Summary
We presenteren een protocol om te bepalen van de optimale extractie oplosmiddel voor het meten van cortisol van Koala vacht. De in dit Protocol gebruikte oplosmiddelen zijn methanol, ethanol en isopropanol. Het bepalen van een optimaal extractieoplosmiddel zal helpen bij het betrouwbaar meten van de vacht om de impact van chronische stress op koala's te bepalen.
Abstract
Optimale methoden van hormoon extractie gebruikt voor het meten van stress bij dieren over de monster soorten zijn niet altijd hetzelfde. De iconische marsupiale soort van Australië, de Koala (Phascolarctos cinereus), wordt geconfronteerd met langdurige blootstelling aan antropogene-geïnduceerde stressoren en de beoordeling van chronische stress in wilde populaties is dringend gerechtvaardigd. Een van de meest effectieve manieren om chronische stress te meten is door het analyseren van het Glucocorticoïde hormoon cortisol in haar of vacht, omdat het fysiologische en gedragsmatige reacties ondersteunt. Dit laboratorium validatie studie is bedoeld om te testen van de huidige technieken voor het valideren van een optimale hormoon extractiemethode te gebruiken als een niet-invasieve maatregel van cortisol in Koala vacht. Het is bekend dat het gebruik van niet-invasieve technieken voor het meten van stresshormonen de voorkeur heeft boven traditionele, invasieve technieken vanwege hun ideale praktische en ethische standpunten. Bovendien is het relatief gemakkelijker om bont van koala's te verwerven dan om monsters van hun bloed te verwerven. Deze studie gebruikte monsters van Koala bont verworven van de Adelaide Koala en Wildlife Hospital om een aantal hormoon extractietechnieken uit te voeren in een poging om een optimale cortisol extractiemethode te valideren. De resultaten toonden aan dat 100% methanol de meest optimale oplosmiddelextractie leverde ten opzichte van 100% ethanol of 100% isopropanol op basis van parallellisme resultaten. Concluderend, deze methode van cortisol extractie van Koala bont verstrekt een betrouwbare niet-invasieve assay die kan worden gebruikt voor het bestuderen van chronische stress in koala's.
Introduction
Australische ecosystemen ondersteunen het menselijk leven door het leveren van diensten, waaronder voedsel en vezels onder vele andere dynamische interacties1. Ironisch genoeg is het menselijke activiteit die opereert als de dominante drijfkracht van ecosysteem verstoring door biodiversiteits verandering2. Habitat fragmentatie, bekend als het proces van het verdelen van grote continue habitats in kleine stukjes land, geïsoleerd van elkaar, is de belangrijkste antropogene biodiversiteits verandering die de Australische ecosystemen2bedreigt. Habitat fragmentatie wijzigt de structuur en diversiteit van de soortensamenstelling in een bepaald gebied, waardoor het gebied van habitat dat voor deze soorten nodig is, wordt verminderd om levensvatbare populaties2te behouden. Het resultaat hiervan is een toegenomen concurrentie tussen soorten voor hulpbronnen, waaronder voedsel, brandstof, vezels en water3. De vernietiging van de Australische ecosystemen door het veranderen van biodiversiteit heeft catastrofale gevolgen voor veel Australische inheemse soorten1.
