Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Cortisol måling i Koala (Phascolarctos cinereus) pels

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/59216
Automatic Translation
1, 1
1School of Science and Health, Western Sydney University

Summary

Vi præsenterer en protokol til at bestemme den optimale ekstraktionsmiddel til at måle cortisol fra Koala pels. De opløsningsmidler, der anvendes i denne protokol, er methanol, ethanol og isopropanol. Bestemmelse af en optimal ekstraktionsmiddel vil støtte i pålideligt måling af pels til at bestemme virkningen af kronisk stress på Koalas.

Abstract

Optimale metoder til hormon ekstraktion bruges til at måle stress i dyr på tværs af prøvetyper er ikke altid de samme. Australiens ikoniske pungdyr arter, Koala (phascolarctos cinereus), står over for langvarig udsættelse for antropogene inducerede stressorer og vurdering af kronisk stress i vilde populationer er presserende berettiget. En af de mest effektive måder at måle kronisk stress er gennem analyse af glukokortikoidhormonet cortisol i hår eller pels, da det understøtter fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner. Dette laboratorium validering undersøgelse har til formål at teste nuværende teknikker til at validere en optimal hormon udvinding metode, der skal anvendes som en ikke-invasiv måling af cortisol i Koala pels. Det erkendes, at ved hjælp af ikke-invasive teknikker til at måle stresshormoner foretrækkes frem for traditionelle, invasive teknikker på grund af deres ideelle praktiske og etiske standpunkter. Desuden er det forholdsvis lettere at erhverve pels fra Koalas end det er at erhverve prøver af deres blod. Denne undersøgelse brugte prøver af Koala pels erhvervet fra Adelaide Koala og Wildlife Hospital til at køre en række hormon udvinding teknikker i et forsøg på at validere en optimal cortisol udvinding metode. Resultaterne viste, at 100% methanol gav den mest optimale solventekstraktion sammenlignet med 100% ethanol eller 100% isopropanol baseret på parallelitet resultater. Afslutningsvis, denne metode til cortisol udvinding fra Koala pels forudsat en pålidelig ikke-invasiv analyse, der kunne bruges til at studere kronisk stress i Koalas.

Introduction

Australske økosystemer opretholder menneskeliv gennemleve ring af tjenester, herunder mad og fiber blandt mange andre dynamiske interaktioner1. Ironisk nok er det menneskelig aktivitet, der fungerer som den dominerende drivkraft for økosystem forstyrrelser gennem biodiversitets ændringer2. Fragmentering af levesteder, kendt som processen med at opdele store kontinuerlige habitater i små jord pletter, isoleret fra hinanden, er den største antropogene biodiversitet forandring truer australske økosystemer2. Fragmentering af levesteder ændrer strukturen og mangfoldigheden af artssammensætning i et givet område og mindsker dermed det område af habitat, som er nødvendigt for at opretholde levedygtige populationer2. Resultatet af dette er øget konkurrence mellem arter for ressourcer, herunder fødevarer, brændstof, fiber, og vand3. Ødelæggelsen af australske økosystemer gennem ændringer i biodiversiteten har katastrofale konsekvenser for mange australske indfødte arter1.

Australiens mest ikoniske pungdyr arter, Koala (phascolarctos cinereus), afhænger af australske økosystemer forbliver sunde for deres overlevelse4. Indførelsen af den europæiske bosættelse forårsagede en hurtig nedgang i de australske befolkninger i Koalas, da de blev slagtet for deres skind i jagten på profit i en stor eksporthandel5. Denne praksis blev forbudt i 1980 ' er og populationer af Koalas var derefter i stand til at stabilisere5. Men eksponentiel vækst i den menneskelige befolkning har resulteret i denne art konkurrerer om en stor del af deres habitat, og deres overlevelse er igen under trussel6. Ifølge den internationale Union for naturbevaring (IUCN), alle populationer af australske Koalas er opført som sårbare over for udryddelse med en faldende befolknings tendens7. Denne fortegnelse tilskrives usikkerheden omkring relevante populations parametre og markante variationer i befolknings tendenserne for denne art7. Som de mest ikoniske og endemiske dyr, Koalas stort set gavne den australske økonomi gennem turisme (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Et skøn tyder på, at Koala relaterede turisme har genereret ca 9.000 job og bidrager mellem $1,1 og $2.500.000.000 til økonomien (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Fjernelsen af en art har potentialet til at være katastrofal, og kan ses i den stadige nedgang i indfødte australske dyreliv6. Desuden, Australien økonomi vil føle forgreninger hvis populationer af australske Koalas fortsætte med at falde med den sats, de er6.

