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Biology

Ca2 +の効果の評価のためのスクリーニング アッセイ中スループット-シグナリングおよびひと精子先体反応

Published: March 1, 2019 doi: 10.3791/59212
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Growth and Reproduction, Copenhagen University Hospital, 2International Center for Research and Research Training in Endocrine Disruption of Male Reproduction and Child Health (EDMaRC), University of Copenhagen

Summary

ここでは、Ca2 +の効果の評価のための 2 つの媒体スループット アッセイ-ひと精子シグナリングと先体反応を示します。これらのアッセイは、迅速かつ容易に大量の Ca2 +に対する効果のための化合物をスクリーニングするため使用ことができます-ひと精子シグナリングと先体反応。

Abstract

Ca2 +-信号が正常な精子細胞機能と男性の生殖能力に不可欠であります。同様に、先体反応は、透明帯を貫通し、卵子を受精させる精子細胞の機能に不可欠です。ですので、テスト混合物 (例えば、環境化学物質、薬剤の候補者) の Ca2 +の影響についての関心-ひと精子シグナリングと先体反応ひと精子細胞の機能の潜在的有害作用を調べるかまたは避妊薬としての可能な役割を調査。2 つの媒体スループット アッセイの説明ここでは、: 1) 蛍光を用いた Ca2 +への影響評価の測定-ヒトの精子と 2) ひと精子先体反応の評価イメージ フローサイトメトリーによるアッセイのシグナルします。これらのアッセイは、多数の Ca2 +に対する効果のための化合物をスクリーニングするため使用ことができます-ひと精子シグナリングと先体反応。個々 の化合物の非常に特定の用量-反応曲線を生成する 2 つ以上の化合物の潜在的な加法性/相乗効果を決定し、競争の抑制を介してアクションの薬理学的特性を研究する、アッセイを使用ことができますさらに、医学: CatSper 阻害剤で実験。

Introduction

ここで説明した 2 つの試金の目的は Ca2 +の効果を検討する-シグナル伝達と先体反応ひと精子での示されている、これらを用いたいくつかの出版物の複数の化合物の試金の1,2、 3,4,5,6,7。Ca2 +-シグナル伝達と精子先体反応が正常に重要なひと精子細胞の機能と男性の生殖能力。

ヒトの精子細胞の全体的な目標は、卵を受精することです。正常にし、自然卵を受精させることができるには、精子細胞の機能は、女性の生殖器官の8,9を介して精子細胞の旅の間にしっかりと調整されなければなりません。精子細胞機能の多くが規制されるを介して細胞内 Ca2 +の濃度 [Ca2 +]私(例えば、精子性、走化性、並びにアクロゾーム反応)10。また、精子細胞は卵を肥やすことが可能なレンダリング、精子受精能獲得と呼ばれる成熟プロセスは [Ca2 +] によって部分的に規制の私10です。Ca2 +-押し出し Ca2 +-ATPase ポンプ11を維持、およそ 20.000 折り Ca2 +-、休憩 [Ca2 +]私50 ~ 100 nM のと、人間の精子細胞膜上のグラデーション。Ca2 +ができるか細胞膜を通過 (例えば、Ca2 +の開口部を通って-チャンネル)、[Ca2 +]私の昇格に上昇を与える Ca2 +のかなりの流入が発生します。しかし、また精子細胞を運ぶ細胞内 Ca2 +-ストアは、Ca2 +を解放できると、したがって、また与える上昇 [Ca2 +]私12の昇格。興味深いことに、すべてチャネルを介する Ca2 +-人間の精子細胞の流入が精子細胞11でしか表現が医学: CatSper (猫 Sperm のイオン チャネル)、を介して発生する見つかったところ。ヒトの精子細胞医学: CatSper をアクティブに内因性リガンド プロゲステロンと異なるリガンドでサイト13,14,15を介してプロスタグランジンによる急速な Ca2 +の流入精子細胞。卵の近くの 2 つの主な情報源は、これらの内因性リガンドの高レベルを提供します。プロゲステロン16の高レベルを含む卵胞液であります。一緒に排卵、卵管17内流体と混合で卵成熟卵胞から卵胞液を発売します。その他の主なソースは卵丘細胞卵を囲む、高レベルのプロゲステロンとプロスタグランジンの解放です。プロゲステロン誘発性 Ca2 +-精子細胞の流入が卵9,18に向かって走化性を仲介する、精子運動19,20を制御し、精子を刺激するために示されています。反応21。これら個々 [Ca2 +]私のトリガー-8卵の受精の正しい時刻に正しい順序で調整した精子機能は欠かせません。これに伴い、最適なプロゲステロン誘発性 Ca2 +の流入は男性不妊治療22,23,24,25,26 を削減することができる発見されています。 ,27,28,29 ・機能医学: CatSper が男性の生殖能力26,30,31,32、不可欠 33,34,35,36。

