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Biology

매체-처리량에 캘리포니아2 +효과의 평가 대 한 분석 실험을 심사-신호 및 인간의 정자에서 Acrosome 반응

doi: 10.3791/59212 Published: March 1, 2019

Summary

여기, 캘리포니아2 +에 효과의 평가 대 한 두 개의 중간 처리량 분석-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응 같습니다. 이 분석 실험은 신속 하 고 쉽게 화면에 캘리포니아2 +효과 대 한 화합물의 큰 금액을 사용할 수 있습니다-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응.

Abstract

캘리포니아2 +-신호 하는 것은 정상적인 정자 세포 기능 및 남성 불 임에 필수적 이다. 마찬가지로, acrosome 반응 zona pellucida 관통 하 고 계란을 기름 지 게 하는 인간의 정자 세포의 능력에 대 한 생명 이다. 따라서 화합물 (예: 환경 화학 물질 또는 약물 후보)에 캘리포니아2 +그들의 효과 대 한 테스트를 큰 관심-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응 인간의 정자 세포 기능에 잠재적인 악영향을 검사 하거나 또는 피임약으로 가능한 역할 조사 여기, 두 매체 처리량 분석 설명: 캘리포니아2 +에 효과의 평가 대 한 형광 기반 분석 결과 1)를-인간의 정자에 2) 이미지 cytometric 분석 결과 인간의 정자에서 acrosome 반응의 평가 대 한 신호. 이러한 분석 화면에 캘리포니아2 +효과 대 한 화합물의 많은 수를 사용할 수 있습니다-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응. 개별 화합물의 매우 구체적인 복용량 응답 곡선 생성, 두 개 이상의 화합물에 대 한 잠재적인 가산/성분 확인 하 고 경쟁 저해를 통해 행동의 약리 모드를 공부 하는 분석 실험을 사용할 수 있습니다 또한, CatSper 억제제와 실험입니다.

Introduction

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여기에 설명 된 두 개의 분석 실험의 목적은 캘리포니아2 +에서 효과 검사-신호 및 acrosome 반응 인간의 정자에 대 한 표시 된 것 처럼 이러한 채용 여러 출판물에 여러 화합물 분석 실험1,2, 3,,45,,67. 캘리포니아2 +-신호 및 acrosome 반응은 모두 정상으로 중요 한 인간의 정자 세포 기능 및 남성 불 임.

인간의 정자 세포의 전반적인 목표는 계란을 기름 지 게. 수 성공적으로 하 고 자연스럽 게 계란을 기름 지 게, 정자 세포의 기능 여성 재생산 지역8,9정자 세포의 여행 동안 긴밀 하 게 규제 되어야 합니다. 대부분의 정자 세포 함수는 세포내 캘리포니아2 +를 통해 통제 된다-농도 [캘리포니아2 +] (예를 들어, 정자 운동 성, chemotaxis, 및 acrosome 반응)10. 또한, 정자 세포의 계란을 비 옥 수 있는 렌더링, capacitation 라는 성숙 과정 [캘리포니아2 +]에 의해 부분적으로 규제10이다. 캘리포니아2 +-압출 캘리포니아2 +-ATPase 펌프11 유지는 대략 20.000 배 캘리포니아2 +-는 휴식 [캘리포니아2 +] 50-100 nM의와 인간의 정자 세포 막에 그라데이션. 만약 캘리포니아2 + 수 교차 하는 세포 막 (예를 들어, 캘리포니아2 +의 오프닝을 통해-채널), 캘리포니아2 + 의 상당한 유입을 발생을 야 기한 [캘리포니아2 +]의 상승. 그러나, 정자 세포 또한 운반 세포내 캘리포니아2 +-캘리포니아2 + 풀어 놓을 수 있는 상점, 및, 따라서, 또한 줄 [캘리포니아2 +]12의 상승 상승. 흥미롭게도, 모든 채널 중재 캘리포니아2 +-인간의 정자 세포에 유입은 지금까지 발견 되었습니다 CatSper ( Sperm의고양이이온 채널), 정자 세포11표현만 통해 발생. 인간의 정자 세포에서 CatSper에 의해 활성화 되는 내 인 성 ligands 황 체 호르몬 및 다른 ligand 바인딩 사이트13,,1415, 통해 prostaglandins 선도 하는 급속 한 캘리포니아2 +-로 유입 정자 세포입니다. 두 가지 주요 소스 계란 근처이 내 인 성 ligands의 높은 수준을 제공합니다. 소 낭 모양 액체 progesterone16의 높은 수준을 포함 하는 하나입니다. 소 낭 모양 액체가 배 란 및 oviducts17내 액체와 함께 혼합에 달걀 함께 성숙 난 포에서 나온다. 다른 주요 소스 계란을 포위 하 고 황 체 호르몬과 prostaglandins의 높은 수준을 출시 적 운 세포 이다. 황 체 호르몬 유도 캘리포니아2 +-정자 세포에 유입 계란9,18향해 chemotaxis 중재, 정자 운동 성19,20 제어는 acrosome 자극을 보였다 반응21. 이러한 개별 [캘리포니아2 +]의-규제 정자 기능 올바른 순서로, 올바른 시점에 달걀8의 수정에 대 한 중요 하다. 이 차선 황 체 호르몬 유도 된 Ca2 +라인-유입 발견 되었습니다 관련 된 남성 불 임22,23,,2425,26 감소 ,27,,2829 및 기능 CatSper 남성 불 임26,30,,3132를 위해 근본적 이다 33,,3435,36.

정자 세포에 도달 계란, 이벤트의 시퀀스 일어나 야 한다 발생을 수정에 대 한: 1)는 정자 세포 해야 합니다 주변 적 운 세포 층에 침투, 2)에 zona pellucida, 3) exocytose acrosomal 콘텐츠, 소위 acrosome 반응 37, 4) 침투 zona pellucida, 및 5) 수정38완료 계란 막으로 융합. 이러한 단계를 통해가 서 계란을 기름 지 게 하 수, 정자 세포 먼저 받아야 capacitation11, 정자 세포 "decapacitating" 요인39 를 포함 하는 정액 액체 두고 여성의 체액에 수영으로 시작 중 탄산염과 알 부 민37의 높은 수준의 생식 요로. Capacitation 렌더링 정자 세포 hyperactivation, 운동 편, 그리고 acrosome 반응37의 활발 한 매 질으로의 형태를 받을 수 있게 합니다. Hyperactivated 운동 zona pellucida40의 침투에 대 한 필수 이며는 acrosome 포함41이 침투 과정 원조 하는 각종 가수분해 효소. 또한, acrosome 반응 렌더링 정자 세포 정자 계란 퓨전42에 필요한 정자 표면에 특정 막 단백질을 노출 하 여 계란으로 융합의 수 있습니다. 따라서, hyperactivation 및 acrosome 반응을 받 다 수는 모두42달걀40,성공적인 수정에 필요한. 무슨 마우스 정자 세포43,,4445볼 수 있다, 반대로 acrosome 그대로 인간의 정자 셀 zona pellucida46에 바인딩할 수 있습니다. 인간의 정자 세포 zona pellucida에 바인딩되면 받아야 acrosome 반응 zona pellucida41 침투와 계란38와 융합에 필요한 특정 막 단백질을 노출 해야 합니다. 인간의 정자에서 acrosome 반응의 타이밍은 따라서 수정 발생 하는 것 중요 합니다.

위에서 설명한 대로, 캘리포니아2 +-정상적인 정자 세포 기능8, 그리고 그것은, 따라서, 캘리포니아2 +에서 효과 대 한 화합물의 스크린 다 수 수 큰 관심의 신호 하는 것은 매우 중요-인간의 정자 세포에 신호. 마찬가지로, acrosome 반응에 적절 한 시기와 장소를 받을 인간의 정자 세포 zona pellucida 침투 수 계란46,47을 거 름으로 그것은 또한 테스트를 그들의 능력에 대 한 화합물 수 큰 관심 인간의 정자에서 acrosome 반응을 영향을 줍니다. 이 위해, 2 개의 중간 처리량 심사 분석 설명: 1)에 캘리포니아2 +효과 대 한 분석 결과-인간 정자 세포, 및 2) 인간의 정자 세포에 acrosome 반응을 유도 하는 기능에 대 한 분석 결과에 신호.

분석 결과 1은 중간 처리량 캘리포니아2 +-신호 분석 결과. 이 형광 플레이트 리더 기반 기술은 여러 우물에서 동시에 시간의 기능으로 형광에 변화를 모니터링합니다. 캘리포니아2 +-민감한 형광 염료, Fluo-4는 캘리포니아2 +≈ 335 Kd nM 오전 (acetoxymethyl) 에스테 르 형태로 셀 permeant입니다. Fluo-4를 사용 하 여, 시간이 지남에 그리고 정자 세포에 대 한 관심의 화합물의 추가 후 [캘리포니아2 +]i 에 변화를 측정 가능 하다. 분석 결과 201113 티 Strünker의 연구소에 의해 개발 되었다 이후 사용 되 고 있습니다 화면 화합물을 여러 연구에 대 한 효과에 캘리포니아2 +-인간의 정자1,2,3, 신호 4,5. 또한 유사한 방법 여러 약물 후보48에 사용 되었습니다. 또한,이 분석 결과 또한 행동1,2,3,,45, 복용량 응답 곡선1, 약리학 모드를 평가 하는 데 유용 2,3,,45, 경쟁력 저해1,2, 가산1,2및의 성분3 화합물 관심의.

분석 결과 2 중간 처리량 acrosome 반응 분석 결과가 이다. 이 이미지 cytometer 기반 기술 측정 가능한 양의 acrosome 반응 3 형광 염료를 사용 하 여 샘플에서 정자 세포: propidium 요오드 화물 (PI), Pisum sativum FITC-PSA (), 및 Hoechst 33342 lectin FITC 결합. 분석 결과 Zoppino 외.49 에 의해 유사한 흐름 cytometry 기반 방법에서 수정 하 고 여러 연구6,7에 사용 되었습니다. 캘리포니아2 +에 관해서는-이 acrosome 반응 분석 결과 수 또한 사용 평가 복용량 응답 곡선, 억제, 가산, 그리고 관심의 화합물의 성분 분석 결과, 신호.

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Protocol

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수집 및 분석 프로토콜에서 인간의 정액 샘플의 덴마크의 자본 지역의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 모든 정액 샘플을 자원 봉사 기증자에서 동의 후 가져올 되었습니다. 배달 후 샘플 완전히 익명 했다. 그들의 불편에 대 한 각 기증자 샘플 당 500 DKK (약 75 미국 달러)의 수수료를 받았다. 샘플 배달 당일 분석 하 고 실험실 실험 직후 파괴 했다.

참고: 중간 처리량 캘리포니아2 +-4-5 단계와 6-7 단계에서 중간 처리량 acrosome 반응 분석 결과에서 분석 결과 설명 하는 신호. 인간의 튜 유체 (HTF+) 매체를 준비 하는 프로토콜은 1 단계에서 설명 하 고는 분석 실험에 대 한 정자 세포의 정화 2-3 단계에서 설명 하는.

1. 인간의 튜 유체 (HTF+) 매체의 준비

참고: 적절 한 크기, 측정 실린더, 자기 활동가, 표 1 에 나열 된 소금 1 L과 표 2, 물 정화, 0.2 µ m의 사용 부피 플라스 크에는 필터, 그리고 50 mL 플라스틱 튜브 기 공.

  1. 순화 된 물 (표 1)에 염 분의 재고 솔루션을 준비 합니다.
    1. 적절 한 크기의 부피 플라스 크에 표 1 에 나열 된 소금의 양을 추가 하 고 원하는 볼륨 아래 조금 물을 추가할는 자력을 사용 하 여 잘 혼합.
    2. 소금은 완전히 해산 하 고, 자석 및 채우기 원하는 최종 볼륨을 순화 된 물으로 제거 합니다.
  2. 병에 재고 솔루션을 전송 하 고 사용까지 저장 합니다.
    참고: 재고 솔루션을 유지 하 고 오랜 시간에 다시 사용 수: 포도 당 고-20 ° C에서 HEPES, 실 온 (RT)에서 다른 재고 솔루션.
  3. 재고 솔루션 (표 2)에서 HTF+ 매체의 1 리터를 준비 합니다.
    1. 모든 재고 솔루션은 완전히 해산 하 고 잘 혼합 사용 하기 전에 확인 하십시오.
    2. 재고 솔루션 및 측정 실린더 1 L를 표 2 에 나열 된 소금의 양을 추가 하 고 순화 된 물 900 mL에 추가.
    3. 자력 교 반기를 사용 하 여 잘 혼합 하 고 pH 7.35 NaOH 솔루션을 조정.
    4. 자석 분리 하 고 순화 된 물 1000 mL에 추가.
  4. 0.2 µ m 기 공 필터, 50 mL 플라스틱 튜브, 그리고 저장소 사용까지 4 ° C에서 aliquot HTF+ 매체를 통해 살 균 여과 액 HTF+ 매체.
  5. 실험을 실행 하기 전에 그냥 0.33 m m의 최종 없음 pyruvate 농도를 약 50 mL 수를 Na pyruvate의 165 µ L를 추가 합니다.
    참고: 인간의 튜 액체 매체는 또한 다양 한 상업적인 공급자에서 얻을 수 있습니다. 4 m m HCO3- 매체를 사용할 때 샘플 pH에 큰 드리프트 없이 공기에서 여분의 CO2 없이 인큐베이터에서 닫힌 뚜껑 incubated 수 있습니다. CO2 배양 기를 사용할 수 있으면 헨 더 슨-Hasselbalch 방정식을 사용 하 여 및 사용 CO2 의 해당 금액을 계산할 수 있습니다. CO2 (5-10% 사이 보통 대기압에 따라 다름)의 해당 금액을 포함 하는 공기 샘플 CO2 배양 기에서 오픈 뚜껑 incubated 한다 25 m m HCO3- 매체를 사용 하는 경우 산도에서 드리프트 방지를 위해. 헨 더 슨-Hasselbalch 방정식을 사용 하 여 CO2 의 정확한 금액을 계산할 수 있습니다.

2. 수영 업 (그림 1)를 통해 운동 정자 세포의 정화

참고: 깨끗 한 넓은 물리기 플라스틱 컨테이너를 사용 하 여 45 ° 각도, HTF+ 매체 (에서 준비 단계 1 또는 얻은 상업적인 공급자에서), 원심 분리기, 그리고 인간의 혈 청에 50ml 플라스틱 튜브를 삽입 하기 위한 랙, 50ml 플라스틱 튜브, 인큐베이터, 정액 샘플에 대 한 알 부 민 (HSA)입니다.

  1. 자 위를 통해 생산 하 고 넓은 물리기 깨끗 한 플라스틱 용기에 ejaculated 갓 기증된 인간의 정액 샘플을 얻습니다. 검사 및 인간 정액의 처리에 대 한 WHO 실험실 설명서에 의해 설립 하는 매개 변수를 충족 하는 정액 샘플만 사용 합니다.
  2. 액 화 하 수 있도록 15-30 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
  3. 4 m m HTF+ 매체의 50 mL HCO3- 37 ° c 열
  4. 장소 (액체 사이의 표면 영역을 증가)를 45 ° 각도로 랙에 50 mL 플라스틱 튜브 청소. 원시 정액의 mL 당 1 튜브를 사용 합니다.
  5. 튜브의 각 preheated HTF+ 매체의 4 mL를 추가 합니다.
  6. 신중 하 게 데워 HTF+의 4 mL를 포함 하는 각 관의 바닥에 액상된 정액 샘플의 1 mL를 플라스틱. 공기 방울의 출시를 하지 마십시오.
  7. 뚜껑을 닫고 1 시간 동안 37 ° C에서 튜브를 품 어.
  8. 부드럽게 발음 하 고 전송 위 분수 (운동 정자 세포 HTF+ )의 많은 가능한 새로운 15 mL 플라스틱 튜브, 바닥 분수 (immotile 및 죽은 세포와 정액) 로부터 아무것도 포함 됩니다 주의 하는 동안. 일반적으로, 그것은 3.5 mL 최고 분수의 바닥 분수를 방해 하지 않고 전송 안전입니다. 흡입 난 기류를 피하기 위해, 잘라 피 펫 팁의 바깥쪽 1-2 m m 더 큰 개통을 얻기 위해 45 ° 각도에서.
  9. 세포를 씻어 실시간에서 10 분 700 x g 에서 튜브 원심 HTF+ 와 15 mL 플라스틱 튜브를 채우기
  10. 부드럽게 발음 하 고는 상쾌한 제거 HTF+의 2 mL에 정자 세포 pellet을 resuspend.
  11. 20 µ L 정자 서 스 펜 션의 정자 농도의 평가 대 한 두 개의 작은 플라스틱 튜브를 전송 (3 단계 참조).
  12. 세포를 씻어 실시간에서 10 분 700 x g 에서 튜브 원심 HTF+ 와 15 mL 플라스틱 튜브를 채우기
  13. 부드럽게 발음 하 고는 상쾌한 제거 10 x 106 셀/mL (단계 2.11에서에서 평가 셀 농도에 따라)에 정자 세포 펠 릿 resuspend.
    1. 유엔 capacitated 정자 세포를 사용 하 여 실험에 대 한 (일상적인 캘리포니아2 +-신호 분석 결과)
      1. 4 m m HCO3-셀 HTF+ 에 resuspend.
      2. ML 3 mg/mL의 최종 농도를+ HTF 당 인간 혈 청 알 부 민 (HSA) (100 mg/mL)의 30 µ L를 추가 합니다.
      3. 뚜껑을 닫고 ≥1 h 37 ° c.에 대 한 품 어
    2. 사용 하 여 실험에 대 한 capacitated 정자 세포 (acrosome 반응 분석 결과)
      1. 셀 HTF+ 25 m m HCO3-resuspend.
      2. ML 3 mg/mL의 최종 농도를+ HTF 당 HSA (100mg/mL)의 30 µ L를 추가 합니다.
      3. 뚜껑을 느슨하게 연결 하 고 해당 금액의 CO2 와 37 ° C에서 ≥3 시간 동안 품 어 (5-10% CO2사이 보통 1 단계 참조).

3. 정자 세포의 계산

참고: 정자 세포 수 중 계산 수동으로50 또는는 이미지 cytometer51를 사용 하 여 여기에 설명 된 대로. 이미지 cytometer는 vortexer를 사용 하 여, S100 버퍼, SP1-카세트, 수영-최대 순화 정자 세포 (2 단계에서 준비).

  1. 10, 20, 30, 50 또는 90 (단계 2.10에서에서 펠 릿의 수동 검사에 의해 평가) 예상된 농도 따라 둥근 바닥 2 mL 튜브를 사용 하 여 S100 버퍼에의 한 요소에 aliquot 20 µ L를 희석. 사용 희석 농도에 가장 가까운 (즉, 만약 수영 최대 예상 후 mL 당 15 x 106 정자 세포의 농도 다음 S100 버퍼 [희석 요인 20]의 380 µ L와 20 µ L 정자 샘플을 희석)으로 예상.
  2. 10 대 잘 믹스 s 최대 700 rpm에서 소용돌이 믹서를 사용 하 여 샘플에 SP1-카세트 담가 그리고 카세트에 aspirate 샘플의 약 수까지 완벽 하 게 흰색 플런저를 누르십시오.
  3. 이미지 cytometer 열고, 카세트 트레이에 놓고 적용된 희석 요인 (3.1 단계에서 선택)에 따라 수의 PI 얼룩진 인간의 정자 세포 분석 결과 분석 결과 실행 합니다.
  4. 20 µ L 샘플에서 얻은 측정된 농도에 가까운 희석 요소를 사용 하 여 다른 20 µ L 샘플 3.1-3.3 단계를 반복 합니다.
  5. 두 측정에서 평균 정자 세포 농도 계산 합니다.
  6. 곱하기 의미 정자 총 정자 세포 수를 원래 볼륨 세포 농도 (2 단계에서이 원본 볼륨은 2 mL).

4. 무료 세포내 캘리포니아2 +에서 변화의 측정-농도 ([캘리포니아2 +]) 사용 하 여 Ca2 +-fluorimetry (그림 2)

참고: 형광 판 리더, 384-잘 접시, Fluo-4를 사용 하 여 오전, 수영장 정화 정자 세포 (에서 준비 단계 2), 잘으로 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, 자동 중계기 피 펫 및 12 채널 피 펫으로 관심의 화합물.

  1. 2mm Fluo-4 준비 오전 50 µ g Fluo-4의 유리병에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 22.7 µ L을 추가 하 여 재고 오전 튜브를 잘 섞는다.
  2. 새로운 테스트 튜브를 700 µ L 수영 업 복구 된 정자 현 탁 액 (capacitated 또는 취소로 capacitated에서 개설한 2 단계)의 약 수를 추가 합니다. 정자 샘플의 700 µ L (남자에서 3 컨트롤 및 9 화합물을 테스트 하는 데 사용) 384-microwell 접시에서 24 우물의 한 행을 분석 하는 데 필요한 금액입니다.
  3. 추가 Fluo-4의 3.5 µ L 오전 10 µ M의 최종 농도를 정자 현 탁 액의 700 µ L 재고 솔루션 Fluo-4입니다.
  4. 빛 으로부터 보호 하는 37 ° C에서 45 분에 대 한 샘플을 품 어.
  5. 샘플 10 분 700 x g 에서 원심, 발음 하 고 상쾌한 초과 Fluo-4를 제거 하려면 삭제.
  6. 5 x 106 셀/ml (예:, 사용 2 세포 현 탁 액 단계 4.2에서의 볼륨 x) HTF+ 에 묻은 펠 릿 resuspend
  7. 화합물 및 컨트롤 (행 해질 수 있다 4.4-4.5, 단계에서 부 화와 원심 분리 기간 동안 각각)의 희석을 준비 합니다.
    1. 화합물, 부정적인 컨트롤 (차량 버퍼) 고 HTF+에 긍정적인 제어 (progesterone)을 희석. 그들은 희석된 1:3 단계 4.16에서에서 정자 세포에 추가 될 때와 원하는 최종 농도 x 3 컨트롤을 희석.
    2. 4.16 단계에서 사용 되는 12 채널 피 펫의 피 펫 팁 사이의 거리에 해당 하는 튜브 사이의 거리와 선반에 희석 튜브를 놓습니다.
  8. 자동 중계기 피 펫 (50 µ L의 24 단계)을 사용 합니다.
    1. 믹스 Fluo-4 스테인드 정자 샘플을 부드럽게 위아래로 한 번 전체 금액 pipetting으로.
    2. 384 microwell 격판덮개에 행의 24 웰 스를 50 µ L의 aliquots를 추가 합니다.
  9. 30 ° C에서 형광 플레이트 리더에서 microwell 접시를 놓고 서랍을 닫습니다.
  10. Fluo-4에 대 한 적절 한 프로토콜을 선택 합니다. 480 nm에서 형광 및 520에 기록 방출 흥분 nm. 가장 빠른 가능한 시간 주기를 사용 하 여 설정.
    참고: 가능 하면 잘 및 아래쪽 광학 당 적어도 10 플래시를 사용 합니다.
  11. 행에 잘 선택 하 고 20%의 대상 값을 이득 조정.
  12. 측정을 시작 합니다.
  13. 처음 5 주기 동안 기준선을 제어 합니다.
    1. 형광 판독 증가 시간이 지남에 따라 감소 하는 경우 실험을 중지 하 고 이득을 재조정 한 실험을 다시 시작.
    2. 기준선 연속에서 개별 우물 사이 많은 경우, 어느 단계 4.8에서에서 pipetting 되었습니다 정확한 또는 샘플 pipetting 전에 충분히 잘 혼합 하지 했다. 실험을 삭제 합니다.
    3. 형광 판독 행에 우물 사이 비교 및 5 첫 번째 사이클 동안 꾸준한 경우 다음 단계를 계속 합니다.
  14. 10 사이클 (초기 사용), 후 실험을 일시 중지 합니다.
  15. Microwell 플레이트 서랍을 꺼냅니다.
  16. 25 µ L 화합물 및 컨트롤 (단계 4.7) 행의 12 잘 중복 (24 웰 스) 하의 준비 된 솔루션의 추가 12 채널 피 펫 (25 µ L의 2 단계)를 사용 하 여 신속 하 게. 이미 50 µ L의 스테인드 정자 샘플을 포함 하는 우물 솔루션 희석된 1:3, 될 것입니다.
  17. 신속 하 게 가능한 (서랍 닫힐 것 이다 자동으로) 추가 화합물에 의해 유도 된 어떤 형광 신호를 누락을 방지 하 고 컨트롤 측정을 계속 합니다. 형광 (δ)와 컨트롤의 추가 캡처됩니다 지금 후에 변화 한다.
  18. 긍정적인 통제 및 관심사의 화합물에서 형광 신호 기록 되었습니다 때까지 실험을 실행 합니다.
  19. 실험을 중지 하 고 5 단계에서 분석 하 원시 형광 데이터 내보내기.
    참고: 일반적으로 Fluo-4 오전 Ca2 +로 사용 되었습니다-분석 결과, 하지만 다른 Ca2 +에 민감한 fluorophore-여기 및 방출 스펙트럼 형광 플레이트 리더에서 필터와 맞는 경우 민감한 fluorophores 사용 될 수도. Fluorophore의 선택에 따라 이득 수준 유도 형광 봉우리 계측기의 측정 범위는 "안전한" 수준에서 설정 되어 있는지 확인 합니다. 이 특정 이득 설정에서 단일 잘 ionomycin 추가 하 여 테스트할 수 있습니다. 이 임계값 형광 신호 유도, 이득 절감 하 고 다시 시도. 일부 Fluo-41,13, 로드를 원조 하기 위하여 Pluronic F-127를 사용 하지만이 필요한2아니다 발견 되었습니다. 동시에 측정 하는 행의 최대 수는 두 가지 요인에 따라 달라 집니다. 1) 악기의 주기 시간: 유도 봉우리 [캘리포니아2 +] 를 놓친 사이클 시간이 너무 긴 경우. 낮게; 사이클 시간을 유지 하는 동시에 두 개의 행의 최대 측정 2) 단계 4.16에에서 pipetting의 속도: 12 채널 피 펫을 사용 하 여, 그것은 신속 하 게 1 또는 2 행 (예를 들어, 미리 차량 인 큐베이 팅 한 행 한 행 사전 인 큐베이 팅 억제제와 함께)의 12 중복 우물 (24 정)을 12 가지 솔루션을 추가할 수 유도 Ca2 + 봉우리를 누락 없이. 그러나, 추가 하려고 24 다른 솔루션 동시 측정, 두 개의 행에 pipetting 팁에 의하여 유도 된 Ca2 + 봉우리 놓칠 수 수 두 순차 pipetting 단계 사이 교체 해야 합니다으로 권장 하지 않습니다.

5. 캘리포니아2 +-fluorimetry에서 데이터의 분석

  1. 오픈 원시 형광 데이터 취득 하 고 4 단계에서 내보낸.
  2. 중복 된 우물에서 평균을 계산 합니다. 중복 사이 큰 차이가 있으면 특정 우물에서 데이터를 삭제할.
  3. 10 첫 번째 사이클으로 기준선을 정의 합니다.
  4. Δ/F0 (%)를 계산 비율으로 형광 (δ) 화합물 및 10 첫 번째 사이클 (기준) 동안 평균 기저 형광 (F0)에 대해 컨트롤의 추가 후 시간의 경과에서 변경.
  5. 복용량 응답 곡선의 세대에 대 한 데이터를 사용 하 여, pipetting 아티팩트를 제거 하려면, 다른 우물에서 부정적인 컨트롤의 판독을 뺄.

6입니다. Acrosome 반응의 측정

참고: 이미지 cytometer, 인큐베이터, 형광 염료를 사용 하 여: PI, FITC PSA 및 Hoechst 33342, 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, 0.6 M NaHCO3 및 증류수에 0.37% (v/v) 포름알데히드를 포함 하는 immobilizing 솔루션 뿐 아니라 관심의 화합물 A2 슬라이드 그리고 capacitated 수영장 정화 정자 세포 (2 단계에서 준비).

  1. PI를 포함 하는 얼룩 솔루션 준비 (5 µ g/mL), FITC PSA (50 µ g/mL)와 Hoechst 33342 (100 µ g/mL) HTF+에서 소용돌이 믹서를 사용 하 여 잘 혼합 하 고 사용까지 빛에서 그것을 보호.
  2. 그들은 희석된 1:10 단계 6.5에서에서 원하는 최종 농도 x 10에서 화합물 및 컨트롤 솔루션을 준비 합니다. 항상 네거티브 (차량) 제어 및 2 개의 긍정적인 컨트롤 포함: 호르몬 10 µ M 최종 농도 및 ionomycin 2 µ M 최종 농도.
  3. 플라스틱 튜브 (2 단계에서 준비) capacitated 정자 세포의 240 µ L의 aliquots 전송.
  4. 각 관에 대 한 해결책을 얼룩이 지기의 30 µ L를 추가 합니다. 것입니다 얼룩의 최종 농도: 0.5 µ g/mL PI, 5 µ g/mL FITC-PSA, 및 10 µ g/mL Hoechst 33342.
  5. 각 관에 솔루션 컨트롤 또는 화합물의 30 µ L를 추가 (1시 10분 희석).
  6. 몇 번 이나 가벼운 vortexing 위아래로 pipetting으로 샘플을 부드럽게 혼합. 때문에 기계적 스트레스, 과도 한 혼합 하지 마십시오.
  7. 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  8. 새로운 플라스틱 튜브 100 µ L 0.6 M NaHCO3 및 테스트 튜브 하나씩 증류수에 0.37% (v/v) 포름알데히드 immobilizing 솔루션의 준비.
  9. 부 화, 후 pipetting에 의해 잘 샘플을 혼합 하 고 100 µ L immobilizing 솔루션의 튜브를 테스트 샘플의 50 µ L를 추가 합니다.
  10. A2 슬라이드의 챔버를 로드 하기 전에 샘플 pipetting으로 잘 섞는다. 채워 실 신중 하 게 약 30 µ L 공기 거품을 만들지 않고.
    참고: 부 화, 동안 운동 정자 세포가 경향이 집계. 셀 덩어리 (비록 그들은 제외 됩니다)는 측정을 방해 수 있습니다. 따라서, 부 화 후 pipetting으로 철저 한 혼합은 매우 중요 하다입니다. 마찬가지로, 약 실에서 공기 방울 측정을 방해 수 있습니다. 따라서, 챔버 천천히와 액체의 가장자리에 대 한 충족 하 고 공기 방울이 만드는 경우는 피 펫의 각도 변경.
  11. 이미지 cytometer 트레이에 로드 슬라이드를 배치 하 고 트레이 닫습니다.
  12. FlexiCyte 프로토콜을 눌러 실행을 선택 합니다.
    1. FlexiCyte 프로토콜에 대 한 다음 설정을 선택 하십시오: 분석 채널 수: 2; 채널을 마스킹: UV (LED365), 이것은 채널 이미지 세분화;에 사용 채널 1: 블루 (LED475), 노출 시간 3000 ms 방출 필터 560/35; 채널 2: 그린 (LED530), 노출 시간 500ms, 방출 필터 675/75; 분석 된 세포의 최소 수: 5000; 집계 셀 제외: 예.
  13. 6.9-6.12 단계를 반복 하 여 모든 샘플 측정 되었습니다.

7입니다. 이미지 Cytometry에서에서 데이터의 분석

  1. 오픈 데이터 6 단계에서 얻은입니다.
  2. 측정을 평가 하는 두 다음 플롯을 만듭니다.
    1. Biexponential 비늘에 Hoechst 33342 강도 Hoechst 33342 영역 대의 산 점도를 만듭니다. 이 음모는 Hoechst 33342 긍정적인 개체 너무 작은 게이트를 사용 하거나 너무 인간의 정자 세포 수를 큰 될 수 있습니다.
    2. Biexponential 비늘에 FITC PSA 강도와 PI 강도의 산 점도를 만듭니다. 이 플롯을 사용할 수 있습니다 엉덩이를 acrosome의 양을 플롯 (그림 3)에 4 개의 그룹을 구분 하는 사분면 게이트의 사용에 의해 정자 세포 반응: 1) PI 양수와 FITC PSA 긍정적인 그룹: Acrosome 반응 부실 정자 세포; 2) PI 부정과 FITC PSA 긍정적인 그룹: Acrosome 반응 가능한 정자 세포; 3) PI 양수와 FITC PSA 부정적인 그룹: Acrosome 그대로 부실 정자 세포; 그리고 4) PI 부정과 FITC PSA 부정적인 그룹: Acrosome 그대로 가능한 정자 세포.

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Representative Results

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대표는 매체 처리량 캘리포니아2 +를 사용 하 여 인간의 정자에 긍정적인 (progesterone) 및 네거티브 (버퍼) 컨트롤 [캘리포니아2 +]i 4 화합물 (A, B, C 및 D)의 효과 테스트 하는 실험에서 결과-신호 그림 4a에 분석 결과 볼 수 있습니다. 그림 4b, 황 체 호르몬의 복용량 응답 곡선 표시 됩니다, 피크 δ/F0 (%)에서 파생 했다 황 체 호르몬, 순차적으로 희석된 농도 의해 유도 된 데이터는 매체 처리량 캘리포니아2 +를 사용 하 여 다른 실험에서 테스트-신호 분석 결과. 캘리포니아2 +에서 데이터의 분석-분석 결과 대해서는 5 단계에서 설명 하는 신호. 부정적인 통제 (DMSO) 또는 두 긍정적인 컨트롤 (황 체 호르몬 및 ionomycin) 매체 처리량 acrosome 반응 분석 결과 수에를 사용 하 여 capacitated 인간의 정자 세포에서 acrosome 반응의 유도 테스트 실험에서 대표적인 결과 그림 3의 맨 위 패널에서 볼 수 있습니다. 3 테스트 조건에서 문이 사분면 점도 볼 수 있습니다. Acrosome 반응 데이터 분석의 단계 7에서에서 설명 합니다.

표 1: HTF의 준비에 대 한 솔루션 주식 + . 재고 솔루션 유지 하 고 오랜 시간, 포도 HEPES-20 ° C에 실내 온도에 다른 재고 솔루션에 대 한 다시 사용할 수 있습니다. 모든 솔루션은 완전히 해산 하 고 잘 혼합 사용 하기 전에 확인 하십시오.

표 2: HTF의 준비 + 4 또는 25 m m HCO와 3 - (표 1에 준비) 소금의 재고 솔루션에서. 나 젖 시럽, 추가할 수 있습니다 60% (w/w), 또는 분말. NaHCO3 분말으로 추가 됩니다.

Figure 1
그림 1: 메구미 인간의 정자 세포의 수영장 정화. 왼쪽: HTF+ 매체와 튜브와 액상된 정액 샘플의 약 수 HTF+ 매체 아래 pipetted. 오른쪽의 수영-37 ° C에서 1 시간 후 운동 정자 세포는 swum을 HTF+ 매체에. Immotile 및 죽은 정자 세포로 정자 세포 HTF+ 매체 아래 정액에 남아 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 다이어그램 매체 처리량 캘리포니아2 +-신호 분석 결과. () 정자 세포는 캘리포니아2 +로드-384-잘 접시의 우물을 씻어 민감한 fluorophore 및 aliquots는 도금. (b) 384-잘 접시는 30 ° c.에 형광 플레이트 리더에 배치 (c) 형광 화합물, 긍정적인 제어 (progesterone) 및 부정적인 제어 (차량 버퍼)의 전후 기록 됩니다. 판독 δ/F0 (%) 부정적이 고 긍정적인 통제의 추가 (화살표) 후 (c)의 하단에 설명 됩니다. 기독교 쉬 퍼의 허가 함께 사용 하는 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 사용 하 여 이미지 cytometry acrosome 반응의 평가. (맨 위 패널) 사분면 문이 분산형 부정적인 차량 제어 (DMSO), 및 긍정적인 컨트롤 황 체 호르몬 (음식물, 10 µ M) ionomycin (Iono, 2 µ M)에서 플롯합니다. 낮은 오른쪽 사분면에서 셀에 증가 (acrosome 반응 가능한 세포) 긍정적인 컨트롤 DMSO 컨트롤을 비교 했을 때 볼 수 있다. (하단 패널) 모든 4 개의 그룹에서 세포를 포함 하 여 붙일 레이블된 정자 세포의 현미경 이미지. BF = 밝은 필드, Hoechst Hoechst 33342, PSA = Pisum Sativum Agglutinin, PI = = Propidium 요오드 화물. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림은 Egeberg 황금 외. 20187에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 캘리포니아2 +-fluorimetry에서 데이터의 예입니다. () 변화 [캘리포니아2 +] 부정적인 제어, 호르몬 및 복합 A, B, C 및 D. (b) 황 체 호르몬 복용량 응답 곡선에 의해 유도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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중간 처리량 캘리포니아2 + 신호 분석 결과 단일 microwells에서 형광의 측정에 따라 약 250000 정자 세포를 포함 하는. 캡처된 신호는 잘에서 모든 개별 정자 세포에서 평균입니다. 분석 결과 [캘리포니아2 +]i 에 변화 소요, 또는 어떻게 다른 유형의 응답은 정자 세포의 크기 비율에는 정자 세포 [캘리포니아2 +]내가 구체적으로 어디에 대 한 공간 정보가 없는 변경 제공 개별 셀 사이. 정보를 얻기 위해 같은, 단일 셀 해상도 실험 (예를 들어,50,52에서 설명)으로 사용 해야 합니다 수 있습니다. 기술은의 또 다른 단점은 초 순서는 시간적 해상도입니다. 25 때 50 µ L 정자 샘플은 잘 혼합 측정 후 다 잘 플레이트 서랍 형광 플레이트 리더 안에 다시 시작 될 수 있다 먼저 솔루션의 µ L 추가 됩니다. 더 높은 시간 해상도 얻으려면 다른 기술을 사용 해야 합니다 (예를 들어, 중지 흐름 fluorimetry13,50). 활용 매체 처리량 캘리포니아2 +-microplate 리더를 사용 하 여 여러 microwells의 동시 측정을 신속 하 고 쉽게 여러 테스트에 대 한 허용 하는 것을 이다 신호 분석 결과, 단일 셀 또는 단일 잘 방법에 비해 긍정적이 고 부정적인 컨트롤과 사이드 화합물 (그림 4)1, 2, 개별 화합물 (그림 4)1,2,3 의 복용량 응답 곡선의 쉬운 세대 , 4 , 5, 가산1,2 , 성분3 두 개 이상의 화합물에 대 한 평가 뿐만 아니라 화합물 비록 경쟁 저해 실험의 행동의 모드의 연구 및 특정의 사용 약리학 저 해제 (예를 들어, CatSper 억제제1,2,3,,45) 또한, fluorophore는 변경 하 여 분석 결과 다른 세포내의 변화 (예, pH1,2) 검사를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 더 이상의 fluorophore 여러 세포내 변화를 동시에 측정을 한 번에 사용할 수 있습니다. 미래에는 매체 처리량 캘리포니아2 +-신호 분석 결과 캘리포니아2 +에서 효과 대 한 관심의 화면 화합물에 사용 될 수-잠재력 불리 한 검사 (예: 환경 화학 물질 또는 약물 후보) 인간의 정자에 신호 인간의 정자 세포 기능에 또는 조사는 피임약으로 가능한 역할을 효과.

매체-처리량 acrosome 반응 분석 결과 형광 현미경을 사용 하 여 수동 평가에 비해 인간의 acrosome 반응을 평가 하는 매력적인 대체 구성 이미지 cytometry를 기반으로 합니다. 그대로 또는 반응 반응 acrosomes의 얼룩 패턴은 항상 명확 하 고, 그리고 큰 내 개별 변형 조의 결과 수 있습니다. 이미지 cytometry와 이미지는 획득 하 고 자동으로 분석. 마스크 채널이 케이스 Hoechst 33342에 셀 정의 하 고 이러한 특정 지역에서만 형광 신호 데이터 분석에 포함 됩니다. 따라서, 잔여 세포질을 포함 하는 enucleated 몸의 얼룩 데이터 분석에는 포함 되지 않습니다. 또한, 형광 현미경 검사 법 보다는 통계를 계산입니다. 현미경의 oculars 통해 200 셀 도전적이 고 시간이 걸리는 작업 이지만 이미지 cytometry 적어도 5000 셀의 분석 보다 몇 분 걸립니다. 그러나, 이미지 cytometer의 낮은 확대로 인해 측정을 평가 하는 능력 손실 이며 하나의 형광 현미경에 얼룩진된 샘플을가지고 해야 합니다. 따라서, 컨트롤의 포함 측정을 확인 하기 위해 멀 언 중요성 이다. 컨트롤이 예상 대로 반응 하지 않습니다, 경우는 실험에서 결과 무시 해야. 여기에 설명 된 프로토콜 작업 Zoppino 외.49, cytometry에 의해 인간의 acrosome 반응 평가 들에 의해 수행에 의해 영감을 했다. 그들은 더 실시간으로 형광 현미경 검사 법에 의해 PSA 막 퓨전 모 acrosome 반응의 유도 따라 나타날 때 acrosomal 구획을 입력 하는 방법을 설명 합니다. 한 번 acrosomal 구획 안에 PSA 나 막 신 하 고 오랜 시간에 대 한 안정적인 마크를 형성 한다. 고정 또는 permeabilization 프로토콜에 적용 되 고 따라서 결과의 해석 명확 하다: 가능한 정자 세포의 acrosomal 구획 안에 PSA가 acrosome 반응. 관해서는 캘리포니아2 +-acrosome 반응 분석 결과 수 또한 사용 평가 복용량 응답 곡선, 억제, 가산, 그리고 관심의 화합물의 성분 분석 결과, 신호. 미래에, 매체 처리량 acrosome 반응 분석 결과 사용 될 수도 관심의 화면 화합물에 acrosome 반응 인간의 정자 (예를 들어, 환경 화학 물질 또는 약물 후보)에 대 한 효과 대 한이 인간에 잠재적인 불리 한 영향을 검토 하 정자 세포 기능 또는 피임약으로 가능한 역할을 조사.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자 그의 실험실에서 그들의 체류 동안 아칸소 DLE의 감독을 위한 티 Strünker의 실험실을 인정 하 고 싶습니다. 또한, 우리는 부의 성장 및 재생산, 코펜하겐 대학 병원, Rigshospitalet 그들의 도움으로이 두 분석 실험 설정에 대 한 우리의 동료를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 혁신 기금 덴마크 (부여 번호 005-2010-3-14-2013-4)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm pore filter Thermo Fisher Scientific, USA 296-4545
1 L measuring cylinder Thermo Fisher Scientific, USA 3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes Eppendorf, Germany 30120086 and 0030120094
12-channel pipette Eppendorf, Germany 4861000813
384 multi-well plates Greiner Bio-One, Germany 781096
15 and 50 mL platic tubes Eppendorf, Germany 0030122151 and 30122178
A2-slide ChemoMetec, Denmark 942-0001
Automatic repeater pipette Eppendorf, Germany 4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) Sigma-Aldrich, Germany L0770
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific, USA F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342 ChemoMetec, Denmark 910-3015
Human serum albumin (HSA) Irvine Scientific 9988 For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer ChemoMetec, Denmark 970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI) ChemoMetec, Denmark 910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer ChemoMetec, Denmark 910-0101
SP1-cassette ChemoMetec, Denmark 941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

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References

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매체-처리량에 캘리포니아<sup>2 +</sup>효과의 평가 대 한 분석 실험을 심사-신호 및 인간의 정자에서 Acrosome 반응
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Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).More

Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).

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