Det foreslås, at forekomsten af død og sygdom som følge af fragmentering af levesteder er resultatet af kronisk stress8. Allerede, fireogtyve pungdyr arter er blevet erklæret uddøde i Australien på grund af habitatfragmentering, med Koalas efter en lignende tendens8. Kompleksiteten af habitatfragmentering og biologiske systemer er synergistisk, men kan pakkes ud gennem analyse af stress respons6. Generelt, enhver forstyrrelse i et dyr naturlige omgivelser aktiverer en kompleks kaskade af Neuro hormonelle begivenheder, kendt som en ' Fight eller Flight ' svar9,10. Denne reaktion på stress er en proces, der begynder i hjernen, hvor hypothalamus-hypofyse-adrenal (HPA) akse er aktiveret11. En komponent i hjernen kaldes hypothalamus frigiver kortikotropin-releasing hormon (CRH), som derefter signalerer den forreste hypofyse til frigivelse adrenocorticotrophic hormon (ACTH)11. Dette stimulerer igen glukokortikoid sekretionen fra binyre medulla. Kroppen cirkulerer glukokortikoider gennem blodet, som afledes lagring af glucose fra glykogen og mobiliserer glukose fra lagret glykogen11. Denne kaskade af Neuro hormonelle begivenheder er det svar, der anvendes af dyret til at beskæftige sig med uforudsigelige stimuli11. Men, når glukokortikoider frigives og forblive forhøjet i en længere periode, dyret anses for at være oplever kronisk stress12,13. Denne proces indebærer at omdirigere energi væk fra andre korporal kropsfunktioner, da det er nødvendigt for løbende glukokortikoid produktion13. Som et resultat, kronisk stress kan forbyde vækst, reproduktion og immunitet, alle er vigtige fitness egenskaber kræves for overlevelse14.

Måling af et dyrs glukokortikoidproduktion er en fælles indikator, der anvendes til at bestemme, om dyret oplever fysiologisk stress15. For at gøre dette kan glukokortikoider måles i blodplasma, serum, spyt, urin eller fæces16. Men, tyder på, at hår er en langt mere effektiv indikator for kronisk stress, i modsætning til de førnævnte16. Dette skyldes, at håret menes at indarbejde blod-bårne hormoner i sin vækstfase; Det er relativt stabilt; og enhver cortisol detekteret i håret afspejler fysiologiske stress oplevet i perioden med hårvækst, som kan være uger frem til måneder16. Desuden bør enhver samling af cortisol være ikke-invasiv for at minimere stress i forbindelse med opsamling og håndtering16. Men, enhver stress oplevet under denne begivenhed ville ikke påvirke glukokortikoid niveauer i hår16. Der har været mange undersøgelser, der udforsker færdighed i at bruge hår til at måle langsigtet stress i en række dyr, og omfatter undersøgelser af rensdyr, Grizzly bjørne, rhesus aber, moskus og brune bjørne17,18, 19 , 20 , 21. hår cortisol er normalt udvindes ved første vask prøven for at sikre sved og sebum-afledte cortisol deponeret på overfladen af håret er ikke Co-ekstraheret med cortisol og derefter pulveriserer prøven i en perle-beater22. Efter vask skal prøven tørres for at sikre fuldstændig fordampning22. Endelig, ved hjælp af et opløsningsmiddel, kan prøven ekstraheres og rekonstitueres for at lette analysen af cortisol22. Det mest almindelige opløsningsmiddel, der anvendes til at udtrække cortisol fra pels, er methanol21,23; Men, der er nogle undersøgelser, der bruger ethanol og isopropanol i deres cortisol udvinding teknikker. For eksempel, en undersøgelse, der brugte ethanol var en succes for udvinding cortisol fra Human amniotisk væske24. Desuden, en undersøgelse, der anvendes isopropanol var en succes for udvinding cortisol fra menneskehår og negle25,26. Af denne grund testede denne undersøgelse alle tre opløsningsmidler (methanol, ethanol og isopropanol) for at afgøre, hvilken var den mest vellykkede til ekstraktion af cortisol fra prøver af Koala pels.

