og bølge ventetid
    1. Udfør en Wavelet-baseret tilgang ved hjælp af den mexicanske hat Wavelet til at bestemme den tidsmæssige-sekventielle arrangement af positive (p) bølger (toppe) samt de negative (n) bølger (Pits) ved hjælp af en standard Wavelet ved kontinuerlig Wavelet Transform (CWT)-baseret mønster matchende algoritme52 (supplerende figur 1).
      1. Matematisk er CWT repræsenteret som følger53.
        Equation
        Her er s (t) signalet, a er skalaen, b er oversættelsen, om (t) er moderen Wavelet, er en, b(t) er skaleret og oversat Wavelet, og C er 2D matrix af Wavelet koefficienter.
    2. I første omgang skal du bruge 55-dB-målingen for hver ABR-kørsel til at identificere de bedste skaleringsparametre for hver bølge, der skal overføres til CWT, hvilket resulterer i tre klasser: skalaer 0,5-4 for alle n-bølger, 0,5-6 for alle p-bølger og 0,5-12 for WIV , da dette er det bredeste bølge i prøverne.
      Bemærk: 55 dB SPL blev valgt som bølger er generelt mest fremtrædende her og kan påvises pålideligt.
    3. Bevis alle klasser til pålideligt at detektere den korrekte tidsmæssige samhusning af Wi-wIV inden for alle 55 dB målinger.
    4. For at bestemme ABRw i-wIV i den nøjagtige tidsmæssige rækkefølge inden for 55 dB-målingen identificeres p-toppe og n-toppe (Pits) i en fast sekvens med relative positioner af tidligere identificerede toppe for at begrænse tidsvinduet for efterfølgende scanninger.
    5. Når alle ni toppe er identificeret ved 55 dB, anvendes relaterede værdier som udgangspunkt for den tidsmæssige søge ramme for de tilstødende lydtryk målinger (50 dB og 60 dB), før identifikationen af toppe 1-9 gentages.
    6. På denne måde bestemmes p-og n-toppe af alle dB-niveauer (55-0 dB og 60-90 dB), hvis det er muligt. Når en p-og n-peak ikke længere identificeres ved Wavelet-analysen, fastsættes dens tidsmæssige placering ved at beregne toppens tidsmæssige forskydning til enhver anden top, der identificeres i det foregående dB-niveau.
    7. Anvendelse af den tidsmæssige forskydning til toppe til andre p-og n-peak inden for det nuværende decibel niveau resulterer i maksimalt otte fastsatte tidsmæssige positioner for de udefineret toppe, hvormiddelværdien tages som den nærmeste tilnærmelse.
    8. For at evaluere amplitude vækst funktion og latenstid sammenligning af alle bølger (WI-wIV), karakteriserer de maksimale amplituder og gennemsnitlige latorer af hver af p-toppe inden for tidsrammen for de relaterede n-toppe.
    9. Kontroller visuelt alle resultater baseret på det selv programmerede automatiske Wavelet-værktøj bagefter, og Ekskluder om nødvendigt individuelle ABR-kørsler fra statistikken, hvis de ikke opfylder de strenge inklusions-/kvalitetskriterier.
      Bemærk: i både automatiseret analyse og visuel inspektion af ABRs anbefales en dobbeltblindet tilgang.

6. postoperativ pleje og post-ABR behandling

  1. Løbende overvåge dyrene, indtil de har genvundet bevidsthed og er i stand til at opretholde brystbenet recumbency.
  2. Du må ikke returnere et dyr, der har gennemgået ABR-optagelser, til virksomheden af andre dyr, før det er fuldt tilbagebetalt.
  3. Injicér carprofen (mus: 1x 5-10 mg/kg, subkutant; rotte: 1x 2,5-5,0 mg/kg, subkutant) til postoperativ smertebehandling.
    Bemærk: langtidsholdbar smertebehandling er ikke påkrævet, da ABR-optagelses elektroder indsættes subkutant.
  4. Postoperativt foder fugtet pellets for at lette udbredelsen af fødevarer. Omhyggeligt observere mad (~ 15 g/100 g kropsvægt/dag; ~ 5 g/24 h) og vand (~ 15 mL/100 g legemsvægt/dag; ~ 5 mL/24 h) forbrug.
