Summary
هنا، نقدم بروتوكول باستخدام جهاز تحديد المواقع الماوس التي تمكن من وضع المناسبة للفئران للإدارة داخل الأنف من الدماغ استهداف الببتيد-siRNA صياغة تمكين إسكات الجينات فعالة في الجهاز العصبي المركزي.
Abstract
وقد برز تسليم المخدرات داخل الأنف (IN) إلى الدماغ كطريقة واعدة لتجاوز حاجز الدم في الدماغ (BBB) لتسليم الأدوية إلى الجهاز العصبي المركزي (الجهاز العصبي المركزي). الدراسات الحديثة تبين استخدام الببتيد, RVG9R, دمج الحد الأدنى من المجال ملزمة مستقبلات من البروتين السكري فيروس داء الكلب, في الحصول على تسليم سيرنا في الخلايا العصبية في الدماغ. في هذا البروتوكول، يتم تسليم صياغة الببتيد-سيرنا بشكل غير مباشر مع ماصة في اليد المهيمنة، في حين يتم تقييد الماوس التخدير من قبل scruff مع اليد غير المهيمنة في "موقف الرأس إلى أسفل وإلى الأمام" لتجنب الصرف في الرئة والمعدة عند الاستنشاق. هذا السيطرة الدقيقة من الفئران يمكن تعلمها ولكن ليس من السهل ويتطلب الممارسة والمهارة لتحقيق فعالية تناول الجهاز العصبي الوطني. وعلاوة على ذلك، فإن العملية طويلة الأمد، وتتطلب حوالي 45 دقيقة لإدارة حجم إجمالي يتراوح بين حوالي 20-30 ميكرولتر من المحلول في أحجام قطرات 1-2 ميكرولتر لكل استنشاق، مع فترات راحة تتراوح بين 3 و4 دقائق بين كل استنشاق. والهدف من هذه الدراسة هو الكشف عن جهاز تحديد المواقع الماوس التي تمكن من وضع المناسبة من الفئران لإدارة كفاءة IN من صياغة الببتيد-سيرنا. يتم دمج ميزات متعددة في تصميم الجهاز، مثل أربعة أو ثمانية كراسي تحديد المواقع مع ارتفاع قابل للتعديل والميل لكبح الفئران التخدير في موقف الرأس إلى أسفل وإلى الأمام، مما يتيح تصور سهل ة من nares الفئران و المدمج في وسادة التدفئة للحفاظ على درجات حرارة الجسم الفئران خلال الإجراء. الأهم من ذلك، والقدرة على علاج أربعة أو ثمانية فئران في وقت واحد مع المجمعات RVG9R-siRNA بهذه الطريقة تمكن من إجراء دراسات على نطاق زمني أسرع بكثير، لاختبار نهج سيرنا العلاجية. في الختام، يسمح هذا الجهاز لتحديد المواقع مناسبة وخاضعة للرقابة رأس الماوس لتطبيق IN من RVG9R-siRNA والجزيئات العلاجية الأخرى، مثل الجسيمات النانوية أو الأجسام المضادة، لتسليم الجهاز العصبي المركز.
Introduction
يمنع BBB الجزيئات التي تدار بشكل منهجي من > 400-600 دا من دخول الدماغ، مما يشكل تحديا كبيرا لتسليم الجزيئات الحيوية العلاجية للأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي والدماغ1. ويمكن تحقيق التسليم المباشر للمخدرات إلى الدماغ عن طريق الحقن المجسم. ومع ذلك، وهذا يتطلب الخبرة الجراحية ومقيدة للغاية في التسليم إلى المناطق القريبةمن موقع الحقن، مما يجعلها غير مناسبة للاستخدام السريري الروتيني 2. في التسليم إلى الدماغ يمكن أن يؤدي أيضا إلى تسليم الدماغ مباشرة عن طريق تجاوز BBB، مما يسمح للنقل المباشر والسريع لمجموعة متنوعة من المواد إلى الدماغ3،4. ويعتقد أن هذا النقل يحدث عن طريق آليات النقل عن طريق الأعصاب الشمية وثلاثية التوائم التي تربط مرور الأنف إلى الدماغ، والسائل الدماغي الشوكي، والأنظمة اللمفاوية5. كما أن الطريق المباشر من الأنف إلى الدماغ لا ينطوي على الأجهزة الطرفية والأنسجة, فإنه يقلل إلى حد كبير من الآثار الجانبية النظامية ويحسن فعالية. IN Administration هو بديل غير الغازية واعدة على حد سواء الطرق المحلية والنظامية لتسليم الدماغ من العوامل العلاجية، ويمكن أن تمثل نهجا قويا لمكافحة الاضطرابات العصبية، بما في ذلك مرض الزهايمر، ومرض باركنسون، و سرطان الدماغ، ويجري استكشافها في العديد من التجارب السريرية6و7و8.