De meest iconische marsupiale soort van Australië, de Koala (Phascolarctos cinereus), is afhankelijk van de Australische ecosystemen die gezond blijven voor hun overleving4. De invoering van de Europese nederzetting veroorzaakte een snelle afname van de Australische populaties koala's, omdat ze werden geslacht voor hun pelten in de winstbejag in een grote export handel5. Deze praktijk werd verboden in de jaren 1980 en populaties van koala's waren dan in staat om te stabiliseren5. Echter, exponentiële groei van de menselijke bevolking heeft geresulteerd in deze soort concurreren voor een groot deel van hun habitat, en hun overleving is weer onder bedreiging6. Volgens de Internationale Unie voor het behoud van de natuur (IUCN) worden alle populaties van Australische koala's als kwetsbaar voor uitsterven vermeld met een dalende bevolkings trend7. Deze vermelding wordt toegeschreven aan de onzekerheid rond relevante bevolkings parameters en een duidelijke variatie in bevolkings trends voor deze soort7. Als de meest iconische en endemische dieren, koala's profiteren grotendeels de Australische economie door middel van toerisme (NSW kantoor van milieu en erfgoed 2018). Een schatting suggereert dat Koala gerelateerd toerisme ongeveer 9.000 banen heeft opgeleverd en bijdraagt tussen $1,1 en $2.500.000.000 aan de economie (NSW Office of Environment en Heritage 2018). Het verwijderen van één soort heeft het potentieel catastrofaal te zijn, en is te zien in de gestage achteruitgang van inheemse Australische fauna6. Bovendien, de Australië economie zal de consequenties voelen als de populaties van de Australische koala's blijven dalen tegen het tarief dat ze zijn6.
Er wordt gesuggereerd dat de prevalentie van dood en ziekte in reactie op habitatfragmentatie het resultaat is van chronische stress8. Al vierentwintig buideldier soorten zijn verklaard uitgestorven in Australië als gevolg van habitatfragmentatie, met koala's volgens een soortgelijke trend8. De complexiteit van habitatfragmentatie en biologische systemen is synergetisch, maar kan worden uitgepakt door analyse van de stressrespons6. Over het algemeen activeert elke verstoring in een natuurlijke omgeving van dieren een complexe cascade van neurohormonale gebeurtenissen, bekend als een ' gevecht of vlucht ' reactie9,10. Deze reactie op stress is een proces dat begint in de hersenen waar de hypothalamische-hypofyse-adrenale (HPA) as is geactiveerd11. Een onderdeel van de hersenen genaamd de hypothalamus releases corticotrophin-releasing hormoon (CRH), die vervolgens signalen van de anterieure hypofyse om adrenocorticotrofische hormoon (ACTH)11vrijgeven. Dit stimuleert op zijn beurt de Glucocorticoïde secretie van de bijnier Medulla. Het lichaam circuleert glucocorticoïden door het bloed, die de opslag van glucose uit glycogeen afleidt en glucose van opgeslagen glycogeen11mobiliseert. Deze cascade van neurohormonale gebeurtenissen is de reactie die door het dier wordt gebruikt om te gaan met onvoorspelbare stimuli11. Echter, wanneer glucocorticoïden vrijkomen en gedurende langere tijd verhoogd blijven, wordt het dier geacht chronische stress12,13te ervaren. Dit proces omvat het afleiden van energie uit de buurt van andere corporale lichaamsfuncties, omdat het nodig is voor lopende Glucocorticoïde productie13. Als gevolg daarvan, chronische stress kan het verbieden van groei, reproductie en immuniteit, alle belangrijke fitness eigenschappen die nodig zijn voor overleving14.
