Summary
Wir präsentieren eine einfache zytogenetische Technik mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) zu bestimmen, die Befruchtungsrate und primäre Geschlechtverhältnis der diploide invasive Schädling Tabak Tabaci.
Abstract
Einige Arten von saugenden weiße fliegen sind einige der weltweit schädlichsten terrestrischen Schädlinge wegen der Ernte Schaden, den sie anrichten und Pflanzenviren sie Vektor. Trotz zahlreichen Studien über die Biologie dieser Arten in verschiedenen Umgebungen einem wichtigen Lebensgeschichte Parameter, Nachkommen Geschlechtverhältnisse, wenig Aufmerksamkeit erhalten hat, noch ist wichtig für die Vorhersage der Populationsdynamik. Die primäre Geschlechterverhältnis (Geschlechterverhältnis bei der Eiablage) Tabak Tabaci wurde nie berichtet aber kann durch die Bestimmung der Ei Befruchtungsrate dieses Insekts diploide gefunden werden. Bei dieser Technik wird die Dechorionation von Eiern mit Bleichmittel, eine Reihe von Schritten Fixierung und die Anwendung der allgemeinen DNA fluoreszierende Fleck, DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, eine DNA-Bindung Fluoreszenzfarbstoff) an weiblichen und männlichen Vorkerne binden. Hier stellen wir die Technik und ein Beispiel für die Anwendung zu testen, ob ein endosymbiontische Bakterium Rickettsia SP. nr. Bellii, beeinflusst das primäre Geschlechtverhältnis von B. Tabaci. Diese Methode kann helfen, in Bevölkerungsstudien der weiße fliegen oder bei der Bestimmung, wenn Geschlecht Zuweisung mit bestimmte Reize aus der Umwelt vorhanden ist.
Introduction
Das Studium der Geschlecht-Zuweisung oder die relative Investition in männlichen und weiblichen Nachkommen, ist ein Eckpfeiler der Verhaltensökologie1,2,3. Neben seiner Kraft zu Testzwecken adaptive Modelle des Verhaltens kann zu wissen, die Sex-Allocation-Strategie eines Organismus Modelle der Populationsdynamik verbessern. Bei vielen Arten ist Sex Zuordnung von Müttern gesteuert. Um Sex-Zuweisung zu bestimmen, ist es wichtig zu bestimmen, der primäre Sex-Verhältnis oder der Anteil der Frauen bei der Eiablage. Obwohl das Geschlechterverhältnis bei Erwachsenen auftreten können Hinweise auf Geschlecht-Zuweisung vorsehen, kann differentielle Entwicklungsstörungen Mortalität zwischen männlichen und weiblichen Jugendlichen Erwachsenen Sex-Verhältnis häufig erheblich verzerren. Bei einigen Arten der Hautflügler, die Ordnung der Insekten, die Ameisen, Bienen und Wespen, enthält wurde das primäre Geschlechtverhältnis zytogenetische Tests, Färbung der Embryonen genetische DNA anzeigen ermittelt. Weil Hautflügler diploide, eine beginnende männlichen Ei ist haploid und enthält nur die weiblichen Vorkern (n), während beginnende weibliche Eier diploid sind und sowohl männliche als auch weibliche Vorkerne (2n enthalten). Obwohl Aleyrodidae, die Sap-Fütterung Familie True Wanzen (Hemiptera) bekannt als weiße fliegen, auch diploide, hat nicht stattgefunden ein etablierte Assay, der primäre Sex-Verhältnis in dieser Insekten zu finden. Dies ist vielleicht überraschend, da die Intensität der Studie über die paar kosmopolitischen ernsthafte Schädlinge in dieser Familie und die Bedeutung der Geschlechtverhältnisse in wettbewerbsfähige Interaktionen weiße fliegen4,5,6,7 ,8,9,10 und Populationsdynamik im Allgemeinen. In diploide Insekten sind auch Geschlechtverhältnisse ungezwungen Sex Bestimmung Systeme, die Möglichkeit der selektiven Düngung und labile Geschlechtverhältnisse, die mit der Umwelt2variieren. Hier präsentieren wir eine Technik, um festzustellen, das primäre Geschlechtverhältnis des Komplexes Arten der weiße fliegen, zusammen bekannt als die Süßkartoffel Mottenschildläuse, B. Tabaci. Dieser ein Artname umfasst mehr als 28 Arten weltweit11und beinhaltet einige der schädlichsten global invasive Schädlinge12,13. Die Anwendung dieser Technik bestimmen Geschlecht Zuordnungsmuster in B. Tabaci und andere Aleyrodidae ermöglicht eine gründlichere Untersuchung von Variablen, einschließlich Temperatur, Wirtspflanze, endosymbiontische Bakterien oder Pflanzen/Mottenschildläuse Krankheitserreger, die primäre Geschlechtverhältnisse Pflanzensaft und Mottenschildläuse Populationsdynamik beeinflussen können.