العديد من العوامل التجريبية، مثل حجم وطريقة التلقيح، فضلا عن درجة الحموضة في الصياغة، تؤثر بقوة على تسليم المخدرات إلى الجهاز العصبي الوطني عبر مسار الأنف إلى الدماغ9. في الدراسات مع الفئران، ونجاح تسليم المخدرات IN يعتمد بقوة على تحديد المواقع الرأس السليم، وهو أمر بالغ الأهمية لترسب الدماغ كفاءة وتجنب تصريف المخدرات في البيئة الخارجية أو المسالك الهوائية. وتجدر الإشارة إلى أن غالبية دراسات القوارض تستخدم وضع الرأس الخلفي (supine) مع ميل 70 درجة-90 درجة لتسليم المخدرات إلى ظهارة الشم، على الرغم من أن وضع الرأس في 0 درجة قد تفضل الصرف في القصبة الهوائية9. في تسليم الأدوية في الفئران التي هي نتائج مستيقظا في انخفاض ترسب الدماغ بالمقارنة مع أي تطبيق في موقف supine، ويرجع ذلك في الغالب إلى عدم قدرة العلماء على عقد الفئران في الموقف المطلوب لفترات أطول من الزمن. وعلاوة على ذلك، فإن الوضع رأسا على عقب المطلوبة من قبل طريقة قبضة الجلد المستخدمة للفئران مستيقظا يؤدي إلى ترسب المخدرات في الغالب في العصب ثلاثي التوائم ولمبة الشم، فضلا عن الأجهزة الطرفية، مثل الكلى والرئتين، في غضون 30 دقيقة 10. ويبدو أن أنسب وضع للجسم لإيصال العلاجات من خلال الأعصاب الشمية أو ثلاثية التوائم في الحيوانات الكبيرة مثل الرئيسيات غير البشرية في الدراسات السريرية هو وضع الرأس إلى الأسفل وإلى الأمام (أي ما يسمى "الصلاة إلى مكة المكرمة موقف ")11. ومع ذلك، لم يتم دراسة هذا الموقف بشكل جيد في نموذج الماوس، ويستخدم موقف supine على نطاق أوسع في دراسات القوارض.
سابقا, لقد أظهرنا أن RVG9R, الببتيد مصممة على أساس الحد الأدنى من مستقبلات ربط المجال من فيروس داء الكلب, يعرض التروبيسم إلى الخلايا التي تعبر عن وحدات فرعية مستقبلات أستيل النيكوتينمثل الخلايا العصبية والضامة وتوسط في تسليم داخل الخلايا من siRNA من خلال آلية تنطوي على المشاركة مستقبلات ومؤقتة إلغاء توطين غشاء البلازما في موقع تجميع مستقبلات12،13. الأهم من ذلك، الإدارة الوريدية النظامية من المجمعات RVG9R-siRNA تمكن من تسليم عبر الأوعية الدموية من siRNA في الجهاز العصبي الوطني14. ومع ذلك، فإن الطريق النظامي يخفف من كمية siRNA تسليمها إلى الجهاز العصبي الوطني، والبيانات الأخيرة تبين أن إدارة IN من المجمعات RVG9R:siRNA إلى الفئران المتمركزة في موقف الرأس إلى أسفل وإلى الأمام يثير واسعة الانتشار الجينات المستهدفة بالضربة القاضية في مناطق متعددة من الدماغ15. الأهم من ذلك, وقد تحقق هذا المستوى من الضربة القاضية مع أقل من 13.5 ميكروغرام من siRNA تدار على مدى أربعة جرعة, 2 يوم نظام في حين أن الطريق الرابع يتطلب جرعة أعلى ~ 5 مرات لكل حقن لتحقيق ضربة قاضية مماثلة. القصور الوحيد في نهج IN هو أنه إجراء شاق، يتطلب استخدام كلتا اليدين أثناء إدارة الحل في حين تسيطر باستمرار الفئران بدلا من ذلك في الرأس إلى أسفل وإلى الأمام وفي مواقف استرخاء بين كل استنشاق لفترة طويلة كبيرة من العلاج (إجراء 30-45 دقيقة للاستفادة الفعالة من حجم ~ 20-30 درجة مئوية لكل فأر). باستخدام جهاز تحديد المواقع الماوس المعروضة هنا تمكن من وضع السليم من الفئران مع القليل من الإكراه البدني للالحيوانات والموظفين تنفيذ البروتوكول، فضلا عن علاج مجموعات متعددة من الفئران في غضون فترة معقولة من الزمن، تمكين دراسة متعمقة حول استخدام siRNAs كعلاج لالتهاب الدماغ غرب النيل في الفئران في المراحل المتأخرة من المرض15.