  5. Overvåge dyrene nøje for tilbagevenden af deres normale stillinger og adfærd.
    Bemærk: systemisk administration af antibiotika såsom enrofloxacin eller trimethoprim-sulfonamid anbefales ikke her, da subdermal elektrodeplacering kun er minimal invasivitet. Anvendelse af antibiotika bør begrænses, medmindre der forekommer tegn på lokal eller generaliseret inflammation.
  6. Opfølgende post eksperimentel bedring efter ABR-optagelser ved at kontrollere dyrets legemsvægt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Klik-og tone burst-fremkaldte ABR-optagelser kan bruges til at evaluere forskelle i høre tærskelværdier, amplitude vækst funktion og latenstid sammenligning. Klik-fremkaldte ABRs i SPL stigende tilstand er afbildet i figur 1 for kontrol og to eksemplariske muterede muse linjer, som er mangelfuld for cav3,2 T-type spændings-gated ca2 + kanal (dvs. cav3,2+/- og ca v3,2 null-mutanter [Cav3,2-/-]). Som skitseret ovenfor anbefales en kønsspecifik undersøgelse generelt på grund af kønsspecifikke forskelle i auditive parametre i mennesker54,55 og mus56,57. ABRs til frit felt klik (0,1 MS) og tone burst (1 – 42 kHz i 6 kHz trin, 4,5 MS i alt med en 1,5 MS rampe tid) akustiske stimuli blev indspillet som beskrevet i protokollen. Bemærk, at knudepunkternes positive potentialer afbildes som opadgående deformation som afbildet i repræsentative Klik-fremkaldte optagelser for kvindelige cav3,2+/+ (figur 1a), cav3,2+/- (figur 1b ) og cav3,2-/- mus (figur 1c). I denne indstilling, repræsentative ABRs hos kvinder foreslog en øget Klik-fremkaldte ABR hørelse tærskel og ændret amplitude vækst funktion i kvindelige cav3,2-/- mus sammenlignet med cav3,2+/+ og cav 3,2+/- dyr. Den samme tendens blev observeret for mænd, som foreslog en øget Klik-fremkaldte ABR tærskler og reducerede amplituder i cav2,3-/- sammenlignet med kontrol og heterozygot cav3,2+/- mus. Eksemplarisk tone burst-fremkaldte ABR'er er afbildet i figur 2 for kvindelige cav3,2+/+, cav3,2+/-og cav3,3-/- mus (alle dyr var 20 uger gamle).

Som et første skridt i analysen af den generelle hørelse blev der undersøgt en række ABRs for forskellige Spl'er (0 – 90 dB) ved hjælp af det automatiserede ABR-tærskel detekteringssystem, der er beskrevet i protokollens afsnit 5 (figur 3). De analyserede dyr var alders matchede, da aldring kan have en dramatisk indvirkning på sensorineuralt høretab58,59. Dernæst blev potentielle ændringer i ABR-tærskelværdierne fremkaldt af forskellige tone burst-frekvenser (1 – 42 kHz, figur 4) analyseret. I de eksemplariske muse linjer, cav2,3+/- og cav3,2-/- udstillet øgede Klik-og tone burst-relaterede høre tærskler i forhold til kontrol (alle dyr var 20 uger gamle).

Ved hjælp af den Wavelet-baserede tilgang, der er skitseret ovenfor, klik-fremkaldte ABR amplitude vækst funktion og ABR bølgeform latency analyse blev udført (figure 5 og figure 6, hhv.). Sidstnævnte giver indsigt i den mulige rumlige indflydelse af genet af interesse for auditiv informationsbehandling i det indre øre og hjernestammen.