Wir sind keine vergleichbaren Ei-beflecken Techniken für B. Tabacinicht bewusst. Das Protokoll ist bequem im Vergleich zu Färbung Methoden für andere Insekteneier14 verwendet, da es einen Übernachtung Fixierung Schritt unterlässt und daher innerhalb von 3 Stunden abgeschlossen werden kann. Als ein Beispiel für eine Anwendung, ein endosymbiontische Bakterium, Rickettsien SP. nr. Bellii, ist verbunden mit weiblicher Neigung in unserem Labor Zeilen von B. Tabaci Nahost-Asia Minor 1 (MEAM1)15,16. In B. Tabaci MEAM1 Labor einzeilig ("MAC1," von der Maricopa Agricultural Center gesammelt), wir testen ob Rickettsia-infizierten (R+) Weibchen befruchten mehr Eier als nicht infizierte Frauen (R–).
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Protocol
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Arbeiten bei Raumtemperatur in einem gut belüfteten Raum oder unter einem Abzug durchgeführt wird. Alle "Tropfen" in diesem Protokoll sind definiert als 5 – 20 µL, je nach Vorliebe des Betreibers.
1. Ersteinrichtung
- Weibliche weiße fliegen, auf saubere Blätter oviposit zu ermöglichen. Beispiele für die Eiablage Arenen Clip Käfige oder Blätter geschnitten, um auf Agar in einer Petrischale. Machen Sie ein abdeckbar Loch in der Clip-Käfig oder Petrischale Cover einfügen und entfernen die Erwachsenen. Alternativ ein Gefäß der gesammelten Erwachsene schnell auf Eis gelegt und dann auf dem Blatt zu hinterlegen. Begrenzen Sie die Zeit zwischen Eiablage und Ei Fixierung auf nicht mehr als 60 min, um die Beobachtung von den Spermien Übergang in die väterliche Vorkern in Eiern zu gewährleisten.
Hinweis: Eier, die nicht aus dem Blatt entfernt können bis zum Erwachsenenalter Erwachsenen Geschlechtverhältnisse aufzeichnen aufgezogen werden. - Bereiten Sie vor oder bei der Eiablage Pflanzensaft einen Objektträger durch Reinigung mit Seife und Wasser, trocknen es gut, und dann ein Stück Paraffin Film über ein Ende, dafür, dass die Filmoberfläche Paraffin nicht bricht (Abbildung 1).
Hinweis: Paraffin-Film ist hydrophob und halbdeckend, fällt und Eier leichter abzuwarten, so dass Flüssigkeiten zu bilden.
(2) Dechorionation
- Mit einem Glas Pasteur pipette, Tropfen von Bleichmittel-Lösung (0,83 % Natriumhypochlorit) auf der Paraffin-Film.
Hinweis: Es ist einfacher zu behalten Eier wenn nur 2 – 3 Eier in jedem Tropfen sind. Alternativ, um ein großes Ei Nummer zu verwalten, sammeln Sie die Eier in Tropfen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
Vorsicht: Bleach ist ätzend; tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit bleichen und nicht einatmen. - Entfernen Sie die Erwachsenen weiße fliegen aus dem Blatt.
- Legen Sie das Blatt unter dem Mikroskop zu sehen die Eier deutlich und sammeln die Eier einzeln und vorsichtig mit einer dünnen Sonde. Um eine Probe zu machen, setzen Sie einen Minuten Nadel Stift, bei 45° oder auf einem bequemen Arbeitswinkel in eine geschmolzene Pipettenspitze (Abbildung 2).
- Übertragen Sie die Eier auf Bleichmittel oder 1 X PBS. Wenn 1 X PBS verwenden, entfernen Sie das 1 X PBS mit einem Glas Pasteur pipette einmal alle Eier werden gesammelt und dann fügen Sie Bleichmittel auf die Eier.
Hinweis: Beim Sammeln von Eiern heben Sie langsam das Ei von der Basis bis der Stiel aus dem Blatt entfernt wird. Der Stiel ist klebrig, und das Ei wird häufig halten Sie sich an der Sondenspitze bis es in der Bleiche getaucht wird.
Hinweis: Es wird empfohlen, separate Glas, die Pasteur Pipetten für alle Reagenzien zu verwenden, und die Pipetten mit Hitze, um die Spitzen schmaler zu machen und das Risiko von versehentlich Absaugen Mottenschildläuse Eier geändert werden können. Zur Vermeidung von Rückständen und Verunreinigungen Reinigen der Pipetten mit entionisiertem Wasser nach jedem Gebrauch. - 10 min. warten. Besteht ein Interesse an der Embryogenese in Eiern, die älter als 1 h, lassen Sie die Eier in Bleichmittel für bis zu 15 Minuten.
Hinweis: Für Eier, die bis zu 1 Stunde alt sind, ist 10 Minuten ausreichend.
(3) Fixierung
Hinweis: Diese Schritte sind von einer Hymenopteran Protokoll17.
- Das Bleichmittel (enthält die Chorion-Fragmente) mit einem Glas Pasteurpipette entfernen und entsorgen. Fügen Sie Tropfen Eisessig mit einem Glas Pasteur pipette und 3 min warten.
Vorsicht: Gehen Sie mit diesem Schritt unter einem Abzug. Eisessig ist ätzend; Handschuhe tragen beim Umgang mit Eisessig und nicht einatmen, vor allem in Kombination mit den restlichen Bleichmittel. - Eisessig mit einem Glas Pasteurpipette entfernen und Clarkes Lösung Tropfen (3:1 von absoluten Ethanol: Eisessig) mit einem Glas Pasteur pipette. Warten Sie, bis die meisten der Lösung verdampft (oder max. 10 min).
- Tropfen von 70 % Ethanol auf die Eier mit einem Glas Pasteurpipette und warten Sie, bis die meisten des Ethanols verdampft (oder 10 min-Max).
(4) Färbung
- Die Eier mit einem Glas Pasteurpipette zu den pH-Wert in der Nähe von 7.0 fügen Sie Tropfen 1 X PBS hinzu und entfernen Sie alle verbleibenden Ethanol mit einem Glas Pasteurpipette. Legen Sie den Mikroskop-Objektträger in eine feuchte Kammer, Austrocknung, z. B. in einer leeren Pipette-Tipp-Box mit einem feuchten Papiertuch innen (Abbildung 3) zu verhindern. Warten Sie mindestens 30 Minuten.
Hinweis: Dies ist der beste Punkt, wenn eine Pause benötigt wird, solange die feuchte Kammer Austrocknung verhindern kann. - 1 X PBS mit einem Glas Pasteurpipette, zu entfernen und Tropfen von 0,1 μg/mL DAPI, einen DNA-fluoreszierende Fleck, mit einem Glas Pasteur pipette. Objektträger in eine dunkle feuchte Kammer und warten Sie mindestens 15 Minuten.
Vorsicht: DAPI ist reizend, also mit Handschuhen umgehen.
5. Waschen
- Entfernen Sie das DAPI mit einem Glas Pasteurpipette.
- 1 Tropfen X TBST (5 X Lösung aus 30 g Tris, 43,8 g NaCl und 5 mL Polysorbat 20 1,0 g NaN3 [pH 7.5] und brachte bis 1 L mit PCR Grad Wasser) auf die Eier mit einem Glas Pasteur pipette. Warten Sie 5 Minuten vor dem Entfernen der 1 X TBST mit einem Glas Pasteurpipette. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 Mal.
6. Montage
- Nach der letzten Wäsche pipette vorsichtig die Eier aus dem Paraffin-Film auf einem sauberen Teil des Mikroskop-Objektträger. Entfernen Sie überschüssige 1 X TBST; Fügen Sie 20 µL Montage Medien (80 % Glycerin und 20 % 1 X TBST mit 2 % n-Propyl-Gallat) und legen Sie eine saubere Abdeckung Folie auf die Eier.
- Für langfristige Lagerung Titeldia mit klaren Nagellack versiegeln und dann entweder die Folie im Dunkeln bei 2 ° C zu speichern oder sofort unter dem Fluoreszenz-Mikroskop anzeigen.
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Representative Results
Um zu testen ob Rickettsia die Befruchtungsrate von B. Tabaci MEAM1 Weibchen beeinflusst aufgezogen wir Rickettsia-infiziert (R+) oder nicht (R–) infizierte B. Tabaci auf Cowpea Pflanzen (Vigna Unguiculata) in separate Käfige bei 27 ° C, 70 % relativer Luftfeuchtigkeit und ein 16 h Licht/8 h dunkel Photoperiode. + R und R– vierten Instar weiße Fliegen wurden sorgfältig aus den Blättern entfernt und in 200 µL Streifen Rohre isoliert. Als Erwachsene, sie wurden in Gruppen von 50 % Frauen und auf saubere Blätter in Petrischalen übertragen (n = ~50-100/leaf) für 4 Tage der Paarung. Gruppen von ca. 20 Frauen und einige Männer wurden dann auf ein sauberes Blatt Datenträger (eine R– Erwachsene, einer für Erwachsene R+ ) in 35 mm Petrischalen ruht auf 1 % Agar übertragen. Die Petrischale Deckel ausgeschnitten und das feinen Stoff-Netz zur Eindämmung verhindert auch überschüssige Kondenswasser. Nach ca. 45 min alle Erwachsenen wurden entfernt, einige der Eier wurden geerntet, um die Befruchtungsrate zu bestimmen und die Eier, die nicht abgeholt wurden bis zum Erwachsenenalter, das Erwachsenen Sex-Verhältnis berechnen aufgezogen wurden. Eine Kohorte für einen einzigen Tag für+ R und R– weiße fliegen, wurde als Block definiert. Es gab sieben Blöcke für die Berechnung die Befruchtungsrate oder primäre Geschlechtverhältnis, zwar gab es sechs Blöcke für die Berechnung der Erwachsenen Sex-Verhältnis, da gab es nicht genug übrig gebliebene Eier von einem Block nach hinten bis zum Erwachsenenalter. Ein generalisiertes lineares Modell wurde in Statistikpaket R verwendet, um festzustellen, ob die Befruchtung Steuersätze oder Erwachsenen Geschlechtverhältnisse maßgeblich durch Rickettsien Infektion und/oder Block beeinflusst wurden. Der Antwortvariablen wurden der Anteil der befruchteten Eier/alle Eier oder der Anteil der weiblichen Erwachsenen/alle Erwachsenen bzw. während erklärende Variablen wurden die Block und Rickettsia Infektionsstatus.
Ei Dechorionation gefolgt von DAPI nuklearen Färbung erlaubt die eindeutige Zuordnung der Düngung (und Embryo Geschlecht) Wenn Sie mit einem Fluoreszenz-Mikroskop (Abbildung 4) beobachtet. Für dieses Experiment 90 Eier gelegt von R–B. Tabaci MEAM1 Frauen und 82 Eier R+B. Tabaci MEAM1 Weibchen erzielt wurden. Wie bei Eiern aufgezogen bis zum Erwachsenenalter wurden 60 R– und 95 R+ Erwachsene erzielte. Während weibliche Verzerrungen bei Erwachsenen Geschlechtverhältnisse konsequent in früheren Studien15,18,19, in der aktuellen Studie Erwachsene R+ nachweislich waren Geschlechtverhältnisse (69 % Frauen, Median) weiblich voreingenommen im Vergleich zu R – Frauen (50 % Frauen, Median), aber die Sex-Verhältnisse in den beiden Behandlungen waren nicht signifikant unterschiedlich (χ2 = 1,02, df = 1 p = 0,31; ( Abbildung 5). Die primäre R– Geschlechtverhältnisse (60 % befruchtete Eier, Median) im Vergleich zu R+ Geschlechtverhältnisse (44 % befruchtete Eier, Median) waren weiblich voreingenommen aber waren auch nicht signifikant unterschiedlich (χ2 = 0,51, df = 1 p = 0,47), Bereitstellung von keine Beweise für größere Befruchtung Preise von R+ Weibchen (Abbildung 5). Block auch nicht über einen signifikanten Einfluss auf die primäre (χ2 = 0.29, df = 1 p = 0,59) oder Erwachsene (χ2 = 1,20, df = 1 p = 0,27) Geschlechterverhältnis.
Abbildung 1: Foto von einem Objektträger mit Paraffin Film und Tropfen Bleichmittel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beispiel einer Sonde, altmodisch mit Wärme aus einer Pipettenspitze und eine Minuten Nadeln Pin. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: ein Beispiel für eine feuchte Kammer, gestaltet aus einer leeren Pipette-Info-Feld und einem feuchten Papiertuch. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Fluoreszierende Mikroskopbilder B. Tabaci Eier. (ein) B. Tabaci MEAM1 befruchtete, beginnende weibliche Eizelle. (b) Unfertilized, beginnende männlichen Ei. Die Eier wurden auf weniger als 1 h nach der Eiablage fixiert und mit DAPI gefärbt. Die Basis jedes Ei ist aufgrund bakterieller DNA (Portiera, Hamiltonellaund möglicherweise Rickettsien) in der Zelle Bacteriome Stammvater fluoreszieren die gelegten Ei20,21gehört. In jedes Ei der weibliche Vorkern ist nahe der Mitte des Eies, und im weiblichen Ei nur das Sperma ist als eine helle Streifen in der Nähe der Spitze des Eies in der Nähe von, was vermutlich eine Autofluorescing Mikropyle ist sichtbar. Die Bilder sind Screenshots aus einem Z-Stapel erzeugt video, genommen von einem Laser-scanning-konfokale inversen Mikroskop hergestellt. Die Maßstabsleisten wurden von früheren Mikroskopbilder geschätzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Primär- und Erwachsenen Geschlechtverhältnisse von Rickettsia-infiziert oder nicht infizierten B. Tabaci. Box und Whisker Grundstücke das primäre Geschlechterverhältnis (Prozentsatz der befruchteten Eier oder Prozentsatz der weiblichen Zygoten) in Schwarz im Vergleich zu Erwachsenen Geschlechterverhältnis (in Prozent der Erwachsenen Frauen) in grau, von Rickettsia-infiziert (R+) und nicht-infizierte (R -) B. Tabaci MEAM1, "MAC1" genetischen Linie. Box und Whisker-Plots zeigen den Median als die mittlere Linie, der Mittelwert als ein Plus-Zeichen und obere und untere Quartile wie die Linien, die die Enden der Box machen, und der Bereich wird in den äußeren Linien, die aus dem Feld dargestellt. Für R– Eier erzielte: n = 90; für R+ Eier erzielte: n = 82. Für R– Erwachsene gezählt: n = 60; für+ R Erwachsene gezählt: n = 95. In einer logistischen Analyse der primäre Sex Ratio (Verhältnis von befruchteten Eier) trat in das Statistikpaket R, fanden sich keine signifikanten Effekte für Block (n = 7, χ2 = 0.29, df = 1 p = 0,59) oder für Rickettsia Infektion (χ2 = 0,51, df = 1 p = 0,47). Adult Sex-Verhältnisse als beeinflusst von Block (n = 6) und Rickettsia Infektionsstatus, wurden ebenso analysiert. Hier auch keine signifikanten Effekte für Block gefunden wurden (χ2 = 1,20, df = 1 p = 0,27) oder für Rickettsien Infektion (χ2 = 1,02, df = 1 p = 0,31). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll ist die erste, die Befruchtungsrate oder primäre Geschlechterverhältnis, B. Tabacizu erfassen. Die Herausforderung dieses Protokolls ist, dass es Forscher lernen, wie man die Mottenschildläuse Eier schnell verarbeiten erfordert sicherzustellen, dass nicht mehr als 1 h vergangen, seit die Eier oviposited wurden, bis diese behoben sind. In Vorversuchen waren Eier, die bei 3 h oder mehr Postoviposition befestigt waren zu alt, um die Befruchtung zu beobachten, wie Syngamy eingetreten und mitotische Divisionen im Gange waren. Zwischen 1 bis 3 h nahm die Vorkerne eine rundere Form. Während die frühe Anwesenheit von zwei Kerne eine befruchtete Eizelle ein bisschen später angibt, die Apposition der zwei Kerne in Vorbereitung auf Syngamycan erscheinen einem Zellkern und später wieder, sind die beiden Produkte die erste mitotische Teilung in männliche und weibliche Eier gefunden. Daher die Unterscheidung zwischen den Geschlechtern ist nicht klar zu dieser späteren Zeitpunkten, und wir empfehlen das Intervall von Eiablage bis Fixierung bis 1 h als konservative Maß zu begrenzen. Es ist auch schwierig zu lernen wie man sanft mit den Eiern mit jede Übertragung der Flüssigkeit, so dass sie nicht versehentlich in die Pipette abgesaugt werden. Zum Zeitpunkt der Betrachtung die Eier unter dem Fluoreszenz-Mikroskop können ein paar Eier gebrochen haben während des Protokolls, so dass die Eier nicht geschlechtlich und als die Vorkerne gezählt und Eigelb möglicherweise entgangen. Ansonsten, sobald der Bediener komfortabel mit diesen Schritten wird, kann das Protokoll bequem innerhalb von 3 h abgeschlossen werden erfordert nicht die einen Übernachtung Fixierung Schritt. Es ist auch flexibel, dass sie geändert werden kann, um ältere Eier für diejenigen Forscher interessiert bei der Erfassung von Entwicklung zu beflecken.
Eine Anwendung dieses Protokolls gehören Untersuchungen über Geschlecht-Zuweisung. Obwohl viele Dutzende von Studien der Mottenschildläuse Biologie Erwachsenen Geschlechtverhältnisse in verschiedenen Umgebungen gemeldet haben, Erwachsene Geschlechtverhältnisse Geschlecht Zuweisung der Mutter mit Geschlecht-spezifische Entwicklungsstörungen Mortalität von Nymphen zu verwirren und machen es unmöglich, die Ursache zu ermitteln beliebige Geschlechtverhältnis Muster. Die hier beschriebene zytogenetische Technik bietet die Möglichkeit Verständnis Mottenschildläuse Sex Zuordnungsmuster ganz allgemein. Während die großen dispersiven Populationen von B. Tabaci und andere Schädlinge wie die Gewächshaus-Mottenschildläuse könnte Trialeurodes Vaporariorum vorhergesagt werden 1:1 Geschlechtverhältnisse, so oft ausgestellt im Labor Einstellungen22, zur Folge 23, erwarten wir auch, dass reproduktive Störungen, Endosymbionts und potenziell Host Pflanzenqualität primäre Geschlechtverhältnisse beeinflussen könnten. Diese Faktoren auch geschlechtsspezifische Mortalitätsmustern während der Entwicklung systematisch neigen Geschlechtverhältnis beeinflussen könnten schätzt, unterstreicht die Notwendigkeit für ein direktes Maß für die primäre Geschlechterverhältnis.
Während weibliche Voreingenommenheit mit Rickettsien Infektion assoziiert konsequent in der genetischen Linie "MAC1"15,18,19gefunden wurden, waren die Erwachsenen Sex-Verhältnisse nicht deutlich weiblich voreingenommen in der aktuellen Studie. Der primäre Sex-Verhältnisse beobachtet mit der Zytogenetik Technik nicht signifikant waren voreingenommen, entweder. Wir censused die primär- und Erwachsenen Geschlechtverhältnisse B. Tabaci Weibchen an nur 1 Tag, zu Beginn der Eiablage-Kampf, wenn die Weibchen 4 bis 5 Tage alt, waren so dass die Geschlechtverhältnisse studierte nicht die Geschlechtverhältnisse vertreten haben kann, die wir über einen längeren Zeitraum beobachtet. Dennoch, die Technik machte es möglich, die Befruchtungsrate oder primäre Geschlechterverhältnis zu bestimmen und in diesem Fall, eine Korrespondenz zwischen den Primär- und Erwachsenen Geschlechtverhältnisse zeigte.
Bestimmung der Befruchtung wertvolle in Fällen möglicherweise auch in dem Forscher wollen die Art der reproduktiven Isolation unter Mottenschildläuse Bevölkerungen bestimmen könnte. Während es eine Angelegenheit von etwas Kontroverse12,24,25gewesen ist, es ist heute allgemein anerkannt, dass der Name B. Tabaci Zehntausende kryptische Arten mit Nachweise sowohl genetische Divergenz bezieht und Kreuzung Tests, in denen einige Weibchen sind, produziert12,25. In diesen Studien wäre es interessant zu wissen, wo die Isolierung auftritt. Ist Sperma übertragen, und befruchten artfremden Spermien die Eier, oder sind versuchte Paarungen erfolglos? Über die Bestimmung der primären Geschlechtverhältnis kann diese Technik festzustellen, ob das primäre Geschlechtverhältnis von Endosymbionts, egoistischen genetischen Elemente oder eine der vielen anderen Faktoren, einschließlich Artgenossen, Konkurrenz, Räuber beeinflusst wird, Parasitoide, Krankheitserreger, die Wirtspflanze oder abiotische Effekte.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch eine NSF Grant (DEB-1020460), M.S.H. und ein USDA AFRI-Stipendium (2010-03752), M.S.H. finanziert. Die Autoren danken Brennan Zehr für Färbung Mottenschildläuse Eier mit viel Geschick und Zen. Die Autoren danken Mike Riehle für die Verwendung von seinem fluoreszierenden Mikroskop für die Bildgebung. Die Autoren danken für die Ei-Bilder Suzanne Kelly und Marco Gebiola. Die Autoren danken für die Unterstützung in entscheidenden Momenten während der Experimente Suzanne Kelly und Jimmy Conway.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Any | ||
| 1x TBST | Any | 5x solution made from 30 g Tris, 43.8 g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0 g NaN3 pH 7.5, and brought to 1 L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10x magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18 mm x 18 mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
References
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