精子細胞卵に到達と一連のイベントが発生する受精のための場所を取る必要があります: 1)、精子細胞必要が周囲の卵丘細胞層に浸透、2) 透明帯にバインド、3) exocytose 先コンテンツ、いわゆる精子先体反応37, 4) 透明帯と 5 貫通) 受精38を完了する卵膜と融合。手順を通過し、卵子を受精させることができる、精子細胞に精子11、精子細胞"decapacitating"の要因39を含む精液を残すし、女性の流体に泳ぐとして始まりまず受ける必要があります。重炭酸塩およびアルブミンの37の高レベルの生殖器。精子は、精子細胞の陰嚢、鞭毛と精子先体反応37の積極的な打撃と運動の形を受けることをレンダリングします。Hyperactivated 運動は、40の透明帯の浸透のため、先にこの浸透プロセス41を支援する様々 な加水分解酵素が含まれています。さらに、先体反応は精子細胞を精子卵融合42に必要な精子表面の特定の膜タンパク質を公開することによって、卵と融合させるが可能なレンダリングします。その結果、陰嚢と先体反応を受けるための能力は、正常な受精卵40,42のために必要な両方。マウス精子細胞43,44,45見られているものに反して精子そのまま唯一の人間の精子は透明帯46にバインドできます。人間の精子が透明帯にバインドされたとき彼らは41透明帯を貫通して卵38との融合のために必要な特定の膜タンパク質を公開する先体反応を受けなければなりません。ひと精子先体反応のタイミング、受精が発生するために重要です。

前述の通り、Ca2 +-重要な信号が正常な精子細胞機能8、それは、したがって、画面多数 Ca2 +の効果のための化合物のことができるの関心-ひと精子細胞におけるシグナル伝達します。同様に、適切なタイミングと場所で精子先体反応を受ける唯一の人間の精子は透明帯を貫通でき、受精卵46,47、だもする機能のための化合物をテストすることができるの関心ひと精子先体反応に影響を与えます。このため、2 つの培地スクリーニング アッセイが記載されて: 1) Ca2 +の影響の分析-人間の精子細胞と 2) ひと精子先体反応を誘導する能力のアッセイのシグナルします。

1 の試金は媒体スループット Ca2 +-アッセイをシグナリングします。この蛍光プレート リーダー ベースの技術は、複数の井戸で同時に時間の関数としての蛍光性の変更を監視します。Ca2 +-敏感な蛍光染料、蛍光色 4 は Ca2 +≒ 335 の Kd nM、AM (アセトキシメチルセファロスポリン) エステル フォームのセル側の透過を物。蛍光色 4 を使用すると、時間が経つと精子細胞に関心の化合物の添加後に [Ca2 +]iの変化を測定することが可能です。アッセイ 2011年13ティモ ・ Strünker の研究室で開発された、以来 Ca2 +の効果のための化合物の画面にいくつかの研究で使用されています-ひと精子1,2,3、シグナル伝達 4,5。同様のメソッドは、複数の薬物候補48を画面に使用されています。さらに、この試金はアクション1,2,3,4,の5用量-反応曲線1、薬理学的モードを評価するために有用なも 2,3,4、5、競争阻害1,2加法1,2、および相乗作用3興味の化合物。

2 の試金は媒体スループット精子先体反応アッセイです。この画像の cytometer ベース技術対策実行可能な量精子先体反応 3 つの蛍光染料を使用して、サンプルの精子細胞: propidium ヨウ化 (PI) エンドウ (FITC PSA) とヘキスト 33342 の FITC 結合レクチン。試金は Zoppino ら49によって似たような流れの cytometry ベースのメソッドから変更され、いくつか研究6,7で使用されています。Ca2 +は-シグナリング アッセイは、この先体反応アッセイは興味の化合物の相乗効果、加法性、阻害用量反応曲線を評価するためにも使えます。

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Protocol

コレクションとプロトコルで人間の精液のサンプル解析デンマーク首都地域の研究倫理委員会のガイドラインに従います。すべての精液サンプルは、インフォームド コンセント後ボランティア ドナーから得られています。出産後、サンプルが完全に匿名化。迷惑の各ドナーはサンプルにつき 500 DKK (約 $75 米国. ドル) の手数料を受け取った。サンプル配信の日に分析し、実験後すぐに破棄されます。

注: 中程度のスループット Ca2 +-シグナリング手順 4 5、6 7 の手順で中スループット精子先体反応アッセイでアッセイを説明。ひと卵管液 (HTF+) 媒体を準備するためのプロトコルについては、手順 1 と 2-3 の手順で、試金のための精子細胞の浄化を説明しました。

