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Biology

매체-처리량에 캘리포니아2 +효과의 평가 대 한 분석 실험을 심사-신호 및 인간의 정자에서 Acrosome 반응

Published: March 1, 2019 doi: 10.3791/59212
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Growth and Reproduction, Copenhagen University Hospital, 2International Center for Research and Research Training in Endocrine Disruption of Male Reproduction and Child Health (EDMaRC), University of Copenhagen

Summary

여기, 캘리포니아2 +에 효과의 평가 대 한 두 개의 중간 처리량 분석-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응 같습니다. 이 분석 실험은 신속 하 고 쉽게 화면에 캘리포니아2 +효과 대 한 화합물의 큰 금액을 사용할 수 있습니다-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응.

Abstract

캘리포니아2 +-신호 하는 것은 정상적인 정자 세포 기능 및 남성 불 임에 필수적 이다. 마찬가지로, acrosome 반응 zona pellucida 관통 하 고 계란을 기름 지 게 하는 인간의 정자 세포의 능력에 대 한 생명 이다. 따라서 화합물 (예: 환경 화학 물질 또는 약물 후보)에 캘리포니아2 +그들의 효과 대 한 테스트를 큰 관심-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응 인간의 정자 세포 기능에 잠재적인 악영향을 검사 하거나 또는 피임약으로 가능한 역할 조사 여기, 두 매체 처리량 분석 설명: 캘리포니아2 +에 효과의 평가 대 한 형광 기반 분석 결과 1)를-인간의 정자에 2) 이미지 cytometric 분석 결과 인간의 정자에서 acrosome 반응의 평가 대 한 신호. 이러한 분석 화면에 캘리포니아2 +효과 대 한 화합물의 많은 수를 사용할 수 있습니다-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응. 개별 화합물의 매우 구체적인 복용량 응답 곡선 생성, 두 개 이상의 화합물에 대 한 잠재적인 가산/성분 확인 하 고 경쟁 저해를 통해 행동의 약리 모드를 공부 하는 분석 실험을 사용할 수 있습니다 또한, CatSper 억제제와 실험입니다.

Introduction

여기에 설명 된 두 개의 분석 실험의 목적은 캘리포니아2 +에서 효과 검사-신호 및 acrosome 반응 인간의 정자에 대 한 표시 된 것 처럼 이러한 채용 여러 출판물에 여러 화합물 분석 실험1,2, 3,,45,,67. 캘리포니아2 +-신호 및 acrosome 반응은 모두 정상으로 중요 한 인간의 정자 세포 기능 및 남성 불 임.

인간의 정자 세포의 전반적인 목표는 계란을 기름 지 게. 수 성공적으로 하 고 자연스럽 게 계란을 기름 지 게, 정자 세포의 기능 여성 재생산 지역8,9정자 세포의 여행 동안 긴밀 하 게 규제 되어야 합니다. 대부분의 정자 세포 함수는 세포내 캘리포니아2 +를 통해 통제 된다-농도 [캘리포니아2 +]나 (예를 들어, 정자 운동 성, chemotaxis, 및 acrosome 반응)10. 또한, 정자 세포의 계란을 비 옥 수 있는 렌더링, capacitation 라는 성숙 과정 [캘리포니아2 +]에 의해 부분적으로 규제나10이다. 캘리포니아2 +-압출 캘리포니아2 +-ATPase 펌프11 유지는 대략 20.000 배 캘리포니아2 +-는 휴식 [캘리포니아2 +]나 50-100 nM의와 인간의 정자 세포 막에 그라데이션. 만약 캘리포니아2 + 수 교차 하는 세포 막 (예를 들어, 캘리포니아2 +의 오프닝을 통해-채널), 캘리포니아2 + 의 상당한 유입을 발생을 야 기한 [캘리포니아2 +]나의 상승. 그러나, 정자 세포 또한 운반 세포내 캘리포니아2 +-캘리포니아2 + 풀어 놓을 수 있는 상점, 및, 따라서, 또한 줄 [캘리포니아2 +]나12의 상승 상승. 흥미롭게도, 모든 채널 중재 캘리포니아2 +-인간의 정자 세포에 유입은 지금까지 발견 되었습니다 CatSper ( Sperm의고양이이온 채널), 정자 세포11표현만 통해 발생. 인간의 정자 세포에서 CatSper에 의해 활성화 되는 내 인 성 ligands 황 체 호르몬 및 다른 ligand 바인딩 사이트13,,1415, 통해 prostaglandins 선도 하는 급속 한 캘리포니아2 +-로 유입 정자 세포입니다. 두 가지 주요 소스 계란 근처이 내 인 성 ligands의 높은 수준을 제공합니다. 소 낭 모양 액체 progesterone16의 높은 수준을 포함 하는 하나입니다. 소 낭 모양 액체가 배 란 및 oviducts17내 액체와 함께 혼합에 달걀 함께 성숙 난 포에서 나온다. 다른 주요 소스 계란을 포위 하 고 황 체 호르몬과 prostaglandins의 높은 수준을 출시 적 운 세포 이다. 황 체 호르몬 유도 캘리포니아2 +-정자 세포에 유입 계란9,18향해 chemotaxis 중재, 정자 운동 성19,20 제어는 acrosome 자극을 보였다 반응21. 이러한 개별 [캘리포니아2 +]나의-규제 정자 기능 올바른 순서로, 올바른 시점에 달걀8의 수정에 대 한 중요 하다. 이 차선 황 체 호르몬 유도 된 Ca2 +라인-유입 발견 되었습니다 관련 된 남성 불 임22,23,,2425,26 감소 ,27,,2829 및 기능 CatSper 남성 불 임26,30,,3132를 위해 근본적 이다 33,,3435,36.