Het meten van de Glucocorticoïde productie van een dier is een veelgebruikte indicator die wordt gebruikt om te bepalen of het dier fysiologische stress ondervindt15. Om dit te doen, glucocorticoïden kunnen worden gemeten in bloed plasma, serum, speeksel, urine of feces16. Echter, bewijs suggereert dat haar een veel effectievere indicator van chronische stress, in tegenstelling tot de bovengenoemde16. Dit komt omdat haar wordt verondersteld te nemen bloed-overgedragen hormonen tijdens de groeifase; het is relatief stabiel; en elke cortisol gedetecteerd in haar weerspiegelt fysiologische stress ervaren over de periode van haargroei, die kan worden weken tot en met maanden16. Bovendien moet elke verzameling van cortisol niet-invasief zijn om de stress die gepaard gaat met het opvangen en hanteren van16te minimaliseren. Echter, elke stress ervaren tijdens dit evenement zou geen invloed hebben op Glucocorticoïde spiegels in haar16. Er zijn veel studies geweest die de vaardigheid van het gebruik van haren onderzoeken om lange termijn stress in een aantal dieren te meten, en omvatten studies over rendieren, grizzly beren, rhesus-apen, muskoxen en bruine beren17,18, 19 , 20 , 21. haar cortisol wordt meestal geëxtraheerd door het eerste wassen van het monster om ervoor te zorgen zweet en sebum-afgeleide cortisol afgezet op het oppervlak van het haar is niet co-geëxtraheerd met cortisol en vervolgens verpulveren het monster in een kraal-klopper22. Na het wassen moet het monster worden gedroogd om volledige verdamping te garanderen22. Tot slot, met behulp van een oplosmiddel, kan het monster worden geëxtraheerd en gereconstitueerd om de assay van cortisol22te vergemakkelijken. Het meest voorkomende oplosmiddel dat wordt gebruikt om cortisol uit de vacht te halen, is methanol21,23; echter, er zijn enkele studies die gebruik maken van ethanol en isopropanol in hun cortisol extractietechnieken. Bijvoorbeeld, een studie die ethanol gebruikte was succesvol voor het extraheren van cortisol uit humaan vrucht vocht24. Bovendien was een studie waarin isopropanol werd gebruikt succesvol voor het extraheren van cortisol uit menselijk haar en nagels25,26. Om deze reden testte deze studie alle drie de oplosmiddelen (methanol, ethanol en isopropanol) om te bepalen welke het meest succesvol was voor extractie van cortisol uit monsters van Koala vacht.
Het primaire doel van deze studie was het gebruik van de huidige technieken om te valideren van een optimale hormoon extractietechniek te worden gebruikt als een niet-invasieve maatregel van cortisol van Koala vacht. Dit werd bereikt door het testen van drie extractiemiddelen (methanol, ethanol en isopropanol). We veronderstelde dat methanol zal het optimale oplosmiddel gebruikt voor het uitpakken van cortisol van Koala vacht omdat het de aanbevolen oplosmiddel van extractie door Arbor assay cortisol kits27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit project werd uitgevoerd onder strikte richtlijnen voor dier-en menselijke zorg. De ethiek van dieren werd verleend door de Western Sydney University (A12373). Daarnaast werden een laboratorium risicobeoordeling en bioveiligheid en stralings vorm ingediend en aanvaard door de Western Sydney University om dit onderzoek veilig uit te voeren (B12366).
Opmerking: Koala fur monsters voor dit project zijn verkregen uit het Adelaide Koala and Wildlife Hospital, gelegen aan de 282 Anzac Highway, Plympton South Australia. Bont werd genomen van een Koala die in het ziekenhuis was toegelaten en werd geëuriseerd als gevolg van hun ernstige verwondingen. De overleden Koala was kort na de dood opgeslagen in een diepvrieskast in een body Bag. Na het verwijderen van de overleden Koala uit de Body tas, werd 1,2 g bont geschoren uit de nek van de hals met behulp van standaard dieren tondeuses. De vacht was zo dicht mogelijk bij de huid geschoren, om ervoor te zorgen dat de huid niet werd gesneden. Eenmaal geschoren, werd de overleden Koala terug in de Body Tas gezet en in de vriezer geplaatst. De vacht werd vervolgens geplaatst in een zakje gemaakt van aluminiumfolie en bewaard onder-20 °C. Tijdens het transport werd de vacht op omgevingstemperatuur gehouden en bij aankomst in het laboratorium werd de vacht bewaard bij-80 °C.
1. koala bont cortisol extractie
- Verwijder de vacht van de opslag bij-80 °C en laat de tijd ontdooien.
- Weeg de vacht af op een laboratoriumanalyse precisie balans.
- Plaats 60 mg van de vacht in een voorgewogen en gelabelde centrifugebuis van 1,5 mL en herhaal dit tot 18 tubes zijn gevuld.
Opmerking: voor dit valideringsonderzoek zijn 18 bont submonsters gebruikt. - Voeg met behulp van een pipet 1 mL 100% High-Performance vloeistofchromatografie (HPLC)-kwaliteit isopropanol toe aan elke buis.
