Summary
Her presenterer vi en protokoll ved hjelp av en mus posisjonering enhet som muliggjør riktig plassering av mus for intranasal administrasjon av en hjerne-målretting peptid-siRNA formulering muliggjør effektiv gen demping i sentralnervesystemet.
Abstract
Intranasal (IN) narkotika levering til hjernen har dukket opp som en lovende metode for å omgå blod-hjerne-barriere (BBB) for levering av narkotika i sentralnervesystemet (CNS). Nyere studier viser bruk av et peptid, RVG9R, som omfatter minimal reseptor-bindende domene av rabies virus glykoprotein, i fremlokkende levering av siRNA i neurons i hjernen. I denne protokollen, peptid-siRNA formulering leveres intranasalt med en pipette i den dominerende hånden, mens anesthetized musen er behersket av scruff med nondominant hånd i en "hodet ned-og-frem posisjon" for å unngå drenering i lungene og magen ved innånding. Denne presise grep av mus kan læres, men er ikke lett og krever praksis og dyktighet til å resultere i effektive CNS opptak. Videre er prosessen lang trukket, krever ca 45 min for administrasjon av et samlet volum på ~ 20-30 μL av oppløsning i 1-2 μL dråpe volum per inhalasjon, med 3-4 min hvileperioder mellom hver inhalasjon. Målet med denne studien er å avsløre en mus posisjonering enhet som muliggjør riktig plassering av mus for effektiv i administrasjon av peptid-siRNA formulering. Flere funksjoner er innlemmet i utformingen av enheten, for eksempel fire eller åtte posisjonering stoler med justerbar høyde og vippe for å holde anesthetized mus i hodet ned-og-fremover posisjon, slik at enkel visualisering av musene nares og en innebygd oppvarming pad for å opprettholde musene kropps temperaturer under inngrepet. Viktigere, muligheten til å behandle fire eller åtte mus samtidig med RVG9R-siRNA komplekser på denne måten gjør studier på en mye raskere tidsskala, for testing av en IN terapeutisk siRNA tilnærming. Som konklusjon, denne enheten gir riktig og kontrollert mus hodet posisjonering for IN anvendelse av RVG9R-siRNA og andre terapeutiske molekyler, som nanopartikler eller antistoffer, for CNS levering.
Introduction
Den BBB hindrer systemisk administrert molekyler av > 400-600 da fra å komme inn i hjernen, utgjør en betydelig utfordring for levering av terapeutiske biomolekyler for sykdommer som påvirker CNS og hjernen1. Direkte legemiddellevering til hjernen kan oppnås ved stereotactic injeksjon; Dette krever imidlertid kirurgisk kompetanse og er svært begrenset i levering til områder proksimale til injeksjonsstedet, noe som gjør det uegnet for rutinemessig klinisk bruk2. I levering til hjernen kan også føre til direkte hjerne levering ved å omgå BBB, slik at for direkte og rask overføring av en rekke stoffer til hjernen3,4. Denne overføringen er antatt å skje ved transport mekanismer via olfactory og Trigeminal nerver som kobler nese passasje til hjernen, spinalvæsken, og lymfesystemet5. Som direkte nese-til-hjerne ruten ikke involverer perifere organer og vev, det vesentlig reduserer systemiske bivirkninger og forbedrer potens. IN administrasjon er et lovende ikke-invasiv alternativ til både lokale og systemiske ruter for hjerne levering av terapeutiske midler og kan representere en kraftig tilnærming for å bekjempe nevrologiske lidelser, inkludert Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, og Brain Cancer, og blir utforsket i flere kliniske studier6,7,8.