Figure 1
Figur 1: Klik-fremkaldte ABRs i kontrol og mutant mus (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Repræsentative ABR fremstillet af (A)ca v3,2 +/+, (B) cav3,2+/-, og (C) cav3,2-/- hunmus ved klik stimulation i den stigende SPL-tilstand (fra 0 – 90 dB med 5 dB SPL trin). For gennemsnit blev hver stimulus-enhed anvendt 300 gange ved 20 Hz. Den akustiske stimulus debut er angivet med en lodret rød linje. Dette tal er modificeret fra Lundt et al.60. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: tone burst-fremkaldte ABRs i kontrol og mutant mus (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Repræsentative abrs fra (A) cav 3,2+/+, (B) cav3,2+/-, og (C) cav3,2-/- hunmus efter tone udbrud på 1 – 42 kHz (6 kHz trin) ved et SPL på 80 dB. For gennemsnit blev hver stimulus-enhed præsenteret 300 gange ved 20 Hz. Den akustiske stimulus debut er angivet med en lodret rød linje. Dette tal er modificeret fra Lundt et al.60. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Klik-fremkaldte ABR-baserede høre tærskler i kontrol og mutant mus (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Klik-evoked audiometrisk høretærskel for (A) kvinde og (B) mandlige cav3,2+/+ (kvinde: n = 12; han: n = 13), cav3,2+/- (kvinde: n = 10; mand: n = 9) og cav3,2-/- mus (kvinde: n = 10; mand: n = 9). Data afbildes som middelværdien ± SEM. Statistisk signifikans blev fastlagt ved anvendelse af α-niveau = 0,05 og p-værdier defineret som *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dette tal er modificeret fra Lundt et al.60. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Tone burst-fremkaldte ABR-baserede høre tærskler i kontrol og mutant mus (cav3,2+/-, cav3,2-/-). 1 – 42 kHz (6 kHz trin) tone burst-fremkaldte ABR-baserede audiometriske høre tærskler for cav3,2+/+ (kvinde: n = 12; mand: n = 12; ▲), cav3,2+/- (kvinde: n = 10; mand: n = 8; ■), og cav3,2-/- dyr (kvinder: n = 10; mand: n = 9; ○). Data afbildes som middelværdien ± SEM. Statistisk signifikans blev fastlagt ved anvendelse af α-niveau = 0,05 og p-værdier defineret som *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dette tal er modificeret fra Lundt et al.60. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: amplitude vækst funktion på Klik-baserede ABR optagelser i kontrol og mutant mus (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Wi – wIV amplitude (i μV) plottet mod en stigende SPL (i decibel) for klik-fremkaldt ABR bølge analyse i cav3,2+/+ (kvinde: n = 12; mand: n = 11; sort linje, der repræsenterer tilnærmeld kontrol kurve, herunder 95% konfidensinterval i gråt), cav3,2+/- (kvinde: n = 8; mand: n = 7; ■) og cav3,2-/- dyr (kvinder: n = 7; mand: n = 9 ; ○). Både cav3,2-/- kvinder og hanmus udviser signifikant forsinket stigning i amplitude væksten på tværs af de stigende spl'er for (a og B) wI, (C og D) wII, og (G og H) WIV sammenlignet med cav3,2+/+ og cav3,2+/- mus. (E og F) For WIIIviste kun cav3,2-/- hanmus en signifikant forsinkelse i amplitude væksten på tværs af den stigende SPL sammenlignet med kvindelige cav3,2-/- dyr. Data præsenteres som middelværdien ± SEM. Statistisk signifikans blev fastlagt ved anvendelse af α-niveau = 0,05 og p-værdier defineret som *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dette tal er modificeret fra Lundt et al.60. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: ventetid analyse ved klik-fremkaldte ABR optagelser i kontrol og mutant mus (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Ventetid (i millisekunder) for hver ABR-bølge (wi– wIV) ved 65 dB SPL er afbildet forca v3,2+/+ (kvinde: n = 12; mand: n = 11), cav3,2+/- (kvinde: n = 8; mand: n = 7) og Cav3,2-/- mus (kvinde: n = 8; mandlig: n = 9). Bemærk, at ventetid analyse kan også udføres på specifikke sensation niveauer. Data afbildes som middelværdien ± SEM. Statistisk signifikans blev fastlagt ved anvendelse af α-niveau = 0,05 og p-værdier defineret som *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dette tal er modificeret fra Lundt et al.60. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: ABR-arkitektur og elektrode positionering. A) repræsentativ ABR-optagelse ved 65 dB SPL. Den oprindelige baseline (TW1,5MS) blev efterfulgt af test stimulus (klik eller tone burst) og tw2 (10 MS), der indeholder de tidlige hjernestammen-fremkaldte potentialer. TW2 blev efterfulgt af en anden baseline (TW3, 10 MS). De oprindelige perioder blev brugt til at beregne SD af den grundlæggende støj. Når en individuel ABR bølge (WI-wIV) amplitude oversteg SD af baseline støj i firfold, blev høretærsklen nået. For bølge amplitude og latenstid sammenligning, en "mexicansk hat"-baserede Wavelet tilgang blev udført for automatisk at opdage negative toppe (blå-gule stribede linjer) og positive toppe (rød-grå stribede linjer). Grønne Kors indikerer det absolutte maksimum af ABR bølge amplituer og viser ikke tilnærlede værdier baseret på Wavelet-tilgangen. B) for ABR-optagelserne anvendtes subdermal elektroder af rustfrit stål med en krog formet spids. Reference elektroden blev anbragt i venstre hofte, den positive (+) elektrode blev placeret ved knudepunktet (aksial i pinnae), og den negative (-) elektrode blev indsat ventrolaterale af højre Pinna, afhængigt af om en mono eller binaural optagelse var Udført. Dette tal er modificeret fra Lundt et al.60. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol indeholder en detaljeret og Integrativ beskrivelse af, hvordan auditive fremkaldte Brain EM-svar optages i mus. Det sætter specifikt fokus på dyrs forbehandling, anæstesi, og potentielle metodologiske forstyrrende faktorer. Sidstnævnte omfatter blandt andet køn, muse linje, alder og boligforhold. Det skal bemærkes, at alle disse faktorer kan have en indvirkning på sensorineuralt høretab og grundlæggende aspekter af auditiv informationsbehandling. Derfor er passende stratificering af auditive profilering undersøgelser obligatorisk.

