Summary
نقدم بروتوكول لتحديد المذيبات استخراج الأمثل لقياس الكورتيزول من الفراء كوالا. والمذيبات المستخدمة في هذا البروتوكول هي الميثانول والإيثانول والإيزوبروبانول. تحديد المذيبات استخراج الأمثل سوف تساعد في قياس موثوق الفراء لتحديد تأثير الإجهاد المزمن على الكوالا.
Abstract
الطرق المثلى لاستخراج هرمون المستخدمة لقياس الإجهاد في الحيوانات عبر أنواع العينة ليست دائماً هي نفسها. تواجه الأنواع المريخية الشهيرة في أستراليا، الكوالا(Phascolarctos cinereus)،التعرض لفترات طويلة لعوامل الإجهاد التي يسببها الإنسان وتقييم الإجهاد المزمن في السكان البرية له ما يبرره على وجه السرعة. واحدة من أكثر الطرق فعالية لقياس الإجهاد المزمن من خلال تحليل هرمون الكورتيزول الكورتيزول الكورتيزول في الشعر أو الفراء، كما أنه يدعم الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية. تهدف هذه الدراسة التحقق من صحة المختبر لاختبار التقنيات الحالية للتحقق من طريقة استخراج هرمون الأمثل لاستخدامها كتدبير غير الغازية من الكورتيزول في الفراء كوالا. ومن المسلم به أن استخدام التقنيات غير الغازية لقياس هرمونات الإجهاد هو المفضل على التقنيات التقليدية، الغازية بسبب وجهات نظرهم العملية والأخلاقية المثالية. بالإضافة إلى ذلك، فمن الأسهل نسبيا للحصول على الفراء من الكوالا مما هو عليه للحصول على عينات من دمائهم. استخدمت هذه الدراسة عينات من فرو الكوالا المكتسبة من مستشفى أديلايد كوالا والحياة البرية لتشغيل عدد من تقنيات استخراج الهرمونات في محاولة للتحقق من طريقة استخراج الكورتيزول الأمثل. وأظهرت النتائج أن الميثانول 100٪ قدم استخراج المذيبات الأمثل مقارنة مع الإيثانول 100٪ أو 100٪ isopropanol على أساس نتائج التوازي. وفي الختام، وفرت هذه الطريقة لاستخراج الكورتيزول من فرو كوالا اختباراً موثوقاً به غير الغازية يمكن استخدامه لدراسة الإجهاد المزمن في الكوالا.
Introduction
النظم الإيكولوجية الأسترالية تحافظ على حياة الإنسان من خلال توفير الخدمات بما في ذلك الغذاء والألياف من بين العديد من التفاعلات الدينامية الأخرى1. ومن المفارقات أن النشاط البشري هو الذي يعمل كمحرك مهيمن لاضطراب النظم الإيكولوجية من خلال تغيير التنوع البيولوجي2. إن تجزئة الموائل، المعروفة باسم عملية تقسيم الموائل المستمرة الكبيرة إلى بقع صغيرة من الأراضي، معزولة عن بعضها البعض، هي التغير الرئيسي في التنوع البيولوجي البشري المنشأ الذي يهدد النظم الإيكولوجية الأسترالية2. ويغير تجزؤ الموئل هيكل وتنوع تكوين الأنواع في أي منطقة معينة، مما يقلل من مساحة الموائل اللازمة لهذه الأنواع للحفاظ على تجمعات قابلة للحياة2. ونتيجة لذلك هو زيادة المنافسة بين الأنواع للموارد بما في ذلك الغذاء والوقود والألياف والمياه3. إن تدمير النظم الإيكولوجية الأسترالية من خلال تغيير التنوع البيولوجي له عواقب كارثية على العديد من الأنواع الأسترالية الأصلية1.
الأنواع المريخية الأكثر شهرة في أستراليا، والكوالا(Phascolarctos cinereus)،يعتمد على النظم الإيكولوجية الأسترالية تبقى صحية لبقائها4. وأدى إدخال التسوية الأوروبية إلى انخفاض سريع في عدد السكان الأستراليين من الكوالا، حيث ذبحوا بسبب رشقاتهم سعيا وراء الربح في تجارة تصدير ية كبيرة5. وقد حظرت هذه الممارسة في الثمانينات، ثم تمكن سكان الكوالا من تحقيق الاستقرار5. ومع ذلك، أدى النمو الأسي للسكان البشر في هذا النوع تتنافس على جزء كبير من بيئتها، وبقاءها هو مرة أخرى تحت التهديد6. ووفقا للاتحاد الدولي لحفظ الطبيعة، فإن جميع سكان الكوالا الأستراليين مدرجون في قائمة عرضة للانقراض مع انخفاض الاتجاه السكاني7. وتعزى هذه القائمة إلى عدم اليقين بشأن البارامترات السكانية ذات الصلة والتباين الملحوظ في الاتجاهات السكانية لهذا النوع7. وباعتبارها أكثر الحيوانات شهرة ومتوطنة، فإن الكوالا تعود بالفائدة إلى حد كبير على الاقتصاد الأسترالي من خلال السياحة (مكتب البيئة والتراث في نيو ساوث ويلز 2018). ويشير تقدير إلى أن السياحة ذات الصلة بالكوالا قد ولدت حوالي 9000 فرصة عمل وتسهم بما يتراوح بين 1.1 و2.5 مليار دولار في الاقتصاد (مكتب البيئة والتراث في نيو ساوث ويلز 2018). إزالة أي نوع واحد لديه القدرة على أن تكون كارثية، ويمكن أن ينظر إليها في الانخفاض المطرد للحياة البرية الأسترالية الأصلية6. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاقتصاد الأسترالي سوف يشعر العواقب إذا استمر سكان الكوالا الأسترالية في الانخفاض بمعدل6.
ويُقترح أن انتشار الوفيات والأمراض استجابة لتجزؤ الموائل هو نتيجة للإجهاد المزمن8. وبالفعل، أُعلن عن انقراض أربعة وعشرين نوعاً من الأنواع المريخية في أستراليا بسبب تجزؤ الموائل، مع اتباع الكوالا اتجاهاً مماثلاً8. إن تعقيد تجزؤ الموائل والنظم البيولوجية هو أمر تآزري ولكن يمكن تفكيكه من خلال تحليل الاستجابة للإجهاد6. عموما، أي اضطراب في محيط الحيوانات الطبيعية ينشط سلسلة معقدة من الأحداث العصبيةالهرمونية، والمعروفة باسم "القتال أو الطيران" استجابة 9،10. هذه الاستجابة للإجهاد هي العملية التي تبدأ في الدماغ حيث يتم تنشيط محور الغدة النخامية الغدة النخامية الغدة الكظرية (HPA)11. عنصر من الدماغ يسمى تحت المهاد النشرات هرمون الإفراج عن الكورتيكوتروفين (CRH), الذي يشير بعد ذلك الغدة النخامية الأمامية لإطلاق هرمون أدرينوكورتيكوتروبيوم (ACTH)11. وهذا بدوره يحفز إفراز الكورتيزون من النخاع الكظري. يقوم الجسم بتعميم الكورتيزون من خلال الدم، مما يحول تخزين الجلوكوز من الجليكوجين ويعبئ الجلوكوز من الجليكوجين المخزن11. هذه السلسلة من الأحداث العصبية الهرمونية هي الاستجابة المستخدمة من قبل الحيوان للتعامل مع المحفزات لا يمكن التنبؤ بها11. ومع ذلك ، عندما يتم إطلاق الكورتيزون وتبقى مرتفعة لفترة طويلة من الزمن ، يعتبر الحيوان يعاني من الإجهاد المزمن12،13. وتنطوي هذه العملية على تحويل الطاقة بعيدا عن الوظائف الجسدية البدنية الأخرى، حيث أنها ضرورية لإنتاج الغلوكوكورتيكود المستمر13. ونتيجة لذلك، يمكن للإجهاد المزمن أن يمنع النمو والإنجاب والمناعة، وكلها سمات اللياقة البدنية الرئيسية المطلوبة للبقاء على قيد الحياة14.
قياس إنتاج الحيوان غلوكوكورتيكود هو مؤشر شائع يستخدم لتحديد ما إذا كان الحيوان يعاني من الإجهاد الفسيولوجي15. للقيام بذلك، يمكن قياس الكورتيزون في بلازما الدم، المصل، اللعاب، البول أو البراز16. ومع ذلك، تشير الأدلة إلى أن الشعر هو مؤشر أكثر فعالية بكثير من الإجهاد المزمن، بدلا من16المذكورة أعلاه . ويرجع ذلك إلى أن الشعر يعتقد أن دمج الهرمونات المنقولة بالدم خلال مرحلة نموها; هو نسبيّا ثابتة; وأي الكورتيزول المكتشف في الشعر يعكس الإجهاد الفسيولوجي الذي عانى منه خلال فترة نمو الشعر، والذي يمكن أن يكون أسابيع حتى أشهر16. وعلاوة على ذلك، فإن أي مجموعة من الكورتيزول ينبغي أن تكون غير الغازية من أجل تقليل الإجهاد المرتبط ة التقاط والتعامل مع16. ومع ذلك، فإن أي الإجهاد من ذوي الخبرة خلال هذا الحدث لن يؤثر على مستويات الكورتيزون في الشعر16. كانت هناك العديد من الدراسات التي تستكشف كفاءة استخدام الشعر لقياس الإجهاد على المدى الطويل في عدد من الحيوانات، وتشمل دراسات عن الرنة، الدببة الأشيب، الحصى ريسوس، muskoxen، والدببة البني17،18، 19 سنة , 20 , 21.عادة ما يتم استخراج الكورتيزول الشعر عن طريق غسل العينة أولا لضمان العرق والزهم المستمدة من الكورتيزول المودعة على سطح الشعر لا يتم استخراج مشترك مع الكورتيزول ومن ثم سحق العينة في حبة الخافق22. بعد الغسيل، تحتاج العينة إلى تجفيفها لضمان التبخر الكامل22. وأخيرا، باستخدام المذيبات، يمكن استخراج العينة وإعادة تشكيلها لتسهيل اختبار الكورتيزول22. المذيب الأكثر شيوعا المستخدمة لاستخراج الكورتيزول من الفراء هو الميثانول21،23؛ ومع ذلك, هناك بعض الدراسات التي تستخدم الإيثانول وisopropanol في تقنيات استخراج الكورتيزول. على سبيل المثال، كانت دراسة استخدام الإيثانول ناجحة لاستخراج الكورتيزول من السائل السلوي البشري24. بالإضافة إلى ذلك، كانت دراسة التي استخدمت isopropanol ناجحة لاستخراج الكورتيزول من شعر الإنسان والأظافر25،26. ولهذا السبب، اختبرت هذه الدراسة جميع المذيبات الثلاثة (الميثانول والإيثانول والإيزوبروبانول) لتحديد أيهما كان الأكثر نجاحا لاستخراج الكورتيزول من عينات من فرو الكوالا.
وكان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة استخدام التقنيات الحالية للتحقق من صحة تقنية استخراج هرمون الأمثل لاستخدامها كتدبير غير الغازية من الكورتيزول من الفراء كوالا. وقد تحقق ذلك عن طريق اختبار ثلاثة مذيبات استخراج (الميثانول، الإيثانول، وإيزوبروبانول). افترضنا أن الميثانول سيكون المذيب الأمثل المستخدم لاستخراج الكورتيزول من فرو كوالا لأنه هو المذيب الموصى به لاستخراج من قبل شجرة اختبار الكورتيزول مجموعات27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم تنفيذ هذا المشروع في إطار مبادئ توجيهية صارمة لرعاية الحيوانات والبشر. منحت أخلاقيات الحيوان من قبل جامعة سيدني الغربية (A12373). بالإضافة إلى ذلك، تم تقديم تقييم المخاطر المختبرية والسلامة البيولوجية ونموذج الإشعاع وقبلت من قبل جامعة سيدني الغربية لإجراء هذا البحث بأمان (B12366).
ملاحظة: تم الحصول على عينات فرو كوالا لهذا المشروع من مستشفى أديلايد كوالا والحياة البرية، الواقع في 282 طريق أنزاك السريع، بليمبتون جنوب أستراليا. وقد أخذ الفراء من أحد الكوالا الذي أدخل المستشفى وتم نقله إلى المستشفى بسبب إصاباته الشديدة. وقد تم تخزين الكوالا المتوفى في فريزر داخل كيس جثة بعد وقت قصير من الوفاة. بعد إزالة الكوالا المتوفى من كيس الجسم، تم حلق 1.2 غرام من الفراء من مؤخر الرقبة باستخدام كليبرز الحيوان القياسية. تم حلق الفراء أقرب ما يمكن إلى الجلد، وذلك لضمان عدم قطع الجلد. وبمجرد حلقه، أعيد الكوالا المتوفى إلى كيس الجثة ووضع هافي الفريزر. ثم وضعت الفراء في كيس مصنوعة من رقائق الألومنيوم وتخزينها تحت -20 درجة مئوية. أثناء العبور، تم الاحتفاظ بالفراء في درجة الحرارة المحيطة، وعند وصوله إلى المختبر، تم تخزين الفراء في -80 درجة مئوية.
1. كوالا استخراج الكورتيزول الفراء
- قم بإزالة الفراء من التخزين عند -80 درجة مئوية واترك الوقت للذوبان.
- وزن الفراء على توازن الدقة التحليلية المختبرية.
- ضع 60 ملغ من الفراء في أنبوب طرد مركزي مُقاس مسبقًا وموسّم بـ 1.5 مل وكرر حتى يتم ملء 18 أنبوبًا.
ملاحظة: استُخدمت 18 عينة فرعية من الفراء في دراسة التحقق هذه. - إضافة 1 مل من 100٪ عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائلة (HPLC) الصف isopropanol إلى كل أنبوب باستخدام ماصة.
- عينات دوامة لمدة 30 s.
- سلالة كل عينة باستخدام منخل الدقة الدقيقة 0.5 مم وذلك لتحقيق فصل السائل والفراء.
- تخلص من السائل في حاوية نفايات.
- وضع كل عينة الفراء في قارب وزنها البلاستيك المسمى، ثم وضع في المجفف فراغ، وترك الفراء لتجف لمدة 3 أيام.
- مرة واحدة جافة تماما، ووضع كل عينة في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 مل وصفت.
- ضع كل عينة في مطحنة حبة مع 3 حبات من الصلب الكروم (3.2 ملم) وسحق لمدة 2 دقيقة في 30 يهز في الثانية الواحدة.
- ماصة 1.5 مل من تقنية الاستخراج الأولى (100٪ الإيثانول الصف التحليلي) إلى 6 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على عينة الفراء.
- أداء نفس ل100٪ الميثانول الصف التحليلي و 100٪ الصف التحليلي isopropanol حتى يتم تعبئة ثمانية عشر أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل.
- قم بغطاء كل أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل واحتضن في درجة حرارة الغرفة (RT) مع نبض مستمر باستخدام شاكر لمدة 3 ساعة.
- إزالة وإجهاد العينات باستخدام منخل الدقة الدقيقة 0.5 مم.
- نقل السائل إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الصغير بـ 1.5 مل مع ماصة مع ضمان التخلص من الفراء بشكل مناسب.
- استخراج المذيبات الجافة تماما تحت تيار من بخار N2 تحت خزانة الدخان.
- إعادة تشكيل استخراج عينة المجففة باستخدام 400 درجة مئوية من العازلة اختبار (تكوين المقدمة في مجموعة الكورتيزول التجارية؛ انظر جدولالمواد) و 100 درجة من الإيثانول الصف التحليلي 100٪.
ملاحظة: يمكن تخزين مقتطفات عينة في -80 .
2 - الضوابط الداخلية
- لجعل الضوابط، وجعل مجموعة من العينات المستخرجة مع مستويات هرمون عالية. لجعل هذا التجمع، حدد عينات من الحيوانات مع التعرض المعروف لإجهاد. على سبيل المثال، حدد عينات من الكوالا التي تم إنقاذها من الصدمة البيئية لأنها سوف تظهر عموما مستويات هرمون الكورتيزول عالية6.
- لجعل تجمع استخراج، واتخاذ 20 درجة مئوية من استخراج من كل عينة (ن = 10) حتى يتم الحصول على حجم إجمالي 200 درجة مئوية. يمكن تخزين تجمع استخراج في -80 C حتى الاختبارات. تشغيل التجمع في كل تسرب كعناصر تحكم داخلية منخفضة أو عالية (راجع الخطوة 2.2).
- للحصول على التبيّاب، استخدم المسبح لجعل الأسهم للضوابط المنخفضة والعالية التي تربط بنسبة 70% (C1) و30% (C2)، على التوالي. الحصول على عامل التخفيف لنقاط الربط 30٪ و 70٪ من الرسم البياني التوازيللمستخلص مقابل معيار الكورتيزول (الشكل 1). استخدم المخزن المؤقت للتحليل لتخفيف تجمع العينات. على سبيل المثال، استخدم 60 ميكرولتر من مستخلص التجمع و60 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاختبار للتخفيف 1:2.
ملاحظة: بالنسبة لاستخراج الميثانول، كانت نقطة الربط 30٪ في أنيق في حين أن 70٪ نقطة ملزمة كان ما يقرب من 1:2 وفقا للرقم 1. وهكذا، وفرت هذه العوامل عامل التخفيف للضوابط الداخلية (C1 و C2 على التوالي) لتشغيلها ضمن نطاق المراقبة.
3. تحليل الكورتيزول في مستخلصات الفراء كوالا
- استخدام مجموعة الكورتيزولالتجارية (جدول المواد) وإعداد لوحة قطاع جيدا 96 بما في ذلك العينات، والضوابط، ومعايير الكورتيزول، والآبار ملزمة غير محددة، والآبار ملزمة كحد أقصى وفقا لتعليمات المورد. استخدم ورقة تخطيط اللوحة المتوفرة في كتيب المجموعة لسرد مواضع العينات وعناصر التحكم والمعايير على خريطة اللوحة.
ملاحظة: من المستحسن تشغيل كافة العينات وعناصر التحكم والمعايير في تكرار للسماح بدقة النتائج. - جهزوا العينات اتبع استخراج هرمون الفراء (القسم 1) للحصول على 100٪ الميثانول المستخرجة الفراء كوالا.
- جهز الكواشف اتبع الإجراء الموضح في مجموعة الكورتيزول التجارية لإعداد الكواشف بما في ذلك (1) فحص العازلة، (2) غسل العازلة، و (3) المعايير (التراكيب المقدمة في مجموعة الكورتيزول، جدولالمواد).
- وفقا للتعليمات المقدمة في مجموعة الكورتيزول، pipet 50 ميكرولتر من العينات أو المعايير في الآبار في لوحة. الأنابيب 75 درجة مئوية و 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للبفحص في آبار الربط غير المحددة (NSB) وآبار الربط القصوى (B0 أو صفر قياسي)، على التوالي.
- إضافة 25 درجة مئوية من متقارن الكورتيزول إلى كل بئر باستخدام أنبوب مكرر. ثم pipet 25 درجة مئوية من الأجسام المضادة الكورتيزول في كل بئر، باستثناء الآبار NSB. اضغط بلطف على جانبي اللوحة للتأكد من أن الكواشف مختلطة بشكل جيد.
- تغطية لوحة مع السدادة لوحة ويهز في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة (بسرعة بطيئة) باستخدام شاكر المدارية.
- إزالة السدادة لوحة وأسق لوحة جيدا عن طريق غسل كل بئر مع 300 درجة مئوية من العازلة غسل 4 مرات.
- تجفيف لوحة عن طريق النقر على لوحة على المناشف ماصة نظيفة.
- ماصة 100 ميكرولتر من رباعي ميثيل البنزادين (TMB) الركيزة (تكوين المقدمة في مجموعة الكورتيزول، جدولالمواد) إلى كل بئر.
- ضع السدادة لوحة على لوحة جيدا وحضانة في RT لمدة 30 دقيقة.
- ماصة 50 درجة مئوية من وقف الحل لكل بئر.
- وضع لوحة جيدا في قارئ لوحة قادرة على قراءة 450 نانومتر.
- لحساب تركيز الهرمون النهائي، تستمد تركيز الكورتيزول الفراء النهائي في نانوغرام / ملغ من العينة عن طريق ضرب تركيز هرمون PG /مل مع حجم استخراج النهائي (0.5 مل) والقسمة على كتلة عينة الفراء (60 ملغ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تحديد الكشف عن اختبار الأيض هرمون من الفائدة باستخدام التوازي. باستخدام منحنى التوازي، تحدد نقطة الربط 50٪ أيضًا عامل تخفيفالعينة على المنحنى القياسي (الشكل 1). كما هو مبين فيالرسم البياني التوازي (الشكل 1)، والإيثانول 100٪ و100٪ مقتطفات Isopropanol لم توفر الإزاحة موازية ضد معيار الكورتيزول. ومع ذلك، فإن استخراج الميثانول 100٪ قدمت الإزاحة موازية ضد معيار الكورتيزول. تم تشغيل المستخلصات المجففة أنيق من خلال التخفيف في العازلة اختبار (100 درجة مئوية من الإيثانول 100٪ و 400 درجة مئوية من العازلة اختبار).
تم تحديد معاملات التباين داخل (داخل) وبين (بين) من أعلى مستوى (حوالي 70٪) ومنخفضة (حوالي 30٪) يتم تشغيل مقتطفات عينة ملزمة في جميع الاختبارات. استناداً إلى الرسمالبياني المتوازي (الشكل 1)، كانت الضوابط الداخلية الملزمة 30٪ (منخفضة) تجمع استخراج كوالا أنيق في حين أن 70٪ (عالية) الضوابط الداخلية ملزمة كانت 1:2 المخفف ة تجمع استخراج كوالا. وكانت نسبة السيرة الذاتية للضوابط الداخلية الداخلية العالية والمنخفضة <15%.
يمكن تحديد هامش الخطأ داخل الفحص باستخدام مراقبة الجودة بما في ذلك معاملات التباين داخل وبين الفحص، والتي يجب أن تكون <15%. تم حساب حساسية التقدير على أنها القيمة 2 الانحرافات المعيارية من متوسط استجابة العينات فارغة (صفر الربط)، وأعرب عن 81.26 pg/well.
الشكل 1: التوازي من الفراء كوالا مجمعة المستخرجة باستخدام 3 المذيبات المختلفة (100٪ الإيثانول، 100٪ إيزوبروبانول أو 100٪ الميثانول) ضد منحنى الكورتيزول القياسية تحت الكورتيزول إنزيم المناعية. B/TB هي النسبة المئوية للربط على إجمالي الربط. وقد تم توفير عامل التخفيف التسلسلي (على سبيل المثال، 1:2X متوسط عامل التخفيف من 2) جنبا إلى جنب مع تركيز كل معيار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ثانيا، تم تحديد الارتباط بين كل استخراج المذيبات ومعيار الكورتيزول باستخدام مؤامرة الانحدار (الشكل2). كما هو مبين في الشكل2، قدم استخراج الميثانول 100٪ أفضل خط الانحدار مع أعلى قيمة R2 مقارنة مع الإيثانول 100٪ و100٪ مقتطفات isopropanol.
الشكل 2: قطع الانحدار للربط بالنسبة المئوية لمعيار الكورتيزول مقابل كل من المذيبات الثلاثة (الإيثانول والميثانول والإيزوبروبانول) المستخدمة لاستخراج فرو الكوالا. تم الحصول على قيمة R2 من خط الملاءمة الأنسب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وعلاوة على ذلك، تم اختبار المجموعة الفرعية من فرو الكوالا المستخرج باستخدام كل من المذيبات الثلاثة وترد النتائج في الجدول 1 أدناه. وكما هو مبين في الجدول1، فإن التركيز الملاحظ لمعيار الكورتيزول كان في حدود 2879.61-125.70 بيكوغرام/بئر. لا يمكن لطريقة استخراج الإيثانول أو الإيزوبروبانول تحقيق الاتساق في النتيجة حيث أن تركيزات استخراج الفراء التي تم الحصول عليها باستخدام أي من الطرق أسفرت عن مجموعة عالية جداً من تركيزات الهرمونات (انظر أرقام الجدول 1 التي تم وضع علامة عليها باللون الأحمر)، والتي كانت تتجاوز حد الكشف عن اكتشاف اكتشاف الكورتيزول. ومع ذلك، أدت مقتطفات الميثانول إلى تركيزات الكورتيزول ضمن نطاق معيار الكورتيزول (كما هو مبين في الأرقام السوداء الجريئة في الجدول1). وعلاوة على ذلك، كانت تركيزات الكورتيزول الفراء المكتشف باستخدام طريقة استخراج الميثانول متسقة للغاية مقارنة بالنتائج التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقتين الأخريين (انظر الجدول1). وهكذا، نحن نقبل فرضية فارغة أن الميثانول هو المذيب الأكثر ملاءمة لاستخراج هرمون الفراء كوالا بالمقارنة مع الإيثانول وisopropanol.
الجدول 1: تركيز الكورتيزول (نانوغرام/مغ) لفرو الكوالا (n = 18) المستخرج باستخدام 3 مذيبات مختلفة (الإيثانول، الإيزوبروبانول أو الميثانول) ويتعارض مع منحنى الكورتيزول القياسي تحت اختبار إنزيم الكورتيزول المناعي. وتظهر الأرقام الحمراء الجريئة تركيزات غير متناسقة لمستخلصات الإيثانول والإيزوبروبانول التي كانت خارج نطاق التصاق (pg/well). تظهر الأرقام السوداء الجريئة تركيزات الكورتيزول الفراء المستخرجة باستخدام الميثانول التي تقع ضمن نطاق معايير الكورتيزول (pg/well). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك عدد من الدراسات التي تستخدم مجموعة من التقنيات للكشف عن الكورتيزول في الفراء الثدييات. تعرض هذه الدراسة نتائج للكشف عن الكورتيزول في الفراء الذي تم جمعه من كوالا البرية المعرضة للإجهاد البشري الحالي. استخدمت هذه الدراسة الرائدة الفراء لاختبار أي من المذيبات الثلاثة شائعة الاستخدام هي الأفضل في استخراج الكورتيزول، وهو مقياس للإجهاد المزمن، من الفراء كوالا. وأظهرت النتائج أن الميثانول 100٪ كان المذيب الموصى به لاستخراج الكورتيزول في هذا النوع من الفراء الثدييات.
الإيثانول والميثانول وإيزوبروبانول كلها الكحول الأولية التي يتم المستعبدين من جزيئات الهيدروجين وتستخدم عادة كمذيبات في تجارب استخراج هرمون28. وعموما، تذوب المواد القطبية على أفضل وجه في المواد القطبية الأخرى، في حين أن المواد غير القطبية تذوب على أفضل وجه في المواد غير القطبية الأخرى. مجموعة الكحول التي تحتوي على الميثانول هو القطبية جدا، في حين أن مجموعة الكحول التي تحتوي على إيزوبروبانول غير القطبية جدا. بسبب بنيتها الجزيئية، مجموعة الكحول التي تحتوي على الإيثانول لديه ميزة كونها على حد سواء المذيبات القطبية وغير القطبية. تعتبر هرمونات الستيرويد مثل الكورتيزول غير القطبية, وهذا يعني أن الكورتيزول ينبغي أن يكون لها ارتباط ملزم قوي مع المذيبات القطبية.
ولإجراء تحليل أشمل لمذيبات الاستخراج المستخدمة لتقييم الإجهاد الفسيولوجي في فرو الكوالا، ينبغي أن تحاول مشاريع البحوث المستقبلية أساليب متطابقة بهذا الترتيب على النحو المبين في الشكل 3. وقد أجريت دراسات مماثلة تاريخيا غسل قبل طحن22، وذلك لضمان عدم وجود عرق غير مقصود و / أو الزهم المستمدة الكورتيزول المودعة في عينة الفراء. وعلاوة على ذلك، من المهم أن قياس الكورتيزول وحده لا يمكن أن يضمن إشارة كاملة من الإجهاد المزمن. قراءات الكورتيزول الشعر هي أداة قيمة عند محاولة فهم الإجهاد الفسيولوجي الذي يعاني منه الحيوان، ولكن يمكن أن يحدث ارتفاع نشاط HPA في ظل مجموعة متنوعة من الظروف بما في ذلك ممارسة الرياضة البدنية، وتشوهات التمثيل الغذائي ووجود الأمراض المعدية22. وتشمل العوامل الهامة الأخرى التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار إلى سلامة الرئيسية للبيانات الهرمونية ما يلي. (1) المستوى المقبول للخطأ العشوائي - يجب أن يتم متوسط معاملات التباين التي يتم الحصول عليها من الضوابط الداخلية (CV1 و CV2) إلى <15% لجميع الاختبارات. (2) خطأ عشوائي داخل عينة فحص، يجب أن يكون عينات مكررة تعمل على كل لوحة السيرة الذاتية٪ من <15٪؛ وإلا فإن العينة سوف تحتاج إلى إعادة تشغيل. (3) حد الكشف عن اختبار - تركيز هرمون كميا داخل كل اختبار ينبغي أن يكون ضمن حد الكشف عن اختبار (بين قراءات لأعلى تخفيف ومعيار أنيق)؛ وإلا فقد تتطلب العينات المزيد من التخفيف (إذا كانت المستويات المكتشفة للعينات أكبر من تركيز المعيار الدقيق) أو قد لا يتم تحليلها ضمن التصنيف (إذا كانت المستويات المكتشفة للعينات أقل من تركيز أعلى المستويات المخففة القياسية). (4) حساسية الفحص - وهذا يمكن أن يتأثر بقراءة الخلفية (ملزمة غير محددة)، وبالتالي من المهم الحفاظ على أعلى مستوى من ضمان الجودة للفحص (على سبيل المثال، يجب أن تكون مزودة بمعدات مثل غسالة الألواح وقارئ الألواح مخدومة بانتظام). (5) عينة استخراج التجفيف - هذه الخطوة يمكن أن يؤدي إلى احتمال التلوث المتبادل أو فقدان العينات. ويوصى بتجفيف العينات تحت بخار غاز N2 على حدة واستبدال ماصة باستور المستخدمة للاستخراج بين كل عينة.
الشكل 3: رسم بياني للتدفق المفاهيمي يبين الخطوات الرئيسية التي ينطوي عليها الانزيم المناعي للإزيمات المناعية (EIA) لفرو الكوالا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الإجراء المبين في هذهالدراسة (الشكل 3) هو الإجراء الذي يمكن تكراره بسهولة لأنه من السهل نسبياً القيام به، منهجية خطوة بخطوة تتضمن المواد الكيميائية المتاحة بسهولة، والكواشف، والإمدادات مع المعدات التي من المرجح أن تكون وجدت في مختبر تحليلي قياسي. تطبيق هذه الدراسة تمكن تقنية غير الغازية لاستخدامها لتقييم الإجهاد الفسيولوجي في كل من الكوالا البرية والأسيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من خلال تمويل البحوث الناشئة لإدوارد نارايان من خلال جامعة سيدني الغربية، كلية العلوم والصحة. ويشكر المؤلفون جاك نخول على مساعدته في معالجة العينات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
| Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
| DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
| Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
| Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
| Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
| Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
| Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
| Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
| Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
| Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
| Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |
References
- Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
- Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
- Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World's Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615 (2017).
- MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
- Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
- Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
- Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).
- Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
- Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
- Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109 (2010).
- Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
- McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
- Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
- Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
- Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
- Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055 (2014).
- Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
- Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
- Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
- Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052 (2017).
- Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026 (2014).
- Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).
- Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
- Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177 (2016).
- Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
- Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).