Flere eksperimentelle faktorer, slik som volum og metode for inoculation, samt formulering pH, sterkt påvirke stoffet levering til CNS via nese-til-hjerne Pathway9. I studier med mus, er suksessen til IN narkotika levering sterkt avhengig av riktig hode posisjonering, som er avgjørende for effektiv hjerne deponering og for å unngå narkotika drenering i det ytre miljøet eller luftveiene. Spesielt, sysselsetter flertallet av gnagere studier en hode-back stilling (liggende) med en 70 °-90 ° Tilt for narkotika levering til olfactory epitel, selv om hodet posisjonering på 0 ° kan favorisere drenering i luftrøret9. I levering av narkotika i mus som er våken resultater i redusert hjerne deponering i forhold til enhver anvendelse i liggende posisjon, hovedsakelig på grunn av vitenskapsmenn manglende evne til å holde mus i ønsket posisjon for lengre perioder av gangen. Videre, den opp-ned posisjon som kreves av huden grep metoden ansatt for våken mus resulterer i narkotika deponering hovedsakelig i Trigeminal Nerve og olfactory pære, samt perifere organer, som nyrer og lunger, innen 30 min postinoculation10. Den mest hensiktsmessige kroppen posisjon for levering av legemidler gjennom olfactory eller Trigeminal nerver i større dyr som nonhuman primater i kliniske studier synes å være hodet ned-og-fremover posisjon (dvs. den såkalte "ber til Mekka posisjon ")11. Imidlertid har denne posisjonen ikke vært godt studert i muse modellen, og liggende posisjon er mer utbredt i gnager studier.
Tidligere har vi vist at RVG9R, et peptid designet basert på minimal reseptor bindende domene av rabies virus, viser tropism til celler uttrykker nikotins acetylkolin reseptor under enheter som neurons og makrofager og formidler intracellulære levering av siRNA av en mekanisme som involverer reseptor engasjement og midlertidig plasma membran delocalization på stedet av reseptor aggregering12,13. Viktigere, systemisk intravenøs administrering av RVG9R-siRNA komplekser muliggjør transvascular levering av siRNA i CNS14. Men den systemiske ruten utvanner mengden siRNA levert til CNS, og nyere data viser at IN administrasjon av RVG9R: siRNA komplekser til mus plassert i hodet ned-og-fremover posisjon utløser bredt spredt mål genet knockdown i flere regioner av hjernen15. Viktigere var dette nivået av knockdown oppnådd med så lite som 13,5 mikrogram siRNA administrert over en fire-dose, 2 dagers regime mens IV ruten krever en ~ 5 ganger høyere dose per injeksjon for å oppnå sammenlignbare knockdown. Den eneste brist i IN tilnærmingen er at det er en krevende prosedyre, som krever bruk av begge hender under administrasjon av løsningen mens kontinuerlig gripe musene alternativt i hodet ned-og-frem og i avslappet posisjoner mellom hver inhalasjon for en betydelig lang behandlingsperiode (en 30-45 min prosedyre for effektiv opptak av et ~ 20-30 μL volum per mus). Ved hjelp av musen posisjonering enheten som presenteres her gjør at riktig plassering av mus med lite fysisk tvang til dyrene og personell utfører protokollen, samt behandling av flere kohorter av mus innen rimelig tid, muliggjør en grundig studie om bruk av siRNAs som en terapeutisk for West Nile encefalitt i mus ved sene stadier av sykdommen15.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med retningslinjer og protokoller godkjent av Animal Care og use Committee av Hanyang University. I denne protokollen ble 6 uker gamle Balb/c-mus som veide 20-25 g brukt (n = 3 per gruppe). Dyrene ble plassert i en patogen-fritt anlegg med 12 h lys/mørke sykluser på en kontrollert temperatur og luftfuktighet nivå med fri tilgang til vann og mat.
1. montering av enheten
- Monter de enkelte delene av posisjonerings enheten som vist i figur 1a.
Merk: enheten leveres i individuelle deler som enkelt kan monteres og demonteres.
2. Material oppsett
Merk: IN administrering av flytende medikamenter krever følgende forbehandling trinn.
- Klargjør de nødvendige materialene, inkludert posisjonerings enheten, 10 μL micropipette, 10 μL micropipette spisser, en behandlingsløsning (f.eks. RVG9R-siRNA-kompleks), en timer klokke og 70% etanol (se figur 2a).
- Plugg strøm koden for å slå på enhetens varmesystem minst 15-20 min før eksperimentet. Den optimale temperaturen for dyre eksperimenter opprettholdes automatisk ved ~ 37 ° c.
- Forbered anestesi ketamin: xylazine: fosfat-bufret Saline (PBS) i forholdet 1:0,5:8.5 og bedøve hver mus med en enkelt intraperitoneal (IP) injeksjon i et endelig volum på 200 μL per 20 g mus.
Merk: Vær oppmerksom på at noen optimalisert legemiddel for å sikre anestesi tilstand for en periode på 30-45 min kan brukes.
3. mus posisjonering
- Vurdere nivået av anestesi ved pedal refleks (fast tå knipe) for å opprettholde den kirurgiske planet.
- Plasser posisjonerings enheten i passende avstand og høyde for å sørge for praktisk tilgang til alle nødvendige reagenser.
- Når musene er riktig anesthetized, forsiktig løfte hver mus ved scruff av nakken med tommelen og pekefingeren og plassere den på den utpekte stolen.
- Riktig posisjonering av musen på stolen er svært viktig på dette stadiet. Lay musa er tilbake parallelt med ryggen støtte av stolen, og ved 90 ° til stolen setet. Løft hendene av musen og la dyret ligge naturlig i hodet ned-og-fremover posisjon, uten å trykke eller trykke, som vist i figur 2b. Sikre det musen ' forelimbs skaffe naturlig oppbacking stund det dyr er i denne avslappet holdning, uten alle ubehag å musa.
- Når musene er riktig plassert, stropp musene inn med stolen belte, og umiddelbart starte IN inoculation.
4. intranasal levering
Merk: denne protokollen beskriver IN levering av RVG9R: siRNA komplekser ved hjelp av musen posisjonering enheten. Ved hjelp av denne protokollen kan maksimalt 20-30 μL av oppløsning enkelt administreres til hver mus i 2 μL dråper. Dette volumet er lavere enn for musen er nesehulen, som er 0,032 cm3, slik at prosedyren ikke resulterer i dødelig nesebor obstruksjon eller kvelning. Denne protokollen tillater samtidig inoculation av minst fire mus og maksimalt åtte mus per enhet, noe som resulterer i tids optimalisering og redusert variasjon.
- Ta 10 μL micropipette og Juster den til 2 μL.
- Legg micropipette med 2 μL av RVG9R: siRNA kompleks løsning (f.eks. 5,2 μg av siCy5-complexed med 104 mikrogram RVG9R for leveringsforsøket, og 13,5 μg av siSOD1-complexed med 270 mikrogram RVG9R for forsøket med demping, i et endelig volum på 25 μL av PBS som inneholder 5% glukose.
- Mens du holder pipette i den dominerende hånden, justere posisjon ved å plassere en albue på benken toppen. Støtt hånden som holder pipette med den andre hånden for å unngå ukontrollerte bevegelser under administrering.
- Plasser en ~ 2 μL dråpe svært nær en nesebor, slik at musen kan direkte inhalerer dråpe (se figur 2b). Hvis en liten dråpe ikke er lett dannes, deretter erstatte pipette spissen med en ny og gjenta operasjonen. Bruk stoppeklokken til å kontrollere tidsintervallet mellom vaksiner.
- Denne enheten tillater behandling av minst fire mus om gangen. Hvis en annen gruppe av mus er nødvendig for å gjenta trinn 4,4, sette en annen bar med fire stoler over eller under den første linjen med fire stoler for å romme opptil åtte mus om gangen på enheten.
- Gjenta trinn 4,4 med det andre baugen etter 3-4 min fra første inoculation. Dette tidsintervallet er tilstrekkelig for musen til å fullføre innånding av den første dosen og gjenopprette normal pusting. Hvis en dråpe av inhalert oppløsning er forskyves på grunn av utilsiktet sniffet ut fra musen er naris, reinoculate ytterligere 2 μL løsning.
- Gjenta hele prosessen med alternative nesebor til 20-30-dosen av μL er ferdig. Det vil ta ~ 30-45 min å fullføre hele inoculation prosedyren.
- Sett våt salve på musene øyne før du returnerer musene tilbake til sine utpekte bur.
Merk: ikke la musene uten tilsyn før de har fått tilbake nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
5. data analyse
- For å bekrefte hjernen deponering av fluor-merket RVG9R, bedøve musene (som beskrevet i trinn 2,3) og isolere hjernen, så vel som andre perifere organer, som for eksempel lunge, lever, milt, og nyre. Plasser hvert organ på ImageStation og Visualiser fluorescens ved hjelp av ImageStation.
- For å visualisere fluorescens på grunn av Cy5-etiketten, klargjør du 20 μm-tykke cryosections, costained med Hoechst 33342 og utfører full hjerneskanning med et konfokalmikroskopi mikroskop.
- For å vurdere gendeaktivering, Pakk RNA fra forskjellige hjerneområder, slik som olfactory pære, cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lillehjernen og hjernestammen, med et RNA rensesett, omvendt-kopieres til cDNA ved hjelp av en cDNA syntese Kit, og utføre qPCR med primer parene som beskrevet tidligere15.
Representative Results
Head posisjon under IN administrasjon er en stor innflytelse på effektiviteten av stoffet levering til hjernen. Her har vi beskrevet hodet ned-og-fremover posisjon ved hjelp av en mus posisjonering enhet for IN administrasjon av en hjerne-målretting peptid-siRNA formulering for levering av blandingen til musen er CNS. For å verifisere levering gjennom i ruten, brukte vi RVG9R peptid, tidligere vist å effektivt binde til neuronal celler både in vitro og in vivo14,16.
Vi først testet nese-til-hjerne levering av RVG9R peptid merket med Alexa fluor 488 (RVG9R-A488) ved hjelp av musen posisjonering enheten beskrevet her. På 48 h postinoculation, ulike organer, inkludert hjernen, sinus, lungene, leveren, milten, og nyrene var excised å måle vev-assosiert A488 fluorescens. A488 alene, eller en kontroll PEPTID (RVM9R-a488)14 som ikke binder nAchR, ble brukt som negative kontroller. Som forventet, verken en488 eller RVM9R-A488 ble påvist i noen av organene på 48 h postinoculation (figur 3a, venstre). På den annen side, en sterk fluorescerende A488 signal ble oppdaget utelukkende i hjernen til RVG9R-inokulert gruppe. I tillegg har vi sammenlignet denne musen plassering posisjon til liggende posisjon metoden som har vært brukt tidligere17, så vel som til våken metode, for effekt. Vi inokulert et fast beløp på RVG9R-A488 (100 μg) og analyseres biodistribusjon ved 48 h postinoculation. Resultatene indikerte at posisjonering musene hodet ned-og-frem forbedret penetrans og deponering av RVG9R-en488 i hele hjernevevet (figur 3a, høyre). I kontrast, dyrene inokulert i en liggende posisjon resulterte i levering av RVG9R-en488 til hjernen, men ikke så sterk som sett med posisjonering enheten metoden. For ytterligere å bekrefte siRNA levering til hjernen, utførte vi full-hjerneskanning etter en enkelt IN administrasjon av RVG9R complexed til 400 pmol (5,2 mikrogram) av Cy5-merket siRNA. I motsetning til PBS eller RVM9R, kompleks med RVG9R resulterte i en sterk opphopning av siRNA i store hjernen regioner, inkludert olfactory pære, cortex, hippocampus, den thalamus, hypothalamus, den mellomhjernen, og lillehjernen (figur 3b ).
Til slutt har vi ansatt RT-qPCR analyse for å verifisere intracellulære levering av funksjonell siRNA rettet mot superoxide dismutase-1 (SOD1) genet. Mus ble inokulert intranasalt for 3 ganger på etterfølgende dager med RVG9R: siSOD1 (13,2 μg av siRNA), og SOD1 mRNA-uttrykket ble analysert 24 h etter siste inoculation. RVG9R: siSOD1 administrasjon resulterte i en betydelig reduksjon av SOD1 uttrykket i olfactory pære (63%), cortex (47%), hippocampus (61%), thalamus (53%), hypothalamus (55%), mellomhjernen (39%), og lillehjernen (30%) (Bilde 4). Som konklusjon, bruk av en posisjonering enhet muliggjør en enkel IN inoculation av RVG9R-complexed siRNA i mus, noe som resulterer i hjerne-spesifikk siRNA levering inducing funksjonell demping av målet genet.
Figur 1 : Fotografisk presentasjon av enheten forsamlingen. Posisjonering stolene er montert på stativet i riktig høyde med skruer. Etter monteringen er enheten koblet til en strømforsyning for oppvarming til fysiologisk temperatur under inoculation. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Fotografisk presentasjon av in inoculation-prosedyren ved hjelp av posisjonerings enheten. (A) eksperimentell utstyr som kreves for in-inoculation. (B) dyr i hodet ned-og-frem posisjon sitter på enheten (venstre) og deponering av en 2 μL DRÅPE for in inoculation (høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Fordeling av fluorescensmerkete merket peptid og siRNA etter in administrasjon. (A) biodistribusjon av INTRANASALT inokulert RVG9R peptid på 48 h etter en singel in inoculation. Hjernen og andre perifere organer ble evaluert for tilstedeværelsen av fluorescens i mus inokulert med saltvann (PBS), A488, RVM-a488, og RVG-A488 (venstre). Imaging av musene behandlet som nevnt ovenfor, mens de er våken, i liggende posisjon, og i musen posisjonering utarbeide i hodet ned-og-fremover posisjon (høyre). (B) BIODISTRIBUSJON av RVG9R: siRNA-komplekset i hjernen (n = 3 per gruppe). Fordelingen av Cy5-merket siRNA ble visualisere i full hjerne cryosections med et konfokalmikroskopi laser mikroskop i dyr inokulert med Saline (PBS), siRNA complexed med kontroll peptid (RVM9R-siCy5), eller hjernen-målretting peptid RVG9R (RVG9R-siCy5). Skalaen bar representerer 1 mm. forkortelser: o. b = olfactory pære; ctx = cortex; = hippocampus; allergi = hypothalamus; tha = thalamus; m. b = mellomhjernen; CER = lillehjernen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Ved anvendelse av RVG9R: siSOD1 induserer mål gendeaktivering i flere områder av hjernen. qPCR-analyse for murine SOD1 mRNA i angitte hjerneområder 24 timer etter den siste i inoculation av saltvann (PBS), RVG9R: siCD4 (siCD4), RVM9R: siSOD1 (RVM9R) og RVG9R: siSOD1 (RVG9R). Den relative SOD1-demping i olfactory pære, cortex, hippocampus (øvre), thalamus, hypothalamus, den lillehjernen (midten), og mellomhjernen (lavere) vises. Data representerer gjennomsnittet ± SD i forhold til GAPDH etter normalisering med de tilsvarende data av salt-behandlede mus (n = 3 per gruppe). Tegneserien viser prosentandelen av SOD1 mRNA i angitt hjerne region etter IN-inoculation vises (nederst til høyre). * *P < 0,01, * ** p < 0,001. Forkortelser: o. b = olfactory pære; ctx = cortex; = hippocampus; allergi = hippocampus; tha = thalamus; m. b = mellomhjernen; CER = lillehjernen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vi har utviklet en mus posisjonerings enhet for optimalt posisjonering mus for nese-til-hjerne levering av legemiddel selskap. Enheten er utstyrt med ulike funksjoner, noe som sikrer enkel samtidig håndtering av dyr. Det er også utstyrt med Varmeputer for vedlikehold av dyrenes fysiologiske kropps temperaturer under eksperimentering. Den anesthetized mus kan opprettholdes i hodet ned-og-fremover posisjon ved hjelp av spesielt designede stoler, med minimal ubehag for dyrene. Høyden på posisjonering stolene kan justeres på en slik måte som er best å visualisere dyret nesebor mens administrering av narkotika.
I hjernen levering har flere iboende begrensninger, inkludert det lille overflatearealet av nesebor (som tillater maksimalt volum på 20-30 μL per administrasjon), nasal irritasjon, epitel skader, og begrenset absorpsjon over nese epitel18. IN administrering av legemidler til mus plassert i liggende posisjon har blitt brukt til hjerne levering ved å slippe flytende medikamenter inn i dyrenes alternative nares via pipette eller polyuretan slange (24 G x 19 mm) koblet til mikroliter sprøyter19, 20. selv om bruk av rørsystemer for å løslate narkotika i nærheten av olfactory epitel er en potensielt egnet tilnærming, det fører til irritasjon eller nasal betennelse ved repeterende administrasjon. Videre begrenser den lille størrelsen på nesehulen denne tilnærmingen, spesielt hos mus som kan overvinnes ved å gjenta, så vel som av legemiddel formuleringer som vedvarer i neseslimhinnen. Et annet alternativ er IN administrasjon av legemiddel selskap til våken mus10. Denne tilnærmingen krever imidlertid dyktige prosedyrer for håndtering av dyr i løpet av inoculation. I tillegg fører det dyr stress, og derfor er ikke ideelt for sykdom modeller, spesielt smittsomme sykdommer modeller. Videre kan inkonsekvent dosering lett oppstå fra narkotika drenering i lungene eller magen på grunn av ufullkomne dyr gripende. Tilnærmingen som presenteres her tillater forskere å overvinne disse tekniske barrierene. Hodet Down-og-Forward posisjon reduserer muligheten for narkotika lekkasje fra nesen til lungene mens inhalering, favoriserer direkte og selektiv siRNA levering til hjernen. IN levering ved hjelp av musen posisjonering enheten krever ikke noen spesialisert teknikk for håndtering eller gripe dyrene under inoculation. Fire dyr om gangen kan behandles for en periode på minst 30-45 min. Prosedyren kan skaleres opp ved å inkludere en ekstra fire-stolen bar, noe som åpner for enkel styring av opptil åtte mus i samme eksperimentelle økten. Derfor, etter denne metoden, en enkelt operatør kan indusere narkotika levering til hjernen av store grupper av dyr over lengre perioder.
Den anatomiske strukturen i nesehulen påvirker sterkt nese-til-hjerne-leveringen (som gjennomgått av Merkus et al.11 og Ruigrok og de lange21). Den relative overflateareal av nesehulen i mus er 15 ganger større enn for mennesker og den relative overflateareal av olfactory epitel er 6 ganger større. Selv om det er betydelige forskjeller i anatomi av nesehulen hos mennesker til gnagere, er det ca 45 kliniske studier i gang med IN tilnærming til å behandle flere hjerne lidelser (www.clinicaltrials.gov). Studien viser her at når du bruker i levering av legemiddel, bør forskerne vurdere flere faktorer, for eksempel hodet posisjon, sove, og riktig levering agenter.
Vi har vist den effektive og spesifikke deponering av fluorescensmerkete merket siRNA til musen hjernen. Videre observerte den betydelige reduksjonen i SOD1 genuttrykk etter at IN siRNA-leveransen har bekreftet funksjonelle effekter. Vi har tidligere viste konsekvent at IN administrasjon av RVG9R-siRNA komplekser rettet mot West Nile virus (WNV) RNA utøver en sterk terapeutisk effekt på WNV encefalitt15. Spesielt, nese-til-hjerne siRNA levering krevde en celle-målretting ligand (RVG) og et positivt ladet molekyl (9R) til komplekse siRNA. I fravær av disse elementene, ble molekyler ryddet gjennom systemisk krets og lymfesystemet fartøy 48 h posttreatment (figur 3a)15. Derfor, i den eksperimentelle oppsett beskrevet her, har vi undersøkt peptid/siRNA lokalisering 48 h etter inoculation til bildet bare nivåer beholdt spesielt i hjernen. Denne tilnærmingen kan lett implementeres for levering av andre molekyler, slik som proteiner, peptider, og nanopartikler, eller andre legemidler, for behandling av en rekke hjerne-relaterte lidelser.
Disclosures
P.K. og S.K.L. er Grunnlegerne av signet Biotech. P.K. er coinventor av patent PCT/US07/12152, som delvis omfatter krav knyttet til RVG9R. I.U., K.C., P.K., og S.K.L. er oppført som coinventors av en sendt patent (PCT/KR2016/014220), som inkluderer krav knyttet til en mus posisjonering enhet.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Korea Ministry of Health & velferd (HI17C1046) til S.K.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comercial assays | |||
| iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
| RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
| SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
| Dyes | |||
| Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
| Mouse strain | |||
| Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
| Oligonucleotides and primers | |||
| Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
| siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
| GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
| SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
| Peptides | |||
| RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
| RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
| Software, algorithms and devices | |||
| FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
| Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
References
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (56), e2968 (2011).
- Khan, A. R., Liu, M., Khan, M. W., Zhai, G. Progress in brain targeting drug delivery system by nasal route. Journal of Controlled Release. 268, 364-389 (2017).
- Meredith, M. E., Salameh, T. S., Banks, W. A. Intranasal delivery of proteins and peptides in the treatment of neurodegenerative diseases. The AAPS Journal. 17, 780-787 (2015).
- Pardeshi, C. V., Belgamwar, V. S. Direct nose to brain drug delivery via integrated nerve pathways bypassing the blood-brain barrier: an excellent platform for brain targeting. Expert Opinion on Drug Delivery. 10, 957-972 (2013).
- Agrawal, M., et al. Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs. Journal of Controlled Release. 281, 139-177 (2018).
- Van Woensel, M., et al. Formulations for intranasal delivery of pharmacological agents to combat brain disease: a new opportunity to tackle GBM. Cancers. 5, 1020-1048 (2013).
- Kulkarni, A. D., et al. Nanotechnology-mediated nose to brain drug delivery for Parkinson's disease: a mini review. Journal of Drug Targeting. 23, 775-788 (2015).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 1654-1673 (2010).
- Hanson, L. R., Fine, J. M., Svitak, A. L., Faltesek, K. A. Intranasal administration of CNS therapeutics to awake mice. Journal of Visualized Experiments. (74), e4440 (2013).
- Merkus, P., Ebbens, F. A., Muller, B., Fokkens, W. J. Influence of anatomy and head position on intranasal drug deposition. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck. 263, 827-832 (2006).
- Zeller, S., et al. Attachment of cell-binding ligands to arginine-rich cell-penetrating peptides enables cytosolic translocation of complexed siRNA. Chemistry & Biology. 22, 50-62 (2015).
- Kim, J., et al. Silencing CCR2 in macrophages alleviates adipose tissue inflammation and the associated metabolic syndrome in dietary obese mice. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 5, (2016).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39 (2007).
- Beloor, J., et al. Small interfering RNA-mediated control of virus replication in the CNS is therapeutic and enables natural immunity to West Nile virus. Cell Host & Microbe. 23, 549-556 (2018).
- Ullah, I., et al. Trileucine residues in a ligand-CPP-based siRNA delivery platform improve endosomal escape of siRNA. Journal of Drug Targeting. 25, 320-329 (2017).
- Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S., Balyasnikova, I. V. Intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (124), e55845 (2017).
- Mittal, D., et al. Insights into direct nose to brain delivery: current status and future perspective. Drug Delivery. 21, 75-86 (2014).
- Renner, D. B., Frey, W. H., Hanson, L. R. Intranasal delivery of siRNA to the olfactory bulbs of mice via the olfactory nerve pathway. Neuroscience Letters. 513, 193-197 (2012).
- Serralheiro, A., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Intranasal administration of carbamazepine to mice: a direct delivery pathway for brain targeting. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 60, 32-39 (2014).
- Ruigrok, M. J., de Lange, E. C. Emerging insights for translational pharmacokinetic and pharmacokinetic-pharmacodynamic studies: towards prediction of nose-to-brain transport in humans. The AAPS Journal. 17, 493-505 (2015).