정자 세포에 도달 계란, 이벤트의 시퀀스 일어나 야 한다 발생을 수정에 대 한: 1)는 정자 세포 해야 합니다 주변 적 운 세포 층에 침투, 2)에 zona pellucida, 3) exocytose acrosomal 콘텐츠, 소위 acrosome 반응 37, 4) 침투 zona pellucida, 및 5) 수정38완료 계란 막으로 융합. 이러한 단계를 통해가 서 계란을 기름 지 게 하 수, 정자 세포 먼저 받아야 capacitation11, 정자 세포 "decapacitating" 요인39 를 포함 하는 정액 액체 두고 여성의 체액에 수영으로 시작 중 탄산염과 알 부 민37의 높은 수준의 생식 요로. Capacitation 렌더링 정자 세포 hyperactivation, 운동 편, 그리고 acrosome 반응37의 활발 한 매 질으로의 형태를 받을 수 있게 합니다. Hyperactivated 운동 zona pellucida40의 침투에 대 한 필수 이며는 acrosome 포함41이 침투 과정 원조 하는 각종 가수분해 효소. 또한, acrosome 반응 렌더링 정자 세포 정자 계란 퓨전42에 필요한 정자 표면에 특정 막 단백질을 노출 하 여 계란으로 융합의 수 있습니다. 따라서, hyperactivation 및 acrosome 반응을 받 다 수는 모두42달걀40,성공적인 수정에 필요한. 무슨 마우스 정자 세포43,,4445볼 수 있다, 반대로 acrosome 그대로 인간의 정자 셀 zona pellucida46에 바인딩할 수 있습니다. 인간의 정자 세포 zona pellucida에 바인딩되면 받아야 acrosome 반응 zona pellucida41 침투와 계란38와 융합에 필요한 특정 막 단백질을 노출 해야 합니다. 인간의 정자에서 acrosome 반응의 타이밍은 따라서 수정 발생 하는 것 중요 합니다.

위에서 설명한 대로, 캘리포니아2 +-정상적인 정자 세포 기능8, 그리고 그것은, 따라서, 캘리포니아2 +에서 효과 대 한 화합물의 스크린 다 수 수 큰 관심의 신호 하는 것은 매우 중요-인간의 정자 세포에 신호. 마찬가지로, acrosome 반응에 적절 한 시기와 장소를 받을 인간의 정자 세포 zona pellucida 침투 수 계란46,47을 거 름으로 그것은 또한 테스트를 그들의 능력에 대 한 화합물 수 큰 관심 인간의 정자에서 acrosome 반응을 영향을 줍니다. 이 위해, 2 개의 중간 처리량 심사 분석 설명: 1)에 캘리포니아2 +효과 대 한 분석 결과-인간 정자 세포, 및 2) 인간의 정자 세포에 acrosome 반응을 유도 하는 기능에 대 한 분석 결과에 신호.

분석 결과 1은 중간 처리량 캘리포니아2 +-신호 분석 결과. 이 형광 플레이트 리더 기반 기술은 여러 우물에서 동시에 시간의 기능으로 형광에 변화를 모니터링합니다. 캘리포니아2 +-민감한 형광 염료, Fluo-4는 캘리포니아2 +≈ 335 Kd nM 오전 (acetoxymethyl) 에스테 르 형태로 셀 permeant입니다. Fluo-4를 사용 하 여, 시간이 지남에 그리고 정자 세포에 대 한 관심의 화합물의 추가 후 [캘리포니아2 +]i 에 변화를 측정 가능 하다. 분석 결과 201113 티 Strünker의 연구소에 의해 개발 되었다 이후 사용 되 고 있습니다 화면 화합물을 여러 연구에 대 한 효과에 캘리포니아2 +-인간의 정자1,2,3, 신호 4,5. 또한 유사한 방법 여러 약물 후보48에 사용 되었습니다. 또한,이 분석 결과 또한 행동1,2,3,,45, 복용량 응답 곡선1, 약리학 모드를 평가 하는 데 유용 2,3,,45, 경쟁력 저해1,2, 가산1,2및의 성분3 화합물 관심의.

분석 결과 2 중간 처리량 acrosome 반응 분석 결과가 이다. 이 이미지 cytometer 기반 기술 측정 가능한 양의 acrosome 반응 3 형광 염료를 사용 하 여 샘플에서 정자 세포: propidium 요오드 화물 (PI), Pisum sativum FITC-PSA (), 및 Hoechst 33342 lectin FITC 결합. 분석 결과 Zoppino 외.49 에 의해 유사한 흐름 cytometry 기반 방법에서 수정 하 고 여러 연구6,7에 사용 되었습니다. 캘리포니아2 +에 관해서는-이 acrosome 반응 분석 결과 수 또한 사용 평가 복용량 응답 곡선, 억제, 가산, 그리고 관심의 화합물의 성분 분석 결과, 신호.

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Protocol

수집 및 분석 프로토콜에서 인간의 정액 샘플의 덴마크의 자본 지역의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 모든 정액 샘플을 자원 봉사 기증자에서 동의 후 가져올 되었습니다. 배달 후 샘플 완전히 익명 했다. 그들의 불편에 대 한 각 기증자 샘플 당 500 DKK (약 75 미국 달러)의 수수료를 받았다. 샘플 배달 당일 분석 하 고 실험실 실험 직후 파괴 했다.

참고: 중간 처리량 캘리포니아2 +-4-5 단계와 6-7 단계에서 중간 처리량 acrosome 반응 분석 결과에서 분석 결과 설명 하는 신호. 인간의 튜 유체 (HTF+) 매체를 준비 하는 프로토콜은 1 단계에서 설명 하 고는 분석 실험에 대 한 정자 세포의 정화 2-3 단계에서 설명 하는.