Protocol
وقد أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة هانيانغ. في هذا البروتوكول، تم استخدام فئران Balb/c عمرها 6 أسابيع تزن 20-25 غرام (n = 3 لكل مجموعة). تم إيواء الحيوانات في منشأة خالية من مسببات الأمراض مع دورات الضوء /الظلام 12 ساعة على درجة حرارة ورطوبة تسيطر عليها مع حرية الوصول إلى الماء والغذاء.
1. جهاز الجمعية
- تجميع الأجزاء الفردية من جهاز تحديد المواقع كما هو موضح في الشكل 1A.
ملاحظة: يتم توفير الجهاز في أجزاء فردية التي يمكن تجميعها بسهولة وتفكيكها.
2. إعداد المواد
ملاحظة: تتطلب إدارة IN للأدوية المسيلة الخطوات التالية قبل المعالجة.
- إعداد المواد المطلوبة، بما في ذلك جهاز تحديد المواقع، وميكرومازيت 10 ميكروبليت، و10 ميكرومازيت 10 ميكروصيت، حل علاجي (على سبيل المثال، مجمع RVG9R-siRNA)، وساعة توقيت، و70٪ إيثانول (انظر الشكل 2A).
- قم بتوصيل رمز الطاقة لتشغيل نظام تسخين الجهاز قبل 15-20 دقيقة على الأقل من التجربة. يتم الحفاظ على درجة الحرارة المثلى للتجارب الحيوانية تلقائيا عند ~37 درجة مئوية.
- إعداد الكيتامين التخدير: xylazine: الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (PBS) بنسبة 1:0.5:8.5 والتخدير كل فأر مع حقن واحد داخل الصفاق (i.p.) في حجم نهائي من 200 ميكرولتر لكل 20 غرام الماوس.
ملاحظة: يرجى ملاحظة أنه يمكن استخدام أي دواء الأمثل لضمان حالة التخدير لمدة 30-45 دقيقة.
3. الماوس لتحديد المواقع
- تقييم مستوى التخدير عن طريق دواسة رد الفعل (قرصة اصبع القدم شركة) للحفاظ على الطائرة الجراحية.
- ضع جهاز تحديد المواقع على مسافة وارتفاع مناسبين لتوفير الوصول المريح إلى جميع الكواشف المطلوبة.
- مرة واحدة يتم التخدير الفئران بشكل صحيح، ورفع بلطف كل فأر من قبل scruff من عنقهم مع الإبهام وإصبع المؤشر ووضعها على كرسي معين.
- تحديد المواقع المناسبة للماوس على كرسي مهم جدا في هذه المرحلة. وضع الماوس مرة أخرى موازية لدعم الظهر من الكرسي، وعلى 90 درجة إلى مقعد الكرسي. رفع اليدين قبالة الماوس والسماح للالحيوان تكمن بشكل طبيعي في موقف الرأس إلى أسفل وإلى الأمام، دون دفع أو الضغط، كما هو مبين في الشكل 2B. تأكد من أن أطراف الماوس الأمامية توفر الدعم الطبيعي في حين أن الحيوان في هذا الموقف استرخاء، دون أي إزعاج للماوس.
- مرة واحدة يتم وضع الفئران بشكل صحيح، حزام الفئران في مع حزام كرسي، والبدء فورا في التلقيح.
4. الولادة داخل الأنف
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تسليم IN من المجمعات RVG9R:siRNA باستخدام جهاز تحديد موقع الماوس. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن إعطاء حد أقصى 20-30 درجة مئوية من الحل بسهولة لكل فأر في 2 × لتر قطرات. هذا الحجم هو أقل من ذلك من تجويف الأنف الماوس، وهو0.032 سم 3، وبالتالي فإن الإجراء لا يؤدي إلى انسداد الأنف القاتلة أو الاختناق. يسمح هذا البروتوكول بتلقيح أربعة فئران على الأقل في وقت واحد وثمانية فئران كحد أقصى لكل جهاز، مما يؤدي إلى تحسين الوقت وتقليل التغير.
- خذ ميكرومازيت 10 ميكرول واضبطه إلى 2 ميكرولتر.
- تحميل micropipette مع 2 ميكرولتر من RVG9R: siRNA حل معقد (على سبيل المثال، 5.2 ميكروغرام من siCy5 معقدة مع 104 ميكروغرام من RVG9R لتجربة التسليم، و 13.5 ميكروغرام من siSOD1 معقدة مع 270 ميكروغرام من RVG9R لتجربة إسكات، في حجم نهائي من 25 ميكرولتر من PBS تحتوي على 5% الجلوكوز.
- في حين عقد ماصة في اليد المهيمنة، وضبط الموقف عن طريق وضع الكوع على أعلى مقاعد البدلاء. دعم اليد عقد ماصة مع اليد الأخرى لتجنب الحركات غير المنضبط أثناء إدارة.
- وضع ~ 2 € L قطرة قريبة جدا من فتحة الأنف واحد بحيث يمكن للماوس يستنشق مباشرة قطرات (الرجوع إلى الشكل 2B). إذا لم يتم تشكيل قطرة صغيرة بسهولة، ثم استبدال طرف ماصة مع واحد جديد وتكرار العملية. استخدم ساعة الإيقاف للتحقق من الفاصل الزمني بين التطعيمات.
- يسمح هذا الجهاز لعلاج أربعة فئران على الأقل في كل مرة. إذا كان مطلوبا مجموعة أخرى من الفئران لتكرار الخطوة 4.4، تعيين شريط آخر مع أربعة كراسي فوق أو تحت شريط الأول مع أربعة كراسي لاستيعاب ما يصل إلى ثمانية فئران في وقت واحد على الجهاز.
- كرر الخطوة 4.4 مع الأنف الآخر بعد 3-4 دقائق من التطعيم الأول. هذا الفاصل الزمني يكفي للماوس لإكمال استنشاق الجرعة الأولى واستعادة التنفس الطبيعي. إذا تم إزاحة قطرة من الحل المستنشق بسبب الشخير العرضي من نارس الماوس، قم بإزالة 2 ميكرولتر إضافية من الحل.
- كرر العملية بأكملها مع الخياشيم البديلة حتى يتم الانتهاء من جرعة 20-30 ميكرولتر. وسوف يستغرق ~ 30-45 دقيقة لإكمال إجراء التلقيح بأكمله.
- وضع مرهم الرطب على عيون الفئران قبل إعادة الفئران مرة أخرى إلى أقفاصها المخصصة.
ملاحظة: لا تترك الفئران غير المراقب حتى أنها قد استعادت الوعي الكافي للحفاظ على recumbency القصية.
5 - تحليل البيانات
- لتأكيد ترسب الدماغ من RVG9R التي تحمل اسم فلور، قم بالتخدير على الفئران (كما هو موضح في الخطوة 2.3) وعزل الدماغ، فضلا عن الأجهزة الطرفية الأخرى، مثل الرئة والكبد والطحال والكلى. ضع كل عضو على ImageStation وتصور الفلورة باستخدام ImageStation.
- لتصور الفلورة بسبب تسمية Cy5، وإعداد 20 ميكرومتر سميكة من التبريد، costained مع Hoechst 33342، وإجراء مسح كامل الدماغ مع المجهر البؤري.
- لتقييم إسكات الجينات، استخراج الحمض النووي الريبي من مناطق الدماغ المختلفة، مثل لمبة الشم، والقشرة، والحصين، والمهاد، وتحت المهاد، المخيخ، وجذع الدماغ، مع مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي، عكس المنقولة في cDNA باستخدام cDNA مجموعة توليف، وأداء qPCR مع أزواج التمهيدي كما هو موضح سابقا15.