1. ひと卵管液 (HTF+) 媒体の作製

注:使用メスフラスコ 1 L 測定シリンダー、磁気スターラー、塩の表 1に記載されている、適切なサイズとテーブル 2、精製水、0.2 μ m の孔フィルター、および 50 mL プラスチック チューブ。

  1. 精製水 (表 1) の塩の溶液を準備します。
    1. 適切なサイズのメスフラスコに表 1に示す塩の量を追加、希望の音量以下のビットに精製水を加えて、磁性攪拌器でよく混ぜ。
    2. 塩が完全に解散したときは、磁石と最終的な音量を純水で塗りつぶしを削除します。
  2. ボトルに原液を転送し、使用するまで保存します。
    注:原液が保たれ、時間の長い期間の再利用: グルコースと HEPES-20 ° C で、常温 (RT) 他の原液。
  3. 原液 (表 2) から HTF+媒体の 1 リットルを準備します。
    1. 在庫のすべてのソリューションが完全に溶解され、使用前によく混合を確認します。
    2. 原液と 1 リットルのメスシリンダーに表 2に記載されている塩の量、900 mL に精製水を追加します。
    3. 磁性攪拌器でよく混ぜ、7.35 NaOH 溶液で pH を調整します。
    4. 磁石を削除し、1,000 mL に精製水を追加します。
  4. 0.2 μ m フィルター、50 mL プラスチック チューブと使用するまで 4 ° C で保存場所に割り切れる HTF+媒体を通じて無菌ろ過 HTF+媒体。
  5. 実験を実行する直前に 0.33 mM の最終的な Na ピルビン酸濃度を取得する 50 mL の約数に Na ピルビン酸の 165 μ L を追加します。
    注:人間の卵管液媒体は、様々 な商用プロバイダーからも入手できます。4 mM HCO3-培地を使用している場合、サンプルは pH の大きなドリフトせずに空気中の余分な CO2インキュベーターで閉じた蓋と培養できます。CO2インキュベーターは、ヘンダーソン Hasselbalch 方程式を使用して、使用される CO2の量が計算できます。空気量 CO2 (5-10% の間に通常の大気圧に依存します) が含まれていると CO2インキュベーターで開く蓋サンプルを培養する必要があります 25 mM HCO3-培地を使用している場合pH でドリフトを避けるために。CO2の正確な量は、ヘンダーソン Hasselbalch 方程式を使用して計算できます。

2. スイムアップ (図 1) 経由での運動性の精子細胞の浄化

注:精液サンプル、インキュベーター、50 mL プラスチック チューブ、45 ° の角度、HTF+媒体 (の準備ステップ 1 または得られた商用プロバイダーから)、遠心分離機、ひと血清で 50 mL プラスチック チューブを配置するためラックのきれいな口の広いプラスチック容器を使用します。アルブミン (HSA)。

  1. マスターベーションを生産し、口の広いきれいなプラスチック容器に射精たて寄贈人間精液サンプルを取得します。のみ検査と人間の精液の処理するため WHO 実験室マニュアルによって確立されたパラメーターを満たす精液のサンプルを使用します。
  2. 液化するように 15-30 分の 37 ° C でサンプルをインキュベートします。
  3. HCO3- 37 ° c. に 4 mm HTF+媒体の 50 mL を加熱します。
  4. 場所はきれい (液体の表面積を増やす) に 45 ° の角度でラックに 50 mL のプラスチック チューブです。生の精液の mL あたり 1 のチューブを使用します。
  5. 各チューブに予熱した HTF+培地 4 mL を追加します。
  6. 予熱した HTF+の 4 mL を含む各チューブの底に液状精液サンプル 1 mL のピペット慎重に。空気の泡の放出を避けること。
  7. 蓋を閉じるし、1 h の 37 ° C でチューブを孵化させなさい。
  8. 優しく吸引し、最終留分 (immotile および死んだ細胞精液) から何もが含まれること注意を払いながら新しい 15 mL プラスチック チューブできるだけ多く上の分数 (運動性精子細胞と HTF+ ) の転送します。通常、最終留分を乱すことがなくトップ画分の 3.5 mL を転送しても安全です。吸引の乱流を避けるためには、大きな開口部を取得する 45 ° の角度でピペット チップの最も外側の 1-2 mm をカットします。
  9. HTF+細胞を洗浄し、700 × g 10 分間室温でチューブを遠心分離機で 15 mL プラスチック チューブを埋める
  10. 優しく吸引し上澄みを除去し、HTF+の 2 mL で精子細胞ペレットを再懸濁します。
  11. 精子濃度の評価の 2 つの小さなプラスチック製のチューブに精子懸濁液 20 μ L を転送 (手順 3. を参照)。
  12. HTF+細胞を洗浄し、700 × g 10 分間室温でチューブを遠心分離機で 15 mL プラスチック チューブを埋める
  13. 優しく吸引し上澄みを除去し、10 x 106セル/mL (2.11 の手順で評価セル濃度に基づく) に精子細胞ペレットを再懸濁します。
    1. 非容量制約をもつ精子細胞を用いた実験 (ルーチン Ca2 +-アッセイをシグナリング)
      1. 4 mM HCO3-と HTF+で細胞を再懸濁します。
      2. ML HTF+ 3 mg/mL の最終的な集中を得るにあたり、ひと血清アルブミン (HSA) (100 mg/mL) の 30 μ L を追加します。
      3. 蓋を閉じるし、≥ 1 h 37 ° c. で孵化させなさい
    2. 実験用精子細胞 (精子先体反応法) を可能にしました。
      1. 25 mM HCO3-と HTF+で細胞を再懸濁します。
      2. Ml HTF+ 3 mg/mL の最終的な集中を取得する HSA (100 mg/mL) の 30 μ L を追加します。
      3. ふたを緩く取り付けます、CO2の量を 37 ° C で 3 時間孵化させなさい (通常の 5-10% CO2間のステップ 1 を参照)。