1. 인간의 튜 유체 (HTF+) 매체의 준비

참고: 적절 한 크기, 측정 실린더, 자기 활동가, 표 1 에 나열 된 소금 1 L과 표 2, 물 정화, 0.2 µ m의 사용 부피 플라스 크에는 필터, 그리고 50 mL 플라스틱 튜브 기 공.

  1. 순화 된 물 (표 1)에 염 분의 재고 솔루션을 준비 합니다.
    1. 적절 한 크기의 부피 플라스 크에 표 1 에 나열 된 소금의 양을 추가 하 고 원하는 볼륨 아래 조금 물을 추가할는 자력을 사용 하 여 잘 혼합.
    2. 소금은 완전히 해산 하 고, 자석 및 채우기 원하는 최종 볼륨을 순화 된 물으로 제거 합니다.
  2. 병에 재고 솔루션을 전송 하 고 사용까지 저장 합니다.
    참고: 재고 솔루션을 유지 하 고 오랜 시간에 다시 사용 수: 포도 당 고-20 ° C에서 HEPES, 실 온 (RT)에서 다른 재고 솔루션.
  3. 재고 솔루션 (표 2)에서 HTF+ 매체의 1 리터를 준비 합니다.
    1. 모든 재고 솔루션은 완전히 해산 하 고 잘 혼합 사용 하기 전에 확인 하십시오.
    2. 재고 솔루션 및 측정 실린더 1 L를 표 2 에 나열 된 소금의 양을 추가 하 고 순화 된 물 900 mL에 추가.
    3. 자력 교 반기를 사용 하 여 잘 혼합 하 고 pH 7.35 NaOH 솔루션을 조정.
    4. 자석 분리 하 고 순화 된 물 1000 mL에 추가.
  4. 0.2 µ m 기 공 필터, 50 mL 플라스틱 튜브, 그리고 저장소 사용까지 4 ° C에서 aliquot HTF+ 매체를 통해 살 균 여과 액 HTF+ 매체.
  5. 실험을 실행 하기 전에 그냥 0.33 m m의 최종 없음 pyruvate 농도를 약 50 mL 수를 Na pyruvate의 165 µ L를 추가 합니다.
    참고: 인간의 튜 액체 매체는 또한 다양 한 상업적인 공급자에서 얻을 수 있습니다. 4 m m HCO3- 매체를 사용할 때 샘플 pH에 큰 드리프트 없이 공기에서 여분의 CO2 없이 인큐베이터에서 닫힌 뚜껑 incubated 수 있습니다. CO2 배양 기를 사용할 수 있으면 헨 더 슨-Hasselbalch 방정식을 사용 하 여 및 사용 CO2 의 해당 금액을 계산할 수 있습니다. CO2 (5-10% 사이 보통 대기압에 따라 다름)의 해당 금액을 포함 하는 공기 샘플 CO2 배양 기에서 오픈 뚜껑 incubated 한다 25 m m HCO3- 매체를 사용 하는 경우 산도에서 드리프트 방지를 위해. 헨 더 슨-Hasselbalch 방정식을 사용 하 여 CO2 의 정확한 금액을 계산할 수 있습니다.

2. 수영 업 (그림 1)를 통해 운동 정자 세포의 정화

참고: 깨끗 한 넓은 물리기 플라스틱 컨테이너를 사용 하 여 45 ° 각도, HTF+ 매체 (에서 준비 단계 1 또는 얻은 상업적인 공급자에서), 원심 분리기, 그리고 인간의 혈 청에 50ml 플라스틱 튜브를 삽입 하기 위한 랙, 50ml 플라스틱 튜브, 인큐베이터, 정액 샘플에 대 한 알 부 민 (HSA)입니다.