Instrumenteringen af AEP optagelser har enormt udviklet sig i de sidste 50-60 år, og i dag, kommercielle ABR registreringssystemer er til rådighed, som har forbedret og forenklet anvendelsen af teknikken, men har også indført nye faldgruber. Nogle af disse aspekter drøftes her. For det første skal brugeren vænne sig til ABR-systemet, det vil være instrumentering bestående af stationær eller bærbar computer, forforstærker, forstærker, elektrode indtastningsboks og potentielle transducere (f. eks. højttalere, isætning af øretelefoner, supraaural hovedtelefoner og knogle oscillatorer). Navnlig er optagelsesforholdene af central betydning. På grund af deres høje modtagelighed skal ABR-optagelser være afskærmede for at beskytte dem mod kontaminering med ekstern elektrisk støj og for at sikre et tilstrækkeligt signal-støj-forhold.

Et andet vigtigt aspekt er instrumentering selv (f. eks. stimulus generator, transducere, og udløsere). De mest almindeligt anvendte typer af stimuli i mus er 100 μs Klik og kortvarige tone brister med en moduleret amplitude og/eller frekvens egenskaber. Transducere kan præsentere en række akustiske stimuli enten til det ene øre eller til begge ører. Her har vi præsenteret ABR resultater ved hjælp af en enkelt højttaler rostral Columns til forsøgsdyr. Men, andre tilgange er også muligt, herunder Tubal-stil indsætte øretelefoner enten i det ene øre eller begge ører. Supra-aural hovedtelefoner som anvendes i mennesker er ikke muligt i mus. Som litteraturen illustrerer, kan forskellige tilgange være vellykkede, og de bør tilpasses afhængigt af de eksperimentelle behov. Der skal lægges særlig vægt på nøjagtigheden af udløseren, som er afgørende for signal i gennemsnit, da denne digitale puls afgør, hvornår hver enkelt stimulus præsenteres. For korrekt optagelser skal udløseren og stimulus debut være synkrone, der repræsenterer tidspunkt nul. Kommercielt tilgængelige ABR-optagelses systemer omfatter normalt selv indesluttede udløsere, når de enkelte stimuli præsenteres. I mange systemer, der er eksterne indgange, som tillader en forbindelse fra en ekstern stimulus generator og en tilhørende udløser. I begge tilfælde viste det sig at være værdifuldt at kontrollere stimulus og udløse egenskaber ved hjælp af en ekstern Oscilloscope. Der skal også lægges særlig vægt på anskaffelses parametrene (f. eks. differentialforstærkning, filtrering, analog versus digitale filtre, filter design og parametre for signal gennemsnit). Især parametre præsenteret i den protokol, der præsenteres her, passer til de eksperimentelle krav i de eksemplariske resultater, der er afbildet ovenfor. Men tilpasninger, for eksempel i prøveudtagnings hastigheden, antallet af stimuli, der anvendes til gennemsnit, og deres anvendelse frekvens, kan være nødvendigt afhængigt af de eksperimentelle indstillinger.

Endelig bør der gives nogle korte kommentarer om elektrode impedans, elektrode typer og elektrodeplacering. Elektroderne fungerer som antenner, picking up spændingsændringer fra under huden. Subkutan elektrodeplacering er obligatorisk, da den blotte anvendelse af elektroder på huden eller hovedbunden ikke er egnet på grund af modstanden i det ydre hudlag (dvs. stratum corneum). Der henviser til, at den elektriske ledningsevne normalt forbedres ved at anvende døde hudceller og anvendelse af en elektrolyt-gel eller-pasta, men dette er normalt ikke gjort og egnet til mus, hvor der anvendes subdermal elektrode. Grænsefladen af elektrode og huden danner elektrode impedansen, som omfatter de elektriske egenskaber af dirigenten i alt. Dirigentens egenskaber omfatter elektrodens materielle egenskaber og overfladearealet af den kontaktende elektrode, vævs egenskaber, herunder snavs (olie, snavs, sved osv.) og elektrolyt opløsningen. Elektrode materialet omfatter sølv, guld, platin, bly, tin og rustfrit stål med lav impedans og lav elektrode potentialer. Der skal udvises forsigtighed ved, at elektrode materialet er inert under optagelses forhold. Med sølv opnås dette ved hjælp af såkaldte komplekse elektroder (dvs. sølv-sølvklorid [Ag-AgCl] elektroderne). I dette tilfælde, den elektriske dobbelt lag giver mulighed for en fri udveksling af ioner, som yderligere reducerer impedans. Det anbefales ofte, at elektrode impedansen ikke må overstige 5 kΩ, og at impedansen af de enkelte elektroder (mindst tre) er sammenlignelig. Det anbefales også, at interelektrode impedansen skal være under 2 kΩ. Optage elektroden repræsenterer en lang metal ledning med en isolerende belægning. Trådelektroden tilsluttes via et stik til kontrolapparatet, i de fleste tilfælde forforstærker/forstærker. I mus er den anden ende af elektrode tråden normalt oprustning af en nål-elektrode, der kan efterlades lige eller — bedre — arcuated. Andre elektrode typer, såsom disk-eller Cup-formede, uanset om de er til genbrug eller prægerede engangsbrug, er begrænset til anvendelse hos mennesker og gælder ikke for mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Christina Kolb (tysk Center for neurodegenerative sygdomme [DZNE]) og Dr. Robert Stark (DZNE) for deres bistand i dyreopdræt og dyresundheds pleje. Dette arbejde blev støttet finansielt af Forbundsinstituttet for narkotika og medicinsk udstyr (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM, Bonn, Tyskland).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AEP/OAE Software for RZ6 (BioSigRZ software) Tucker-Davis Technologies (TDT) BioSigRZ
Binocular surgical magnification microscope Zeiss Stemi 2000 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
Cages (Macrolon) Techniplast 1264C, 1290D
Carprox vet, 50mg/ml Virbac Tierarzneimittel GmbH PZN 11149509
Cold light source Schott KL2500 LCD 9.705 202
Cotton tip applicators (sterile) Carl Roth EH12.1
Custom made meshed metal Faraday cage (stainless steel, 2 mm thickness, 1 cm mesh size) custom made custom made
5% Dexpanthenole (Bepanthen eye and nose creme) Bayer Vital GmbH PZN: 01578681
Disposable Subdermal stainless steel Needle
electrodes, 27GA, 12mm		 Rochester Electro-Medical, Inc. S03366-18
Surgical drape sheets (sterile) Hartmann PZN 0366787
Ethanol, 70% Carl Roth 9065.5
1/4'' Free Field Measure Calibration Mic Kit Tucker-Davis Technologies (TDT) PCB-378C0
Gloves (sterile) Unigloves 1570
Graefe Forceps-curved, serrated FST 11052-10
GraphPad Prism 6 Software, V6.07 GraphPad Prism Software, Inc. https://www.graphpad.com/
Heat-based surgical instrument sterilizer FST 18000-50
Homeothermic
heating blanked		 ThermoLux 461265 / -67
Ketanest S (Ketamine), 25mg/ml Pfizer PZN 08707288
Ringer’s solution (sterile) B.Braun PZN 01471434
Matlab software MathWorks, Inc. https://de.mathworks.com/products/matlab.html
Medusa 4-Channel Low Imped. Headstage Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4LI
Medusa 4-Channel Pre-Amp/Digitizer Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4PA
Microphone PCB Pieztronics 378C01