3. 精子細胞のカウント

注:精子細胞ことができるどちらかカウント手動で50またはイメージの cytometer51の場合を使用して前述のように。S100 バッファー、SP1 カセット、スイムアップ精子細胞 (ステップ 2 で作成) を精製した、イメージ cytometer で、vortexer を使用します。

  1. 20 μ L の 10、20、30、50 または 90 (2.10 の手順でペレットの手動検査による評価) 予想される濃度によると丸底 2 mL 管を用いた S100 バッファー内の要因に分注を希釈します。使用希釈濃度に最も近い予想 (つまり、スイムアップバーが予定された後の mL あたり 15 x 106精子細胞の濃度は、S100 バッファー [希釈倍率 20] の 380 μ L で 20 μ L の精子のサンプルを希釈して) 場合。
  2. 加えて、10 s 最大の 700 rpm で渦のミキサーを使用して SP1 カセットをサンプルに浸すし、カセットに、サンプルの吸引まで完全に白いプランジャーを押します。
  3. イメージの cytometer を開きカセットをトレイに置き応用希釈倍率 (3.1 の手順で選択) によると数の PI 染色ひと精子細胞アッセイ法を実行します。
  4. 手順 3.1 3.3 最初 20 μ L のサンプルから得られる測定濃度に最も近い希釈係数を使用して、別の 20 μ L サンプルを繰り返します。
  5. 2 つの測定から平均精子細胞濃度を計算します。
  6. 乗算の意味精子細胞濃度総精子細胞数を取得元のボリューム (ステップ 2 では、この元のボリュームは 2 mL)。

4. 変化、細胞内 Ca2 +の測定-濃度 ([Ca2 +]私) を使用して Ca2 +-/蛍光定量 (図 2)

注:蛍光プレート リーダー、384 ウェル プレート蛍光 4 を使用して午前、スイムアップ浄化された精子細胞 (の準備ステップ 2) も、正と負のコントロール、自動中継器ピペット 12 ch ピペットと関心の化合物。