- Vortex samples voor 30 s.
- Rek elk monster met een micro precisie zeef van 0,5 mm om de scheiding van vloeistof en bont te bereiken.
- Gooi de vloeistof weg in een afvalbak.
- Plaats elk bont monster in een gelabelde plastic weeg boot en plaats het in een vacuümexsiccator, laat de vacht 3 dagen drogen.
- Eenmaal volledig droog, plaats elk monster in een gelabelde 1,5 mL micro centrifugebuis.
- Plaats elk monster in een kraal molen met 3 chroomstalen kralen (3,2 mm) en pulverize voor 2 min bij 30 shakes per seconde.
- Pipetteer 1,5 mL van de eerste extractietechniek (100% analytische kwaliteit ethanol) in 6 1,5 mL microcentrifugebuisjes die het bont monster bevatten.
- Voer hetzelfde uit voor 100% analytische kwaliteit methanol en 100% analytische kwaliteit isopropanol tot achttien 1,5 mL micro centrifugebuizen zijn gevuld.
- Dop elke micro centrifugebuis van 1,5 mL en incuberen bij kamertemperatuur (RT) met constante pulserende met een shaker voor 3 uur.
- Verwijder en stam monsters met een 0,5 mm micro-precisie zeef.
- Breng de vloeistof over in een nieuwe, gelabelde micro centrifugebuis van 1,5 mL met een pipet en zorg ervoor dat de vacht op de juiste manier wordt weggegooid.
- Volledig droog oplosmiddel extract onder een stroom van N2 damp onder een rookkast.
- Reconstitueer het gedroogde monsterextract met 400 μL test buffer (samenstelling in de commerciële cortisol Kit; Zie tabel met materialen) en 100 μL van 100% analytische kwaliteit ethanol.
Opmerking: monsterextracten kunnen worden opgeslagen bij-80.
2. interne controles
- Om controles te maken, maken een pool van geëxtraheerde monsters met hoge hormoonspiegels. Selecteer monsters van dieren met bekende blootstelling aan stressor om deze groep te maken. Bijvoorbeeld, selecteer monsters van koala's die zijn gered van milieu trauma omdat ze over het algemeen hoge cortisol hormoonniveaus6zullen vertonen.
- Om de extract pool te maken, neemt u 20 μL extract van elk monster (n = 10) tot een totaal volume van 200 μL wordt verkregen. De extractie pool kan worden opgeslagen bij-80 C tot en met assays. Voer de pool in elke assay uit als lage of hoge interne controles (zie stap 2,2).
- Gebruik voor de test de pool om voorraden te maken voor lage en hoge controles die binden op respectievelijk 70% (C1) en 30% (C2). Verkrijgen van de verdunningsfactor voor de 30% en 70% bindende punten van de parallellisme grafiek voor het extract tegen de cortisol norm (Figuur 1). Gebruik de test buffer voor verdunning van de monster pool. Gebruik bijvoorbeeld 60 μL van het pool extract en 60 μL test buffer voor 1:2 verdunning.
Opmerking: voor het methanol-extract was het bindende punt van 30% netjes, terwijl 70% bindend punt ongeveer 1:2 was, zoals per Figuur 1. Deze waren dus voorzien van de verdunningsfactor voor de interne controles (respectievelijk C1 en C2) voor de uitvoering binnen de test.
3. cortisol-analyse in Koala bont extracten
- Gebruik een commerciële cortisol Kit (tabel van de materialen) en zet de 96 goed STRIPPLAAT met inbegrip van de monsters, controles, cortisol normen, niet-specifieke bindende putten, en maximale binding putten volgens de instructies van de leverancier. Gebruik het Plate layout sheet in het Kit boekje om de posities van samples, Controls en Standards op de plaat kaart te vermelden.
Opmerking: het wordt aanbevolen dat alle voorbeelden, besturingselementen en standaarden in tweevoud worden uitgevoerd om nauwkeurigheid van resultaten mogelijk te maken. - Monsters voorbereiden. Volg de pels hormoon-extractie (sectie 1) om 100% methanol geëxtraheerd Koala vacht te verkrijgen.
- Bereid de reagentia voor. Volg de procedure beschreven in de commerciële cortisol Kit om de reagentia voor te bereiden, inclusief (1) test buffer, (2) wasbuffer, en (3) normen (composities in de cortisol Kit, tabel met materialen).
- Volgens de instructies in de cortisol Kit, pipet 50 μL monsters of normen in putjes in de plaat. Pipet 75 μL en 50 μL van de test buffer in de niet-specifieke binding (NSB) putten en de maximale binding (B0 of Zero Standard) Wells, respectievelijk.
- Voeg 25 μL van het cortisol conjugaat toe aan elk goed met behulp van een repeater pipet. Pipet dan 25 μL van het cortisol-antilichaam in elk putje, behalve de NSB-putten. Tik zachtjes op de zijkanten van de plaat om er zeker van te zijn dat de reagentia goed gemengd zijn.
- Bedek de plaat met de plaat sealer en schud bij kamertemperatuur gedurende 1 uur (bij trage snelheid) met behulp van een rondschudapparaat.
- Verwijder de plaat sealer en zuig de goed plaat door elke put met 300 μL wasbuffer 4 keer te wassen.
- Droog de plaat door op de plaat te tikken op schone, absorberende handdoeken.
- Pipetteer 100 μL tetramethylbenzadine (TMB) substraat (samenstelling in de cortisol Kit, tabel van de materialen) aan elke put.
- Plaats de plaat sealer op de put en inincuberen bij RT gedurende 30 minuten.
- Pipetteer 50 μL stop oplossing voor elke put.
- Plaats de goed plaat in een plaat lezer die in staat is om 450 nm te lezen.
- Voor het berekenen van de uiteindelijke hormoon concentratie, afleiden van de uiteindelijke vacht cortisol concentratie in ng/mg van het monster door vermenigvuldiging van de PG/mL hormoon concentratie met het uiteindelijke extract volume (0,5 mL) en delen door de massa van de vacht monster (60 mg).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assay detectie van hormoon metabolieten van belang wordt bepaald met behulp van parallellisme. Met behulp van een parallellisme curve bepaalt het binding punt 50% ook de monster verdunningsfactor op de standaard curve (Figuur 1). Zoals weergegeven in de parallellisme grafiek (Figuur 1), hebben de 100% ethanol en 100% Isopropanolextracten geen parallelle verplaatsing tegen de cortisol norm opgeleverd. Echter, de 100% methanol extract voorzag parallel verplaatsing tegen de cortisol-standaard. Gedroogde extracten werden netjes uitgevoerd door verdunning in de test buffer (100 μL van 100% ethanol en 400 μL test buffer).
Intra-(binnen) en inter-(tussen) assay coëfficiënten van variatie (CV) werden bepaald van hoog-(ongeveer 70%) en laag-(ongeveer 30%) bindende monsterextracten worden uitgevoerd in alle assays. Op basis van de parallellisme grafiek (Figuur 1), de 30% (lage) bindende interne controles waren nette Koala extract pool terwijl de 70% (hoge) bindende interne controles waren 1:2 verdunde Koala extract pool. CV% voor interne hoge en lage interne controles waren < 15%.
De foutmarge binnen de test kan worden bepaald aan de hand van kwaliteitscontrole, met inbegrip van de intra-en interassay-coëfficiënten van variatie, die moeten worden < 15%. De gevoeligheid van de assay werd berekend als de waarde 2 standaardafwijkingen van de gemiddelde respons van de blanco (nulbinding) monsters, en uitgedrukt als 81,26 PG/well.
Figuur 1: parallellisme van gepoolde Koala pels, geëxtraheerd met 3 verschillende oplosmiddelen (100% ethanol, 100% isopropanol of 100% methanol) tegen cortisol-standaard curve onder een cortisol-enzym-immunoassay. B/TB is het percentage binding over totale binding. De seriële verdunningsfactor (bijv. 1:2X gemiddelde verdunningsfactor 2) is samen met de concentratie van elke norm verstrekt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Ten tweede werd de koppeling tussen elk oplosmiddel extract en de cortisol norm bepaald met behulp van een regressie plot (Figuur 2). Zoals weergegeven in Figuur 2, voorzag het 100% methanol extract in de beste regressielijn met de hoogste R2 -waarde ten opzichte van de 100% ethanol en 100% isopropanolextracten.
Figuur 2: regressie plots voor percentage binding van de cortisol norm tegen elk van de 3 oplosmiddelen (ethanol, methanol en isopropanol) die worden gebruikt om Koala pels te extraheren. De R2 -waarde is verkregen uit de lijn van de beste pasvorm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Verder werden de onderstellen van Koala pels die met elk van de drie oplosmiddelen werden geëxtraheerd, onderzocht en de resultaten worden gegeven in tabel 1 hieronder. Zoals weergegeven in tabel 1, de waargenomen concentratie van cortisol standaard was binnen het bereik van 2879.61-125.70 PG/well. Noch de ethanol-of isopropanol-extractiemethode kan consistentie in het resultaat bereiken, omdat de pels extract concentraties verkregen met behulp van een van de methoden resulteerden in een zeer hoog min-max bereik van hormoon concentraties (Zie tabel 1 getallen gemarkeerd in rood), die buiten de aantoonbaarheidsgrens van de cortisol assay stonden. De extracten van methanol resulteerden echter in cortisol concentraties binnen het bereik van de cortisol norm (zoals weergegeven in vetgedrukte zwarte getallen in tabel 1). Bovendien was de concentratie van bont cortisol gedetecteerd met behulp van methanol extractiemethode zeer consistent in vergelijking met de resultaten verkregen met behulp van de andere twee methoden (Zie tabel 1). Zo accepteren we de nulhypothese dat methanol het meest geschikte oplosmiddel is voor koala-hormoon extractie in vergelijking met ethanol en isopropanol.
Tabel 1: de cortisol concentratie (ng/mg) voor koala Pels (n = 18) geëxtraheerd met behulp van 3 verschillende oplosmiddelen (ethanol, isopropanol of methanol) en uitgevoerd tegen cortisol standaard curve onder een cortisol enzym-immunoassay. Vet rode getallen vertonen inconsistente concentraties voor extracten van ethanol en isopropanol die buiten het testbereik liggen (PG/well). Vet zwarte getallen tonen de concentraties voor bont cortisol geëxtraheerd met behulp van methanol die viel binnen het bereik van de cortisol-normen (PG/well). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een aantal studies die gebruik maken van een scala van technieken voor het opsporen van cortisol in zoogdier vacht. Deze studie presenteert resultaten voor de opsporing van cortisol in bont verzameld van een wilde Koala blootgesteld aan huidige antropogene stress. Deze baanbrekende studie gebruikt bont om te testen welke van de drie veelgebruikte oplosmiddelen het beste zijn bij het uitpakken van cortisol, een maat voor chronische stress, van Koala vacht. De resultaten toonden aan dat 100% methanol het aanbevolen oplosmiddel voor cortisol extractie in dit type zoogdier bont was.
Ethanol, methanol en isopropanol zijn alle primaire alcoholen die zijn gebonden door waterstof moleculen en worden vaak gebruikt als oplosmiddel in hormoon extractie experimenten28. In het algemeen lossen polaire stoffen het beste op in andere polaire stoffen, terwijl niet-polaire stoffen het beste in andere niet-polaire stoffen oplossen. De alcohol groep met methanol is zeer polair, terwijl de alcohol groep met isopropanol zeer niet-polair is. Door zijn moleculaire opbouw heeft alcohol groep met ethanol het voordeel dat het zowel een polaire als een niet-polaire oplosmiddel is. Steroïdhormonen zoals cortisol worden beschouwd als niet-polaire, wat betekent dat cortisol een sterke binding associatie met polaire oplosmiddelen moet hebben.
Voor een uitgebreidere analyse van extractiemiddelen die worden gebruikt om fysiologische stress in Koala pels te beoordelen, moeten toekomstige onderzoeksprojecten identieke methoden in die volgorde proberen zoals beschreven in Figuur 3. Vergelijkbare studies hebben historisch uitgevoerd de wassen voor het slijpen22, om ervoor te zorgen dat er geen onbedoelde zweet en/of talg afgeleide cortisol afgezet in de vacht monster. Bovendien is het belangrijk dat het meten van cortisol alleen geen volledige indicatie van chronische stress kan garanderen. Haar cortisol lezingen zijn een waardevol hulpmiddel bij het proberen te begrijpen van fysiologische stress ervaren door een dier, maar verhoogde HPA activiteit kan optreden onder een verscheidenheid van voorwaarden, met inbegrip van lichamelijke oefening, metabole afwijkingen en de aanwezigheid van besmettelijke ziekte22. Andere belangrijke factoren die rekening moeten worden gehouden met de belangrijkste integriteit van hormoon gegevens omvatten de volgende. (1) aanvaardbaar niveau van willekeurige fout-de coëfficiënten van variatie verkregen uit interne controles (CV1 en CV2) moeten worden gemiddeld tot < 15% voor alle assays. (2) willekeurige fout in de bemonsterings test ― dubbele monsters die op elke plaat worden uitgevoerd, moeten een CV% van < 15% hebben; anders zal het monster opnieuw moeten worden uitgevoerd. (3) test detectiegrens-concentratie van in elke test gekwantificeerd hormoon moet binnen de detectiegrens van de assay liggen (tussen metingen voor de hoogste verdunning en nette standaard); anders kunnen monsters verdere verdunning vereisen (indien de voor monsters vastgestelde niveaus groter zijn dan de concentratie van nette standaard) of mogen zij niet binnen de test worden geanalyseerd (als de voor monsters vastgestelde niveaus lager zijn dan de concentratie van de hoogste verdunde standaard). (4) gevoeligheid van de test-dit kan worden beïnvloed door achtergrond lezen (niet-specifieke binding), daarom is het belangrijk om het hoogste niveau van kwaliteitsborging voor de test te handhaven (bijv. apparatuur zoals plaat wasmachine en plaat lezer moet regelmatig worden onderhouden). (5) drogen van het monsterextract-deze stap kan resulteren in mogelijke kruisbesmetting of verlies van monsters. Het wordt aanbevolen om monsters onder stoom van N2 gas afzonderlijk te drogen en de pasteurpipet die wordt gebruikt voor extractie tussen elk monster te vervangen.
Figuur 3: conceptueel stroomdiagram dat de belangrijkste stappen toont die betrokken zijn bij de Koala fur cortisol enzyme-immunoassay (EIA). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De in dit onderzoek beschreven procedure (Figuur 3) is een methode die gemakkelijk kan worden gerepliceerd omdat deze relatief eenvoudig is uit te voeren, stapsgewijze methodologie die gemakkelijk beschikbare chemicaliën, reagentia en benodigdheden bevat met apparatuur die waarschijnlijk gevonden in een standaard analytisch laboratorium. De toepassing van deze studie maakt het mogelijk een niet-invasieve techniek te gebruiken om fysiologische stress te beoordelen in zowel wilde als gevangen koala's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de start-up onderzoeksfinanciering voor Edward Narayan via de Western Sydney University, school of Science and Health. De auteurs bedanken Jack Nakhoul voor hulp bij het verwerken van monsters.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
| Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
| DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
| Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
| Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
| Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
| Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
| Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
| Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
| Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
| Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
| Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |
References
- Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
- Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
- Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World's Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615 (2017).
- MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
- Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
- Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
- Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).
- Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
- Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
- Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109 (2010).
- Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
- McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
- Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
- Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
- Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
- Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055 (2014).
- Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
- Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
- Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
- Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052 (2017).
- Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026 (2014).
- Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).
- Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
- Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177 (2016).
- Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
- Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).