  1. 자 위를 통해 생산 하 고 넓은 물리기 깨끗 한 플라스틱 용기에 ejaculated 갓 기증된 인간의 정액 샘플을 얻습니다. 검사 및 인간 정액의 처리에 대 한 WHO 실험실 설명서에 의해 설립 하는 매개 변수를 충족 하는 정액 샘플만 사용 합니다.
  2. 액 화 하 수 있도록 15-30 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
  3. 4 m m HTF+ 매체의 50 mL HCO3- 37 ° c 열
  4. 장소 (액체 사이의 표면 영역을 증가)를 45 ° 각도로 랙에 50 mL 플라스틱 튜브 청소. 원시 정액의 mL 당 1 튜브를 사용 합니다.
  5. 튜브의 각 preheated HTF+ 매체의 4 mL를 추가 합니다.
  6. 신중 하 게 데워 HTF+의 4 mL를 포함 하는 각 관의 바닥에 액상된 정액 샘플의 1 mL를 플라스틱. 공기 방울의 출시를 하지 마십시오.
  7. 뚜껑을 닫고 1 시간 동안 37 ° C에서 튜브를 품 어.
  8. 부드럽게 발음 하 고 전송 위 분수 (운동 정자 세포 HTF+ )의 많은 가능한 새로운 15 mL 플라스틱 튜브, 바닥 분수 (immotile 및 죽은 세포와 정액) 로부터 아무것도 포함 됩니다 주의 하는 동안. 일반적으로, 그것은 3.5 mL 최고 분수의 바닥 분수를 방해 하지 않고 전송 안전입니다. 흡입 난 기류를 피하기 위해, 잘라 피 펫 팁의 바깥쪽 1-2 m m 더 큰 개통을 얻기 위해 45 ° 각도에서.
  9. 세포를 씻어 실시간에서 10 분 700 x g 에서 튜브 원심 HTF+ 와 15 mL 플라스틱 튜브를 채우기
  10. 부드럽게 발음 하 고는 상쾌한 제거 HTF+의 2 mL에 정자 세포 pellet을 resuspend.
  11. 20 µ L 정자 서 스 펜 션의 정자 농도의 평가 대 한 두 개의 작은 플라스틱 튜브를 전송 (3 단계 참조).
  12. 세포를 씻어 실시간에서 10 분 700 x g 에서 튜브 원심 HTF+ 와 15 mL 플라스틱 튜브를 채우기
  13. 부드럽게 발음 하 고는 상쾌한 제거 10 x 106 셀/mL (단계 2.11에서에서 평가 셀 농도에 따라)에 정자 세포 펠 릿 resuspend.
    1. 유엔 capacitated 정자 세포를 사용 하 여 실험에 대 한 (일상적인 캘리포니아2 +-신호 분석 결과)
      1. 4 m m HCO3-셀 HTF+ 에 resuspend.
      2. ML 3 mg/mL의 최종 농도를+ HTF 당 인간 혈 청 알 부 민 (HSA) (100 mg/mL)의 30 µ L를 추가 합니다.
      3. 뚜껑을 닫고 ≥1 h 37 ° c.에 대 한 품 어
    2. 사용 하 여 실험에 대 한 capacitated 정자 세포 (acrosome 반응 분석 결과)
      1. 셀 HTF+ 25 m m HCO3-resuspend.
      2. ML 3 mg/mL의 최종 농도를+ HTF 당 HSA (100mg/mL)의 30 µ L를 추가 합니다.
      3. 뚜껑을 느슨하게 연결 하 고 해당 금액의 CO2 와 37 ° C에서 ≥3 시간 동안 품 어 (5-10% CO2사이 보통 1 단계 참조).

3. 정자 세포의 계산

참고: 정자 세포 수 중 계산 수동으로50 또는는 이미지 cytometer51를 사용 하 여 여기에 설명 된 대로. 이미지 cytometer는 vortexer를 사용 하 여, S100 버퍼, SP1-카세트, 수영-최대 순화 정자 세포 (2 단계에서 준비).

  1. 10, 20, 30, 50 또는 90 (단계 2.10에서에서 펠 릿의 수동 검사에 의해 평가) 예상된 농도 따라 둥근 바닥 2 mL 튜브를 사용 하 여 S100 버퍼에의 한 요소에 aliquot 20 µ L를 희석. 사용 희석 농도에 가장 가까운 (즉, 만약 수영 최대 예상 후 mL 당 15 x 106 정자 세포의 농도 다음 S100 버퍼 [희석 요인 20]의 380 µ L와 20 µ L 정자 샘플을 희석)으로 예상.
  2. 10 대 잘 믹스 s 최대 700 rpm에서 소용돌이 믹서를 사용 하 여 샘플에 SP1-카세트 담가 그리고 카세트에 aspirate 샘플의 약 수까지 완벽 하 게 흰색 플런저를 누르십시오.
  3. 이미지 cytometer 열고, 카세트 트레이에 놓고 적용된 희석 요인 (3.1 단계에서 선택)에 따라 수의 PI 얼룩진 인간의 정자 세포 분석 결과 분석 결과 실행 합니다.
  4. 20 µ L 샘플에서 얻은 측정된 농도에 가까운 희석 요소를 사용 하 여 다른 20 µ L 샘플 3.1-3.3 단계를 반복 합니다.
  5. 두 측정에서 평균 정자 세포 농도 계산 합니다.
  6. 곱하기 의미 정자 총 정자 세포 수를 원래 볼륨 세포 농도 (2 단계에서이 원본 볼륨은 2 mL).

4. 무료 세포내 캘리포니아2 +에서 변화의 측정-농도 ([캘리포니아2 +]나) 사용 하 여 Ca2 +-fluorimetry (그림 2)

참고: 형광 판 리더, 384-잘 접시, Fluo-4를 사용 하 여 오전, 수영장 정화 정자 세포 (에서 준비 단계 2), 잘으로 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, 자동 중계기 피 펫 및 12 채널 피 펫으로 관심의 화합물.

