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Biology

Rendimiento medio de selección de ensayos para la evaluación de efectos sobre la Ca2 +-señalización y reacción acrosómica en espermatozoides humanos

doi: 10.3791/59212 Published: March 1, 2019

Summary

Aquí, dos ensayos de rendimiento medio para la evaluación de efectos sobre la Ca2 +-reacción señalización y acrosómica en espermatozoides humanos se describen. Estos ensayos se pueden utilizar para rápidamente y fácilmente grandes cantidades de compuestos de efectos sobre la Ca2 +-reacción señalización y acrosómica en espermatozoides humanos.

Abstract

CA2 +-señalización es esencial para la función normal de la célula de la esperma y la fertilidad masculina. Del mismo modo, la reacción acrosómica es vital para la capacidad de un espermatozoide humano penetrar la zona pelúcida y fertilizar el óvulo. Por lo tanto es de gran interés para probar compuestos (por ejemplo, químicos ambientales o medicamentos) para su efecto sobre el Ca2 +-reacción señalización y acrosómica en espermatozoides humanos para examinar los posibles efectos adversos en función de las células de esperma humano o investigar un posible papel como un anticonceptivo. Aquí, se describen dos ensayos de mediano rendimiento: 1) un análisis basado en la fluorescencia para la evaluación de efectos sobre la Ca2 +-señalización en espermatozoides humanos y 2) un análisis de citometría de imagen para la evaluación de la reacción acrosómica en espermatozoides humanos. Estos ensayos pueden utilizarse para un gran número de compuestos de efectos sobre la Ca2 +de la pantalla-reacción señalización y acrosómica en espermatozoides humanos. Además, el análisis pueden ser utilizados para generar las curvas dosis-respuesta altamente específica de compuestos individuales, determinar la posible aditividad/sinergismo de dos o más compuestos y estudiar el modo farmacológico de acción mediante la inhibición competitiva experimentos con los inhibidores de CatSper.

Introduction

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El propósito de los dos ensayos descritos aquí es examinar los efectos sobre la Ca2 +-reacción señalización y acrosómica en espermatozoides humanos, como ha sido demostrado por múltiples compuestos en varias publicaciones que emplean estos ensayos de1,2, 3,4,5,6,7. CA2 +-señalización y la reacción del acrosoma son función de las células de esperma humano vital para normal y la fertilidad masculina.

El objetivo general de una célula de la esperma humana es fertilizar el óvulo. Para poder naturalmente y con éxito fertilizar el óvulo, las funciones de la célula de la esperma deben regularse bien durante el viaje de la célula de la esperma a través del tracto reproductor femenino8,9. Muchas de las funciones de la célula de la esperma son regulados por el Ca intracelular2 +-concentración [Ca2 +] (por ejemplo, esperma motilidad, quimiotaxis y acrosoma reacción)10. También, un proceso de maduración llamado capacitación, que hace el espermatozoide capaz de fecundar el óvulo, es regulada en parte por [Ca2 +]10. CA2 +-extrusión de Ca2 +-ATPase bombas11 mantener un doblez de aproximadamente 20.000 Ca2 +-gradiente sobre la membrana del espermatozoide humano, con un descanso [Ca2 +] de 50-100 nM. Si Ca2 + se permite cruzar la membrana celular (por ejemplo, mediante la apertura de Ca2 +-canales), se produce una considerable afluencia de Ca2 + , dando lugar a una elevación de la [Ca2 +]. Sin embargo, la célula de la esperma también lleva intracelular Ca2 +-tiendas, las cuales pueden liberar Ca2 + y, por lo tanto, también dan una elevación de la [Ca2 +]i12. Curiosamente, todas mediadas por canales Ca2 +-afluencia en espermatozoides humanos hasta ahora se ha encontrado para ocurrir a través de CatSper (Catcanal iónico de rm de Spe), que se expresa sólo en células de la esperma11. En las células de esperma humanas, CatSper es activado por los ligandos endógenos progesterona y prostaglandinas a través de distinta ligando vinculante sitios13,14,15, llevando a una rápida Ca2 +-afluencia en la célula de la esperma. Dos fuentes principales cerca de los huevos proporcionan altos niveles de estos ligandos endógenos. Uno es el líquido folicular que contiene altos niveles de progesterona16. Se libera el líquido folicular de folículos maduros junto con el óvulo en la ovulación y se mezcla con el líquido dentro de los oviductos17. La otra fuente principal es las células del cúmulo que rodean el huevo y liberan altos niveles de progesterona y prostaglandinas. La progesterona inducida por Ca2 +-afluencia en las células de esperma se ha demostrado para mediar la quimiotaxis hacia el huevo9,18, control de esperma motilidad19,20 y estimular el acrosoma reacción21. El accionar de estos individuales [Ca2 +]-funciones de esperma regulado en el orden correcto y en el momento correcto es crucial para la fertilización del huevo8. En consonancia con esto, un subóptimo inducida por la progesterona Ca2 +-afluencia se ha encontrado asociada con reducir la fertilidad masculina22,23,24,25,26 ,27,28,29 y funcional CatSper es esencial para la fertilidad masculina26,30,31,32, 33,34,35,36.

Como los espermatozoides alcanzar el óvulo, una secuencia de eventos debe ocurrir para que ocurra la fertilización: 1) los espermatozoides deben penetrar la capa circundante de células cumulus, 2) se unen a la zona pelúcida, 3) exocytose el contenido acrosómica, la reacción de acrosoma supuesto 37, 4) penetrar la zona pelúcida y 5) se fusionan con la membrana del huevo para completar la fertilización38. Para poder pasar por estos pasos y fertilizar el óvulo, la célula de la esperma primero debe someterse a capacitación11, que comienza cuando las células de esperma salir el fluido seminal contiene factores "decapacitating"39 y nadar en los fluidos de la mujer tracto reproductivo con altos niveles de bicarbonato y albúmina37. Capacitación hace que los espermatozoides capaces de someterse a hyperactivation, una forma de movilidad con una enérgica paliza de flagelo y reacción de acrosoma37. Ligerament la motilidad es necesaria para la penetración de la zona pelúcida40, y el acrosoma contiene diversas enzimas hidrolíticas que ayudan a este proceso de penetración41. Además, la reacción de acrosoma representa los espermatozoides capaces de fusionarse con el huevo mediante la exposición de proteínas de membrana específicas en la superficie de espermatozoides necesaria para la fusión de esperma huevo42. En consecuencia, la capacidad de experimentar la reacción hyperactivation y acrosoma son ambos necesarios para la fertilización exitosa de los huevos40,42. Contrario a lo que se ha visto para las células espermáticas de ratón43,44,45, sólo humanas células de esperma que son acrosoma intacto puede enlazar a la zona pelúcida46. Cuando las células de esperma humanas están limitadas a la zona pelúcida tienen que sufrir la reacción acrosómica para penetrar la zona pelúcida41 y exponer proteínas de membrana específicas que son necesarias para la fusión con el huevo38. El momento de la reacción acrosómica en espermatozoides humanos así es crítico para que ocurra la fertilización.

Como se describió anteriormente, Ca2 +-señalización es vital para espermatozoides normales la célula función8, y es, por tanto, de gran interés para poder a un gran número de pantalla compuestos por efectos sobre la Ca2 +-señalización en las células de esperma humanas. Del mismo modo, como único humanos espermatozoides que sufren la reacción acrosómica en el lugar y momento adecuado pueden penetrar la zona pelúcida y fertilizar el huevo46,47, también es de gran interés para poder probar los compuestos por su capacidad para afectan la reacción acrosómica en espermatozoides humanos. Para ello, se describen dos ensayos de cribado de mediano rendimiento: 1) un análisis de efectos sobre la Ca2 +-señalización en las células de esperma humanas y 2) un ensayo para determinar la capacidad de inducir la reacción acrosómica en espermatozoides humanos.

Ensayo 1 es a medio rendimiento Ca2 +-ensayo de señalización. Esta técnica basada en el lector de fluorescencia placa controla los cambios en la fluorescencia como una función de tiempo simultáneamente en varios pozos. El Ca2 +-colorante fluorescente sensible, Fluo-4 tiene una Kd de Ca2 +≈ 335 nM y es florescente de la célula en forma de éster de AM (acetoxymethyl). Utilizando Fluo-4, es posible medir los cambios en la [Ca2 +]i con el tiempo y después de la adición de compuestos de interés para los espermatozoides. El análisis fue desarrollado por el laboratorio de Timo Strünker en 201113 y desde entonces se ha utilizado en varios estudios a compuestos de la pantalla de efectos sobre la Ca2 +-señalización en espermatozoides humanos1,2,3, 4,5. También se ha utilizado un método similar para múltiples drogas candidatos48. Además, este ensayo también es útil para evaluar el modo farmacológico de acción1,2,3,4,5, las curvas de dosis-respuesta1, 2,3,4,5, inhibición competitiva1,2, aditividad1,2y3 de la sinergia de compuestos de interés.

2 el análisis es un análisis de la reacción acrosómica de mediano rendimiento. Esta técnica basada en la citometría de imagen mide la cantidad de viable acrosoma reaccionado espermatozoides en una muestra, usando tres colorantes fluorescentes: yoduro de propidio (PI), acoplado a FITC lectina Pisum sativum (PSA-FITC) y Hoechst 33342. El ensayo fue modificado de un método basado en la citometría de flujo similar por Zoppino et al49 y ha sido utilizado en varios estudios6,7. En cuanto a la Ca2 +-señalización ensayo, este análisis de la reacción de acrosoma también podrían usarse para evaluar las curvas dosis-respuesta, inhibición, aditividad y sinergia de los compuestos de interés.

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Protocol

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La recogida y análisis de muestras de semen humano en los protocolos sigue las directrices de la Comisión de ética de investigación de la región Capital de Dinamarca. Todas las muestras de semen se han obtenido después de consentimiento informado de los donantes voluntarios. Después de la entrega, las muestras fueron totalmente anonimizadas. Por sus molestias, cada donante recibió un honorario de 500 coronas danesas (unos 75 dólares) por muestra. Las muestras fueron analizadas en el día de la entrega y luego destruidas inmediatamente después de los experimentos de laboratorio.

Nota: El rendimiento medio Ca2 +-señalización ensayo se describe en los pasos 4-5 y el ensayo de reacción de acrosoma rendimiento medio en los pasos 6 y 7. El protocolo de preparación de medio líquido tubárico humano (HTF+) se describe en el paso 1 y la purificación de células de la esperma para los ensayos se describe en los pasos 2-3.

1. preparación de medio líquido tubárico humano (HTF+)

Nota: Uso de matraces aforados de tamaños adecuados, un 1 L medición de cilindros, un agitador magnético, sales como se indica en la tabla 1 y tabla 2, agua purificada, 0.2 μm de poro filtro y tubos de plástico de 50 mL.

  1. Preparar soluciones de sales en agua purificada (tabla 1).
    1. Agregar la cantidad de sal que se enumeran en la tabla 1 a un matraz aforado del tamaño adecuado, agregar agua purificada a un poco más abajo el volumen deseado y mezclar con un agitador magnético.
    2. Cuando la sal se haya disuelto completamente, retire el imán y llenado con agua purificada hasta el volumen final deseado.
  2. Transferir la solución a una botella y almacenar hasta su uso.
    Nota: Soluciones pueden ser guardadas y reutilizadas por largos períodos de tiempo: glucosa y HEPES a-20 ° C y las otra soluciones a temperatura ambiente (RT).
  3. Preparar 1 L de medio HTF+ de las soluciones madre (cuadro 2).
    1. Asegúrese de que todas las soluciones stock son completamente disueltos y bien mezcladas antes de usar.
    2. La cantidad de solución madre y listados en la tabla 2 a un 1 L cilindro de medición de sal y añadir agua purificada a 900 mL.
    3. Mezclar con un agitador magnético y ajuste el pH a 7.35 con solución de NaOH.
    4. Retirar el imán y añadir agua purificada a 1.000 mL.
  4. Filtrado estéril el medio HTF+ a través de un filtro de poro μm 0,2, alícuota medio HTF+ de tubos de plástico de 50 mL y almacenar a 4 ° C hasta su uso.
  5. Justo antes de ejecutar un experimento, añadir 165 μl de Na-piruvato a la alícuota de 50 mL para obtener una concentración final de Na-piruvato de 0,33 milímetros.
    Nota: Medio fluido tubárico humano también puede obtenerse de varios proveedores comerciales. Cuando se utiliza el medio de 4 mM HCO3 , muestras pueden ser incubadas con las tapas cerradas en una incubadora sin extra de CO2 en el aire sin grandes derivas en el pH. Si se dispone de una incubadora de CO2 , la correspondiente cantidad de CO2 puede calcularse utilizando la ecuación de Henderson-Hasselbalch y utilizado. Si se usa medio 25 mM HCO3 , las muestras deben ser incubadas con las tapas abiertas en un incubador de CO2 con el aire que contiene una cantidad correspondiente de CO2 (depende de la presión atmosférica, normalmente entre 5-10%) para evitar una deriva en el pH. La cantidad exacta de CO2 puede calcularse utilizando la ecuación de Henderson-Hasselbalch.

2. purificación de los espermatozoides móviles mediante Swim-up (Figura 1)

Nota: Utilice un recipiente limpio de boca ancha de plástico para la muestra de semen, una incubadora, tubos de plástico de 50 mL, un rack para colocar tubos de plástico de 50 mL en un ángulo de 45°, medio HTF+ (preparado en paso 1 u Obtenido de proveedor comercial), una centrifugadora y suero humano albúmina (HSA).

  1. Obtener una muestra de semen humano recién donado producido a través de masturbación y eyacular en un recipiente plástico de boca ancha. Utilice sólo las muestras de semen que cumplen con los parámetros establecidos por el manual de laboratorio de OMS para el examen y procesamiento de semen humano.
  2. Incubar la muestra a 37 ° C durante 15-30 minutos permitir que para licuar.
  3. Calentar 50 mL de medio HTF+ con 4 mM HCO3 a 37 ° C.
  4. Lugar limpio 50 mL tubos de plástico en un rack en un ángulo de 45° (para aumentar la superficie entre los líquidos). Utilizar 1 tubo mL de semen crudo.
  5. Añadir 4 mL de medio HTF+ precalentado a cada uno de los tubos.
  6. Cuidadosamente pipetee 1 mL de la muestra de semen licuado a la parte inferior de cada tubo que contiene 4 mL de HTF precalentado+. Evitar la liberación de burbujas de aire.
  7. Cerrar las tapas e incubar los tubos a 37 ° C durante 1 hora.
  8. Suavemente Aspire y transferir gran parte de la fracción superior (HTF+ con células motile de la esperma) como sea posible a un nuevo tubo de plástico de 15 mL, prestando atención que no hay nada de la fracción de la parte inferior (semen con células inmóviles y muertas) incluido. Generalmente, es seguro transferir 3,5 mL de la fracción superior, sin alterar la fracción de la parte inferior. Para evitar turbulencias de succión, corte el exterior 1-2 mm de la punta en un ángulo de 45° para obtener una abertura más grande.
  9. Llenar el tubo de plástico de 15 mL con HTF+ para lavar las células y centrifugue el tubo de 700 x g durante 10 min a TA.
  10. Suavemente aspirar y eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado de la célula de la esperma en 2 mL de HTF+.
  11. Transferir 20 μl de la suspensión de esperma a dos pequeños tubos de plástico para la evaluación de la concentración espermática (ver paso 3).
  12. Llenar el tubo de plástico de 15 mL con HTF+ para lavar las células y centrifugue el tubo de 700 x g durante 10 min a TA.
  13. Suavemente aspirar y eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado de la célula de la esperma a 10 x 106 células/mL (basado en la concentración de células en paso 2.11).
    1. Para los experimentos utilizando espermatozoides no capacitados (rutina Ca2 +-ensayo de señalización)
      1. Resuspender las células en HTF+ con 4 mM HCO3.
      2. Añadir 30 μl de albúmina sérica humana (HSA) (100 mg/mL) por mL HTF+ para obtener una concentración final de 3 mg/mL.
      3. Cerrar las tapas e incube durante ≥1 h a 37 ° C.
    2. Para experimentos con capacitación espermatozoides (análisis de la reacción acrosómica)
      1. Resuspender las células en HTF+ con 25 mM HCO3.
      2. Añadir 30 μl de HSA (100 mg/mL) por mL HTF+ para obtener una concentración final de 3 mg/mL.
      3. Fije sin apretar las tapas e incube por ≥ 3 horas a 37 ° C con la correspondiente cantidad de CO2 (consulte el paso 1, generalmente entre 5-10% CO2).

3. recuento de células de la esperma

Nota: Células de la esperma puede o bien contar manualmente50 o usando un citómetro imagen51, como se describe aquí. Uso de un citómetro de imagen, un Vortex, S100 búfer, una cinta de SP1, swim-up purificado espermatozoides (preparados en el paso 2).

  1. Diluir una alícuota a un factor de 10, 20, 30, 50 o 90 en S100 buffer utilizando un tubo de 2 mL de fondo redondo según la concentración esperada (evaluado por inspección manual de la pelotilla en paso 2.10) de 20 μl. Espera que el uso de la dilución más cercano a la concentración (es decir, si una concentración de 15 x 106 espermatozoides / mL después de swim-up se espera entonces diluir la muestra de esperma μl 20 con 380 μl de tampón de S100 [factor de dilución 20]).
  2. Mezclar bien durante 10 s con un mezclador de vórtice a la máxima 700 rpm, sumerja el cartucho de SP1 en la muestra y empuje el émbolo blanco completamente hasta aspira una alícuota de la muestra en el cassette.
  3. Abra la citometría de imagen, coloque la cinta en la bandeja y ejecute el ensayo de Recuento de PI manchada humana espermatozoides ensayo según el factor de dilución aplicado (elegido en el paso 3.1).
  4. Repita el paso 3.1-3.3 con otra 20 μl de muestra, utilizando un factor de dilución más cercano a la concentración medida de lo primero 20 μl de muestra.
  5. Calcular la concentración media célula de la esperma de las dos medidas.
  6. Significa multiplicar la esperma concentración celular con el volumen original para obtener el conteo de esperma total (en el paso 2, este volumen es de 2 mL).

4. medición de los cambios en el Ca intracelular libre2 +-concentración ([Ca2 +]i) usando Ca2 +- fluorimetría (Figura 2)

Nota: Usar un lector de placa de fluorescencia, 384 placas de varios pocillos, Fluo-4 AM, alberca espermatozoides purificadas (preparado en el paso 2), compuestos de interés como controles positivo y negativo, una pipeta repetidora automática y una pipeta 12 canales.

  1. Preparar una Fluo-4 de 2 mM stock AM añadiendo 22,7 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) a un vial de 50 μg Fluo-4 AM y mezcle bien el tubo.
  2. Añadir una alícuota de la suspensión de espermatozoides recuperados de alberca de 700 μl (paso 2 de la capacitados o no capacitado como se describe en) a un nuevo tubo de ensayo. 700 μl de la muestra de esperma es la cantidad necesaria para analizar una fila de 24 pozos en la placa de 384 pocillos (usado para probar 3 controles y 9 compuestos de Dobletes).
  3. Añadir 3,5 μl de Fluo-4 solución AM a los 700 μl de suspensión de esperma para obtener una concentración final de 10 μm Fluo-4 AM.
  4. Incubar la muestra durante 45 min a 37 ° C, protegido de la luz.
  5. Centrifugar la muestra a 700 x g durante 10 minutos, aspirar y desechar el sobrenadante para quitar exceso de Fluo-4.
  6. Resuspender el precipitado manchada en HTF+ a 5 x 106 células/mL (es decir,, uso 2 x el volumen de la suspensión celular en el paso 4.2)
  7. Preparar diluciones de los compuestos y los controles (se puede hacer durante los períodos de incubación y centrifugación en paso 4.4 y 4.5, respectivamente).
    1. Diluir los compuestos, así como un control negativo (solución tampón con vehículo) y un control positivo (progesterona) en HTF+. Diluir compuestos y controles a 3 x la concentración final deseada, pues son diluido 1:3 cuando se agregan a las células de esperma en el paso 4.16.
    2. Colocar los tubos con las diluciones en un rack con una distancia entre tubos corresponde a la distancia entre las puntas de la pipeta de la pipeta de 12 canales usado en paso 4.16.
  8. Utilice una pipeta repetidora automática (24 pasos de 50 μL).
    1. Muestra de semen manchado de mezcla Fluo-4 suavemente transfiriendo la cantidad entera hacia arriba y hacia abajo una vez.
    2. Añadir alícuotas de 50 μl a los 24 pozos de una fila en la placa de 384 pocillos.
  9. Colocar la placa de pocillos en un lector de fluorescencia a 30 ° C y cerrar el cajón.
  10. Seleccionar el protocolo apropiado para Fluo-4. Excitar la fluorescencia en 480 nm y emisión récord a 520 nm. Utilizar el tiempo de ciclo más rápido posible con el entorno.
    Nota: Utilizar al menos 10 destellos por óptica bien y la parte inferior, si es posible.
  11. Seleccione un pozo en la fila y ajustar la ganancia a un valor del objetivo del 20%.
  12. Iniciar la medición.
  13. La línea de base durante los primeros 5 ciclos de control.
    1. Si la lectura fluorescente está aumentando o disminuyendo con el tiempo, parar el experimento, vuelva a ajustar la ganancia y comenzar nuevamente el experimento.
    2. Si la línea de base difiere mucho entre pocillos individuales en una fila, pipetear en el paso 4.8 ha sido unprecise o la muestra no se mezcla bien antes de pipetear. Deseche el experimento.
    3. Si la lectura fluorescente es comparable entre los pocillos en la fila y constante durante los 5 primeros ciclos, continúe al siguiente paso.
  14. Después de 10 ciclos (utilizados para la línea de base), hacer una pausa en el experimento.
  15. Extraiga el cajón con la placa de micropocillos.
  16. Utilizando una pipeta de 12 canales (2 pasos de 25 μl), rápidamente añadir 25 μl de las soluciones preparadas de compuestos y los controles (de paso 4.7) los duplicados bien 12 (24 pozos) de una fila. Soluciones será diluido 1:3, ya que los pozos ya contienen 50 μl de la muestra de semen manchado.
  17. Continuar la medición tan pronto como sea posible (cajón cerrará automáticamente) para evitar faltar cualquier señal fluorescente inducida por los compuestos agregados y controles. Cambios en la fluorescencia (ΔF) después de la adición de compuestos y controles ahora será capturada.
  18. Ejecutar el experimento hasta que se han registrado señales fluorescentes de control positivo y los compuestos de interés.
  19. Detener el experimento y exportar los datos crudos de la fluorescencia para analizar como en el paso 5.
    Nota: AM general Fluo-4 se ha utilizado como el Ca2 +-fluoróforo sensible en el ensayo, pero otros Ca2 +-fluoróforos sensibles también podrían ser utilizado si espectros de emisión y excitación entra con filtros en el lector de la placa de fluorescencia. Dependiendo de la elección del fluoróforo, asegúrese de que el nivel de ganancia se establece a un nivel "seguro" donde están los picos fluorescentes inducidos dentro de la gama de medición del instrumento. Esto se puede probar agregando ionomycin a un único pozo en un ajuste de ganancia específica. Si este inducido por una señal fluorescente por encima del umbral, bajar la ganancia e inténtelo de nuevo. Algunos utilizan Pluronic F-127 para facilitar la carga de Fluo-41,13, pero se ha encontrado que no es necesario2. El número máximo de filas medido simultáneamente depende de dos factores. 1) el tiempo de ciclo del instrumento: Si el tiempo de ciclo es demasiado largo, podrían perderse [Ca2 +] inducidos picos. Medir un máximo de dos filas simultáneamente para mantener el tiempo de ciclo bajo; 2) la velocidad de pipetear en el paso 4.16: usando la pipeta 12 canales, es posible agregar rápidamente 12 diferentes soluciones a los 12 pocillos duplicados (24 pozos) de 1 o 2 filas (por ejemplo, una fila previamente incubados con el vehículo y una fila incubados previamente con un inhibidor de) , sin faltar el Ca2 + picos inducidos. Sin embargo, no se recomienda para tratar de añadir 24 diferentes soluciones a dos filas para la medición simultánea, como consejos de pipeteo debe ser reemplazado entre los dos pasos pipeteo secuenciales, por el que podrían perderse inducida Ca2 + picos.

5. Análisis de datos de Ca2 +- fluorimetría

  1. Abra los datos crudos de la fluorescencia obtenida y exportado en el paso 4.
  2. Calcular el promedio de los pocillos duplicados. Si existen grandes diferencias entre duplicados, descartar datos de los pozos específicos.
  3. Definir línea de base como los 10 primeros ciclos.
  4. Calcular ΔF/F0 (%) como el porcentaje de cambio en fluorescencia (ΔF) con el tiempo después de la adición de compuestos y los controles con respecto a la fluorescencia basal media (F0) durante los 10 primeros ciclos (línea de base).
  5. Si utiliza los datos para la generación de curvas de dosis-respuesta, restar la lectura de control negativo de los otros pozos para eliminar artefactos de pipeteo.

6. medición de la reacción acrosómica

Nota: Uso de un citómetro de imagen, una incubadora, tintes fluorescentes: PI, FITC-PSA y Hoechst 33342, compuestos de interés, así como controles positivos y negativos, una inmovilización solución 0,6 M NaHCO3 y formaldehído de 0,37% (v/v) en agua destilada, un tobogán de A2 y capacitados alberca purificadas espermatozoides (preparados en el paso 2).

  1. Preparar una solución de tinción con PI (5 μg/mL), FITC-PSA (50 μg/mL) y Hoechst 33342 (100 μg/mL) en HTF+, mezclarlo bien con un mezclador de vórtice y proteger de la luz hasta su uso.
  2. Preparar soluciones de compuestos y los controles en 10 veces la concentración final deseada, pues son diluido 1:10 en el paso 6.5. Incluir siempre un control negativo (vehículo) y dos controles positivos: concentración final de progesterona 10 μm y concentración final de ionomycin 2 μm.
  3. Transferir alícuotas de 240 μl de espermatozoides capacitados (preparado en el paso 2) para tubos de plástico.
  4. Añadir 30 μl de la solución en cada tubo de coloración. Concentración final de manchas será: 0,5 μg/mL PI, FITC-PSA de 5 μg/mL y 10 μg/mL Hoechst 33342.
  5. Añadir 30 μl de soluciones con compuestos o controles a cada tubo (1:10 dilución).
  6. Mezclar suavemente las muestras mediante pipeteo arriba y abajo unas cuantas veces o Vortex suave. Debido a la tensión mecánica, evitar la excesiva mezcla.
  7. Incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
  8. Prepare nuevos tubos de plástico con 100 μl de una solución de inmovilización que contiene 0,6 M NaHCO3 y formaldehído de 0,37% (v/v) en agua destilada, uno por cada tubo de ensayo.
  9. Después de la incubación, las muestras de la mezcla bien por pipeteo y añadir 50 μl de la muestra a un tubo con 100 μl de solución de inmovilización.
  10. Antes de colocar las cámaras de una diapositiva de A2, mezcle la muestra bien por pipeteo. Se llenan las cámaras cuidadosamente aproximadamente 30 μL sin crear burbujas de aire.
    Nota: Durante la incubación, los espermatozoides móviles tienden a agregar. Agregados de células pueden perturbar las mediciones (aunque quedan excluidos). Por lo tanto, una mezcla cuidadosa mediante pipeteo después de la incubación es muy importante. Además, las burbujas de aire en las cámaras pueden alterar las mediciones. Por lo tanto, llene la cámara lentamente y cambiar el ángulo de la pipeta, si los bordes del líquido están a punto de reunirse y crear una burbuja de aire.
  11. Colocar el portaobjetos cargado en la bandeja de la citometría de imagen y cerrar la bandeja.
  12. Seleccione el protocolo de FlexiCyte y pulse ejecutar.
    1. Seleccione los siguientes ajustes para el protocolo FlexiCyte: número de canales analíticos: 2; Canal de enmascaramiento: Ultravioleta (LED365), este es el canal utilizado para la segmentación de la imagen; Canal 1: Azul (LED475), tiempo de exposición 3.000 ms, filtro de emisión 560/35; Canal 2: Verde (LED530), la exposición tiempo de 500 ms, filtro de emisión de 675/75; Número mínimo de células analizadas: 5000; Excluir las células agregadas: sí.
  13. Repita el paso 6.9-6.12 hasta que todas las muestras han sido medidas.

7. Análisis de datos de citometría de imagen

  1. Datos obtenidos en el paso 6.
  2. Crear las siguientes dos parcelas para evaluar las mediciones.
    1. Crear un diagrama de dispersión de Hoechst 33342 intensidad vs área de Hoechst 33342 a escalas biexponential. Este terreno puede ser utilizado para puerta Hoechst 33342 objetos positivos que son demasiado pequeños o demasiado grandes para ser células de esperma humanas.
    2. Crear un diagrama de dispersión de intensidad FITC-PSA y la intensidad de la PI en las escalas de biexponential. Este terreno puede ser utilizado para evaluar la cantidad de acrosoma reaccionado espermatozoides por medio de una puerta de cuadrante que separa los cuatro grupos en la parcela (figura 3): 1) un grupo positivo de FITC-PSA y PI positivo: acrosoma reaccionado espermatozoides no viables; 2) un grupo positivo de FITC-PSA y PI negativo: acrosoma reaccionado espermatozoides viables; 3) un positivo de PI y FITC-PSA negativo Grupo: acrosoma intacto no viables las células espermáticas; y 4) a negativa de PI y FITC-PSA negativo Grupo: acrosoma intactos espermatozoides viables.

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Representative Results

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Representante de los resultados de un experimento que prueba el efecto de 4 compuestos (A, B, C y D) con un positivo (progesterona) y un control negativo (tampón) de [Ca2 +]i en espermatozoides humanos con rendimiento medio Ca2 +-señalización Análisis puede verse en la figura 4a. En la Figura 4b, se muestra una curva de respuesta de dosis de progesterona, que se deriva de pico ΔF/F0 (%) inducida por las concentraciones diluidas en serie de la progesterona, de datos probada en otro experimento con rendimiento medio Ca2 +-ensayo de señalización. El análisis de los datos de la Ca2 +-señalización análisis se explica en el paso 5. Resultados representativos de un experimento que prueba la inducción de la reacción acrosómica en espermatozoides humanos capacitados utilizando un control negativo (DMSO) o los dos controles positivos (progesterona y ionomycin) en la reacción acrosómica de rendimiento medio ensayo puede verse en el panel superior de la figura 3. Se observan parcelas de dispersión cerrada de cuadrante de las condiciones de prueba de 3. El análisis de los datos de la reacción acrosómica se explica en el paso 7.

Tabla 1: soluciones para la preparación de HTF de Stock + . Soluciones pueden ser mantenidas y reutilizadas por períodos más largos de tiempo, la glucosa y HEPES a-20 ° C y las otra soluciones a temperatura ambiente. Asegúrese de que todas las soluciones son completamente disueltos y bien mezcladas antes de usar.

Tabla 2: preparación de HTF + con 4 o 25 mM HCO 3 - de soluciones de sales (preparados en la tabla 1). Lactato de na puede ser agregado como jarabe, 60% (w/w), o en polvo. NaHCO3 se agrega en polvo.

Figure 1
Figura 1: purificación de Swim-up de los móviles espermatozoides humanos. Izquierda: Tubo con medio HTF+ y una alícuota de la muestra de semen licuado pipetea a continuación el medio HTF+ . Derecha: Después de 1 h de swim-up a 37 ° C, células motile de la esperma han nadado para arriba en el medio HTF+ . Fijos y espermatozoides muertos así como células de la esperma siguen en el semen por debajo del medio HTF+ . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Diagrama de rendimiento medio Ca2 +-ensayo de señalización. (a) espermatozoides se cargan con un Ca2 +-fluoróforo sensible, lavado y alícuotas se platean en los pocillos de una placa de 384 pozos. placa de 384 pozos (b) se coloca en un lector de placa de fluorescencia a 30 ° C. (c) de la fluorescencia es registrado antes y después de la adición de compuestos, control positivo (progesterona) y control negativo (solución tampón con vehículo). Lecturas en ΔF/F0 (%) después de la adición (flechas) del control negativo y positivo se ilustran en la parte inferior de la letrac. Ilustración con el permiso de Christian Schiffer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: evaluación de la reacción acrosómica mediante citometría de imagen. (Panel superior) Dispersión de cuadrante terreno parcelas de un control negativo de vehículo (DMSO) y la progesterona controles positivos (Prog, 10 μm) y ionomycin (Iono, 2 μm). Un incremento en las células en el cuadrante inferior derecho (acrosoma reaccionado células viables) se ve al comparar los controles positivos para el control de DMSO. (Panel inferior) Imágenes microscopio fluorescencia marcadas de células de esperma, incluyendo las células de todos los grupos de cuatro. BF = campo claro, Hoechst = Hoechst-33342, PSA = Pisum Sativum aglutinina, PI = yoduro de propidio. Barra de escala = 10 μm. Esta figura ha sido modificada de Egeberg Palme et al 20187. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Ejemplo de datos de Ca2 +- fluorimetría. (a) cambios en la [Ca2 +] inducido por control negativo, progesterona y compuestos A, B, C y D. (b) curva de respuesta a la dosis de progesterona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El rendimiento medio Ca2 + señalización de ensayo se basa en las mediciones de fluorescencia de solo micropocillos que contiene unos 250.000 células de la esperma. La señal capturada es un promedio de todas las células individuales de la esperma en el pozo. El ensayo proporciona así que ninguna información espacial acerca de dónde específicamente en la célula de la esperma [Ca2 +] es cambiada, en gran proporción de las células de esperma un cambio en la [Ca2 +]i lleva a cabo, o como heterogénea es la respuesta entre las células individuales. Para obtener dicha información, experimentos con la resolución de la célula (por ejemplo, como se describe en50,52) deben ser empleados. Otro inconveniente de la técnica es la resolución temporal, que es del orden de segundos. A pesar de las muestras de esperma 50 μl bien mezcladas cuando 25 μl de las soluciones se agregan, las mediciones primero se pueden iniciar después de que el cajón con la placa multi-bien es dentro del lector de fluorescencia. Para obtener una resolución temporal más alta, se deben emplear otras técnicas (por ejemplo, un flujo detenido fluorimetría13,50). La ventaja de rendimiento medio Ca2 +-señalización de ensayo, en comparación con métodos unicelular o bien solo es que permite la medida simultánea de múltiples pocillos usando un lector de microplacas para la prueba rápida y fácil múltiples side-by-side con controles positivos y negativos de los compuestos (Figura 4)1,2, la fácil generación de curvas de dosis-respuesta de compuestos individuales (figura 4)1,2,3 , 4 , 5, evaluación de aditividad1,2 y sinergias3 para dos o más compuestos, así como estudios de modo de acción de los experimentos de inhibición competitiva aunque compuestos y el uso de específicas inhibidores farmacológicos (p. ej., CatSper inhibidores1,2,3,4,5). Además, cambiando el fluoróforo, el ensayo puede ser empleado para examinar otros cambios intracelulares (por ejemplo, pHi1,2). Por último, puede utilizarse a la vez más de un fluoróforo para medir simultáneamente múltiples cambios intracelulares. En el futuro, el rendimiento medio Ca2 +-ensayo podría utilizarse para compuestos de pantalla de interés para efectos sobre la Ca2 +de señalización-señalización en espermatozoides humanos (p. ej., productos químicos ambientales o medicamentos) examinar el potencial adverso efectos sobre la función de las células de esperma humano o para investigar un posible papel como un anticonceptivo.

El análisis de la reacción acrosómica de mediano rendimiento está basado en la citometría de imagen, que constituye un atractivo sustituto para evaluar la reacción de acrosoma humana en comparación con la evaluación manual usando un microscopio de fluorescencia. Patrones de tinción de acrosomes intactos o reaccionar/reaccionó no siempre son claros, y una gran variación intra individual puede ser la consecuencia presente. Con citometría de imagen, imágenes son adquiridas y analizadas automáticamente. El canal de enmascarar, en este caso Hoechst-33342, define a las células y sólo fluorescente las señales de estas áreas específicas están incluidas en el análisis de datos. Por lo tanto, la coloración de los cuerpos anucleados que contienen citoplasma residual no está incluida en el análisis de datos. Además, contar estadísticas es superior a la microscopía de fluorescencia. Para contar 200 células a través de los oculares del microscopio es una tarea difícil y desperdiciador de tiempo pero con citometría de imagen el análisis de al menos 5.000 células lleva menos de unos minutos. Sin embargo, debido a la baja magnificación de la citometría de imagen, se pierde la capacidad de evaluar las mediciones y uno tendrá que traer la muestra teñida en el microscopio de fluorescencia. Por lo tanto, la inclusión de controles es de extrema importancia para validar las medidas. Si los controles no reaccionó como se esperaba, los resultados de un experimento deben ser desechados. El protocolo descrito aquí fue inspirado por el trabajo realizado por Zoppino et al49, que evaluó la reacción acrosómica humana mediante citometría de flujo. Otros describieron por microscopía de fluorescencia en tiempo real cómo PSA entra el compartimiento acrosómica cuando los poros de la membrana de fusión por inducción de la reacción acrosómica. Una vez dentro del compartimiento acrosómica, PSA zuecos y forma una marca estable por largos períodos de tiempo. Ninguna fijación o permeabilización se aplica en el protocolo y por lo tanto la interpretación del resultado es evidente: PSA dentro del compartimiento acrosómica de un espermatozoide viable es igual a la reacción acrosómica. En cuanto a la Ca2 +-señalización de ensayo, el análisis de la reacción de acrosoma también podría utilizarse para evaluar las curvas dosis-respuesta, inhibición, aditividad y sinergia de los compuestos de interés. En el futuro, el análisis de la reacción acrosómica de mediano rendimiento podría también usarse para compuestos pantalla de interés para efectos en el esperma humano de la reacción de acrosoma (p. ej., productos químicos ambientales o medicamentos) para examinar los posibles efectos adversos en este humano función de la célula de la esperma o para investigar un posible papel como un anticonceptivo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer el laboratorio del Timo Strünker de control de AR y DLE durante sus estadías en su laboratorio. Además, nos gustaría agradecer a nuestros colegas en el Departamento de crecimiento y reproducción, Hospital de la Universidad de Copenhague, Rigshospitalet por su ayuda con la configuración de estos dos ensayos. Este trabajo fue financiado por donaciones desde el fondo de innovación de Dinamarca (números de concesión 005-2010-3 y 14-2013-4).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm pore filter Thermo Fisher Scientific, USA 296-4545
1 L measuring cylinder Thermo Fisher Scientific, USA 3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes Eppendorf, Germany 30120086 and 0030120094
12-channel pipette Eppendorf, Germany 4861000813
384 multi-well plates Greiner Bio-One, Germany 781096
15 and 50 mL platic tubes Eppendorf, Germany 0030122151 and 30122178
A2-slide ChemoMetec, Denmark 942-0001
Automatic repeater pipette Eppendorf, Germany 4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) Sigma-Aldrich, Germany L0770
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific, USA F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342 ChemoMetec, Denmark 910-3015
Human serum albumin (HSA) Irvine Scientific 9988 For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer ChemoMetec, Denmark 970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI) ChemoMetec, Denmark 910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer ChemoMetec, Denmark 910-0101
SP1-cassette ChemoMetec, Denmark 941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

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References

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Rendimiento medio de selección de ensayos para la evaluación de efectos sobre la Ca<sup>2 +</sup>-señalización y reacción acrosómica en espermatozoides humanos
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Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).More

Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).

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