  1. 2 mM 蛍光色 4 の準備午前株式 50 μ g 蛍光 4 バイアルにジメチルスルホキシド (DMSO) の 22.7 μ L を追加することによって午前、チューブをよく混ぜます。
  2. 新しい試験管に 700 μ L スイムアップ回復精子懸濁液 (配送計画や国連として配送計画で輪郭を描かれたステップ 2) の因数を追加します。精子サンプルの 700 μ L (ダブレットで 3 つのコントロールと 9 の化合物をテストするために使用) 384 マイクロウェル プレート 24 井戸の 1 つの行を分析するために必要です。
  3. 蛍光色 4 の 3.5 μ L を追加午前 700 μ、10 μ M の濃度が最終的な精子懸濁液に原液蛍光 4 です。
  4. 37 ° C、光から保護の 45 分のサンプルをインキュベートします。
  5. 700 x gで 10 分間のサンプルを遠心分離、吸引、余分な蛍光色 4 を削除する上澄みを廃棄します。
  6. 5 x 10 の6セル/mL (すなわち, 2 x 使用手順 4.2 で行われる細胞懸濁液量) に HTF+でステンド グラスのペレットを再懸濁します
  7. 化合物およびコントロール (行うことができますステップ 4.4 と 4.5 のインキュベーションおよび遠心分離の期間中にそれぞれ) の希釈液を準備します。
    1. 化合物と同様、(車のバッファー) のネガティブ コントロールと HTF+の肯定的な制御 (プロゲステロン) を希釈します。希釈 1:3 になりますが、ステップ 4.16 の精子細胞に追加されます、化合物およびコントロール目的の最終濃度 x 3 を薄くしなさい。
    2. 4.16 のステップで使用される 12 ch ピペット ピペット先端間の距離に対応するチューブ間の距離とラックに希釈でチューブを配置します。
  8. 自動中継器ピペット (50 μ L の 24 ステップ) を使用します。
    1. ミックス蛍光 4 精子サンプル優しく上下に一度全体量をピペットで染色しています。
    2. 384 マイクロウェル プレート内の行の 24 の井戸に 50 μ L の因数を追加します。
  9. 30 ° C での蛍光プレート リーダーでマイクロウェル プレートを置き、引き出しを閉じる。
  10. 蛍光色 4 の適切なプロトコルを選択します。エキサイト 480 nm 蛍光法および 520 レコード放射 nm。設定では、可能な限り最速のサイクル時間を使用します。
    注:井戸と下の光学あたり少なくとも 10 回点滅を可能であれば使用します。
  11. 行の井戸を選択し、20% のターゲット値にゲインを調整します。
  12. 測定を開始します。
  13. 最初 5 サイクル中にベースラインを制御します。
    1. 蛍光の読み出しは、増加または、時間と共に減少している場合、実験を停止、ゲインを調整し、実験を再開します。
    2. ベースラインと異なる場合多く行の個々 のウェル間、4.8 の手順でピペッティングされている正確なまたはサンプルないピペッティングする前に十分に混合されました。実験を破棄します。
    3. 蛍光読み出しを行の井戸間で同等、5 の最初のサイクル中に安定した場合は、次の手順に進みます。
  14. (ベースラインに使用) 10 サイクル後に、実験を一時停止します。
  15. マイクロウェル プレート付き引き出しを取り出します。
  16. すぐに 12 ch ピペット (25 μ L の 2 ステップ) を使用して追加化合物および行の 12 も重複 (24 ウェル) に (ステップ 4.7) からコントロールの準備ができてソリューションを 25 μ l 添加します。ソリューションは、井戸は既にステンド グラス精子サンプルの 50 μ L を含む希釈 1:3 になります。
  17. 可能 (引き出しは自動的に閉じる) 追加した化合物による誘導蛍光信号の欠落を回避してコントロールとしてすぐに測定を続けます。蛍光 (ΔF) キャプチャされる化合物とコントロールを追加した後で変更します。
  18. 肯定的な制御および興味の化合物から蛍光信号が記録されているまでは、実験を実行します。
  19. 実験を停止し、手順 5 のように分析する未加工の蛍光データをエクスポートします。
    注:一般的に蛍光 4時は、Ca2 +として使用されています-アッセイが他 Ca2 +敏感な蛍光体-励起・発光スペクトル適合蛍光プレート リーダーでのフィルターの場合、敏感な fluorophores が付いてを使用もできます。Fluorophore の選択によって誘起蛍光ピークが計測器の測定範囲内では「安全な」レベルの利得レベルが設定されていることを確認します。これは、特定のゲイン設定でよく、単一イオノマイシンを追加することによってテストできます。しきい値を超える蛍光信号を誘発この場合はゲインを低くしてからやり直してください。プルロニック F-127 を使用して蛍光色 41,13の読み込みを支援するためにいくつかが、これは必要な2ではないことがわかった。同時に測定した行の最大数は、2 つの要因に依存します。1) 装置のサイクル タイム: [Ca2 +]私の誘導のピークを逃した可能性がありますサイクル タイムが長すぎる場合。サイクル タイムを低い保つために同時に 2 つの行の最大値を測定します。2) ステップ 4.16 でピペッティング速度: 12 チャネルのピペットを使用して、1 または 2 行 (例えば、プレインキュベートした車両の 1 つの行とプレインキュベートした阻害剤の 1 つの行) の 12 の重複する井戸 (24 ウェル) に 12 の異なるソリューションをすばやく追加することが可能です、誘導 Ca2 +ピークを逃すことがなく。ただし、同時測定の 2 つの行に 24 の異なるソリューションを追加しようとする誘導 Ca2 +ピークが失われるという 2 つの連続分注手順の間に取り替えられるピペッティングのヒントがあるのでそれはお勧めできません。

5. Ca2 +-/蛍光定量データの解析

  1. 未加工の蛍光データ取得し、ステップ 4 でエクスポートしたを開きます。
  2. 重複した井戸から平均を計算します。重複の間に大きな違いが存在する場合は、特定の井戸からデータを破棄します。
  3. 10 の最初のサイクルとしては、ベースラインを定義します。
  4. ΔF/F0 (%) を計算します。割合として化合物および 10 の最初のサイクル (ベースライン) の間に平均の基底蛍光 (F0) に対するコントロールの付加の後で時間をかけて蛍光 (ΔF) に変更します。
  5. 用量-反応曲線の生成のためのデータを使用している場合は、ピペッティングの成果物を削除する、他の井戸から陰性対照の読み出しを減算します。

6. 精子先体反応の測定

注:画像 cytometer、インキュベーター、蛍光染料を使用して: PI、FITC-PSA とヘキスト 33342、化合物と同様、正と負のコントロール、0.6 M NaHCO3と蒸留水、0.37% (v/v) ホルムアルデヒドを含む固定化溶液のA2 スライドと容量制約をもつスイムアップ精子細胞 (ステップ 2 で作成) を精製しました。

  1. PI を含む染色液を準備 (5 μ g/mL)、FITC PSA (50 μ g/mL) とヘキスト 33342 (100 μ g/mL) HTF+でも渦のミキサーを使用してそれをミックス、使用までの光から保護します。
  2. 希釈 1:10 ステップ 6.5 では、所望の最終濃度 x 10 で化合物およびコントロール ソリューションを準備します。常に負 (車) コントロールと 2 つの肯定的なコントロールを含める: プロゲステロン 10 μ M 最終濃度およびイオノマイシン 2 μ M 最終濃度。
  3. 容量制約をもつ精子細胞 (手順 2 で準備) の 240 μ L の因数をプラスチック製のチューブに転送します。
  4. 染色各管に液の 30 μ L を追加します。汚れの最終的な集中になります: 0.5 μ g/mL PI、5 μ G/ml、FITC PSA および 10 μ G/ml ヘキスト 33342。
  5. 各管に 30 μ L のコントロールまたは化合物を使用してソリューションを追加 (1:10 希釈)。
  6. 優しく上下に数回または穏やかなボルテックス ピペッティングによるサンプルをミックスします。機械的ストレスによる過剰な混合を避けます。
  7. 37 ° c 30 分間インキュベートします。
  8. 0.6 M NaHCO3および蒸留水 1 試験管あたり 0.37% (v/v) ホルムアルデヒドを含む固定化溶液 100 μ L を新しいプラスチック チューブを準備します。
  9. インキュベーション後、ピペッティングでよくサンプルを混ぜるし、固定化溶液 100 μ L でチューブにテスト サンプルの 50 μ L を追加します。
  10. A2 スライドのチャンバーをロードする前にサンプルをピペッティングでよく混ぜます。空気泡を作成せず、約 30 μ L で慎重に部屋を入力します。
    注:運動性の精子細胞ががち、インキュベーション中に集計。(にもかかわらず、彼らは除外される)、細胞塊は測定を乱すことができます。したがって、培養後ピペッティングによる徹底した混合非常に重要です。同様に、チャンバ内の気泡は、測定を乱すことができます。したがって、箱いっぱいにゆっくりと液体のエッジが満たすし、空気泡を作成する場合は、ピペットの角度を変更します。
  11. イメージの cytometer のトレイに読み込まれたスライドを配置し、トレイを閉じます。
  12. FlexiCyte プロトコルとプレスの実行を選択します。
    1. FlexiCyte プロトコルの次の設定を選択: 分析チャンネル数: 2;チャネルをマスキング: UV (LED365)、これは画像の領域分割; に使用されるチャンネルチャネル 1: ブルー (LED475)、露出時間 3,000 ms 排出フィルター 560/35;チャネル 2: グリーン (LED530)、露光時間 500 ms、排出フィルター 675/75;分析セルの最小数: 5000;集計セルを除外する: はい。
  13. 6.9 6.12 のステップを繰り返して、すべてのサンプルが測定されています。

7. フローサイトメトリーのイメージからのデータの分析

  1. 手順 6 で得られたデータをオープン。
  2. 測定値を評価する 2 つの次のプロットを作成します。
    1. Biexponential スケールのヘキスト 33342 地域対ヘキスト 33342 強度の散布を作成します。このプロットは、小さすぎる、ヘキスト 33342 肯定的なオブジェクトがゲートに使用されるまたは人間の精子細胞には大きすぎるすることができます。
    2. Biexponential スケールで FITC PSA 強度と PI 強度の散布を作成します。このプロットを使用することができますロバに精子の量のプロット (図 3) の 4 つのグループを分ける象限儀のゲートの使用によって精子細胞の反応: 1) PI 正と FITC PSA グループの肯定: 精子先体反応淘汰の精子細胞;2) PI 負と FITC PSA グループの肯定: 精子先体反応可能な精子細胞;3) PI 正と FITC PSA 負のグループ: 精子そのまま淘汰の精子の細胞;・ 4) PI 負と FITC PSA 負のグループ: 精子そのまま実行可能な精子細胞。

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Representative Results

代表中 Ca2 +によるひと精子テスト陽性 (プロゲステロン) と負 (バッファー) コントロール [Ca2 +]i 4 化合物 (A、B、C、および D) の効果実験からの結果-シグナルアッセイは、図 4 aで見ることができます。図 4 bでプロゲステロンの用量応答曲線が現れ、ピーク ΔF/F0 (%) から派生しました。プロゲステロンの希釈した濃度によるデータ媒体スループット Ca2 +を使用して別の実験でテスト-アッセイをシグナリングします。Ca2 +からデータの分析-シグナリング アッセイは、ステップ 5 で説明します。容量制約をもつひと精子細胞ネガティブ コントロール (DMSO) または媒体スループット精子先体反応アッセイを 2 つ肯定的なコントロール (プロゲステロンおよびイオノマイシン) 使用で精子先体反応の誘導のテスト実験から代表の結果図 3の上部パネルに見られます。3 テスト条件からゲート象限散布が見られます。精子先体反応データの分析は、7 の手順で説明します。

表 1: HTF の準備のためのソリューションを株式+.原液を保管し、長期間、グルコースと HEPES-20 ° C で、常温原液で再利用できます。すべてのソリューションが完全に溶解され、使用前によく混合を確認します。

表 2: HTF の準備+4 または 25 ミリメートルの HCO の3- (表 1 に準備) 塩の溶液から。乳酸 Na はシロップとして追加できる 60% (w/w)、または粉末。NaHCO3は、粉末として追加されます。

Figure 1
図 1: 運動性精子細胞のスイムアップ浄化します。左: HTF+培地で管と液状精液サンプルの因数は、HTF+中下戻。右: 37 ° C でスイムアップの 1 h 後運動精子細胞に泳いだを HTF+媒体に。Immotile、死んだ精子細胞と精子細胞は、HTF+中下精液に残ります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2 図中 Ca2 +-アッセイをシグナリングします。(、) の精子細胞は Ca2 +で読み込まれる-敏感な蛍光体、洗浄や因数をめっきする 384 ウェル プレートの井戸。(b) 384 ウェル プレート、30 ° C で蛍光プレート リーダーに配置されます。(c) 蛍光は、前に、化合物、肯定的な制御 (プロゲステロン) および否定的な制御 (車のバッファー) の付加の後に記録されます。ΔF/F0 (%) の読み出し正および負の制御の付加 (矢印) の後、(c) の下で示されます。キリスト教シファーから許可を得て使用の図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: イメージ フローサイトメトリーを用いた精子先体反応の評価します。(上部パネル)象限儀のゲート散布図 (DMSO)、否定的な車両制御とポジティブ コントロール プロゲステロン (Prog、10 μ M) やイオノマイシン (Iono、2 μ M) から。右下の象限に細胞の増加 (精子先体反応生菌) DMSO コントロールにポジティブ コントロールを比較するときに見られます。(底板)すべての 4 つのグループから細胞を含む蛍光に分類された精子細胞の顕微鏡画像。BF = 明るいフィールド、ヘキスト ヘキスト 33342、PSA を = = エンドウ ニンニク凝集素、PI = Propidium ヨウ化。スケール バー = 10 μ m。この図は、ロジスティック パルメら 20187から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: Ca2 +-/蛍光定量データの例です。ネガティブ コントロール、プロゲステロン、化合物 A、B、C、および D (b) プロゲステロンの用量-反応曲線による [Ca2 +]私の (、) の変化。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

中スループット Ca2 +シグナリング アッセイは単一マイクロウェルから蛍光の測定に基づいて約 250,000 の精子細胞を含みます。取込んだ信号もすべて細胞精子の平均です。アッセイにより空間情報について具体的には、精子細胞 [Ca2 +]私は変更されず、[Ca2 +]iの変更になります場所、または異種の応答は精子細胞の大きさの割合で間個々 のセル。このような情報を取得するには、単一セルの解像度の実験 (例えば、前述の50,52) を用いなければなりません。技術のもう一つの欠点は、秒、時間の分解能です。50 μ L 精子サンプルが十分に混合されたとき 25 にもかかわらずウェル プレートに引き出し蛍光プレート リーダーの内部に戻って後、測定を開始する最初のソリューションの μ L が追加されます。高い時間分解能を得るためには、他のテクニックを採用する必要があります (例えば、停止の流れ/蛍光定量13,50)。利用媒体スループット Ca2 +-高速かつ簡単に複数のテスト用マイクロ プレート リーダーを使用して複数のマイクロウェルの同時測定ができるが単一セルまたは単一ウェルの方法と比較して、アッセイのシグナル正と負のコントロールとのサイド バイ サイド化合物の(図 4)1, 2、簡単に個々 の化合物 (図 4)1,2,3の用量-反応曲線の生成,4,5加法1,2との相乗作用の3 2 つ以上の化合物の評価だけでなく、化合物も競争阻害実験の作用の研究、特定の使用薬理学的阻害剤 (例えば、医学: CatSper 阻害剤1,2,3,4,5)。さらに、蛍光体を変更すると、他の細胞内の変更 (例えば、pH私1,2) を検討するアッセイを採用できます。最後に、1 つ以上の蛍光体は、細胞内の複数の変更を同時に測定する一度に使用される場合があります。将来的に、媒体スループット Ca2 +-シグナルに及ぼす Ca2 +興味の画面化合物にアッセイをされる可能性があります-有害の可能性を検討する (例えば、環境化学物質、薬剤の候補者) のひと精子におけるシグナル伝達人間の精子細胞の機能または避妊薬として可能な役割を調査するための効果。

中精子先体反応アッセイは、イメージ フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡を用いたマニュアルの評価と比較して人間の精子先体反応を評価するために魅力的な代替を構成するに基づいています。そのまままたは反応/反応 acrosomes の染色パターンは常に明確ではない、素晴らしい個人内変動が本結果をすることができます。画像フローサイトメトリーで画像が取得され、自動的に分析されます。マスキング チャネルこのケースのヘキスト 33342 でセルを定義し、蛍光信号のみこれらの特定の領域からのデータ解析に含まれています。したがって、データ解析における除核素地で残留細胞質の染色は含まれません。さらに、統計情報をカウントは蛍光顕微鏡に優れています。顕微鏡の接眼レンズを通して 200 セルをカウントするは困難で時間のかかる仕事が、イメージ フローサイトメトリー少なくとも 5,000 の細胞を分析より少ないほんの数分をかかります。ただし、イメージの cytometer の低倍率のため測定を評価する能力が失われる、蛍光顕微鏡のステンド グラス サンプルを持参する必要が 1 つ。したがって、測定値の検証に抜ける重要コントロールを含めることです。コントロールでは、期待どおりには反応しない、実験からの結果を破棄しなければなりません。ここで説明されているプロトコルは、Zoppino ら49, フローサイトメトリーを用いたひと精子先体反応を評価人によってできている仕事に触発されました。彼らはさらにリアルタイム蛍光顕微鏡による精子先体反応の誘導と、膜融合細孔が表示するときに、PSA が先の区画を入力する方法を説明しました。一度先のコンパートメントの中、PSA は下駄し、長期間の安定したマークを形成します。プロトコルで固定または透過は適用されず、したがって結果の解釈は明確な: 実行可能な精子細胞の先のコンパートメントの中の PSA 精子先体反応に等しい。Ca2 +は-シグナリング アッセイ、精子先体反応アッセイは興味の化合物の相乗効果、加法性、阻害用量反応曲線を評価するためにも使えます。将来は、媒体スループット精子先体反応アッセイされる可能性がありますも画面化合物金利の精子先体反応ひと精子 (例えば、環境化学物質、薬剤の候補者) の効果にこの人間の潜在的有害作用を調べる精子細胞の機能または避妊薬として可能な役割を調査するため。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、ティモ ・ Strünker の彼の実験室で彼らの滞在中に AR と DLE の監督のためのラボを認めたいと思います。さらに、部門の成長と再生、コペンハーゲン大学病院 Rigshospitalet のこれらの 2 つの試金の設定に協力の方々 に感謝したいと思います。この作業は、技術革新基金デンマーク (許可番号 005-2010-3 および 14-2013-4) からの助成金によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm pore filter Thermo Fisher Scientific, USA 296-4545
1 L measuring cylinder Thermo Fisher Scientific, USA 3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes Eppendorf, Germany 30120086 and 0030120094
12-channel pipette Eppendorf, Germany 4861000813
384 multi-well plates Greiner Bio-One, Germany 781096
15 and 50 mL platic tubes Eppendorf, Germany 0030122151 and 30122178
A2-slide ChemoMetec, Denmark 942-0001
Automatic repeater pipette Eppendorf, Germany 4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) Sigma-Aldrich, Germany L0770
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific, USA F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342 ChemoMetec, Denmark 910-3015
Human serum albumin (HSA) Irvine Scientific 9988 For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer ChemoMetec, Denmark 970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI) ChemoMetec, Denmark 910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer ChemoMetec, Denmark 910-0101
SP1-cassette ChemoMetec, Denmark 941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

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References

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生物学、145 の問題、精子、精液、医学: CatSper、カルシウム、精子、不妊治療
Ca<sup>2 +</sup>の効果の評価のためのスクリーニング アッセイ中スループット-シグナリングおよびひと精子先体反応
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Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).

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