  1. 2mm Fluo-4 준비 오전 50 µ g Fluo-4의 유리병에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 22.7 µ L을 추가 하 여 재고 오전 튜브를 잘 섞는다.
  2. 새로운 테스트 튜브를 700 µ L 수영 업 복구 된 정자 현 탁 액 (capacitated 또는 취소로 capacitated에서 개설한 2 단계)의 약 수를 추가 합니다. 정자 샘플의 700 µ L (남자에서 3 컨트롤 및 9 화합물을 테스트 하는 데 사용) 384-microwell 접시에서 24 우물의 한 행을 분석 하는 데 필요한 금액입니다.
  3. 추가 Fluo-4의 3.5 µ L 오전 10 µ M의 최종 농도를 정자 현 탁 액의 700 µ L 재고 솔루션 Fluo-4입니다.
  4. 빛 으로부터 보호 하는 37 ° C에서 45 분에 대 한 샘플을 품 어.
  5. 샘플 10 분 700 x g 에서 원심, 발음 하 고 상쾌한 초과 Fluo-4를 제거 하려면 삭제.
  6. 5 x 106 셀/ml (예:, 사용 2 세포 현 탁 액 단계 4.2에서의 볼륨 x) HTF+ 에 묻은 펠 릿 resuspend
  7. 화합물 및 컨트롤 (행 해질 수 있다 4.4-4.5, 단계에서 부 화와 원심 분리 기간 동안 각각)의 희석을 준비 합니다.
    1. 화합물, 부정적인 컨트롤 (차량 버퍼) 고 HTF+에 긍정적인 제어 (progesterone)을 희석. 그들은 희석된 1:3 단계 4.16에서에서 정자 세포에 추가 될 때와 원하는 최종 농도 x 3 컨트롤을 희석.
    2. 4.16 단계에서 사용 되는 12 채널 피 펫의 피 펫 팁 사이의 거리에 해당 하는 튜브 사이의 거리와 선반에 희석 튜브를 놓습니다.
  8. 자동 중계기 피 펫 (50 µ L의 24 단계)을 사용 합니다.
    1. 믹스 Fluo-4 스테인드 정자 샘플을 부드럽게 위아래로 한 번 전체 금액 pipetting으로.
    2. 384 microwell 격판덮개에 행의 24 웰 스를 50 µ L의 aliquots를 추가 합니다.
  9. 30 ° C에서 형광 플레이트 리더에서 microwell 접시를 놓고 서랍을 닫습니다.
  10. Fluo-4에 대 한 적절 한 프로토콜을 선택 합니다. 480 nm에서 형광 및 520에 기록 방출 흥분 nm. 가장 빠른 가능한 시간 주기를 사용 하 여 설정.
    참고: 가능 하면 잘 및 아래쪽 광학 당 적어도 10 플래시를 사용 합니다.
  11. 행에 잘 선택 하 고 20%의 대상 값을 이득 조정.
  12. 측정을 시작 합니다.
  13. 처음 5 주기 동안 기준선을 제어 합니다.
    1. 형광 판독 증가 시간이 지남에 따라 감소 하는 경우 실험을 중지 하 고 이득을 재조정 한 실험을 다시 시작.
    2. 기준선 연속에서 개별 우물 사이 많은 경우, 어느 단계 4.8에서에서 pipetting 되었습니다 정확한 또는 샘플 pipetting 전에 충분히 잘 혼합 하지 했다. 실험을 삭제 합니다.
    3. 형광 판독 행에 우물 사이 비교 및 5 첫 번째 사이클 동안 꾸준한 경우 다음 단계를 계속 합니다.
  14. 10 사이클 (초기 사용), 후 실험을 일시 중지 합니다.
  15. Microwell 플레이트 서랍을 꺼냅니다.
  16. 25 µ L 화합물 및 컨트롤 (단계 4.7) 행의 12 잘 중복 (24 웰 스) 하의 준비 된 솔루션의 추가 12 채널 피 펫 (25 µ L의 2 단계)를 사용 하 여 신속 하 게. 이미 50 µ L의 스테인드 정자 샘플을 포함 하는 우물 솔루션 희석된 1:3, 될 것입니다.
  17. 신속 하 게 가능한 (서랍 닫힐 것 이다 자동으로) 추가 화합물에 의해 유도 된 어떤 형광 신호를 누락을 방지 하 고 컨트롤 측정을 계속 합니다. 형광 (δ)와 컨트롤의 추가 캡처됩니다 지금 후에 변화 한다.
  18. 긍정적인 통제 및 관심사의 화합물에서 형광 신호 기록 되었습니다 때까지 실험을 실행 합니다.
  19. 실험을 중지 하 고 5 단계에서 분석 하 원시 형광 데이터 내보내기.
    참고: 일반적으로 Fluo-4 오전 Ca2 +로 사용 되었습니다-분석 결과, 하지만 다른 Ca2 +에 민감한 fluorophore-여기 및 방출 스펙트럼 형광 플레이트 리더에서 필터와 맞는 경우 민감한 fluorophores 사용 될 수도. Fluorophore의 선택에 따라 이득 수준 유도 형광 봉우리 계측기의 측정 범위는 "안전한" 수준에서 설정 되어 있는지 확인 합니다. 이 특정 이득 설정에서 단일 잘 ionomycin 추가 하 여 테스트할 수 있습니다. 이 임계값 형광 신호 유도, 이득 절감 하 고 다시 시도. 일부 Fluo-41,13, 로드를 원조 하기 위하여 Pluronic F-127를 사용 하지만이 필요한2아니다 발견 되었습니다. 동시에 측정 하는 행의 최대 수는 두 가지 요인에 따라 달라 집니다. 1) 악기의 주기 시간: 유도 봉우리 [캘리포니아2 +]나 를 놓친 사이클 시간이 너무 긴 경우. 낮게; 사이클 시간을 유지 하는 동시에 두 개의 행의 최대 측정 2) 단계 4.16에에서 pipetting의 속도: 12 채널 피 펫을 사용 하 여, 그것은 신속 하 게 1 또는 2 행 (예를 들어, 미리 차량 인 큐베이 팅 한 행 한 행 사전 인 큐베이 팅 억제제와 함께)의 12 중복 우물 (24 정)을 12 가지 솔루션을 추가할 수 유도 Ca2 + 봉우리를 누락 없이. 그러나, 추가 하려고 24 다른 솔루션 동시 측정, 두 개의 행에 pipetting 팁에 의하여 유도 된 Ca2 + 봉우리 놓칠 수 수 두 순차 pipetting 단계 사이 교체 해야 합니다으로 권장 하지 않습니다.

5. 캘리포니아2 +-fluorimetry에서 데이터의 분석

  1. 오픈 원시 형광 데이터 취득 하 고 4 단계에서 내보낸.
  2. 중복 된 우물에서 평균을 계산 합니다. 중복 사이 큰 차이가 있으면 특정 우물에서 데이터를 삭제할.
  3. 10 첫 번째 사이클으로 기준선을 정의 합니다.
  4. Δ/F0 (%)를 계산 비율으로 형광 (δ) 화합물 및 10 첫 번째 사이클 (기준) 동안 평균 기저 형광 (F0)에 대해 컨트롤의 추가 후 시간의 경과에서 변경.
  5. 복용량 응답 곡선의 세대에 대 한 데이터를 사용 하 여, pipetting 아티팩트를 제거 하려면, 다른 우물에서 부정적인 컨트롤의 판독을 뺄.