Multi Field Speaker- Stereo Tucker-Davis Technologies (TDT) MF1-S
Oscilloscope Tektronix DPO3012
Optical PC1 express card for Optibit Interface) Tucker-Davis Systems (TDT) PO5e
Askina Braucel pads (cellulose absorbet pads) B.Braun PZN 8473637
Preamplifier PCB Pieztronics 480C02
RZ6 Multi I/O Processor system (BioSigRZ) Tucker-Davis Technologies (TDT) RZ6-A-PI
0.9% saline (NaCl, sterile) B.Braun PZN:8609255
SigGenRZ software Tucker-Davis Technologies (TDT) https://www.tdt.com/
Software R (version 3.2.1) + Reshape 2 (Version 1.4.1) + ggplot 2 (version 1.0.1) + datatable (version 1.9.4), + gdata (version 2.13.3), + pastecs (version 1.3.18), + waveslim (version 1.7.5), + MassSpecWavelet (version 1.30.0) The R Foundation, R Core Team 2015 Open Source Software (freely distributable)
Sound attenuating cubicle Med Associates Inc. ENV-018V
Standard Pattern Forceps, 12cm and 14.5 cm length FST 11000-12, 11000-14
Leukosilk tape BSN medical GmbH & Co. KG PZN 00397109
Tissue Forceps- 1x2 Teeth 12 cm FST 11021-12
Uniprotect ventilated cabinet Bioscape THF3378
Ventilated cabinet Tecniplast 9AV125P
Xylazine (Rompun), 2% Bayer Vital GmbH PZN 1320422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sporns, O., Tononi, G., Kotter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLOS Computational Biology. 1 (4), e42 (2005).
  2. Bebarova, M. Advances in patch clamp technique: towards higher quality and quantity. General Physiology and Biophysics. 31 (2), 131-140 (2012).
  3. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  4. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  5. Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
  6. Heuschkel, M. O., Fejtl, M., Raggenbass, M., Bertrand, D., Renaud, P. A three-dimensional multi-electrode array for multi-site stimulation and recording in acute brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 135-148 (2002).
  7. Kimiskidis, V. K. Transcranial magnetic stimulation (TMS) coupled with electroencephalography (EEG): Biomarker of the future. Reviews in Neurology. 172 (2), 123-126 (2016).
  8. Nunez, P. L. Toward a quantitative description of large-scale neocortical dynamic function and EEG. Behavioral Brain Science. 23 (3), 371-437 (2000).
  9. Lundt, A., et al. EEG Radiotelemetry in Small Laboratory Rodents: A Powerful State-of-the Art Approach in Neuropsychiatric, Neurodegenerative, and Epilepsy Research. Neural Plasticity. 2016, 8213878 (2016).
  10. Papazoglou, A., et al. Non-restraining EEG Radiotelemetry: Epidural and Deep Intracerebral Stereotaxic EEG Electrode Placement. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), e54216 (2016).
  11. Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Research Brain Research Protocols. 14 (3), 154-164 (2005).
  12. Kallstrand, J., Nehlstedt, S. F., Skold, M. L., Nielzen, S. Lateral asymmetry and reduced forward masking effect in early brainstem auditory evoked responses in schizophrenia. Psychiatry Research. 196 (2-3), 188-193 (2012).
  13. Muller, R., et al. Automatic Detection of Highly Organized Theta Oscillations in the Murine EEG. Journal of Visualized Experiments. (121), e55089 (2017).
  14. Papazoglou, A., et al. Gender specific hippocampal whole genome transcriptome data from mice lacking the Cav2.3 R-type or Cav3.2 T-type voltage-gated calcium channel. Data in Brief. 12, 81-86 (2017).
  15. Papazoglou, A., et al. Gender-Specific Hippocampal Dysrhythmia and Aberrant Hippocampal and Cortical Excitability in the APPswePS1dE9 Model of Alzheimer's Disease. Neural Plasticity. 2016, 7167358 (2016).
  16. Papazoglou, A., et al. Motor Cortex Theta and Gamma Architecture in Young Adult APPswePS1dE9 Alzheimer Mice. PLOS ONE. 12 (1), e0169654 (2017).
  17. Siwek, M. E., et al. Altered theta oscillations and aberrant cortical excitatory activity in the 5XFAD model of Alzheimer's disease. Neural Plasticity. , 781731 (2015).
  18. Welch, T. M., Church, M. W., Shucard, D. W. A method for chronically recording brain-stem and cortical auditory evoked potentials from unanesthetized mice. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 60 (1), 78-83 (1985).
