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Immunology and Infection

Un dispositivo de posicionamiento para la colocación de ratones durante la entrega de siRNA intranasal al sistema nervioso central

doi: 10.3791/59201 Published: August 15, 2019

Summary

Aquí, presentamos un protocolo utilizando un dispositivo de posicionamiento del ratón que permite la colocación adecuada de ratones para la administración intranasal de una formulación de péptido-siRNA dirigida al cerebro que permite un silenciamiento eficaz del gen en el sistema nervioso central.

Abstract

La administración intranasal (IN) de medicamentos al cerebro ha surgido como un método prometedor para eludir la barrera hematoencefálica (BBB) para la administración de medicamentos en el sistema nervioso central (SNC). Estudios recientes demuestran el uso de un péptido, RVG9R, incorporando el dominio mínimo de unión a receptores de la glicoproteína del virus de la rabia, en la provocación de la entrega de siRNA en las neuronas en el cerebro. En este protocolo, la formulación de péptido-siRNA se entrega por vía intranasal con una pipeta en la mano dominante, mientras que el ratón anestesiado es restringido por el escruff con la mano no dominante en una "posición de cabeza hacia abajo y hacia adelante" para evitar el drenaje en el pulmón y el estómago al inhalar. Este agarre preciso de los ratones se puede aprender, pero no es fácil y requiere práctica y habilidad para resultar en la participación efectiva del SNC. Además, el proceso es de larga duración, requiriendo alrededor de 45 minutos para la administración de un volumen total de 20-30 l de solución en volúmenes de gotas de 1-2 l por inhalación, con 3-4 min períodos de descanso entre cada inhalación. El objetivo de este estudio es revelar un dispositivo de posicionamiento del ratón que permita la colocación adecuada de ratones para la administración eficiente de IN de la formulación de péptido-siRNA. Múltiples características se incorporan en el diseño del dispositivo, tales como cuatro u ocho sillas de posicionamiento con altura ajustable e inclinación para contener ratones anestesiados en la posición de la cabeza hacia abajo y hacia adelante, lo que permite una fácil visualización de las nares de los ratones y un almohadilla de calentamiento incorporada para mantener las temperaturas corporales de los ratones durante el procedimiento. Es importante destacar que la capacidad de tratar cuatro u ocho ratones simultáneamente con complejos RVG9R-siRNA de esta manera permite realizar estudios en una escala de tiempo mucho más rápida, para la prueba de un enfoque de SIRNA terapéutico IN. En conclusión, este dispositivo permite el posicionamiento adecuado y controlado del cabezal del ratón para la aplicación IN de RVG9R-siRNA y otras moléculas terapéuticas, como nanopartículas o anticuerpos, para la administración del SNC.

Introduction

El BBB evita que las moléculas administradas sistémicamente de >400-600 Da entren en el cerebro, lo que plantea un desafío significativo a la entrega de biomoléculas terapéuticas para enfermedades que afectan al SNC y al cerebro1. La administración directa de fármacos al cerebro se puede lograr mediante inyección estereotáctica; sin embargo, esto requiere experiencia quirúrgica y está altamente restringido en la entrega a áreas próximas al lugar de inyección, por lo que no es adecuado para uso clínico de rutina2. IN entrega al cerebro también puede resultar en la entrega directa del cerebro al pasar por alto el BBB, lo que permite la transferencia directa y rápida de una variedad de sustancias al cerebro3,4. Se cree que esta transferencia ocurre por los mecanismos de transporte a través de los nervios olfativos y trigéminos que conectan el conducto nasal con el cerebro, el líquido cefalorraquídeo y los sistemas linfáticos5. Como la ruta directa nariz-cerebro no involucra órganos y tejidos periféricos, reduce sustancialmente los efectos secundarios sistémicos y mejora la potencia. La administración IN es una alternativa no invasiva prometedora a las vías locales y sistémicas para la entrega cerebral de agentes terapéuticos y puede representar un enfoque poderoso para combatir los trastornos neurológicos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, y cáncer cerebral, y está siendo explorado en varios ensayos clínicos6,7,8.

Varios factores experimentales, como el volumen y el método de inoculación, así como el pH de formulación, influyen fuertemente en la administración de fármacos al SNC a través de la vía nariz-cerebro9. En estudios con ratones, el éxito de la administración de fármacos IN depende en gran medida del posicionamiento adecuado de la cabeza, que es fundamental para la deposición cerebral eficiente y para evitar el drenaje de fármacos en el entorno externo o las vías respiratorias. En particular, la mayoría de los estudios de roedores emplean una posición de dirección atrás (supina) con una inclinación de 70o-90o para la administración de fármacos al epitelio olfativo, aunque el posicionamiento de la cabeza a 0o puede favorecer el drenaje en la tráquea9. EN la administración de fármacos en ratones que están despiertos resulta en una reducción de la posición cerebral en comparación con cualquier aplicación en la posición supina, principalmente debido a la incapacidad de los científicos para mantener a los ratones en la posición deseada durante períodos más largos de tiempo. Por otra parte, la posición al revés requerida por el método de agarre de la piel empleado para ratones despiertos da como resultado la deposición de fármacos predominantemente en el nervio trigémino y el bulbo olfativo, así como en los órganos periféricos, como los riñones y los pulmones, en un plazo de 30 minutos postinoculación10. La posición corporal más adecuada para la administración de terapias a través de los nervios olfativos o trigémino en animales más grandes como los primates no humanos en estudios clínicos parece ser la posición de cabeza hacia abajo y hacia adelante (es decir, la llamada "oración a La Meca posición")11. Sin embargo, esta posición no ha sido bien estudiada en el modelo de ratón, y la posición supina es más ampliamente utilizada en estudios de roedores.

Anteriormente, hemos demostrado que el RVG9R, un péptido diseñado sobre la base del dominio mínimo de unión de receptores del virus de la rabia, muestra el tropismo a las células que expresan subunidades receptoras de acetilcolina nicotínicos como neuronas y macrófagos y media la entrega intracelular de siRNA mediante un mecanismo que implique la participación del receptor y la deslocalización temporal de la membrana plasmática en el lugar de la agregación del receptor12,13. Es importante destacar que la administración intravenosa sistémica de los complejos RVG9R-siRNA permite la administración transvascular de siRNA en el SNC14. Sin embargo, la vía sistémica diluye la cantidad de siRNA entregado al SNC, y los datos recientes demuestran que la administración IN de RVG9R:siRNA se complejo a ratones posicionados en la posición de cabeza hacia abajo y hacia adelante provoca nacones de genes objetivo de amplia propagación en múltiples regiones del cerebro15. Es importante destacar que este nivel de derribo se logró con tan solo 13,5 g de siRNA administrado en un régimen de cuatro dosis y 2 días, mientras que la vía intravenosa requiere una dosis de 5 veces más alta por inyección para lograr un derribo comparable. La única deficiencia del enfoque IN es que se trata de un procedimiento arduo, que requiere el uso de ambas manos durante la administración de la solución mientras se agarra continuamente a los ratones alternativamente en la cabeza hacia abajo y hacia adelante y en posiciones relajadas entre cada inhalación durante un período de tratamiento largo y considerable (un procedimiento de 30-45 min para la toma efectiva de un volumen de 20-30 l por ratón). El uso del dispositivo de posicionamiento del ratón presentado aquí permite la colocación adecuada de ratones con poca coacción física a los animales y al personal que realiza el protocolo, así como el tratamiento de múltiples cohortes de ratones dentro de un período de tiempo razonable, permitiendo un estudio en profundidad sobre el uso de siRNAs como terapéutico para la encefalitis del Nilo Occidental en ratones en etapas tardías de la enfermedad15.

Protocol

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Hanyang. En este protocolo, se utilizaron ratones Balb/c de 6 semanas de edad que pesan 20-25 g (n .3 por grupo). Los animales fueron alojados en una instalación libre de patógenos con ciclos de luz/oscuridad de 12 h a un nivel de temperatura y humedad controlado con libre acceso al agua y los alimentos.

1. Montaje del dispositivo

  1. Ensamble las partes individuales del dispositivo de posicionamiento como se muestra en la Figura 1A.
    NOTA: El dispositivo se suministra en piezas individuales que se pueden montar y desmontar fácilmente.

2. Configuración del material

NOTA: La administración IN de medicamentos licuados requiere los siguientes pasos de pretratamiento.

  1. Preparar los materiales necesarios, incluido el dispositivo de posicionamiento, una micropipeta de 10 l, puntas de micropipeta de 10 l, una solución de tratamiento (por ejemplo, complejo RVG9R-siRNA), un reloj del temporizador y un 70% de etanol (consulte la figura 2A).
  2. Enchufe el código de alimentación para encender el sistema de calefacción del dispositivo al menos 15-20 minutos antes del experimento. La temperatura óptima para los experimentos con animales se mantiene automáticamente a 37 oC.
  3. Preparar la anestesia ketamina:xilazina:solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una proporción de 1:0.5:8.5 y anestesiar cada ratón con una sola inyección intraperitoneal (es decir), inyección en un volumen final de 200 l por ratón de 20 g.
    NOTA: Tenga en cuenta que cualquier medicamento optimizado para garantizar la condición de anestesia durante un período de 30-45 min se puede utilizar.

3. Posicionamiento del ratón

  1. Evaluar el nivel de anestesia por reflejo de pedal (pellizco firme del dedo del pecho) para mantener el plano quirúrgico.
  2. Coloque el dispositivo de posicionamiento a una distancia y altura adecuadas para proporcionar un acceso conveniente a todos los reactivos necesarios.
  3. Una vez que los ratones estén correctamente anestesiados, levante suavemente cada ratón por el escraco de su cuello con el pulgar y el dedo puntero y colóquelo en la silla designada.
  4. El posicionamiento adecuado del ratón en la silla es muy importante en esta etapa. Poner la parte posterior del ratón paralela al soporte posterior de la silla, y a 90o del asiento de la silla. Levante las manos del ratón y deje que el animal se acueste naturalmente en la posición de la cabeza hacia abajo y hacia adelante, sin empujar o presionar, como se muestra en la Figura 2B. Asegúrese de que las extremidades delanteras del ratón proporcionen un soporte natural mientras el animal está en esta posición relajada, sin ninguna molestia para el ratón.
  5. Una vez que los ratones estén correctamente colocados, abróchelos con el cinturón de la silla e inicie inmediatamente la inoculación IN.

4. Parto intranasal

NOTA: Este protocolo describe la entrega IN de los complejos RVG9R:siRNA utilizando el dispositivo de posicionamiento del ratón. Usando este protocolo, se puede administrar fácilmente un máximo de 20-30 l de solución a cada ratón en gotas de 2 l. Este volumen es inferior al de la cavidad nasal del ratón,que es 0,032 cm 3, por lo que el procedimiento no da lugar a obstrucción o asfixia nasal letal. Este protocolo permite la inoculación simultánea de al menos cuatro ratones y un máximo de ocho ratones por dispositivo, lo que resulta en una optimización del tiempo y una variabilidad reducida.

  1. Tome el micropipeta de 10 l y ajústelo a 2 s.
  2. Cargue el micropipeta con 2 l de solución compleja de RVG9R:siRNA (p. ej., 5,2 g de siCy5 complejo con 104 g de RVG9R para el experimento de entrega, y 13,5 g de siSOD1 complejo con 270 g de RVG9R para el experimento de silenciamiento, en un volumen final de 25 l de PBS que contiene 5% de glucosa.
  3. Mientras sostiene la pipeta en la mano dominante, ajuste la posición colocando un codo en la parte superior del banco. Apoyar la mano sosteniendo la pipeta con la otra mano para evitar movimientos incontrolados durante la administración.
  4. Coloque una caída de 2 l muy cerca de una fosa nasal para que el ratón pueda inhalar directamente la gota (consulte la figura 2B). Si una pequeña gota no se forma fácilmente, entonces reemplace la punta de la pipeta por una nueva y repita la operación. Utilice el cronómetro para verificar el intervalo de tiempo entre las inoculaciones.
  5. Este dispositivo permite el tratamiento de al menos cuatro ratones a la vez. Si se requiere otro grupo de ratones para repetir el paso 4.4, establezca otra barra con cuatro sillas por encima o por debajo de la primera barra con cuatro sillas para acomodar hasta ocho ratones a la vez en el dispositivo.
  6. Repita el paso 4.4 con la otra fosa nasal después de 3-4 min desde la primera inoculación. Este intervalo de tiempo es suficiente para que el ratón complete la inhalación de la primera dosis y restaure la respiración normal. Si una gota de la solución inhalada se desaloja debido a un esnifar accidentalmente del naris del ratón, reinocula un adicional de 2 ml de solución.
  7. Repita todo el proceso con fosas nasales alternas hasta que finalice la dosis de 20-30 l. Se tardarán 30-45 minutos en completar todo el procedimiento de inoculación.
  8. Ponga un pomada húmeda en los ojos de los ratones antes de devolverlos a sus jaulas designadas.
    NOTA: No deje a los ratones desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la recumbencia esternal.

5. Análisis de datos

  1. Para confirmar la deposición cerebral de RVG9R con etiqueta fluorado, anestesia a los ratones (como se describe en el paso 2.3) y aísla el cerebro, así como otros órganos periféricos, como pulmón, hígado, bazo y riñón. Coloque cada órgano en ImageStation y visualice la fluorescencia con ImageStation.
  2. Para visualizar la fluorescencia debida a la etiqueta Cy5, prepare criosecciones de 20 m de espesor, cocines con Hoechst 33342, y realice un escaneo de cerebro completo con un microscopio confocal.
  3. Para evaluar el silenciamiento genético, extraiga el ARN de varias regiones cerebrales, como el bulbo olfativo, la corteza, el hipocampo, el tálamo, el hipotálamo, el cerebelo y el tallo cerebral, con un kit de purificación de ARN, transcrita inversamente en ADN CDNA utilizando un ADNC kit de síntesis, y realizar qPCR con pares de imprimación como se describió anteriormente15.

Representative Results

Posición de la cabeza durante la administración de IN es una influencia importante en la eficiencia de la administración de fármacos al cerebro. Aquí describimos la posición de la cabeza hacia abajo y hacia adelante utilizando un dispositivo de posicionamiento del ratón para la administración IN de una formulación de péptido-siRNA dirigida al cerebro para la entrega de la mezcla al SNC del ratón. Para verificar la entrega a través de la ruta IN, utilizamos el péptido RVG9R, previamente demostrado para unirse eficientemente a las células neuronales tanto in vitro como in vivo14,16.

Primero probamos la entrega de nariz a cerebro del péptido RVG9R etiquetado con Alexa Fluor 488 (RVG9R-A488) utilizando el dispositivo de posicionamiento del ratón descrito aquí. A 48 h de postinoculación, varios órganos, incluyendo el cerebro, el seno, los pulmones, el hígado, el bazo y los riñones fueron extirgados para medir la fluorescencia A488 asociada al tejido. Un488 solo, o un péptido de control (RVM9R-A488)14 que no se une nAchR, se utilizaron como controles negativos. Como era de esperar, ni A488 ni RVM9R-A488 fueron detectados en ninguno de los órganos a 48 h de postinoculación (Figura3A,izquierda). Por otro lado, una señal fluorescente fuerte A488 fue detectada exclusivamente en los cerebros del grupo inoculado RVG9R. Además, comparamos esta posición de colocación del ratón con el método de posición supina que se ha utilizado anteriormente17,así como con el método de despertar, para la eficacia. Inoculamos una cantidad fija de RVG9R-A488 (100 g) y ensayamos la biodistribución a 48 h de postinoculación. Los resultados indicaron que el posicionamiento de la cabeza de los ratones hacia abajo y hacia adelante mejoró la penetración y la deposición de RVG9R-A488 en todo el tejido cerebral (Figura3A,derecha). Por el contrario, los animales inoculados en una posición supina dieron lugar a la entrega de RVG9R-A488 al cerebro, pero no tan fuerte como se ve con el método del dispositivo de posicionamiento. Para confirmar aún más la entrega de siRNA al cerebro, realizamos un escaneo de cerebro completo después de una sola administración in de RVG9R compleja a 400 pmol (5,2 g) de siRNA con etiqueta Cy5. A diferencia de PBS o RVM9R, la complejidad con RVG9R resultó en una fuerte acumulación de siRNA en las principales regiones cerebrales, incluyendo el bulbo olfativo, la corteza, el hipocampo, el tálamo, el hipotálamo, el cerebro medio y el cerebelo (Figura3B ).

Por último, empleamos el análisis RT-qPCR para verificar la administración intracelular de siRNA funcional dirigida al gen superóxido dismutasa-1 (SOD1). Los ratones fueron inoculados por vía intranasal durante 3 veces en días consecutivos con RVG9R:siSOD1 (13,2 g de siRNA), y la expresión de ARNm SOD1 se analizó 24 horas después de la última inoculación. LA administración de RVG9R:siSOD1 dio lugar a una reducción sustancial de la expresión SOD1 en el bulbo olfativo (63%), la corteza (47%), el hipocampo (61%), el tálamo (53%), el hipotálamo (55%), el cerebro medio (39%) y el cerebelo (30%) (Figura 4). En conclusión, el uso de un dispositivo de posicionamiento permite una fácil inoculación IN de siRNA complejo RVG9R en ratones, lo que resulta en una administración de SIRNA específica del cerebro que induce el silenciamiento funcional del gen objetivo.

Figure 1
Figura 1 : Presentación fotográfica del conjunto del dispositivo. Las sillas de posicionamiento se montan en el soporte a la altura adecuada con tornillos. Después del montaje, el dispositivo se conecta a una fuente de alimentación para calentar a la temperatura fisiológica durante la inoculación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Presentación fotográfica del procedimiento de inoculación IN utilizando el dispositivo de posicionamiento. (A) Equipo experimental necesario para la inoculación IN. (B) Animales en la posición de cabeza hacia abajo y hacia adelante sentados en el dispositivo (izquierda) y la deposición de una gota de 2 l para la inoculación IN (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Distribución de péptido sin etiqueta fluorescente y siRNA después de la administración de IN. (A) Biodistribución del péptido RVG9R inoculado por vía intranasal a 48 h después de una única inoculación IN. El cerebro y otros órganos periféricos fueron evaluados para la presencia de fluorescencia en ratones inoculados con salina (PBS), A488,RVM-A488y RVG-A488 (izquierda). Las imágenes de los ratones tratados como se mencionó anteriormente mientras están despiertos, en la posición supina y en el posicionamiento del ratón se desconsiguen en la posición de la cabeza hacia abajo y hacia adelante (derecha). (B) Biodistribución del complejo RVG9R:siRNA en el cerebro (n a 3 por grupo). La distribución de siRNA con etiqueta Cy5 se visualizó en criosecciones cerebrales completas con un microscopio láser confocal en animales inoculados con salina (PBS), siRNA complejo con péptido de control (RVM9R-siCy5), o el péptido dirigido al cerebro RVG9R (RVG9R-siCy5). La barra de escala representa 1 mm. Abreviaturas: o.b - bombilla olfativa; ctx - corteza; hippo - hipopótamo; hipotálamo; tha á thalamus; m.b - cerebro medio; cerebelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : EN la aplicación de RVG9R:siSOD1 induce el silenciamiento del gen diana en múltiples regiones del cerebro. análisis qPCR para mRNA MUR SOD1 en regiones cerebrales indicadas 24 h después de la última inoculación IN de salina (PBS), RVG9R:siCD4 (siCD4), RVM9R:siSOD1 (RVM9R) y RVG9R:siSOD1 (RVG9R). Se muestra el silenciamiento relativo de SOD1 en la bombilla olfativa, la corteza, el hipocampo (superior), el tálamo, el hipotálamo, el cerebelo (medio) y el cerebro medio (inferior). Los datos representan la media de SD en relación con GAPDH después de normalizar los datos correspondientes de ratones tratados con salina (n a 3 por grupo). La caricatura que representa el porcentaje de ARNm SOD1 en la región cerebral indicada después de la inoculación IN se muestra (abajo a la derecha). **P < 0.01, ***P < 0.001. Abreviaturas: o.b - bombilla olfativa; ctx - corteza; hippo - hipopótamo; hipocampo; tha á thalamus; m.b - cerebro medio; cerebelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Hemos desarrollado un dispositivo de posicionamiento de ratón para posicionar de forma óptima ratones para la entrega nariz-cerebro de terapias. El dispositivo está equipado con diferentes funcionalidades, asegurando el fácil manejo simultáneo de los animales. También está equipado con almohadillas calefactoras para el mantenimiento de las temperaturas corporales fisiológicas de los animales durante la experimentación. Los ratones anestesiados se pueden mantener en la posición de la cabeza hacia abajo y hacia adelante por medio de sillas diseñadas específicamente, con un mínimo malestar a los animales. La altura de las sillas de posicionamiento se puede ajustar de la manera que sea mejor para visualizar las fosas nasales de los animales durante la administración de medicamentos.

IN brain delivery tiene varias limitaciones intrínsecas, incluyendo la pequeña superficie de las fosas nasales (permitiendo volúmenes máximos de 20-30 l por administración), irritación nasal, daño epitelio y absorción limitada a través del epitelio nasal18. La administración IN de fármacos a ratones colocados en la posición supina se ha utilizado para el suministro cerebral mediante la caída de drogas líquidas en las nares alternativas de los animales a través de pipeta o tubo de poliuretano (24 G x 19 mm) conectado a jeringas de microlitros19, 20. Aunque el uso de sistemas de tubos para liberar fármacos cerca del epitelio olfativo es un enfoque potencialmente adecuado, causa irritación o inflamación nasal tras la administración repetitiva. Además, el pequeño tamaño de la cavidad nasal limita este enfoque, especialmente en ratones que pueden ser superados por la repetición, así como por formulaciones de fármacos que persisten en la mucosa nasal. Otra opción es la administración IN de terapias para despertar ratones10. Sin embargo, este enfoque requiere procedimientos calificados para el manejo de animales durante la inoculación inoculación inoculación. Además, causa estrés animal y, por lo tanto, no es ideal para modelos de enfermedades, especialmente modelos de enfermedades infecciosas. Además, la dosificación inconsistente puede ser fácilmente el resultado del drenaje de drogas en los pulmones o el estómago debido al agarre imperfecto de los animales. El enfoque presentado aquí permite a los científicos superar estas barreras técnicas. La posición de la cabeza hacia abajo y hacia adelante reduce la posibilidad de fuga de drogas de la nariz a los pulmones mientras se inhala, favoreciendo la entrega directa y selectiva de siRNA al cerebro. IN entrega utilizando el dispositivo de posicionamiento del ratón no requiere ninguna técnica especializada para el manejo o agarre de los animales durante la inoculación. Cuatro animales a la vez pueden ser tratados por un período de al menos 30-45 min. El procedimiento se puede ampliar mediante la inclusión de una barra adicional de cuatro sillas, lo que permite una fácil gestión de hasta ocho ratones en la misma sesión experimental. Por lo tanto, siguiendo este método, un solo operador puede inducir la administración de medicamentos a los cerebros de grandes grupos de animales durante largos períodos de tiempo.

La estructura anatómica de la cavidad nasal influye fuertemente en el parto de nariz a cerebro (según lo revisado por Merkus et al.11 y Ruigrok y de Lange21). La superficie relativa de la cavidad nasal en ratones es 15 veces mayor que la de los seres humanos y la superficie relativa del epitelio olfativo es 6 veces mayor. Aunque hay diferencias significativas en la anatomía de la cavidad nasal en humanos a los roedores, hay aproximadamente 45 ensayos clínicos en curso utilizando el enfoque IN para tratar varios trastornos cerebrales (www.clinicaltrials.gov). El estudio presentado aquí indica que cuando se utiliza la administración in de terapias, los científicos deben considerar varios factores, como la posición de la cabeza, el sueño, y agentes de entrega adecuados.

Hemos demostrado la deposición eficiente y específica de siRNA etiquetada fluorescentemente al cerebro del ratón. Además, la disminución significativa de la expresión génica SOD1 observada después de la administración de IN siRNA confirmó efectos funcionales. Anteriormente mostramos consistentemente que la administración IN de complejos RVG9R-siRNA dirigidos al ARN del virus del Nilo Occidental (WNV) ejerce un fuerte efecto terapéutico sobre la encefalitis del VNM15. En particular, la administración de siRNA de nariz a cerebro requirió un ligando objetivo celular (RVG) y una molécula cargada positivamente (9R) a un siRNA complejo. En ausencia de estos elementos, las moléculas fueron despejadas a través del circuito sistémico y los vasos linfáticos 48 h posttratamiento (Figura3A)15. Por lo tanto, en la configuración experimental descrita aquí, hemos examinado la localización de péptido/siRNA 48 h después de la inoculación para imaginar sólo los niveles retenidos específicamente en el cerebro. Este enfoque podría implementarse fácilmente para la administración de otras moléculas, como proteínas, péptidos y nanopartículas, u otras terapias, para el tratamiento de una serie de trastornos relacionados con el cerebro.

Disclosures

P.K. y S.K.L. son cofundadores de Signet Biotech. P.K. es coinventor de la patente PCT/US07/12,152, que incluye en parte las reclamaciones relativas a RVG9R. I.U., K.C., P.K. y S.K.L. figuran como coinventores de una patente presentada (PCT/KR2016/014220), que incluye reclamaciones relativas a un dispositivo de posicionamiento del ratón.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Salud y Bienestar de Corea (HI17C1046) a S.K.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comercial assays
iScript cDNA synthesis kit BioRad Cat# 1708891
RNAiso plus TaKaRa Bio Cat# 9108
SYBR Premix ExTaq TaKaRa Bio Cat# RR420A
Dyes
Alexa fluor 488 ThermoFisher Cat# A30052
Mouse strain
Balb/c Orient Bio N/A 6-8 week old, 20-30g
Oligonucleotides and primers
Human CD4 ST Pharm N/A Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’
siSOD1 ST Pharm N/A Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’
GAPDH primers ST Pharm N/A F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’
SOD1 primers ST Pharm N/A F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’
Peptides
RVG9R Peptron N/A YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR
GKRASNGGGGRRRRRRRRR
RVM9R Peptron N/A MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS
PASAPLDGGGGRRRRRRRRR
Software, algorithms and devices
FlowJo software 4.3 FlowJO, LLC N/A http://docs.flowjo.com/vx/
Mouse positioning device Signet Biotech N/A
Prism software Graphpad N/A https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/
Prism software Graphpad N/A https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/

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References

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Ullah, I., Chung, K., Beloor, J., Lee, S. K., Kumar, P. A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (150), e59201, doi:10.3791/59201 (2019).More

Ullah, I., Chung, K., Beloor, J., Lee, S. K., Kumar, P. A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (150), e59201, doi:10.3791/59201 (2019).

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