6입니다. Acrosome 반응의 측정

참고: 이미지 cytometer, 인큐베이터, 형광 염료를 사용 하 여: PI, FITC PSA 및 Hoechst 33342, 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, 0.6 M NaHCO3 및 증류수에 0.37% (v/v) 포름알데히드를 포함 하는 immobilizing 솔루션 뿐 아니라 관심의 화합물 A2 슬라이드 그리고 capacitated 수영장 정화 정자 세포 (2 단계에서 준비).

  1. PI를 포함 하는 얼룩 솔루션 준비 (5 µ g/mL), FITC PSA (50 µ g/mL)와 Hoechst 33342 (100 µ g/mL) HTF+에서 소용돌이 믹서를 사용 하 여 잘 혼합 하 고 사용까지 빛에서 그것을 보호.
  2. 그들은 희석된 1:10 단계 6.5에서에서 원하는 최종 농도 x 10에서 화합물 및 컨트롤 솔루션을 준비 합니다. 항상 네거티브 (차량) 제어 및 2 개의 긍정적인 컨트롤 포함: 호르몬 10 µ M 최종 농도 및 ionomycin 2 µ M 최종 농도.
  3. 플라스틱 튜브 (2 단계에서 준비) capacitated 정자 세포의 240 µ L의 aliquots 전송.
  4. 각 관에 대 한 해결책을 얼룩이 지기의 30 µ L를 추가 합니다. 것입니다 얼룩의 최종 농도: 0.5 µ g/mL PI, 5 µ g/mL FITC-PSA, 및 10 µ g/mL Hoechst 33342.
  5. 각 관에 솔루션 컨트롤 또는 화합물의 30 µ L를 추가 (1시 10분 희석).
  6. 몇 번 이나 가벼운 vortexing 위아래로 pipetting으로 샘플을 부드럽게 혼합. 때문에 기계적 스트레스, 과도 한 혼합 하지 마십시오.
  7. 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  8. 새로운 플라스틱 튜브 100 µ L 0.6 M NaHCO3 및 테스트 튜브 하나씩 증류수에 0.37% (v/v) 포름알데히드 immobilizing 솔루션의 준비.
  9. 부 화, 후 pipetting에 의해 잘 샘플을 혼합 하 고 100 µ L immobilizing 솔루션의 튜브를 테스트 샘플의 50 µ L를 추가 합니다.
  10. A2 슬라이드의 챔버를 로드 하기 전에 샘플 pipetting으로 잘 섞는다. 채워 실 신중 하 게 약 30 µ L 공기 거품을 만들지 않고.
    참고: 부 화, 동안 운동 정자 세포가 경향이 집계. 셀 덩어리 (비록 그들은 제외 됩니다)는 측정을 방해 수 있습니다. 따라서, 부 화 후 pipetting으로 철저 한 혼합은 매우 중요 하다입니다. 마찬가지로, 약 실에서 공기 방울 측정을 방해 수 있습니다. 따라서, 챔버 천천히와 액체의 가장자리에 대 한 충족 하 고 공기 방울이 만드는 경우는 피 펫의 각도 변경.
  11. 이미지 cytometer 트레이에 로드 슬라이드를 배치 하 고 트레이 닫습니다.
  12. FlexiCyte 프로토콜을 눌러 실행을 선택 합니다.
    1. FlexiCyte 프로토콜에 대 한 다음 설정을 선택 하십시오: 분석 채널 수: 2; 채널을 마스킹: UV (LED365), 이것은 채널 이미지 세분화;에 사용 채널 1: 블루 (LED475), 노출 시간 3000 ms 방출 필터 560/35; 채널 2: 그린 (LED530), 노출 시간 500ms, 방출 필터 675/75; 분석 된 세포의 최소 수: 5000; 집계 셀 제외: 예.
  13. 6.9-6.12 단계를 반복 하 여 모든 샘플 측정 되었습니다.

7입니다. 이미지 Cytometry에서에서 데이터의 분석

  1. 오픈 데이터 6 단계에서 얻은입니다.
  2. 측정을 평가 하는 두 다음 플롯을 만듭니다.
    1. Biexponential 비늘에 Hoechst 33342 강도 Hoechst 33342 영역 대의 산 점도를 만듭니다. 이 음모는 Hoechst 33342 긍정적인 개체 너무 작은 게이트를 사용 하거나 너무 인간의 정자 세포 수를 큰 될 수 있습니다.
    2. Biexponential 비늘에 FITC PSA 강도와 PI 강도의 산 점도를 만듭니다. 이 플롯을 사용할 수 있습니다 엉덩이를 acrosome의 양을 플롯 (그림 3)에 4 개의 그룹을 구분 하는 사분면 게이트의 사용에 의해 정자 세포 반응: 1) PI 양수와 FITC PSA 긍정적인 그룹: Acrosome 반응 부실 정자 세포; 2) PI 부정과 FITC PSA 긍정적인 그룹: Acrosome 반응 가능한 정자 세포; 3) PI 양수와 FITC PSA 부정적인 그룹: Acrosome 그대로 부실 정자 세포; 그리고 4) PI 부정과 FITC PSA 부정적인 그룹: Acrosome 그대로 가능한 정자 세포.