  19. Church, M. W., Gritzke, R. Effects of ketamine anesthesia on the rat brain-stem auditory evoked potential as a function of dose and stimulus intensity. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 67 (6), 570-583 (1987).
  20. van Looij, M. A., et al. Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice. Hearing Research. 193 (1-2), 75-82 (2004).
  21. Schomer, D. L., da Silva, F. L. Niedermeyer's Electroencephalography: Basic Principles, Clinical Applications, and Related Fields. , Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
  22. De Cosmo, G., Aceto, P., Clemente, A., Congedo, E. Auditory evoked potentials. Minerva Anestesiology. 70 (5), 293-297 (2004).
  23. Rosburg, T. Auditory N100 gating in patients with schizophrenia: A systematic meta-analysis. Clinical Neurophysiology. 129 (10), 2099-2111 (2018).
  24. DiLalla, L. F., McCrary, M., Diaz, E. A review of endophenotypes in schizophrenia and autism: The next phase for understanding genetic etiologies. American Journal of Medical Genetics Part C Seminar in Medical Genetics. 175 (3), 354-361 (2017).
  25. Walsh, P., Kane, N., Butler, S. The clinical role of evoked potentials. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 76 Suppl 2, ii16-ii22 (2005).
  26. Opgen-Rhein, C., Neuhaus, A., Urbanek, C., Dettling, M. New strategies in schizophrenia: impact of endophentotypes. Psychiatrische Praxis. 31 Suppl 2, S194-S199 (2004).
  27. Knipper, M., Van Dijk, P., Nunes, I., Ruttiger, L., Zimmermann, U. Advances in the neurobiology of hearing disorders: recent developments regarding the basis of tinnitus and hyperacusis. Progress in Neurobiology. 111, 17-33 (2013).
  28. Miller, C. A., Brown, C. J., Abbas, P. J., Chi, S. L. The clinical application of potentials evoked from the peripheral auditory system. Hearing Research. 242 (1-2), 184-197 (2008).
  29. Manouilenko, I., Humble, M. B., Georgieva, J., Bejerot, S. Brainstem Auditory Evoked Potentials for diagnosing Autism Spectrum Disorder, ADHD and Schizophrenia Spectrum Disorders in adults. A blinded study. Psychiatry Research. 257, 21-26 (2017).
  30. Talge, N. M., Tudor, B. M., Kileny, P. R. Click-evoked auditory brainstem responses and autism spectrum disorder: A meta-analytic review. Autism Research. 11 (6), 916-927 (2018).
  31. Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion in Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
  32. Ismi, O., et al. The Effect of Methylphenidate on the Hearing of Children with Attention Deficit Hyperactivity Disorder. International Archive in Otorhinolaryngology. 22 (3), 220-224 (2018).
  33. Michna, M., et al. Cav1.3 (alpha1D) Ca2+ currents in neonatal outer hair cells of mice. Journal of Physiology. 553 (Pt 3), 747-758 (2003).
  34. Platzer, J., et al. Congenital deafness and sinoatrial node dysfunction in mice lacking class D L-type Ca2+ channels. Cell. 102 (1), 89-97 (2000).
  35. Willaredt, M. A., Ebbers, L., Nothwang, H. G. Central auditory function of deafness genes. Hearing Research. 312, 9-20 (2014).
  36. Yee, B. K., Singer, P. A conceptual and practical guide to the behavioural evaluation of animal models of the symptomatology and therapy of schizophrenia. Cell Tissue Research. 354 (1), 221-246 (2013).
  37. Fahey, J. R., Katoh, H., Malcolm, R., Perez, A. V. The case for genetic monitoring of mice and rats used in biomedical research. Mammalian Genome. 24 (3-4), 89-94 (2013).
  38. Hunsaker, M. R. Comprehensive neurocognitive endophenotyping strategies for mouse models of genetic disorders. Progress in Neurobiology. 96 (2), 220-241 (2012).
  39. Turner, J. G., Parrish, J. L., Hughes, L. F., Toth, L. A., Caspary, D. M. Hearing in laboratory animals: strain differences and nonauditory effects of noise. Computational Medicine. 55 (1), 12-23 (2005).
  40. Neumann, P. E., Collins, R. L. Genetic dissection of susceptibility to audiogenic seizures in inbred mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5408-5412 (1991).
  41. Meier, S., Groeben, H., Mitzner, W., Brown, R. H. Genetic variability of induction and emergence times for inhalational anaesthetics. European Journal of Anaesthesiology. 25 (2), 113-117 (2008).
  42. Majewski-Tiedeken, C. R., Rabin, C. R., Siegel, S. J. Ketamine exposure in adult mice leads to increased cell death in C3H, DBA2 and FVB inbred mouse strains. Drug Alcohol Dependence. 92 (1-3), 217-227 (2008).
  43. Bonthuis, P. J., et al. Of mice and rats: key species variations in the sexual differentiation of brain and behavior. Frontiers in Neuroendocrinology. 31 (3), 341-358 (2010).
  44. Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
  45. Jonasson, Z. Meta-analysis of sex differences in rodent models of learning and memory: a review of behavioral and biological data. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 28 (8), 811-825 (2005).
  46. Prendergast, B. J., Onishi, K. G., Zucker, I. Female mice liberated for inclusion in neuroscience and biomedical research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 40, 1-5 (2014).
  47. Ingham, N. J., Pearson, S., Steel, K. P. Using the Auditory Brainstem Response (ABR) to Determine Sensitivity of Hearing in Mutant Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 1 (2), 279-287 (2011).
  48. Tucker-Davis Technologies. SigGenRZ Manual. , Available from: https://www.tdt.com/files/manuals/SigGenRZ_Manual.pdf (2012).
  49. Bogaerts, S., Clements, J. D., Sullivan, J. M., Oleskevich, S. Automated threshold detection for auditory brainstem responses: comparison with visual estimation in a stem cell transplantation study. BMC Neuroscience. 10, 104 (2009).
  50. Probst, F. J., et al. A point mutation in the gene for asparagine-linked glycosylation 10B (Alg10b) causes nonsyndromic hearing impairment in mice (Mus musculus). PLOS ONE. 8 (11), e80408 (2013).
  51. Alvarado, J. C., Fuentes-Santamaria, V., Gabaldon-Ull, M. C., Blanco, J. L., Juiz, J. M. Wistar rats: a forgotten model of age-related hearing loss. Frontiers in Aging Neuroscience. 6, 29 (2014).
  52. Du, P., Kibbe, W. A., Lin, S. M. Improved peak detection in mass spectrum by incorporating continuous wavelet transform-based pattern matching. Bioinformatics. 22 (17), 2059-2065 (2006).
  53. Daubechies, I. Ten lectures on wavelets. , Society for Industrial and Applied Mathematics. Philadelphia, PA. (1992).
  54. Pearson, J. D., et al. Gender differences in a longitudinal study of age-associated hearing loss. Journal of the Acoustical Society of America. 97 (2), 1196-1205 (1995).
  55. Murphy, M. P., Gates, G. A. Hearing Loss: Does Gender Play a Role? Medscape Womens Health. 2 (10), 2 (1997).
  56. Henry, K. R. Males lose hearing earlier in mouse models of late-onset age-related hearing loss; females lose hearing earlier in mouse models of early-onset hearing loss. Hearing Research. 190 (1-2), 141-148 (2004).
  57. Ison, J. R., Allen, P. D., O’Neill, W. E. Age-related hearing loss in C57BL/6J mice has both frequency-specific and non-frequency-specific components that produce a hyperacusis-like exaggeration of the acoustic startle reflex. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 8 (4), 539-550 (2007).
  58. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hearing Research. 130 (1-2), 94-107 (1999).
  59. Zhou, X., Jen, P. H., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
  60. Lundt, A., et al. Cav3.2 T-Type Calcium Channels Are Physiologically Mandatory For The Auditory System. Neuroscience. , In Press (2019).

Tags

Denne måned i JoVE amplitude auditiv system gennemsnit binaural brainstorm klik hørelse tærskel ventetid monoterapi systemisk Neuro fysiologi tone burst Wavelet
Data opsamling og-analyse i hjernestammen fremkaldte respons audiometri i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lundt, A., Soos, J., Henseler, C.,… More

Lundt, A., Soos, J., Henseler, C., Arshaad, M. I., Müller, R., Ehninger, D., Hescheler, J., Sachinidis, A., Broich, K., Wormuth, C., Papazoglou, A., Weiergräber, M. Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice. J. Vis. Exp. (147), e59200, doi:10.3791/59200 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter