Biology

中通量筛选法评估对精子中 ca^{2 +}信号和反应的影响

Published: March 1, 2019 doi: 10.3791/59212

Anders Rehfeld^1,2, Dorte Louise Egeberg Palme^1,2, Kristian Almstrup^1,2, Anders Juul^1,2, Niels Erik Skakkebaek^1,2

¹Department of Growth and Reproduction, Copenhagen University Hospital, ²International Center for Research and Research Training in Endocrine Disruption of Male Reproduction and Child Health (EDMaRC), University of Copenhagen

Summary

在这里, 描述了两个中等吞吐量检测评估对 ca2⁺信号和顶体反应的影响在人类精子中。这些检测方法可用于快速、轻松地筛选大量化合物, 以确定对人类精子中 ca^{2 +}信号和顶体反应的影响。

Abstract

ca^{2 +}信号转导对正常精子细胞功能和男性生育能力至关重要。同样, 丙烯酸反应对于人类精子细胞穿透透明带并使卵子受精的能力也是至关重要的。因此, 测试化合物 (如环境化学品或候选药物) 对人类精子中 ca2⁺信号和顶体反应的影响, 以检查对人类精子细胞功能的潜在不利影响, 是非常有趣的。来调查一种可能的避孕药具作用在这里, 两个中等吞吐量的检测描述: 1) 荧光检测评估对 ca2⁺信号在人类精子中的影响, 2) 图像细胞学测定评估在人类精子中的顶体反应。这些检测方法可用于筛选大量化合物对人类精子中 ca2⁺信号和顶体反应的影响。此外, 该检测方法可用于生成单个化合物的高度特异性剂量-反应曲线, 确定两种或两种以上化合物的潜在加性/协同作用, 并通过竞争抑制研究作用的药理作用模式catspper 抑制剂的实验。

Introduction

这里描述的两种检测的目的是研究对 ca2⁺信号和顶体反应的影响, 正如已在使用这些检测¹^,²的几个出版物中所显示的多种化合物^, ³^、⁴^、⁵^、⁶^、⁷。ca^{2 +}信号和顶体反应对正常的精子细胞功能和男性生育能力都至关重要。

人类精子细胞的总体目标是使卵子受精。为了能够成功和自然地受精的卵子, 精子细胞的功能必须在精子细胞通过女性生殖道⁸^,⁹的过程中受到严格的调节。许多精子细胞功能通过细胞内 ca^{2 +}浓度 [ca^{2 +}]_i (例如, 精子活力、趋化和顶体反应)^调节。此外, 一个成熟过程称为电容, 使精子细胞能够受精的卵子, 部分由 [ca^{2 +}]_i¹⁰调节。ca^{2 +}挤出 ca^{2 +}-atpase 泵¹¹在人类精子细胞膜上保持约 20, 000倍^{ca 2 +}梯度, 休息 [ca^{2 +}]_i为 50-100 nm。如果 ca^{2 +}被允许穿过细胞膜 (例如, 通过 ca^{2 +}通道的开放), 就会发生大量的 ca^{2 +}流入, 从而导致 [ca^{2 +}]_i的升高。然而, 精子细胞也携带细胞内 ca^{2 +}储存, 这可以释放 ca^{2 +} , 因此, 也产生了 [ca^{2 +}]_i¹²的升高。有趣的是, 到目前为止, 所有通道介导的人类精子细胞中的 ca^{2 +}流入都是通过 catsper ( sperm 的cat离子通道) 发生的, 这只在精子细胞¹¹中表达。在人类精子细胞中, catspper 通过不同的配体结合位点¹³^、¹⁴^、¹⁵激活内源配体黄体酮和前列腺素, 从而快速引入 ca^{2 +}-流入精子细胞。鸡蛋附近的两个主要来源提供了高水平的这些内源配体。一种是含有高水平黄体酮16的滤泡液.卵泡液与排卵时的卵子一起从成熟的卵泡中释放, 并与输卵管内的液混合 17.另一个主要来源是围绕鸡蛋的积云细胞, 释放高水平的黄体酮和黄体素。黄体酮诱导的精子细胞中的 ca^{2 +}-流入已被证明可以介导^{对鸡蛋 9}^,¹⁸的趋化作用, 控制精子的活力¹⁹^,^{20, 并}刺激顶体反应²¹。触发这些个体 [ca^{2 +}]_i调节精子功能在正确的顺序和正确的时间是至关重要的受精^的卵子8。与此相一致的是, 发现黄体酮引起的 a^{2 +}-流入的次优与男性生育率^下降有关22^、²³^、²⁴^、²⁵^、²⁶ ²⁷,²⁸^,²⁹和功能 catspper 是必不可少的^{男性生育率 26}^,³⁰,³¹,³²^, ³³^、³⁴^、³⁵^、³⁶。

当精子细胞到达卵子时, 必须发生一系列事件才能发生: 1) 精子细胞必须穿透周围的积云细胞层, 2) 与透明带结合, (3) 外塞的顶体含量, 即所谓的顶体反应³⁷, 4) 穿透透明带, 与卵膜融合完成受精 38.为了能够通过这些步骤和卵子受精 , 精子细胞必须首先经历 11 的容量 , 这开始时精子细胞离开含有斩首^因子的39 , 并游入雌性的液体中生殖道, 碳酸氢盐和白蛋白^{含量高 37}。电容使精子细胞能够进行超活化, 这是一种运动形式, 鞭毛强烈跳动, 并发生顶体反应³⁷。透明带40的渗透需要超激活的动力, 而丙烯酸含有各种水解酶, 有助于这一渗透过程⁴¹。此外, 顶体反应使精子细胞能够与卵子融合, 通过暴露精子-卵子融合⁴²所需的精子表面的特定膜蛋白。因此, 成功受精 40, 42 所需的能力都是进行过度活化和顶体反应的能力。与已经看到的老鼠精子细胞⁴³^,⁴⁴,⁴⁵, 只有人类精子细胞是顶生体完整可以绑定到透明带46。当人类精子细胞与透明带结合时, 它们必须经历伴随反应, 以穿透透明带 41, 并暴露与卵子38融合所需的特定膜蛋白.因此, 人类精子中顶体反应的时间对受精的发生至关重要。

如上所述, ca^{2 +}信号对正常精子细胞功能⁸至关重要, 因此, 能够筛选出大量化合物对人类精子细胞中 ca^{2 +}信号的影响是非常有趣的。同样, 由于只有在适当的时间和地点进行顶体反应的人类精子细胞才能穿透透明带, 使卵子⁴⁶^、^{47 受精}, 因此, 能够测试化合物的能力也是非常有趣的。影响精子中的顶体反应。为此, 描述了两种中等通量筛选方法: 1) 检测对人类精子细胞中 ca^{2 +}信号的影响, 2) 检测诱导精子细胞中顶体反应的能力。

检测1是一种中等吞吐量的 ca^{2 +}信令检测。这种基于荧光板读取器的技术可同时监测多个井中荧光随时间变化的变化。钙^{2 +}敏感荧光染料, fluo-4 具有 k_d ^{为 ca 2 +}335 nm, 并在 am (乙酰氧化甲基) 酯形式为细胞。使用 fluo-4, 可以测量 [ca^{2 +}]_i随着时间的推移和精子细胞中感兴趣的化合物的添加后的变化。该检测方法是由 timo strünker 实验室于 2011年13年开发的, 此后已被用于若干研究, 以筛选化合物对人类精子¹^,²^,³的 ca⁺信号的影响. ⁴^,⁵。另外, 也使用了类似的方法对多个候选药物^进行筛选, 48 人。此外, 这种检测也是有用的评估的药理作用^{模式 1}^,²^,³^,4^,5, 剂量反应曲线¹^, ²^,³^,⁴^,5, 竞争抑制¹^{, 2,}加性¹^{, 2,}^和协同作用³感兴趣的化合物。

检测2是一种中等吞吐量的顶体反应测定。这种基于图像的技术使用三种荧光染料测量样本中可行的顶体反应精子细胞的数量: 碘化铅 (pi)、fitc 耦合的 p相等的松香 (fitc-psa) 凝集素和 hoechst-33342。该方法由 zoppino 等人. 49 人从基于类似的流式细胞仪方法进行了改进, 并已在几^{项研究 6,}⁷中使用。对于 ca^{2 +}信号法, 该顶核反应测定也可用于评估有关化合物的剂量-反应曲线、抑制、加成和协同作用。

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Protocol

议定书中人类精液样本的收集和分析遵循丹麦首都地区研究伦理委员会的准则。所有精液样本都是在自愿捐献者知情同意后获得的。交付后, 样本完全匿名。由于给他们带来不便, 每个捐助者收到的每个样本的费用为500丹麦克朗 (约合75美元)。在分娩当天对样品进行分析, 然后在实验室实验后立即销毁。

注: 介质吞吐量 ca^{2 +}信令分析在步骤4-5 中描述, 介质吞吐量共分反应分析在步骤6-7 中描述。第1步描述了制备人体输卵管液 (htf⁺) 培养基的方案, 第2-3 步描述了检测的精子细胞的纯化。

1. 制备人管状流体 (htf⁺) 培养基

请注意:使用适当尺寸的体积瓶、1升测量筒、磁力搅拌器、表1 和表 2中列出的盐、纯净水、0.2μm 孔隙过滤器和50毫升塑料管。

准备纯净水中的盐的库存溶液 (表 1)。
1. 将表 1中列出的盐加入适当大小的体积瓶中, 将纯净水添加到低于所需体积的程度, 然后使用磁力搅拌器混合均匀。
2. 当盐完全溶解时, 取出磁铁, 然后将纯净水灌满到所需的最终体积。
将库存解决方案转移到瓶子上, 并储存至使用。
请注意:库存解决方案可以在-20°c 下保存和再利用更长的时间: 葡萄糖和 hepes, 以及室温下的其他库存溶液。
从库存解决方案中准备 1 l^{htf +}介质 (表 2)。
1. 确保所有库存解决方案在使用前完全溶解并很好地混合。
2. 将表 2中列出的库存溶液和盐的数量添加到1升测量缸中, 并将纯净水添加到900毫升。
3. 使用磁力搅拌器混合, 用 naoh 溶液将 ph 值调整到7.35。
4. 取出磁铁, 将纯净水添加到1000毫升。
无菌滤液^{htf +}介质通过0.2μm 的孔隙过滤器, aliquot^{htf +}培养基至 50 ml 塑料管, 并储存在 4°c, 直到使用。
就在进行实验之前, 在50毫升的脂肪中加入165μl 的钠丙酮酸, 以获得 0.33 mm 的最终钠丙酮酸浓度。
请注意:人类输卵管液体培养基也可以从各种商业供应商获得。当使用 4 mm hco₃^-介质时, 样品可以用封闭的盖子在孵化器中孵育, 而不会在空气中额外的 co2, 而不会在 ph 值中出现较大的漂移。如果有 co2 孵化器, 则可以使用 henderson-hasselbalch 方程计算相应数量的 co2, 并使用该公式. 如果使用 25 mm hco₃^-介质, 样品应在 co2 孵化器中用开放盖孵育,空气中含有相应数量的 co2 (取决于大气压力, 通常在5-10 之间)以避免 ph 值的漂移。使用 henderson-hasselbalch 方程可以计算出二氧化碳的确切数量.

2. 通过游泳纯化运动精子细胞 (图 1)

请注意:使用清洁的宽口塑料容器进行精液样品、孵化器、50毫升塑料管、以45°角放置50毫升塑料管的机架、htf⁺介质 (在步骤1中制备或从商业供应商处获得)、离心机和人体血清白蛋白 (hsa)。

获得新鲜捐献的人类精液样本, 通过手淫产生, 并在宽口清洁塑料容器中射精。仅使用符合世卫组织实验室手册规定的参数的精液样本来检查和处理人类精液。
在37°c 下将样品加生 15-30, 使其液化。
用 4 mm^{hco 3}至37°c 加热50毫升 htf + 介质。
以45°角将50毫升塑料管清洁在机架中 (以增加液体之间的表面积)。使用1管每毫升的生精液。
在每个管中加入4毫升预热 htf⁺介质。
仔细将液滴1毫升的液化精液样品输送到每根含有4毫升预热 htf⁺的试管底部。避免释放气泡。
关闭盖子, 在37°c 孵育管1小时。
轻轻吸气 , 并转移尽可能多的上部分 ( htf⁺与运动精子细胞 ) 到一个新的 15 毫升塑料管 , 同时注意从底部部分 ( 与不运动和死亡细胞 ) 不包括在内。一般情况下, 它是安全的转移3.5 毫升的顶部, 而不干扰底部分数。为避免吸力湍流, 请在45°角上切断移液器尖端的最外层1-2 毫米, 以获得更大的开口。
用 htf⁺填充15毫升塑料管, 将电池清洗, 并在 700 x g 的情况下离心管10分钟。
轻轻吸气并取出上清液, 并在 htf + 2 毫升^中重新悬浮精子细胞颗粒。
将精子悬浮液的20μl 转移到两个小塑料管, 以评估精子浓度 (见步骤 3)。
用 htf⁺填充15毫升塑料管, 将电池清洗, 并在 700 x g 的情况下离心管10分钟。
轻轻吸气并取出上清液, 将精子细胞颗粒重新悬浮到 10 x^{10 6}细胞 (根据第2.11 步评估的细胞浓度)。
1. 用于使用无容量精子细胞的实验 (常规 ca^{2 +}信号检测)
  1. 用 4 mm^{hco 3}在 htf + 中重新填充电池-。
  2. 每 ml^{htf +}加入30μl 的人血清白蛋白 (hsa) (100 mg/ml), 最终浓度为 3 mg/ml。
  3. 在37°c 下关闭盖子并孵育≥1小时。
2. 用于使用电容精子细胞的实验 (顶体反应检测)
  1. 用 25 mm^{hco 3}在 htf + 中重新填充电池-。
  2. 每 ml^{htf +}加入 30μl hsa (100 mg/ml), 最终浓度为 3 mg/ml。
  3. 在37°c 条件下, 松散地附着盖子, 孵育≥≥≥≥≥ 3小时, 并与相应数量的 co2 (见步骤 1, 通常在 5-10 co2 之间).

3. 精子细胞的计数

请注意:精子细胞可以手动计数⁵⁰或使用图像细胞仪 51, 如下所述。使用图像细胞仪, 涡流, s100 缓冲液, sp1 盒, 游泳纯化精子细胞 (在步骤2中准备)。

根据预期浓度 (通过在步骤2.10 中手动检查颗粒进行评估), 在 s100 缓冲液中使用圆底 2 ml 管, 将20μl 的脂肪稀释到10、20、30、50或90的系数。使用最接近预期浓度的稀释 (即, 如果游泳后每毫升浓度为 15 x^{10 6个}精子细胞, 则用 380μl s100 缓冲液稀释20μl 精子样本 [稀释因子 20])。
在最大 700 rpm 处使用涡流混合器混合 10秒, 将 sp1 盒式磁带浸入样品中, 然后将白色柱塞完全按下, 将样品的一个外位吸进盒式磁带中。
打开图像细胞仪, 将盒式磁带放入纸盒中, 并根据应用稀释因子 (在步骤3.1 中选择) 运行pi 抑制人类精子细胞检测计数。
对另一个20μl 样品重复步骤 3.1-3.3, 使用最接近从第一个20μl 样品中获得的测量浓度的稀释系数。
计算两个测量值的平均精子细胞浓度。
将平均精子细胞浓度乘以原始体积, 以获得精子细胞总数 (在步骤2中, 这个原始体积为2毫升)。

4. 使用 ca²+-荧光法测量游离细胞^{内 ca 2 +}浓度 ([ca^{2 +}]_{i) (}图 2)

请注意:使用荧光版读取器、384个多孔板、fluo-4 am、游泳纯化精子细胞 (在步骤2中制备)、感兴趣的化合物以及正负对照、自动中继器移液器和12通道移液器。

在 50μg fluo-4 am 的小瓶中加入22.7μl 的二甲基亚硫酸盐 (dmso), 制备 2 mm 氟-4 am 库存, 并将试管混合良好。
添加一个700μl 游泳恢复精子悬浮液 (如步骤2中所述的电容或无容量) 到一个新的试管。700μl 精子样本是在384个微井板 (用于测试3个控制和9个双孔化合物) 中的24口井的一排所需的量。
在700μl 精子悬浮液中加入3.5μl 的 fluo-4 am 库存溶液, 以获得10μm 弗鲁-4 am 的最终浓度。
在37°c 下对样品进行45分钟的孵化, 防止光线照射。
以 700 x g离心样品 10分钟, 吸气并丢弃上清液, 以去除多余的氟-4。
在 htf⁺到 5 x^{10 6 cells/mL ml 中}再悬浮染色颗粒 (即使用步骤 4.2 中的细胞悬浮液体积的 2倍)
制备化合物和控制装置的稀释剂 (可分别在4.4 步和4.5 的孵育和离心期间进行)。
1. 稀释化合物, 以及在 htf⁺中的负控制 (与车辆缓冲) 和阳性对照 (黄体酮)。稀释化合物和控制, 使其达到所需最终浓度的 3倍, 因为它们在步骤4.16 中添加到精子细胞时被稀释为1:3。
2. 将带有稀释剂的管放置在与步骤4.16 中使用的12通道移液器的移液器吸管头之间的距离相对应的管架中。
使用自动中继器移压器 (24 步 50μl)。
1. 通过向上和向下移液一次, 轻轻混合氟-4 染色精子样本。
2. 在384微井板中的行24口中加入50μl 的等价物。
在30°c 的温度下将微孔板放入荧光板读取器中, 然后关闭抽屉。
为 fluo-4 选择适当的协议。在480纳米处激发荧光, 并在520纳米时记录发射。在设置中使用尽可能最快的循环时间。
请注意:如果可能的话, 每口井和底部至少使用10次闪光灯。
在行中选择一个井, 并将增益调整为20% 的目标值。
开始测量。
在前5个周期中控制基线。
1. 如果荧光读数随着时间的推移而增加或减少, 停止实验, 重新调整增益, 然后重新开始实验。
2. 如果各口井之间的基线连续差异很大, 要么步骤4.8 中的移液不精确, 要么样品在移液前混合得不够好。放弃实验。
3. 如果荧光读数在行中的井之间是可比的, 并且在5个第一个周期中保持稳定, 则继续下一步。
在10个周期 (用于基线) 后, 暂停实验。
用微井板弹出抽屉。
使用12通道移液器 (2级 25μl), 快速将化合物和控制装置的制备溶液 (从步骤 4.7) 添加 25μl, 加入到一行12井复制 (24 口井) 中。溶液将被稀释 1:3, 因为井已经含有50μl 的染色精子样本。
尽快继续测量 (抽屉将自动关闭), 以避免缺少由添加的化合物和控件引起的任何荧光信号。现在将捕获添加化合物和控件后荧光 (f) 的变化。
运行实验, 直到荧光信号已被记录从积极的控制和感兴趣的化合物。
停止实验并导出原始荧光数据, 以便按照步骤5中的步骤对其进行分析。
请注意:通常在检测中使用了氟-4^{am 作为 ca 2 +}敏感荧光体, 但如果激发和发射光谱与荧光版读取器中的过滤器相匹配, 也可以使用其他 ca^{2 +}敏感荧光。根据荧光体的选择, 确保增益水平设置在 "安全" 水平, 其中诱导荧光峰在仪器的测量范围内。这可以通过在特定增益设置下将 ionomycin 添加到单个井中来测试。如果这导致荧光信号超过阈值, 降低增益, 然后再试一次。有些人使用多元素 f-127^来帮助加载 fluo-4^1,13, 但它已经发现, 这是不必要的²。同时测量的最大行数取决于两个因素。1) 仪器的循环时间: 如果循环时间太长, [ca^{2 +}]_i中的诱导峰值可能会被错过。同时测量最多两行, 以保持较低的周期时间;2) 步骤4.16 中的移液速度: 使用12通道移液器, 可以在1排或2行的12口重复井 (24 口井) 中快速添加12种不同的溶液 (例如, 用车辆预孵化1行, 用抑制剂预孵化一行), 而不会漏掉诱导的 ca^{2 +}峰值。但是, 不建议尝试在两行中添加24种不同的解决方案以同时测量, 因为在两个连续移液步骤之间必须更换移液吸头, 从而可能会错过感应 ca^{2 +}峰值。

5. 分析 ca^{2 +}-荧光法的数据

打开步骤4中获得并导出的原始荧光数据。
计算重复井的平均值。如果重复项之间存在较大差异, 请丢弃特定井中的数据。
将基线定义为10个第一个周期。
计算 f 0 (%)在10个第一个周期 (基线) 中, 在添加化合物和对照后, 荧光的百分比变化 (f) 相对于平均基部荧光 (f₀)。
如果利用这些数据生成剂量-响应曲线, 从其他井中减去负控制的读出, 以消除移液伪影。

6. 丙烯酸反应的测量

请注意:使用图像细胞仪、孵化器、荧光染料: pi、fitc-psa 和 hoechst-33342、感兴趣的化合物以及正负对照, 在蒸馏水中含有 0.6 m nahco_{3 和}0.37 甲醛的固定化溶液,a 2 幻灯片, 和电容游泳纯化精子细胞 (在步骤2中准备)。

在 htf⁺中制备含有 pi (5μg/ml)、fitc-psc (50μg/ml) 和 hoechst-33342 (100μg/ml) 的染色溶液, 使用涡旋混合器将其混合, 并在使用前免受光线影响。
准备化合物和控制的溶液, 在10倍的最终浓度, 因为他们是稀释 1:10 在步骤6.5。始终包括一个负 (车辆) 控制和两个阳性控制: 黄体酮10μm 最终浓度和 ionomycin 2μm 最终浓度。
将240μl 的电容精子细胞 (在步骤2中制备) 转移到塑料管中。
在每个管中加入30μl 的染色溶液。污渍的最终浓度为: 0.5μgml pi、5μgl fitc-psa 和 10μgml hoechst-33342。
在每个管中加入30μl 的溶液, 包括控制或化合物 (1:10 稀释)。
通过向上和向下移液几次或轻度涡流轻轻混合样品。由于机械应力, 避免过度混合。
在37°c 下孵化30分钟。
在蒸馏水中制备含有 0.6 m nahco₃和0.37 甲醛的固定化溶液的100μl 新塑料管, 每个试管一个。
孵育后, 通过移液将样品充分混合, 并将50μl 的测试样品添加到具有100μl 固定化溶液的试管中。
在装入 a2 滑块的腔之前, 通过移液将样品充分混合。在不产生气泡的情况下, 小心地将腔中填充大约30μl。
请注意:在孵育过程中, 运动精子细胞趋于聚集。细胞团块可能会干扰测量结果 (即使它们被排除在外)。因此, 孵育后通过移液进行彻底混合是非常重要的。同样, 腔内的气泡也会干扰测量结果。因此, 如果液体的边缘即将相遇并产生气泡, 请慢慢填充腔内并改变移液器的角度。
将加载的幻灯片放在图像扫描仪的纸盒上, 然后关闭纸盒。
选择 fleximcyte 协议, 然后按 "运行"。
1. 为 flexiscyte 协议选择以下设置: 分析通道数: 2;屏蔽通道: uv (led365), 这是用于图像分割的通道;通道 1: 蓝色 (led475), 曝光时间 3, 000 毫秒, 发射过滤器 560/35;通道 2: 绿色 (led530), 曝光时间500毫秒, 发射过滤器 675/75;分析细胞的最小数量: 5000;排除聚合单元格: 是。
重复步骤 6.9-6.12, 直到测量了所有样品。

7. 图像细胞仪数据分析

打开在步骤6中获得的数据。
创建以下两个图形来评估测量值。
1. 在双指数尺度上创建 hoechst-33342 强度与 hoechst-33342 区域的散点图。这个情节可以用来挖出太小或太大的积极物体, 使它们成为人类的精子细胞。
2. 在双指数尺度上创建 fitc-psa 强度和 pi 强度的散点图。这个情节可以用来评估的顶体反应精子细胞的数量, 通过使用象限门分离四个组的情节 (图 3): 1) pi 阳性和 fitc-psa 阳性组: acrosome 反应精子细胞的数量;2) pi 阴性和 fitc-psa 阳性组: Acrosome 处反应精子细胞;3) pi 阳性和 fitc-psa 阴性组: Acrosome 完整的不活精子细胞;4) pi 阴性和 fitc-psa 阴性组: 丙烯酸完整的活精子细胞。

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Representative Results

一个实验的结果, 测试4种化合物 (a, b, c 和 d) 的影响, 以及一个积极 (黄体酮) 和负 (缓冲) 控制 [ca²+]_i在人类精子使用中等吞吐量 ca^{2 +}信号分析可以在图4a 中看到。在图 4b中, 显示了黄体酮的剂量响应曲线, 该曲线来自于峰值 f/f0 (%)由连续稀释的黄体酮浓度引起的数据, 在另一个实验中使用中等吞吐量 ca^{2 +}信号法进行了测试。步骤5解释了 ca^{2 +}信令分析中的数据分析。用负对照 (dmso) 或两种阳性对照 (黄体酮和异名霉素) 对中等吞吐量顶核反应检测方法在增强体精子细胞中诱导顶体反应的实验结果具有代表性。可在图 3的顶部面板中看到。可以看到3个测试条件下的象限门控散点图。步骤7对丙烯酸反应数据进行了分析。

表 1: 编制 htf 的库存解决方案⁺.库存解决方案可以在-20°c 下保存和再利用更长的时间, 葡萄糖和 hepes 以及其他库存溶液在室温下使用。确保所有溶液在使用前完全溶解并很好地混合。

表 2: htf 的准备工作⁺4 或 25 mm hco_{3 个}^-从盐的库存溶液 (在表1中制备).乳酸钠可以作为糖浆、60% (w w) 或粉末添加。将 nhco₃添加为粉末。

图 1: 运动体精子细胞的快速纯化.左: 管与 htf⁺介质和液化精液样品的脂肪下的 htf + 培养基.右: 在37°c 游泳1小时后, 运动精子细胞就会游入^{htf +}培养基。植入和死亡精子细胞以及非精子细胞仍留在 htf⁺培养基下方的精液中。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 中通量 ca^{2 +}信令分析示意图。(a) 精子细胞装有 2⁺敏感的含氟菌, 清洗后, 脂肪被镀到384孔板的水井上。(b) 384 孔板位于30°c 的荧光板读取器中。(c) 在添加化合物之前和之后记录荧光、阳性控制 (黄体酮) 和负控制 (与车辆缓冲)。在 f/f0 (%)_中读出在加法 (箭头) 的消极和正面控制以后在 (c) 的底部被说明。经克里斯蒂安·希弗允许使用的插图。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 使用图像细胞学评估丙烯酸反应.(顶部面板)来自负车辆控制 (dmso) 的象限门控散点图, 以及正控制黄体酮 (prog, 10μm) 和 ionomycin (iono, 2μm)。在比较正对照与 dmso 控件时, 可以看到右下象限 (顶体反应活细胞) 中细胞的增加。(底部面板)荧光标记精子细胞的显微图像, 包括所有四个组的细胞。bf = 明亮的领域, hoechst = hoechst-33342, psa = pisum Sativum 凝胶, pi = 碘化天。刻度杆 = 10μm。这一数字已从 egeberg palme 等人的 2018年 7项修改。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4^{: ca 2 +}-荧光测量的数据示例。(a) 由负对照、黄体酮和化合物 a、b、c 和 d. (b) 孕酮剂量-反应曲线引起的 [ca 2 +] i 的变化。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

中等通量 ca^{2 +}信号检测是基于测量荧光从单个微细胞每个包含约 250, 000个精子细胞。捕获的信号是从井中所有单个精子细胞的平均信号。因此, 该检测没有提供任何空间信息, 说明精子细胞 [ca^{2 +}]_i在哪里发生了变化, 精子细胞的变化有多大, 或者反应是怎样的异质性的在单个细胞之间。为了获得这类信息, 必须使用单细胞分辨率实验 (例如^{, 如 50}^、^{52 所}述)。该技术的另一个缺点是时间分辨率, 它是秒的顺序。即使在添加25μl 溶液时, 50μl 精子样品混合良好, 但在带有多孔板的抽屉回到荧光板读取器内之后, 可以首先开始测量。为了获得更高的时间分辨率, 必须使用其他技术 (例如, 停止流动荧光测量¹³^,⁵⁰)。中等吞吐量 ca^{2 +}信令检测的优点是, 与单细胞或单井方法相比, 使用微板读取器同时测量多个微孔, 可以快速、轻松地测试多个微孔。化合物并排与正和负控制(图 4)^{1, 2}, 容易生成单个化合物的剂量-响应曲线 (图 4)¹^,²^,³^,^{4 个}^,⁵、评估两种或两种以上化合物的添加剂 1^、²和协同增效³ , 以及通过竞争抑制实验和使用特定化合物的作用方式研究药理抑制剂 (例如, catspper^{抑制剂 1}^,²^,³^,^{4, 5}⁾。此外, 通过改变荧光体, 该检测可用于检查其他细胞内的变化 (例如 ph 值¹^,²)。最后, 可以同时使用多个荧光体来同时测量多个细胞内的变化。今后, 中等吞吐量的 ca^{2 +}信号检测可用于筛选感兴趣的化合物, 以了解对人类精子中 ca^{2 +}信号的影响 (如环境化学品或候选药物), 从而检查潜在的不利影响。对人类精子细胞功能的影响或调查作为一种避孕手段的可能作用。

中通量共长度反应检测是基于图像细胞仪, 它是一个有吸引力的替代品, 以评估人类的顶体反应相比, 手动评估使用荧光显微镜。完整或反应的排列位体的染色模式并不总是很清楚, 在此过程中可能会出现巨大的个体内部变异。通过图像细胞学, 可以自动采集和分析图像。在这种情况下, 屏蔽通道是 hoechst-33342, 它定义了细胞, 数据分析中只包括来自这些特定区域的荧光信号。因此, 含有残留细胞质的被磨砂体染色不包括在数据分析中。此外, 计数统计量优于荧光显微镜。通过显微镜的望远镜计算200个细胞是一项具有挑战性和耗时的任务, 但使用图像细胞学, 对至少 5, 000个细胞的分析需要不到几分钟的时间。然而, 由于图像细胞仪的放大倍率较低, 评估测量结果的能力丧失, 并且必须将染色样品带到荧光显微镜上。因此, 包含控件对于验证测量非常重要。如果控件没有按预期的方式响应, 则应放弃实验的结果。这里描述的协议是受 zoppino 等^人49岁所做的工作的启发, 他通过流式细胞术评估了人类的顶体反应。他们进一步描述了如何 psa 进入顶体隔间时, 膜融合毛孔出现诱导的顶体反应。一旦进入顶体隔间, psa 就会堵塞并形成一个长时间稳定的标记。该协议中不应用固定或渗透, 因此对结果的解释是明确的: psa 内的一个可行的精子细胞的顶体隔间等于顶部反应。对于 ca^{2 +}信号法, 丙烯酸反应测定也可用于评估有关化合物的剂量-反应曲线、抑制、加成和协同作用。今后, 中等吞吐量的顶体反应检测也可用于筛选感兴趣的化合物, 以了解对顶体反应的影响, 人类精子 (如环境化学品或候选药物), 从而检查对人类的潜在不利影响精子细胞功能或调查作为一种避孕手段的可能作用。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者希望感谢 timo strünker 的实验室在他们在他的实验室逗留期间对 ar 和 dle 进行监督。此外, 我们要感谢我们在 rijshospitalet 哥本哈根大学医院增长和复制部的同事们协助建立这两项评估。这项工作得到了丹麦创新基金赠款的支持 (赠款号码005-2010-3 和 14-2013-4)。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl₂
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO₃ and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH₂PO₄
Magnetic stirrer
MgSO₄
Na-Lactate
NaCl
NaHCO₃
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

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Biology

中通量筛选法评估对精子中 ca^{2 +}信号和反应的影响

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Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

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Materials

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