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Representative Results

대표는 매체 처리량 캘리포니아2 +를 사용 하 여 인간의 정자에 긍정적인 (progesterone) 및 네거티브 (버퍼) 컨트롤 [캘리포니아2 +]i 4 화합물 (A, B, C 및 D)의 효과 테스트 하는 실험에서 결과-신호 그림 4a에 분석 결과 볼 수 있습니다. 그림 4b, 황 체 호르몬의 복용량 응답 곡선 표시 됩니다, 피크 δ/F0 (%)에서 파생 했다 황 체 호르몬, 순차적으로 희석된 농도 의해 유도 된 데이터는 매체 처리량 캘리포니아2 +를 사용 하 여 다른 실험에서 테스트-신호 분석 결과. 캘리포니아2 +에서 데이터의 분석-분석 결과 대해서는 5 단계에서 설명 하는 신호. 부정적인 통제 (DMSO) 또는 두 긍정적인 컨트롤 (황 체 호르몬 및 ionomycin) 매체 처리량 acrosome 반응 분석 결과 수에를 사용 하 여 capacitated 인간의 정자 세포에서 acrosome 반응의 유도 테스트 실험에서 대표적인 결과 그림 3의 맨 위 패널에서 볼 수 있습니다. 3 테스트 조건에서 문이 사분면 점도 볼 수 있습니다. Acrosome 반응 데이터 분석의 단계 7에서에서 설명 합니다.

표 1: HTF의 준비에 대 한 솔루션 주식 + . 재고 솔루션 유지 하 고 오랜 시간, 포도 HEPES-20 ° C에 실내 온도에 다른 재고 솔루션에 대 한 다시 사용할 수 있습니다. 모든 솔루션은 완전히 해산 하 고 잘 혼합 사용 하기 전에 확인 하십시오.

표 2: HTF의 준비 + 4 또는 25 m m HCO와 3 - (표 1에 준비) 소금의 재고 솔루션에서. 나 젖 시럽, 추가할 수 있습니다 60% (w/w), 또는 분말. NaHCO3 분말으로 추가 됩니다.

Figure 1
그림 1: 메구미 인간의 정자 세포의 수영장 정화. 왼쪽: HTF+ 매체와 튜브와 액상된 정액 샘플의 약 수 HTF+ 매체 아래 pipetted. 오른쪽의 수영-37 ° C에서 1 시간 후 운동 정자 세포는 swum을 HTF+ 매체에. Immotile 및 죽은 정자 세포로 정자 세포 HTF+ 매체 아래 정액에 남아 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 다이어그램 매체 처리량 캘리포니아2 +-신호 분석 결과. (한) 정자 세포는 캘리포니아2 +로드-384-잘 접시의 우물을 씻어 민감한 fluorophore 및 aliquots는 도금. (b) 384-잘 접시는 30 ° c.에 형광 플레이트 리더에 배치 (c) 형광 화합물, 긍정적인 제어 (progesterone) 및 부정적인 제어 (차량 버퍼)의 전후 기록 됩니다. 판독 δ/F0 (%) 부정적이 고 긍정적인 통제의 추가 (화살표) 후 (c)의 하단에 설명 됩니다. 기독교 쉬 퍼의 허가 함께 사용 하는 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 사용 하 여 이미지 cytometry acrosome 반응의 평가. (맨 위 패널) 사분면 문이 분산형 부정적인 차량 제어 (DMSO), 및 긍정적인 컨트롤 황 체 호르몬 (음식물, 10 µ M) ionomycin (Iono, 2 µ M)에서 플롯합니다. 낮은 오른쪽 사분면에서 셀에 증가 (acrosome 반응 가능한 세포) 긍정적인 컨트롤 DMSO 컨트롤을 비교 했을 때 볼 수 있다. (하단 패널) 모든 4 개의 그룹에서 세포를 포함 하 여 붙일 레이블된 정자 세포의 현미경 이미지. BF = 밝은 필드, Hoechst Hoechst 33342, PSA = Pisum Sativum Agglutinin, PI = = Propidium 요오드 화물. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림은 Egeberg 황금 외. 20187에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 캘리포니아2 +-fluorimetry에서 데이터의 예입니다. (한) 변화 [캘리포니아2 +]난 부정적인 제어, 호르몬 및 복합 A, B, C 및 D. (b) 황 체 호르몬 복용량 응답 곡선에 의해 유도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

중간 처리량 캘리포니아2 + 신호 분석 결과 단일 microwells에서 형광의 측정에 따라 약 250000 정자 세포를 포함 하는. 캡처된 신호는 잘에서 모든 개별 정자 세포에서 평균입니다. 분석 결과 [캘리포니아2 +]i 에 변화 소요, 또는 어떻게 다른 유형의 응답은 정자 세포의 크기 비율에는 정자 세포 [캘리포니아2 +]내가 구체적으로 어디에 대 한 공간 정보가 없는 변경 제공 개별 셀 사이. 정보를 얻기 위해 같은, 단일 셀 해상도 실험 (예를 들어,50,52에서 설명)으로 사용 해야 합니다 수 있습니다. 기술은의 또 다른 단점은 초 순서는 시간적 해상도입니다. 25 때 50 µ L 정자 샘플은 잘 혼합 측정 후 다 잘 플레이트 서랍 형광 플레이트 리더 안에 다시 시작 될 수 있다 먼저 솔루션의 µ L 추가 됩니다. 더 높은 시간 해상도 얻으려면 다른 기술을 사용 해야 합니다 (예를 들어, 중지 흐름 fluorimetry13,50). 활용 매체 처리량 캘리포니아2 +-microplate 리더를 사용 하 여 여러 microwells의 동시 측정을 신속 하 고 쉽게 여러 테스트에 대 한 허용 하는 것을 이다 신호 분석 결과, 단일 셀 또는 단일 잘 방법에 비해 긍정적이 고 부정적인 컨트롤과 사이드 화합물 (그림 4)1, 2, 개별 화합물 (그림 4)1,2,3 의 복용량 응답 곡선의 쉬운 세대 , 4 , 5, 가산1,2 , 성분3 두 개 이상의 화합물에 대 한 평가 뿐만 아니라 화합물 비록 경쟁 저해 실험의 행동의 모드의 연구 및 특정의 사용 약리학 저 해제 (예를 들어, CatSper 억제제1,2,3,,45) 또한, fluorophore는 변경 하 여 분석 결과 다른 세포내의 변화 (예, pH나1,2) 검사를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 더 이상의 fluorophore 여러 세포내 변화를 동시에 측정을 한 번에 사용할 수 있습니다. 미래에는 매체 처리량 캘리포니아2 +-신호 분석 결과 캘리포니아2 +에서 효과 대 한 관심의 화면 화합물에 사용 될 수-잠재력 불리 한 검사 (예: 환경 화학 물질 또는 약물 후보) 인간의 정자에 신호 인간의 정자 세포 기능에 또는 조사는 피임약으로 가능한 역할을 효과.

매체-처리량 acrosome 반응 분석 결과 형광 현미경을 사용 하 여 수동 평가에 비해 인간의 acrosome 반응을 평가 하는 매력적인 대체 구성 이미지 cytometry를 기반으로 합니다. 그대로 또는 반응 반응 acrosomes의 얼룩 패턴은 항상 명확 하 고, 그리고 큰 내 개별 변형 조의 결과 수 있습니다. 이미지 cytometry와 이미지는 획득 하 고 자동으로 분석. 마스크 채널이 케이스 Hoechst 33342에 셀 정의 하 고 이러한 특정 지역에서만 형광 신호 데이터 분석에 포함 됩니다. 따라서, 잔여 세포질을 포함 하는 enucleated 몸의 얼룩 데이터 분석에는 포함 되지 않습니다. 또한, 형광 현미경 검사 법 보다는 통계를 계산입니다. 현미경의 oculars 통해 200 셀 도전적이 고 시간이 걸리는 작업 이지만 이미지 cytometry 적어도 5000 셀의 분석 보다 몇 분 걸립니다. 그러나, 이미지 cytometer의 낮은 확대로 인해 측정을 평가 하는 능력 손실 이며 하나의 형광 현미경에 얼룩진된 샘플을가지고 해야 합니다. 따라서, 컨트롤의 포함 측정을 확인 하기 위해 멀 언 중요성 이다. 컨트롤이 예상 대로 반응 하지 않습니다, 경우는 실험에서 결과 무시 해야. 여기에 설명 된 프로토콜 작업 Zoppino 외.49, cytometry에 의해 인간의 acrosome 반응 평가 들에 의해 수행에 의해 영감을 했다. 그들은 더 실시간으로 형광 현미경 검사 법에 의해 PSA 막 퓨전 모 acrosome 반응의 유도 따라 나타날 때 acrosomal 구획을 입력 하는 방법을 설명 합니다. 한 번 acrosomal 구획 안에 PSA 나 막 신 하 고 오랜 시간에 대 한 안정적인 마크를 형성 한다. 고정 또는 permeabilization 프로토콜에 적용 되 고 따라서 결과의 해석 명확 하다: 가능한 정자 세포의 acrosomal 구획 안에 PSA가 acrosome 반응. 관해서는 캘리포니아2 +-acrosome 반응 분석 결과 수 또한 사용 평가 복용량 응답 곡선, 억제, 가산, 그리고 관심의 화합물의 성분 분석 결과, 신호. 미래에, 매체 처리량 acrosome 반응 분석 결과 사용 될 수도 관심의 화면 화합물에 acrosome 반응 인간의 정자 (예를 들어, 환경 화학 물질 또는 약물 후보)에 대 한 효과 대 한이 인간에 잠재적인 불리 한 영향을 검토 하 정자 세포 기능 또는 피임약으로 가능한 역할을 조사.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자 그의 실험실에서 그들의 체류 동안 아칸소 DLE의 감독을 위한 티 Strünker의 실험실을 인정 하 고 싶습니다. 또한, 우리는 부의 성장 및 재생산, 코펜하겐 대학 병원, Rigshospitalet 그들의 도움으로이 두 분석 실험 설정에 대 한 우리의 동료를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 혁신 기금 덴마크 (부여 번호 005-2010-3-14-2013-4)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm pore filter Thermo Fisher Scientific, USA 296-4545
1 L measuring cylinder Thermo Fisher Scientific, USA 3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes Eppendorf, Germany 30120086 and 0030120094
12-channel pipette Eppendorf, Germany 4861000813
384 multi-well plates Greiner Bio-One, Germany 781096
15 and 50 mL platic tubes Eppendorf, Germany 0030122151 and 30122178
A2-slide ChemoMetec, Denmark 942-0001
Automatic repeater pipette Eppendorf, Germany 4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) Sigma-Aldrich, Germany L0770
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific, USA F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342 ChemoMetec, Denmark 910-3015
Human serum albumin (HSA) Irvine Scientific 9988 For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer ChemoMetec, Denmark 970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI) ChemoMetec, Denmark 910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer ChemoMetec, Denmark 910-0101
SP1-cassette ChemoMetec, Denmark 941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

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References

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매체-처리량에 캘리포니아<sup>2 +</sup>효과의 평가 대 한 분석 실험을 심사-신호 및 인간의 정자에서 Acrosome 반응
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Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L.,… More

Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).

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