Representative Results
منصب رئيس خلال إدارة IN هو تأثير كبير على كفاءة تسليم المخدرات إلى الدماغ. هنا وصفنا موقف الرأس إلى أسفل وإلى الأمام باستخدام جهاز تحديد المواقع الماوس لإدارة IN من الدماغ استهداف الببتيد-siRNA صياغة لتسليم الخليط إلى الجهاز العصبي الوطني للماوس. للتحقق من التسليم من خلال الطريق IN، استخدمنا الببتيد RVG9R، أظهرت سابقا لربط بكفاءة إلى الخلايا العصبية على حد سواء في المختبر وفي الجسم الحي14،16.
اختبرنا أولا تسليم الأنف إلى الدماغ من الببتيد RVG9R المسمى مع اليكسا فلور 488 (RVG9R-A488) باستخدام جهاز تحديد المواقع الماوس الموضحة هنا. في 48 ح ما بعد التلقيح، تم استئصال أجهزة مختلفة، بما في ذلك الدماغ والجيوب الأنفية والرئتين والكبد والطحال والكلى لقياس الفلورة A488 المرتبطة بالأنسجة. A488 وحدها، أو الببتيد التحكم (RVM9R-A488)14 التي لا تربط nAchR، واستخدمت كعناصر تحكم سلبية. كما هو متوقع، لم يتم الكشف عنA 488 ولا RVM9R-A488 في أي من الأعضاء في 48 ح postinoculation (الشكل3A،اليسار). من ناحية أخرى، تم الكشف عن إشارة الفلورسنت قويةA 488 حصرا في عقول مجموعة RVG9R-تلقيح. وبالإضافة إلى ذلك، قارنا هذا الموقف وضع الماوس إلى طريقة موقف supine التي تم استخدامها سابقا17، وكذلك إلى طريقة مستيقظا ، لفعالية. قمنا بتلقيح كمية ثابتة من RVG9R-A488 (100 ميكروغرام) والتوزيع البيولوجي في 48 ح postinoculation. وأشارت النتائج إلى أن وضع رأس الفئران إلى أسفل وإلى الأمام تحسين penetrance وترسب RVG9R-A488 في جميع أنحاء أنسجة الدماغ (الشكل3A،الحق). وعلى النقيض من ذلك، أدت الحيوانات الملقحة في وضع supine في تسليم RVG9R-A488 إلى الدماغ ولكن ليس قوية كما رأينا مع طريقة جهاز تحديد المواقع. لمزيد من تأكيد تسليم سيرنا إلى الدماغ، قمنا بإجراء مسح كامل للدماغ بعد إدارة واحدة في RVG9R معقدة إلى 400 pmol (5.2 ميكروغرام) من siRNA المسمى Cy5. على النقيض من PBS أو RVM9R، أدى المعقدة مع RVG9R في تراكم قوي من siRNA في مناطق الدماغ الرئيسية، بما في ذلك لمبة الشم، والقشرة، والحصين، والمهاد، تحت المهاد، والدماغ الأوسط، والمخيخ (الشكل3B ).
وأخيرا، وظفنا تحليل RT-qPCR للتحقق من التسليم داخل الخلايا من siRNA وظيفية تستهدف الجينات dismutase-1 (SOD1) فائقة الأكسيد. تم تلقيح الفئران بشكل غير متوفر لمدة 3 مرات في أيام متتالية مع RVG9R:siSOD1 (13.2 ميكروغرام من siRNA)، وتم تحليل تعبير SOD1 mRNA 24 ساعة بعد التلقيح الأخير. أدى RVG9R:siSOD1 الإدارة إلى انخفاض كبير في التعبير SOD1 في لمبة الشم (63٪)، والقشرة (47٪)، والحصين (61٪)، المهاد (53٪)، وتحت المهاد (55٪)، والدماغ الأوسط (39٪)، والمخيخ (30٪) (الشكل4). وفي الختام، فإن استخدام جهاز تحديد المواقع يمكّن من التلقيح السهل في الـ RVG9R المركب ة في الفئران، مما يؤدي إلى تسليم سيرنا الخاص بالدماغ مما يؤدي إلى إسكات الجين المستهدف وظيفيًا.
الشكل 1 عرض فوتوغرافي لتجميع الجهاز: يتم تجميع كراسي تحديد المواقع على الوقوف على ارتفاع المناسبة مع مسامير. بعد التجميع، يتم توصيل الجهاز إلى إمدادات الطاقة للتدفئة إلى درجة الحرارة الفسيولوجية أثناء التلقيح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 عرض فوتوغرافي لإجراء التلقيح IN باستخدام جهاز تحديد المواقع: (أ) المعدات التجريبية اللازمة للتلقيح IN. (ب) الحيوانات في وضع الرأس إلى أسفل وإلى الأمام يجلس على الجهاز (اليسار) وترسب قطرة 2 ميكرولتر للتلقيح IN (يمين). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 توزيع الببتيد المسمى الفلورسنت وsiRNA بعد الإدارة IN. (أ) التوزيع الحيوي للببتيد RVG9R المطعّم بكثافة في 48 ساعة بعد تلقيح واحد في. تم تقييم الدماغ والأجهزة الطرفية الأخرى لوجود الفلورة في الفئران الملقحة مع المالحة (PBS)،A 488،RVM-A488،وRVG-A488 (يسار). تصوير الفئران تعامل كما ذكر أعلاه في حين أنها مستيقظا، في موقف supine، وفي وضع الماوس ابتكار في موقف الرأس إلى أسفل وإلى الأمام (يمين). (ب) التوزيع الحيوي لمجمع RVG9R:siRNA في الدماغ (n = 3 لكل مجموعة). تم تصور توزيع siRNA المسمى Cy5 في استئصال التبريد الدماغ الكامل مع مجهر الليزر البؤري في الحيوانات الملقحة مع المالحة (PBS)، سيرنا معقدة مع الببتيد التحكم (RVM9R-siCy5)، أو الببتيد يستهدف الدماغ RVG9R (RVG9R-siCy5). ويمثل شريط المقياس 1 مم. ctx = القشرة. فرس النهر = الحصين. نقص = تحت المهاد. ثا = المهاد؛ m.b = الدماغ المتوسط؛ سير = المخيخ. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 في تطبيق RVG9R: siSOD1 يحفز الجينات المستهدفة إسكات في مناطق متعددة من الدماغ. تحليل qPCR لmurine SOD1 mRNA في مناطق الدماغ المشار إليها 24 ساعة بعد آخر تلقيح في المالحة (PBS)، RVG9R:siCD4 (siCD4)، RVM9R: siSOD1 (RVM9R)، وRVG9R: siSOD1 (RVG9R). يتم عرض الإسكات SOD1 النسبي في لمبة الشم، والقشرة، والحصين (العلوي)، والمهاد، وتحت المهاد، المخيخ (الأوسط)، ومنتصف الدماغ (السفلي). تمثل البيانات متوسط ± SD نسبة إلى GAPDH بعد التطبيع مع البيانات المقابلة من الفئران المعالجة المالحة (ن = 3 لكل مجموعة). يظهر الكرتون الذي يصور النسبة المئوية لـ SOD1 mRNA في منطقة الدماغ المشار إليها بعد التلقيح IN (أسفل اليمين). **P < 0.01, *** P < 0.001. المختصرات: o.b = لمبة الشم؛ ctx = القشرة. فرس النهر = الحصين. نقص = الحصين. ثا = المهاد؛ m.b = الدماغ المتوسط؛ سير = المخيخ. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
لقد قمنا بتطوير جهاز لتحديد المواقع الماوس لتحديد المواقع المثلى الفئران لتسليم الأنف إلى الدماغ من العلاجات. وقد تم تجهيز الجهاز مع وظائف مختلفة، وضمان سهولة التعامل في وقت واحد من الحيوانات. كما أنها مجهزة منصات التدفئة للحفاظ على درجات حرارة الجسم الفسيولوجية للالحيوانات أثناء التجريب. يمكن الحفاظ على الفئران التخدير في موقف الرأس إلى أسفل وإلى الأمام عن طريق الكراسي المصممة خصيصا، مع الحد الأدنى من عدم الراحة للالحيوانات. يمكن تعديل ارتفاع كراسي تحديد المواقع بطريقة أفضل لتصور أنف الحيوان أثناء إدارة الأدوية.
في تسليم الدماغ لديها العديد من القيود الجوهرية، بما في ذلك المساحة السطحية الصغيرة من الخياشيم (مما يسمح لأحجام قصوى من 20-30 درجة مئوية لكل إدارة)، تهيج الأنف، تلف ظهارة، وامتصاص محدود عبر ظهارة الأنف18. وقد استخدمت إدارة IN من المخدرات للفئران وضعت في موقف supine لتسليم الدماغ عن طريق إسقاط الأدوية السائلة في nares الحيوانات البديلة عن طريق ماصة أو أنابيب البولي يوريثين (24 G × 19 ملم) متصلة المحاقن ميكرولتر19، 20.على الرغم من أن استخدام أنظمة الأنابيب لإطلاق الأدوية بالقرب من ظهارة الشم هو نهج مناسب محتمل، فإنه يسبب تهيج أو التهاب الأنف عند الإدارة المتكررة. وعلاوة على ذلك ، فإن صغر حجم تجويف الأنف يحد من هذا النهج ، وخاصة في الفئران التي يمكن التغلب عليها عن طريق التكرار ، وكذلك عن طريق تركيبات المخدرات التي تستمر في الغشاء المخاطي للأنف. خيار آخر هو إدارة IN من العلاجات للفئران مستيقظا10. ومع ذلك، يتطلب هذا النهج إجراءات ماهرة للتعامل مع الحيوانات أثناء التلقيح الداخلي. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يسبب الإجهاد الحيواني، وبالتالي، ليست مثالية لنماذج المرض، وخاصة نماذج الأمراض المعدية. وعلاوة على ذلك، قد ينتج التطبيب غير المتسق بسهولة عن تصريف المخدرات في الرئتين أو المعدة بسبب سيطرة الحيوانات غير الكاملة. ويسمح النهج المعروض هنا للعلماء بالتغلب على هذه الحواجز التقنية. رئيس أسفل وإلى الأمام موقف يقلل من إمكانية تسرب المخدرات من الأنف إلى الرئتين أثناء استنشاق, تفضيل التسليم مباشرة وانتقائية siRNA إلى الدماغ. في التسليم باستخدام جهاز تحديد المواقع الماوس لا يتطلب أي تقنية متخصصة للتعامل مع أو الاستيلاء على الحيوانات أثناء التلقيح. يمكن علاج أربعة الحيوانات في وقت واحد لمدة لا تقل عن 30-45 دقيقة. ويمكن توسيع نطاق هذا الإجراء عن طريق إدراج شريط إضافي بأربعة رؤساء، مما يسمح بإدارة سهلة لما يصل إلى ثمانية فئران في نفس الدورة التجريبية. ولذلك، باتباع هذه الطريقة، قد يدفع مشغل واحد إلى توصيل المخدرات إلى أدمغة مجموعات كبيرة من الحيوانات على مدى فترات طويلة من الزمن.
التركيب التشريحي للتجويف الأنفي يؤثر بقوة على الولادة من الأنف إلى الدماغ (كما استعرض هاركوس وآخرون11 وRuigrok ودي لانج21). المساحة السطحية النسبية للتجويف الأنفي في الفئران أكبر 15 مرة من مساحة البشر والمساحة السطحية النسبية للظهارة الشمية أكبر بـ 6 مرات. على الرغم من أن هناك اختلافات كبيرة في تشريح تجويف الأنف في البشر إلى القوارض، هناك ما يقرب من 45 التجارب السريرية الجارية باستخدام نهج IN لعلاج العديد من اضطرابات الدماغ (www.clinicaltrials.gov). تشير الدراسة المعروضة هنا إلى أنه عند استخدام IN تقديم العلاجات، يجب على العلماء النظر في عدة عوامل، مثل وضع الرأس، والنوم، ووكلاء التسليم السليم.
لقد أظهرنا ترسب فعالة ومحددة من siRNA المسمى الفلورسنت إلى الدماغ الماوس. وعلاوة على ذلك، فإن الانخفاض الكبير في التعبير الجيني SOD1 لوحظ بعد تسليم في سرنا أكد الآثار الوظيفية. أظهرنا في السابق باستمرار أن إدارة IN من المجمعات RVG9R-siRNA التي تستهدف فيروس غرب النيل (WNV) RNA يمارس تأثير علاجي قوي على التهاب الدماغ WNV15. وتجدر الإشارة إلى أن تسليم سيرنا من الأنف إلى الدماغ يتطلب ربط الخلايا المستهدفة (RVG) وجزيء مشحون بشكل إيجابي (9R) إلى سيرنا معقدة. في غياب هذه العناصر ، تم مسح الجزيئات من خلال الدائرة الجهازية والأوعية اللمفاوية 48 ح المعالجة اللاحقة (الشكل3A)15. لذلك، في الإعداد التجريبي الموصوفة هنا، قمنا بفحص توطين الببتيد/سيرنا 48 ساعة بعد التلقيح إلى صورة فقط المستويات المحتفظ بها على وجه التحديد في الدماغ. ويمكن تنفيذ هذا النهج بسهولة لتسليم جزيئات أخرى، مثل البروتينات والببتيدات والجسيمات النانوية، أو غيرها من العلاجات، لعلاج عدد من الاضطرابات المتصلة بالدماغ.
Disclosures
بي كي) و(س.ك.ل) هما مؤسسان مشاركان لـ(سينيت) للتكنولوجيا الحيوية) P.K. هو المخترع المشارك للبراءات PCT/US07/12,152، والتي تشمل جزئيا المطالبات المتعلقة RVG9R. I.U., K.C., P.K., and S.K.L. مدرجة كمخترعين مشاركين لبراءة اختراع مقدمة (PCT/KR2016/014220)، والتي تشمل المطالبات المتعلقة بجهاز تحديد موقع الماوس.
Acknowledgments
وقد دعمت هذا العمل وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية الكورية (HI17C1046) إلى S.K.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comercial assays | |||
| iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
| RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
| SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
| Dyes | |||
| Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
| Mouse strain | |||
| Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
| Oligonucleotides and primers | |||
| Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
| siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
| GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
| SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
| Peptides | |||
| RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
| RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
| Software, algorithms and devices | |||
| FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
| Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
References
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (56), e2968 (2011).
- Khan, A. R., Liu, M., Khan, M. W., Zhai, G. Progress in brain targeting drug delivery system by nasal route. Journal of Controlled Release. 268, 364-389 (2017).
- Meredith, M. E., Salameh, T. S., Banks, W. A. Intranasal delivery of proteins and peptides in the treatment of neurodegenerative diseases. The AAPS Journal. 17, 780-787 (2015).
- Pardeshi, C. V., Belgamwar, V. S. Direct nose to brain drug delivery via integrated nerve pathways bypassing the blood-brain barrier: an excellent platform for brain targeting. Expert Opinion on Drug Delivery. 10, 957-972 (2013).
- Agrawal, M., et al. Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs. Journal of Controlled Release. 281, 139-177 (2018).
- Van Woensel, M., et al. Formulations for intranasal delivery of pharmacological agents to combat brain disease: a new opportunity to tackle GBM. Cancers. 5, 1020-1048 (2013).
- Kulkarni, A. D., et al. Nanotechnology-mediated nose to brain drug delivery for Parkinson's disease: a mini review. Journal of Drug Targeting. 23, 775-788 (2015).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 1654-1673 (2010).
- Hanson, L. R., Fine, J. M., Svitak, A. L., Faltesek, K. A. Intranasal administration of CNS therapeutics to awake mice. Journal of Visualized Experiments. (74), e4440 (2013).
- Merkus, P., Ebbens, F. A., Muller, B., Fokkens, W. J. Influence of anatomy and head position on intranasal drug deposition. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck. 263, 827-832 (2006).
- Zeller, S., et al. Attachment of cell-binding ligands to arginine-rich cell-penetrating peptides enables cytosolic translocation of complexed siRNA. Chemistry & Biology. 22, 50-62 (2015).
- Kim, J., et al. Silencing CCR2 in macrophages alleviates adipose tissue inflammation and the associated metabolic syndrome in dietary obese mice. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 5, (2016).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39 (2007).
- Beloor, J., et al. Small interfering RNA-mediated control of virus replication in the CNS is therapeutic and enables natural immunity to West Nile virus. Cell Host & Microbe. 23, 549-556 (2018).
- Ullah, I., et al. Trileucine residues in a ligand-CPP-based siRNA delivery platform improve endosomal escape of siRNA. Journal of Drug Targeting. 25, 320-329 (2017).
- Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S., Balyasnikova, I. V. Intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (124), e55845 (2017).
- Mittal, D., et al. Insights into direct nose to brain delivery: current status and future perspective. Drug Delivery. 21, 75-86 (2014).
- Renner, D. B., Frey, W. H., Hanson, L. R. Intranasal delivery of siRNA to the olfactory bulbs of mice via the olfactory nerve pathway. Neuroscience Letters. 513, 193-197 (2012).
- Serralheiro, A., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Intranasal administration of carbamazepine to mice: a direct delivery pathway for brain targeting. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 60, 32-39 (2014).
- Ruigrok, M. J., de Lange, E. C. Emerging insights for translational pharmacokinetic and pharmacokinetic-pharmacodynamic studies: towards prediction of nose-to-brain transport in humans. The AAPS Journal. 17, 493-505 (2015).
