Summary
Her præsenterer vi en protokol ved hjælp af en mus positionering enhed, der gør det muligt for passende placering af mus til intranasal administration af en hjerne-målretning peptid-siRNA formulering muliggør effektiv genhæmning i centralnervesystemet.
Abstract
Intranasal (i) Drug levering til hjernen er dukket op som en lovende metode til at omgå blod-hjerne barrieren (BBB) for levering af lægemidler ind i centralnervesystemet (CNS). Nylige undersøgelser viser brugen af et peptid, RVG9R, indarbejde minimal receptor-binding domæne af rabies virus glycoprotein, i fremkalde leveringen af siRNA til neuroner i hjernen. I denne protokol leveres peptid-siRNA-formuleringen intranasalt med en pipette i den dominerende hånd, mens den bedøvede mus er fastholdt af Scruff med den ikke-dominerende hånd i en "hoved nedad-og-fremad position" for at undgå dræning i lungerne og mave ved indånding. Denne præcise gribende af mus kan læres, men er ikke let og kræver praksis og dygtighed til at resultere i effektiv CNS optagelse. Desuden er processen langtrukne, der kræver ca. 45 min for administration af et samlet volumen på ~ 20-30 μL opløsning i 1-2 μL dråbe volumen pr. inhalation, med 3-4 min hvileperioder mellem hver inhalation. Formålet med denne undersøgelse er at afsløre en mus positionering enhed, der muliggør passende placering af mus til effektiv i administrationen af peptid-siRNA formulering. Flere funktioner er indarbejdet i udformningen af enheden, såsom fire eller otte positionerings stole med justerbar højde og hældning for at begrænse bedøvede mus i hovedet ned-og-fremad position, hvilket muliggør nem visualisering af musene Nares og en indbygget varmepude til at opretholde musene krops temperaturer under proceduren. Vigtigere, evnen til at behandle fire eller otte mus samtidig med RVG9R-siRNA komplekser på denne måde muliggør undersøgelser på en meget hurtigere tidsskala, til afprøvning af en i terapeutisk siRNA tilgang. Afslutningsvis, denne enhed giver mulighed for passende og kontrolleret muse hoved positionering for i anvendelse af RVG9R-siRNA og andre terapeutiske molekyler, såsom nanopartikler eller antistoffer, for CNS-levering.
Introduction
BBB forhindrer systemisk administrerede molekyler af > 400-600 da fra at trænge ind i hjernen, hvilket udgør en betydelig udfordring for leveringen af terapeutiske biomolekyler for sygdomme, der påvirker CNS og hjernen1. Direkte Drug levering til hjernen kan opnås ved Stereotaktisk injektion; Dette kræver imidlertid kirurgisk ekspertise og er meget begrænset i leveringen til områder proksimalt på injektionsstedet, hvilket gør det uegnet til rutinemæssig klinisk brug2. I levering til hjernen kan også resultere i direkte hjernen levering ved at omgå BBB, giver mulighed for direkte og hurtig overførsel af en række stoffer til hjernen3,4. Denne overførsel menes at ske ved transport mekanismer via olfaktoriske og trigeminus nerver, der forbinder nasal passage til hjernen, cerebrospinalvæsken, og lymfesystemet5. Som den direkte næse-til-hjerne rute ikke involverer perifere organer og væv, det væsentligt reducerer systemiske bivirkninger og forbedrer styrken. I administrationen er et lovende ikke-invasivt alternativ til både lokale og systemiske ruter for hjernen levering af terapeutiske midler og kan repræsentere en stærk tilgang til at bekæmpe neurologiske lidelser, herunder Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, og hjernekræft, og er ved at blive udforsket i flere kliniske forsøg6,7,8.
Flere eksperimentelle faktorer, såsom volumen og metode til inokulation, samt formulering pH, stærkt påvirker Drug levering til CNS via næse-til-hjerne pathway9. I undersøgelser med mus, succesen af i lægemiddel levering stærkt afhænger af korrekt hoved positionering, som er afgørende for effektiv hjerne deposition og for at undgå narkotika dræning i det ydre miljø eller luftvejene. Især, størstedelen af gnaver undersøgelser ansætte en hoved-back position (supine) med en 70 °-90 ° Tilt for Drug levering til olfaktoriske epitel, selv om hoved positionering på 0 ° kan favorisere dræning i luftrøret9. I leveringen af lægemidler i mus, der er vågne resulterer i reduceret hjerne aflejring i forhold til enhver applikation i liggende stilling, mest på grund af videnskabsfolk ' manglende evne til at holde mus i den ønskede position i længere tid. Desuden resulterer den opadrettede position, der kræves af den anvendte hudgrebs metode til vågen mus, i lægemiddel aflejring overvejende i trigeminus nerve og olfaktoriske pære samt perifere organer, såsom nyrer og lunger, inden for 30 min. postinoculation10. Den mest hensigtsmæssige kropsstilling til levering af terapeutisk gennem olfaktoriske eller trigeminus nerver i større dyr såsom ikke-menneskelige primater i kliniske undersøgelser synes at være hovedet ned-og-fremad position (dvs. den såkaldte "bede til Mekka position ")11. Men, denne holdning er ikke blevet godt undersøgt i muse-model, og liggende position er mere udbredt i gnaver undersøgelser.
Tidligere har vi vist, at RVG9R, et peptid designet baseret på den minimale receptor binding domæne af rabies virus, viser tropisme til celler, der udtrykker nicotinsyre acetylcholin receptor under enheder som neuroner og makrofager og medierer intracellulær levering af siRNA ved en mekanisme, der involverer receptor engagement og midlertidig plasma membran udflytning på stedet for receptor Aggregation12,13. Det er vigtigt, at systemisk intravenøs administration af RVG9R-siRNA-komplekser muliggør transvaskulær levering af siRNA til CNS14. Den systemiske rute udvander imidlertid den mængde siRNA, der leveres til CNS, og de seneste data viser, at i administration af RVG9R: siRNA-komplekser til mus placeret i hovedet nedad-og-fremad-position fremkalder et bredt Spread Target-gen Knockdown i flere regioner i hjernen15. Det er vigtigt, at dette niveau af Knockdown blev opnået med så lidt som 13,5 μg siRNA administreret over en fire-dosis, 2 dages regime, mens IV-ruten kræver en ~ 5 gange højere dosis pr injektion for at opnå sammenlignelige Knockdown. Den eneste mangel i den tilgang er, at det er en besværlig procedure, der kræver brug af begge hænder under administrationen af opløsningen, mens hele tiden griber musene alternativt i hovedet ned-og-fremad og i afslappede positioner mellem hver inhalation i en betydelig lang behandlingsperiode (en 30-45 min procedure for effektiv optagelse af en ~ 20-30 μL volumen pr. mus). Brug af musen positionering enhed præsenteret her giver mulighed for korrekt placering af mus med lidt fysisk tvang til dyrene og det personale, der udfører protokollen, samt behandling af flere kohorter af mus inden for en rimelig tidsperiode, muliggøre en dybtgående undersøgelse om brug af siRNAs som en terapeutisk for West Nile encephalitis i mus på sene stadier af sygdommen15.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med retningslinjer og protokoller godkendt af Animal Care og use Udvalget af Hanyang University. I denne protokol blev der anvendt 6 uger gamle Balb/c-mus, som vejede 20-25 g (n = 3 pr. gruppe). Dyrene blev anbragt i en patogen-fri facilitet med 12 h lys/mørke cyklusser ved en kontrolleret temperatur og fugtighedsniveau med fri adgang til vand og mad.
1. montering af enhed
- Saml de enkelte dele af positionerings anordningen som vist i figur 1a.
Bemærk: Enheden leveres i individuelle dele, der let kan samles og skilles ad.
2. opsætning af materiale
Bemærk: ved indgivelse af flydende lægemidler kræves følgende forbehandlings trin.
- Forbered de påkrævede materialer, herunder positionerings anordningen, en 10 μL mikropipette, 10 μL mikropipette spidser, en behandlings løsning (f. eks. RVG9R-siRNA-kompleks), et timerur og 70% ethanol (Se figur 2a).
- Tilslut strøm koden for at tænde for enhedens opvarmningssystem mindst 15-20 min før eksperimentet. Den optimale temperatur for dyreforsøg vedligeholdes automatisk ved ~ 37 °C.
- Forbered anæstesi ketamin: xylazine: fosfat-Buffered saltvand (PBS) i et forhold på 1:0.5:8.5 og bedøve hver mus med en enkelt intraperitoneal (IP) injektion i et endeligt volumen på 200 μL pr. 20 g mus.
Bemærk: Bemærk venligst, at enhver optimeret stof til at sikre anæstesi tilstand i en periode på 30-45 min kan anvendes.
3. placering af musen
- Vurder niveauet af anæstesi ved pedal refleks (fast tå knivspids) for at opretholde det kirurgiske plan.
- Placer positionerings anordningen i en passende afstand og højde, så der er nem adgang til alle nødvendige reagenser.
- Når musene er ordentligt bedøvet, forsigtigt løfte hver mus ved skruff af halsen med tommel-og pegefinger og placere den på den udpegede stol.
- Korrekt positionering af musen på stolen er meget vigtigt på dette stadium. Læg musens ryg parallelt med bagsiden støtte af stolen, og ved 90 ° til stolen sædet. Løft hænderne af musen og lad dyret ligge naturligt i hovedet nedad og fremad, uden at skubbe eller trykke, som vist i figur 2b. Sørg for, at musens forbimb'er giver naturlig støtte, mens dyret er i denne afslappede position, uden ubehag til musen.
- Når musene er placeret korrekt, strop musene i med stolen bælte, og straks starte i inokulation.
4. intranasal levering
Bemærk: denne protokol beskriver i leveringen af RVG9R: siRNA komplekser ved hjælp af musen positionering enhed. Ved hjælp af denne protokol kan maksimalt 20-30 μL opløsning let administreres til hver mus i 2 μL dråber. Denne volumen er lavere end musen næsehulen, som er 0,032 cm3, så proceduren ikke resulterer i dødbringende næsebor obstruktion eller kvælning. Denne protokol giver mulighed for samtidig inokulation af mindst fire mus og højst otte mus pr. enhed, hvilket resulterer i tids optimering og reduceret variabilitet.
- Tag 10 μL mikropipetten og justér den til 2 μL.
- Mikropipetten indlà ¦ ses med 2 μL RVG9R: siRNA-kompleks opløsning (f. eks. 5,2 μg siCy5 med 104 μg RVG9R til leverings forsøget og 13,5 μg siSOD1, der er pakket med 270 μg RVG9R til lyddæmpnings forsøget, i et endeligt volumen på 25 μL PBS, som indeholder 5% glukose.
- Mens du holder pipetten i den dominerende hånd, justeres positionen ved at placere en albue på bordpladen. Støt den hånd, som holder pipetten, med den anden hånd for at undgå ukontrollerede bevægelser under administration.
- Placer en ~ 2 μL dråbe meget tæt på et næsebor, så musen direkte kan inhalere dråbe (Se figur 2b). Hvis en lille dråbe ikke er let at forme, skal du udskifte pipettespidsen med en ny og gentage operationen. Brug stopur til at kontrollere tidsintervallet mellem inokuleringer.
- Denne anordning giver mulighed for behandling af mindst fire mus ad gangen. Hvis der kræves en anden gruppe mus for at gentage trin 4,4, skal du indstille en anden bjælke med fire stole over eller under den første bjælke med fire stole for at rumme op til otte mus ad gangen på enheden.
- Gentag trin 4,4 med det andet næsebor efter 3-4 min fra den første inokulation. Dette tidsinterval er tilstrækkeligt til, at musen fuldfører inhalationen af den første dosis og gendanner normal vejrtrækning. Hvis en dråbe af den inhalerede opløsning er blevet opløst på grund af utilsigtet snidning fra musens Naris, skal der genindsættes yderligere 2 μL opløsning.
- Gentag hele processen med alternative næsebor, indtil 20-30 μL dosis er færdig. Det vil tage ~ 30-45 min at fuldføre hele inokulering procedure.
- Put våd salve på musene øjne, før du returnerer musene tilbage til deres udpegede bure.
Bemærk: Efterlad ikke musene uden opsyn, før de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystbenet recumbency.
5. data analyse
- For at bekræfte hjerne aflejring af fluor-mærket RVG9R, bedøve musene (som beskrevet i trin 2,3) og isolere hjernen, samt andre perifere organer, såsom lunge, lever, milt og nyrer. Placer hvert organ på ImageStation og Visualiser fluorescens ved hjælp af ImageStation.
- At visualisere fluorescens på grund af Cy5-label, forberede 20 μm-tykke kryosektioner, costained med Hoechst 33342, og udføre fuld hjernescanning med et Konfokal mikroskop.
- At vurdere genhæmning, ekstrakt RNA fra forskellige hjerneområder, såsom olfaktoriske pære, cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebellum, og hjernen stammen, med en RNA rensning kit, omvendt transskriberet til cDNA ved hjælp af en cDNA syntese sættet, og Udfør qPCR med primer-par som beskrevet tidligere15.
Representative Results
Hovedposition under administration er en stor indflydelse på effektiviteten af Drug levering til hjernen. Her beskrev vi hovedet ned-og-fremad position ved hjælp af en mus positionering enhed til i administrationen af en hjerne-målretning peptid-siRNA formulering til levering af blandingen til musens CNS. For at verificere levering gennem in-ruten, brugte vi RVG9R peptid, tidligere vist sig at effektivt binde til neuronal celler både in vitro og in vivo14,16.
Vi testede først næse-til-hjerne levering af RVG9R peptid mærket med Alexa fluor 488 (RVG9R-A488) ved hjælp af musen positionering enhed beskrevet her. På 48 h postinoculation, forskellige organer, herunder hjernen, sinus, lunger, leveren, milten, og nyrerne blev fjernet for at måle væv-associeret en488 fluorescens. En488 alene, eller et kontrol peptid (RVM9R-a488)14 , der ikke binder nachr, blev brugt som negative kontroller. Som forventet blev hverken en488 eller RVM9R-A488 påvist i nogen af organerne ved 48 h postinokulation (figur 3a, venstre). På den anden side blev et stærkt fluorescerende et488 -signal udelukkende detekteret i hjernen i den RVG9R-inokulerede gruppe. Hertil kommer, vi sammenlignede denne mus placering position til liggende position metode, der har været anvendt tidligere17, samt til vågen metode, for effektivitet. Vi inokulerede et fast beløb på RVG9R-a488 (100 μg) og analyseret Biodistribution ved 48 h postinoculation. Resultaterne viste, at positionering af musene hovedet ned-og-Forward forbedret penetrans og deposition af RVG9R-A488 i hele hjernevæv (figur 3a, højre). I modsætning hertil resulterede dyrene i en rygstilling i leveringen af RVG9R-A488 til hjernen, men ikke så stærk som set med positionerings anordningen metode. For yderligere at bekræfte siRNA levering til hjernen, vi udførte fuld hjernescanning efter en enkelt i administration af RVG9R kompleks til 400 pmol (5,2 μg) Cy5-mærket siRNA. I modsætning til PBS eller RVM9R resulterede kompleksdannere med RVG9R i en stærk ophobning af siRNA i større hjerneområder, herunder olfaktoriske pære, cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, midbrain og cerebellum (figur 3b ).
Endelig anvendte vi RT-qPCR-analyse til at verificere den intracellulære levering af funktionel siRNA, som var rettet mod Superoxid dismutase-1 (SOD1)-genet. Mus blev inokuleret intranasalt i 3 gange på hinanden følgende dage med RVG9R: siSOD1 (13,2 μg siRNA), og SOD1 mRNA-ekspression blev analyseret 24 timer efter den sidste inokulation. RVG9R: siSOD1 administration resulterede i en betydelig reduktion af SOD1 ekspression i olfaktoriske pære (63%), cortex (47%), hippocampus (61%), thalamus (53%), hypothalamus (55%), midthjernen (39%) og cerebellum (30%) (Figur 4). Afslutningsvis giver brugen af en positionerings anordning en nem inokulering af RVG9R-kompleks siRNA i mus, hvilket resulterer i hjerne specifik siRNA-levering, der inducerer funktionel lyddæmpning af målgenet.
Figur 1 : Fotografisk præsentation af enheds samlingen. Positionerings stolene samles på stativet i passende højde med skruer. Efter monteringen er enheden sluttet til en strømforsyning til opvarmning til den fysiologiske temperatur under inokulering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Fotografisk præsentation af inokulationsproceduren ved hjælp af positionerings anordningen. A) forsøgsudstyr, der kræves til inokulering. B) dyr i hovedet nedad-og-fremad siddende position på anordningen (venstre) og aflejring af en 2 μl dråbe til inokulering (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Distribution af fluorescently mærket peptid og siRNA efter administration. A) Biodistribution af intranasalt INOKULERET RVG9R peptid ved 48 h efter en enkelt inokulation. Hjernen og andre perifere organer blev evalueret for tilstedeværelsen af fluorescens i mus inokuleret med saltvand (PBS), en488, RVM-a488, og rvg-a488 (venstre). Billeddannelse af musene behandlet som nævnt ovenfor, mens de er vågne, i liggende position, og i musen positionering udtænke i hovedet ned-og-fremad position (højre). B) BIODISTRIBUTION af RVG9R: siRNA-komplekset i hjernen (n = 3 pr. gruppe). Distributionen af Cy5-mærket siRNA blev visualiseret i komplette hjerne kryosektioner med et confokal laser mikroskop i dyr, der blev vaccineret med saltvand (PBS), siRNA-kompleks med kontrol peptid (RVM9R-siCy5) eller hjernen-målretning peptid RVG9R (RVG9R-siCy5). Skala bjælken repræsenterer 1 mm. forkortelser: o. b = olfaktoriske pære; ctx = cortex; Hippo = hippocampus; hypo = hypothalamus; Tha = thalamus; m. b = midbrain; cer = cerebellum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Ved anvendelse af RVG9R: siSOD1 inducerer målgenhæmning i flere områder af hjernen. qPCR-analyse for murine SOD1 mRNA i indikerede hjerneområder 24 timer efter den sidste inokulering af saltvand (PBS), RVG9R: siCD4 (siCD4), RVM9R: siSOD1 (RVM9R) og RVG9R: siSOD1 (RVG9R). Den relative SOD1 hæmning i olfaktoriske pære, cortex, hippocampus (øvre), thalamus, hypothalamus, cerebellum (midten), og midthjernen (nedre) er vist. Data repræsenterer middelværdien ± SD i forhold til GAPDH efter normalisering med de tilsvarende data for salt behandlede mus (n = 3 pr. gruppe). Tegneserien skildrer procentdelen af SOD1 mRNA i den angivne hjerneregion efter inokulering vises (nederst til højre). * *P < 0,01, * ** P < 0,001. Forkortelser: o. b = olfaktoriske pære; ctx = cortex; Hippo = hippocampus; hypo = hippocampus; Tha = thalamus; m. b = midbrain; cer = cerebellum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi har udviklet en mus positionering enhed til optimalt positionering mus til næse-til-hjerne levering af Therapeutics. Enheden er udstyret med forskellige funktionaliteter, der sikrer nem samtidig håndtering af dyr. Den er også udstyret med varmepuder til vedligeholdelse af dyrenes fysiologiske krops temperaturer under eksperimenter. De bedøvede mus kan opretholdes i hovedet ned-og-fremad position ved hjælp af specielt designede stole, med minimal ubehag for dyrene. Højden af positionerings Stolene kan justeres på en sådan måde, som det er bedst at visualisere dyre næsebor, mens administration af lægemidler.
I hjernen levering har flere iboende begrænsninger, herunder den lille overflade af næsebor (tillader maksimale mængder af 20-30 μL pr administration), nasal irritation, Epitelet skader, og begrænset absorption på tværs af nasal epitel18. I administrationen af lægemidler til mus placeret i liggende stilling har været anvendt til hjernens levering ved at droppe flydende stoffer i dyrenes alternative Nares via pipette eller polyurethan slange (24 G x 19 mm) tilsluttet mikroliter sprøjter19, 20. selv om brugen af slange systemer til at frigive stoffer i nærheden af olfaktoriske epitel er en potentielt egnet tilgang, det forårsager irritation eller nasal inflammation ved gentagen administration. Desuden begrænser den lille størrelse af næsehulen denne tilgang, især i mus, der kan overvindes ved at gentage, samt ved lægemiddel formuleringer, der fortsætter i næseslimhinden. En anden mulighed er i administrationen af Therapeutics til vågen mus10. Denne fremgangsmåde kræver dog kvalificerede procedurer for håndtering af dyr under inokulering. Desuden, det forårsager dyre stress og derfor ikke er ideel til sygdomsmodeller, især smitsomme sygdomsmodeller. Desuden kan inkonsistent dosering let skyldes narkotika dræning i lungerne eller maven på grund af ufuldkommen animalsk gribe. Den fremgangsmåde, der præsenteres her, giver forskerne mulighed for at overvinde disse tekniske barrierer. Hovedet nedad-og-fremad position reducerer muligheden for stof lækage fra næsen til lungerne, mens indånding, favoriserer direkte og selektiv siRNA levering til hjernen. Ved levering ved hjælp af musen positionering enhed kræver ikke nogen specialiseret teknik til håndtering eller griber dyrene under inokulation. Fire dyr ad gangen kan behandles i en periode på mindst 30-45 min. Proceduren kan skaleres op ved at medtage en ekstra fire-Chair bar, der giver mulighed for nem styring af op til otte mus i samme eksperimentelle session. Derfor kan en enkelt operatør efter denne metode inducere levering af lægemidler til hjernen hos store grupper af dyr i længere tid ad gangen.
Den anatomiske struktur i næsehulen påvirker kraftigt næse-til-hjerne-leveringen (som gennemgået af Merkus et al.11 og Ruigrok og de lange21). Det relative overfladeareal af næsehulen i mus er 15 gange større end for mennesker, og det relative overfladeareal af olfabrikkens epitel er 6 gange større. Selv om der er betydelige forskelle i anatomi af næsehulen hos mennesker til gnavere, der er ca 45 kliniske forsøg undervejs ved hjælp af i tilgang til behandling af flere hjernen lidelser (www.clinicaltrials.gov). Undersøgelsen præsenteres her indikerer, at når du bruger i levering af Therapeutics, forskerne bør overveje flere faktorer, såsom hovedposition, sovende, og ordentlig levering agenter.
Vi har vist en effektiv og specifik aflejring af fluorescently mærket siRNA til muse hjernen. Endvidere, det betydelige fald i SOD1 genekspression observeret efter i siRNA levering bekræftet funktionelle virkninger. Vi har tidligere vist konsekvent, at i administrationen af RVG9R-siRNA komplekser rettet mod West Nile virus (WNV) RNA udøver en stærk terapeutisk virkning på WNV encephalitis15. Især, næse-til-hjerne siRNA levering krævede en celle-målretning ligand (RVG) og en positivt ladet molekyle (9R) til komplekse siRNA. I mangel af disse elementer blev molekyler ryddet gennem det systemiske kredsløb og lymfe skibene 48 h efter behandling (figur 3a)15. Derfor har vi i den eksperimentelle opsætning, der er beskrevet her, undersøgt peptid/siRNA lokalisering 48 h efter inokulation til billedet kun de niveauer, der bevares specifikt i hjernen. Denne fremgangsmåde kan let gennemføres for levering af andre molekyler, såsom proteiner, peptider, og nanopartikler, eller andre Therapeutics, til behandling af en række hjerne-relaterede lidelser.
Disclosures
P.K. og S.K.L. er medstifter af signet Biotech. P.K. er coinventor af patent PCT/US07/12152, som delvis omfatter krav vedrørende RVG9R. I.U., K.C., P.K. og S.K.L. er opført som koopfindere af et indsendt patent (PCT/KR2016/014220), som omfatter krav i forbindelse med en mus positionering enhed.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Koreas sundhedsministerium & Welfare (HI17C1046) til S.K.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comercial assays | |||
| iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
| RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
| SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
| Dyes | |||
| Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
| Mouse strain | |||
| Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
| Oligonucleotides and primers | |||
| Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
| siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
| GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
| SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
| Peptides | |||
| RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
| RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
| Software, algorithms and devices | |||
| FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
| Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
References
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (56), e2968 (2011).
- Khan, A. R., Liu, M., Khan, M. W., Zhai, G. Progress in brain targeting drug delivery system by nasal route. Journal of Controlled Release. 268, 364-389 (2017).
- Meredith, M. E., Salameh, T. S., Banks, W. A. Intranasal delivery of proteins and peptides in the treatment of neurodegenerative diseases. The AAPS Journal. 17, 780-787 (2015).
- Pardeshi, C. V., Belgamwar, V. S. Direct nose to brain drug delivery via integrated nerve pathways bypassing the blood-brain barrier: an excellent platform for brain targeting. Expert Opinion on Drug Delivery. 10, 957-972 (2013).
- Agrawal, M., et al. Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs. Journal of Controlled Release. 281, 139-177 (2018).
- Van Woensel, M., et al. Formulations for intranasal delivery of pharmacological agents to combat brain disease: a new opportunity to tackle GBM. Cancers. 5, 1020-1048 (2013).
- Kulkarni, A. D., et al. Nanotechnology-mediated nose to brain drug delivery for Parkinson's disease: a mini review. Journal of Drug Targeting. 23, 775-788 (2015).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 1654-1673 (2010).
- Hanson, L. R., Fine, J. M., Svitak, A. L., Faltesek, K. A. Intranasal administration of CNS therapeutics to awake mice. Journal of Visualized Experiments. (74), e4440 (2013).
- Merkus, P., Ebbens, F. A., Muller, B., Fokkens, W. J. Influence of anatomy and head position on intranasal drug deposition. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck. 263, 827-832 (2006).
- Zeller, S., et al. Attachment of cell-binding ligands to arginine-rich cell-penetrating peptides enables cytosolic translocation of complexed siRNA. Chemistry & Biology. 22, 50-62 (2015).
- Kim, J., et al. Silencing CCR2 in macrophages alleviates adipose tissue inflammation and the associated metabolic syndrome in dietary obese mice. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 5, (2016).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39 (2007).
- Beloor, J., et al. Small interfering RNA-mediated control of virus replication in the CNS is therapeutic and enables natural immunity to West Nile virus. Cell Host & Microbe. 23, 549-556 (2018).
- Ullah, I., et al. Trileucine residues in a ligand-CPP-based siRNA delivery platform improve endosomal escape of siRNA. Journal of Drug Targeting. 25, 320-329 (2017).
- Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S., Balyasnikova, I. V. Intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (124), e55845 (2017).
- Mittal, D., et al. Insights into direct nose to brain delivery: current status and future perspective. Drug Delivery. 21, 75-86 (2014).
- Renner, D. B., Frey, W. H., Hanson, L. R. Intranasal delivery of siRNA to the olfactory bulbs of mice via the olfactory nerve pathway. Neuroscience Letters. 513, 193-197 (2012).
- Serralheiro, A., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Intranasal administration of carbamazepine to mice: a direct delivery pathway for brain targeting. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 60, 32-39 (2014).
- Ruigrok, M. J., de Lange, E. C. Emerging insights for translational pharmacokinetic and pharmacokinetic-pharmacodynamic studies: towards prediction of nose-to-brain transport in humans. The AAPS Journal. 17, 493-505 (2015).