Det primære formål med denne undersøgelse var at bruge nuværende teknikker til at validere en optimal hormon udvinding teknik, der skal anvendes som en ikke-invasiv måling af cortisol fra Koala pels. Dette blev opnået ved at afprøve tre ekstraktionsmidler (methanol, ethanol og isopropanol). Vi hypotese, at methanol vil være den optimale opløsningsmiddel, der anvendes til udvinding cortisol fra Koala pels, fordi det er den anbefalede opløsningsmiddel af ekstraktion af Arbor assay cortisol kits27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dette projekt blev udført under strenge dyre-og menneske sundheds retningslinjer. Dyreetik blev tildelt af Western Sydney University (A12373). Derudover, en lab risikovurdering og biosikkerhed og stråling form blev indsendt og accepteret af Western Sydney University til sikkert at udføre denne forskning (B12366).

Bemærk: Koala Fur prøver til dette projekt blev indhentet fra Adelaide Koala og Wildlife Hospital, beliggende på 282 Anzac Highway, Plympton South Australia. Fur blev taget fra en Koala, som var blevet indlagt på hospitalet og aflives på grund af deres alvorlige kvæstelser. Den afdøde Koala var blevet opbevaret i en fryser i en krops taske kort efter døden. Efter at have fjernet den afdøde Koala fra Body bag, blev 1,2 g pels barberet fra nakken ved hjælp af standard Animal Clippers. Pels blev barberet så tæt som muligt på huden, for at sikre, at huden ikke blev skåret. Når barberet, den afdøde Koala blev sat tilbage i kroppen taske og placeret i fryseren. Pelsen blev derefter anbragt i en pose fremstillet af aluminiumsfolie og opbevaret under-20 °C. I transit blev pelsen opbevaret ved omgivelsestemperatur, og ved ankomsten til laboratoriet blev pelsen opbevaret ved-80 °C.

1. Koala Fur cortisol ekstraktion

  1. Fjern pels fra opbevaring ved-80 °C og giv tid til at tø.
  2. Vægten af pels på en laboratorie analytisk præcisions balance.
  3. 60 mg pels anbringes i et forvejet og mærket 1,5 mL centrifugeglas og gentages, indtil der fyldes 18 rør.
    Bemærk: 18 pels delprøver blev anvendt til denne valideringsundersøgelse.
  4. Der tilsættes 1 mL 100% højtydende væskekromatografi (HPLC)-grad isopropanol til hvert rør ved hjælp af en pipette.
  5. Vortex prøver til 30 s.
  6. Stamme hver prøve ved hjælp af en 0,5 mm mikro præcision sigte for at opnå adskillelse af væske og pels.
  7. Kassér væsken i en affaldsbeholder.
  8. Placer hver pels prøve i en mærket plastik vejning båd, derefter placere i en vakuum desiccator, lad pelsen tørre i 3 dage.
  9. Når det er helt tørt, placeres hver prøve i et mærket 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
  10. Placer hver prøve i en perle mølle med 3 krom stål perler (3,2 mm) og finknuses i 2 min ved 30 shakes per sekund.
  11. 1,5 mL af den første ekstraktionsteknik (100% ethanol fra analytisk kvalitet) afpipetteres i 6 1,5 mL mikrocentrifuge glas, der indeholder pels prøven.
  12. Udfør det samme for 100% methanol i analytisk kvalitet og 100% isopropanol, indtil atten 1,5 mL mikrocentrifuge glas er fyldt.
  13. Cap hver 1,5 mL mikrocentrifuge tube og Inkuber ved stuetemperatur (RT) med konstant pulserende ved hjælp af en shaker til 3 h.
  14. Fjerne og stamme prøver ved hjælp af en 0,5 mm mikro præcision sigte.
  15. Væsken overføres til et nyt, mærket 1,5 mL mikrocentrifuge glas med en pipette, samtidig med at det sikres, at pelsen kasseres korrekt.
  16. Helt tørt solvent ekstrakt under en strøm af N2 dampe under et stinkskab.
  17. Det tørrede prøveekstrakt rekonstruere med 400 μL analyse buffer (sammensætning i det kommercielle cortisol-sæt; Se tabel over materialer) og 100 μL af 100% ethanol i analytisk kvalitet.
    Bemærk: prøveekstrakter kan opbevares ved-80.

2. intern kontrol

  1. For at gøre kontrol, lave en pulje af ekstraherede prøver med høj hormonniveauer. For at gøre denne pulje, skal du vælge prøver fra dyr med kendt eksponering for stressor. For eksempel, Vælg prøver fra Koalas, der er blevet reddet fra miljømæssige traumer, da de generelt vil vise høj cortisol hormonniveauer6.
    1. For at gøre ekstrakt puljen, tage 20 μL ekstrakt fra hver prøve (n = 10) indtil en samlet volumen på 200 μL er opnået. Ekstrakt puljen kan opbevares ved-80 C indtil assays. Kør puljen i hver analyse som lav eller høj intern kontrol (Se trin 2,2).
  2. Til analysen skal du bruge puljen til at lave lagre for lav og høj kontrol, der binder til henholdsvis 70% (C1) og 30% (C2). Fortyndingsfaktoren for 30%-og 70%-bindings punkterne fra parallelitet-grafen for ekstrakten mod cortisol-standarden (figur 1) opnås. Brug analyse bufferen til fortynding af prøve puljen. Brug for eksempel 60 μL af poolekstrakten og 60 μL analyse buffer til 1:2 fortynding.
    Bemærk: for methanol-ekstrakten var 30%-bindings punktet på pæn tid, mens 70% bindings punkt var ca. 1:2 pr. figur 1. Disse leverede således fortyndingsfaktoren for de interne kontroller (henholdsvis C1 og C2) til kørsel inden for analysen.

3. cortisol analyse i Koala pels ekstrakter

  1. Brug et kommercielt cortisol-sæt (tabel over materialer) og sæt 96 brønd strimmel pladen, herunder prøverne, kontrollerne, cortisol standarder, ikke-specifikke bindende brønde, og maksimale bindende brønde efter leverandørens anvisninger. Brug det plade layout, der findes i hæfte hæftet, til at opliste positionerne for prøver, kontroller og standarder på plade kortet.
    Bemærk: det anbefales, at alle prøver, kontrolelementer og standarder køres i duplikat for at give mulighed for nøjagtighed af resultater.
  2. Forbered prøverne. Følg pels hormon udvinding (afsnit 1) for at opnå 100% methanol udvundet Koala pels.
  3. Forbered reagenser. Følg den procedure, der er beskrevet i det kommercielle cortisol kit til at forberede reagenserne, herunder (1) analyse buffer, (2) vask buffer, og (3) standarder (sammensætninger i cortisol kit, tabel over materialer).
  4. I henhold til instruktionerne i cortisol kit, pipet 50 μL af prøver eller standarder i brønde i pladen. Pipet 75 μL og 50 μL af analyse bufferen i de ikke-specifikke bindingsbrønde (NSB) og den maksimale binding (B0 eller nul standard) brønde.
  5. Tilsæt 25 μL cortisol konjugat til hver brønd ved hjælp af et repeater-pipet. Derefter pipet 25 μL af cortisol antistof i hver brønd, undtagen NSB brønde. Tryk forsigtigt på siderne af pladen for at sikre, at reagenserne er godt blandede.
  6. Dæk pladen med plade forsegler og ryst ved stuetemperatur i 1 time (ved langsom hastighed) ved hjælp af en orbital shaker.
  7. Fjern plade forsegler og Aspirer brønd pladen ved at vaske hver brønd med 300 μL vaskebuffer 4 gange.
  8. Tør pladen af ved at tappe på pladen på rene, absorberende håndklæder.
  9. Der afpipetteres 100 μL tetramethylbenzadin (TMB) substrat (sammensætning i cortisol kit, tabel over materialer) til hver brønd.
  10. Anbring plade forsegler på brønd pladen og Inkuber ved RT i 30 minutter.
  11. Pipetten 50 μL stopopløsning til hver brønd.
  12. Placer brønd pladen i en plade læser, der kan læse 450 Nm.
  13. Til beregning af den endelige hormon koncentration, udlede den endelige pels cortisol koncentration i ng/mg prøve ved at multiplicere PG/mL hormon koncentration med den endelige ekstrakt volumen (0,5 mL) og dividere med pels prøvemassen (60 mg).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse påvisning af hormon metabolitter af interesse bestemmes ved hjælp af parallelitet. Ved hjælp af en parallelitet kurve fastsætter 50%-bindings punktet også prøve fortyndingsfaktoren på standardkurven (figur 1). Som vist i parallelismen Graf (figur 1), 100% ethanol og 100% isopropanol ekstrakter ikke give parallel forskydning mod cortisol standard. Imidlertid leverede 100% methanol-ekstrakten parallel forskydning mod cortisol-standarden. Tørrede ekstrakter blev kørt pænt gennem fortynding i analyse buffer (100 μL 100% ethanol og 400 μL analyse buffer).

Intra-(inden for) og Inter-(mellem) assay Variationskoefficienter (CV) blev bestemt fra høj-(ca. 70%) og lav-(ca. 30%) bindende prøveekstrakter kører i alle assays. Baseret på paralleliteten Graf (figur 1), de 30% (lav) bindende interne kontroller var pæne Koala ekstrakt pulje mens 70% (høj) bindende interne kontroller var 1:2 fortyndet Koala ekstrakt pulje. CV% for intern høj og lav intern kontrol var < 15%.

Fejlmargenen inden for analysen kan bestemmes ved hjælp af kvalitetskontrol, herunder de intra-og Inter-assay Variationskoefficienter, som bør være < 15%. Assay følsomhed blev beregnet som værdien 2 standardafvigelser fra den gennemsnitlige respons af de blanke (nul binding) prøver, og udtrykkes som 81,26 PG/brønd.

Figure 1
Figur 1: parallelitet af poolede Koala pels udvundet ved hjælp af 3 forskellige opløsningsmidler (100% ethanol, 100% isopropanol eller 100% methanol) mod cortisol standardkurve under en cortisol enzym-immunoassay. B/TB er procentdelen af binding over den samlede binding. Den serielle fortyndingsfaktor (f. eks. 1:2X gennemsnitlig fortyndingsfaktor på 2) er givet sammen med koncentrationen af hver standard. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

For det andet blev sammenslutningen mellem hver solvent ekstrakt og cortisol standard fastlagt ved hjælp af et regressions plot (figur 2). Som vist i figur 2gav 100% methanol-ekstrakten den bedste regressionslinje med den højeste R2 -værdi sammenlignet med 100% ethanol og 100% isopropanol-ekstrakter.

Figure 2
Figur 2: regressions parceller for procentvis binding af cortisol-standarden mod hver af de 3 opløsningsmidler (ethanol, methanol og isopropanol), der anvendes til at udtrække Koala-pels. R2 -værdien blev opnået fra linjen af bedste pasform. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Desuden blev undersættet af Koala-pels udvundet med hver af de tre opløsningsmidler analyseret, og resultaterne findes i tabel 1 nedenfor. Som vist i tabel 1var den observerede koncentration af cortisol-standarden inden for intervallet 2879.61-125.70 PG/Well. Hverken ethanol eller isopropanol ekstraktionsmetode kunne opnå konsistens i resultatet, da pels ekstrakt koncentrationerne opnået ved hjælp af en af metoderne resulterede i meget høj min-max vifte af hormon koncentrationer (Se tabel 1 numre markeret i rødt), som lå uden for detektionsgrænsen for cortisol-analysen. Methanolekstrakterne resulterede imidlertid i cortisol-koncentrationer inden for kortisolstandarden (som vist med fede sorte tal i tabel 1). Desuden var koncentrationerne af pelcortisol, der blev påvist ved anvendelse af methaninekstraktions metoden, meget konsistente sammenlignet med de opnåede resultater ved hjælp af de to andre metoder (Se tabel 1). Således accepterer vi null hypotese, at methanol er den mest egnede opløsningsmiddel til Koala pels hormon ekstraktion sammenlignet med ethanol og isopropanol.

Table 1
Tabel 1: cortisol koncentrationen (ng/mg) for Koala Fur (n = 18) ekstraheret med 3 forskellige opløsningsmidler (ethanol, isopropanol eller methanol) og køre mod cortisol standardkurve under en cortisol enzym-immunoassay. Dristige røde tal viser inkonsekvente koncentrationer for ethanol og isopropanol ekstrakter, som lå uden for analyseområdet (PG/Well). Fed sort tal viser koncentrationerne for pels cortisol ekstraheret ved hjælp af methanol, som faldt inden for området af cortisol standarder (PG/brønd). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er en række undersøgelser, der bruger en række teknikker til at detektere cortisol i pattedyrs pels. Denne undersøgelse præsenterer resultater for påvisning af cortisol i pels indsamlet fra en vild Koala udsat for nuværende antropogene stress. Denne banebrydende undersøgelse brugte pels til at teste, hvilke af de tre almindeligt anvendte opløsningsmidler er bedst til at udtrække cortisol, et mål af kronisk stress, fra Koala pels. Resultaterne viste, at 100% methanol var det anbefalede opløsningsmiddel til cortisol ekstraktion i denne type pattedyr pels.

Ethanol, methanol og isopropanol er alle primære alkoholer, der er bundet af brint molekyler og er almindeligt anvendt som opløsningsmidler i hormon ekstraktions eksperimenter28. Generelt opløses polære stoffer bedst i andre polære stoffer, hvorimod ikke-polære stoffer opløses bedst i andre ikke-polære stoffer. Alkohol gruppen, der indeholder methanol, er meget Polar, hvorimod alkohol gruppen, der indeholder isopropanol, er meget ikke-polær. På grund af sin molekylære opbygning har alkohol gruppe, der indeholder ethanol, fordelen af at være både et polært og ikke-polært opløsningsmiddel. Steroid hormoner som cortisol betragtes som ikke-polære, hvilket betyder, at cortisol skal have en stærk binding sammen med polære opløsningsmidler.

For en mere omfattende analyse af ekstraktionsmidler, der anvendes til at vurdere fysiologisk stress i Koala Fur, bør fremtidige forskningsprojekter forsøge identiske metoder i den rækkefølge, som er beskrevet i figur 3. Lignende undersøgelser har historisk udført vask før slibning22, for at sikre, at der ikke er nogen utilsigtet sved og/eller sebum afledt cortisol deponeret i pels prøven. Desuden er det vigtigt, at måling af cortisol alene ikke kan garantere en fuldstændig indikation af kronisk stress. Hår cortisol aflæsninger er et værdifuldt værktøj, når de forsøger at forstå fysiologiske stress opleves af et dyr, men forhøjet HPA aktivitet kan forekomme under en række betingelser, herunder motion, metaboliske abnormiteter og tilstedeværelsen af infektionssygdomme22. Andre vigtige faktorer, der bør tages i betragtning til hoved integriteten af hormon data omfatter følgende. (1) acceptabelt niveau for tilfældig fejl-de Variationskoefficienter, der opnås ved intern kontrol (CV1 og CV2), bør gennemsnitligt < 15% for alle assays. 2) tilfældig fejl i prøveanalysen — duplikerede prøver, der udføres på hver plade, skal have et CV på < 15%. ellers vil prøven skulle køres igen. (3) test detektionsgrænse-koncentration af hormon kvantificeret inden for hver analyse skal være inden for analyse detektionsgrænsen (mellem målinger for højeste fortynding og pæn standard); ellers kan prøverne kræve yderligere fortynding (hvis de niveauer, der påvises for prøverne, er større end koncentrationen af pæn standard) eller ikke kan analyseres i analysen (hvis niveauerne for prøverne er mindre end koncentrationen af den højeste fortyndede standard). (4) analyse følsomhed-dette kan påvirkes af baggrunds aflæsning (ikke-specifik binding), derfor er det vigtigt at opretholde det højeste niveau af kvalitetssikring af analysen (f. eks. skal udstyr som plade skive og plade læser serviceres regelmæssigt). (5) prøveekstrakt tørring-dette trin kan resultere i potentiel krydskontaminering eller tab af prøver. Det anbefales, at prøverne tørres under damp af N2 -gas enkeltvis, og at de skal erstatte den Pasteur-pipette, der anvendes til ekstraktion mellem hver prøve.

Figure 3
Figur 3: begrebsmæssigt flowdiagram, der viser de vigtigste trin, der er involveret i Koala Fur cortisol enzym-immunoassay (EIA). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Den procedure, der er skitseret i dette studie (figur 3), er en metode, som let kan replikeres, da den er relativt nem at udføre, trin-for-trin-metodologi, som indeholder let tilgængelige kemikalier, reagenser og forsyninger med udstyr, der sandsynligvis vil blive findes i et standard analyselaboratorium. Anvendelsen af denne undersøgelse gør det muligt at anvende en ikke-invasiv teknik til at vurdere fysiologisk stress i både vilde og fangenskab Koalas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet gennem opstart forskningsstøtte til Edward Narayan gennem Western Sydney University, School of Science and Health. Forfatterne takker Jack Nakhoul for hjælp til prøve behandling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Tubes n/a n/a 1.5 mL
Chrome Steel Beads n/a n/a 3.2 mm x 3
Cortisol Kit Arbor Assays K003-H1W Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit Arbor Assays K003-H5 Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol n/a n/a HPLC Grade
Isopropanol n/a n/a HPLC Grade
Methanol n/a n/a HPLC Grade
Micro Pipette n/a n/a n/a
Micro Precision Sieve n/a n/a 0.5 mm
Microplate Reader Bio Radi n/a n/a
Microplate Washer Bio Radi n/a n/a
Orbital Shaker Bio Line n/a n/a
Plastic Weighing Boat n/a n/a n/a
Plate Sealer n/a n/a n/a
Precision Balance n/a n/a n/a
Vortex Mixer Eppendorf n/a n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
  2. Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
  3. Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World's Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615 (2017).
  4. MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
  5. Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
  6. Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
  7. Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).
  8. Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
  9. Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
  10. Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109 (2010).
  11. Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
  12. McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
  13. Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
  14. Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
  15. Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
  16. Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055 (2014).
  17. Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
  18. Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
  19. Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
  20. Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052 (2017).
  21. Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026 (2014).
  22. Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
  23. Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).
  24. Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
  25. Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177 (2016).
  26. Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
  27. Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
  28. Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).

Tags

Biokemi kronisk stress Koala glukokortikoider pels methanol ethanol isopropanol
Cortisol måling i Koala (<em>Phascolarctos cinereus</em>) pels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Charalambous, R., Narayan, E.… More

Charalambous, R., Narayan, E. Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur. J. Vis. Exp. (150), e59216, doi:10.3791/59216 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter