Summary
Vi presenterer en protokoll for å fastslå den optimale ekstraksjon løsemiddel å måle kortisol fra Koala pels. Løsnings midlene som brukes i denne protokollen, er metanol, etanol og isopropanol. Bestemme en optimal ekstraksjon løsemiddel vil hjelpe i pålitelig måling pels for å fastslå effekten av kronisk stress på koalabjørner.
Abstract
Optimale metoder for hormon utvinning brukes til å måle stress i dyr over utvalget typer er ikke alltid det samme. Australias ikoniske marsupial arter, Koala (Phascolarctos cinereus), ansikter langvarig eksponering for menneskeskapte-indusert stressorer og vurdering av kronisk stress i ville populasjoner er snarest berettiget. En av de mest effektive måtene å måle kronisk stress er gjennom å analysere glukokortikoid hormonet kortisol i hår eller pels, som det støtter fysiologiske og atferdsmessige responser. Dette laboratoriet validering studien tar sikte på å teste dagens teknikker for å validere en optimal Hormone utvinning metode som skal brukes som en ikke-invasiv måling av kortisol i Koala pels. Det er anerkjent at bruk av ikke-invasiv teknikker for å måle stress hormoner foretrekkes over tradisjonelle, invasive teknikker på grunn av sin ideelle praktiske og etiske ståsteder. I tillegg er det relativt lettere å skaffe pels fra koalabjørner enn det er å tilegne seg prøver av sitt blod. Denne studien brukte prøver av Koala pels ervervet fra Adelaide Koala og Wildlife Hospital å kjøre en rekke hormon utvinning teknikker i et forsøk på å validere en optimal kortisol utvinning metoden. Resultatene viste at 100% metanol ga den mest optimale løsningsmiddel utvinningen sammenlignet med 100% etanol eller 100% isopropanol basert på parallellisme resultater. I konklusjonen, denne metoden for kortisol utvinning fra Koala pels forutsatt en pålitelig ikke-invasiv analysen som kan brukes til å studere kronisk stress i koalabjørner.
Introduction
Australske økosystemer opprettholde menneskelig liv gjennom levering av tjenester, inkludert mat og fiber blant mange andre dynamiske interaksjoner1. Ironisk nok er det menneskelig aktivitet som fungerer som den dominerende føreren av økosystemet avbrudd gjennom biologisk mangfold endring2. Habitat fragmentering, kjent som prosessen med å dele store sammenhengende habitater i små flekker av land, isolert fra hverandre, er den store menneskeskapte biologisk mangfold endring truende australske økosystemer2. Habitat fragmentering endrer strukturen og mangfoldet av arter sammensetning i et gitt område, og dermed redusere arealet av habitat nødvendig for disse artene å opprettholde levedyktig populasjoner2. Resultatet av dette er økt konkurranse mellom arter for ressurser, inkludert mat, drivstoff, fiber, og vann3. Ødeleggelsen av australske økosystemer gjennom endring av biologisk mangfold er å ha katastrofale konsekvenser for mange australske arter1.
Australias mest ikoniske marsupial arter, den Koala (Phascolarctos cinereus), avhenger av australske økosystemer gjenværende sunt for deres overlevelse4. Innføringen av den europeiske bosetningen førte til en rask nedgang i australske populasjoner av koalabjørner, da de ble slaktet for deres skinnene i jakten på profitt i en stor eksport handel5. Denne praksisen ble forbudt på 1980-tallet og bestander av koalabjørner var da i stand til å stabilisere5. Men eksponentiell vekst av den menneskelige befolkning har resultert i denne arten konkurrerer om mye av deres habitat, og deres overlevelse er igjen under trussel6. Ifølge International Union for Conservation of Nature (IUCN), er alle populasjoner av australske koalabjørner oppført som sårbare for utryddelse med en synkende befolknings trend7. Denne oppføringen er tilskrevet usikkerheten rundt relevante befolknings parametre og markert variasjon i befolknings trender for denne arten7. Som den mest ikoniske og endemisk dyr, koalabjørner i stor grad nytte den australske økonomien gjennom turisme (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Et anslag tyder på at Koala relatert turisme har generert ca 9 000 arbeidsplasser og bidrar mellom $1,1 og $2 500 000 000 til økonomien (NSW Office of Environment og Heritage 2018). Fjerning av en Art har potensial til å bli katastrofale, og kan sees i jevn nedgang på Native Australian Wildlife6. I tillegg vil Australia økonomien føler konsekvenser hvis populasjoner av australske koalabjørner fortsetter å avta på den hastigheten de er6.
Det er antydet at utbredelsen av død og sykdom som svar på habitat fragmentering er et resultat av kronisk stress8. Allerede har tjuefire marsupial arter blitt erklært utryddet i Australia på grunn av habitat fragmentering, med koalabjørner etter en lignende trend8. Kompleksiteten av habitat fragmentering og biologiske systemer er synergi, men kan pakkes ut gjennom analyse av stress respons6. Generelt aktiverer enhver forstyrrelse i et dyr naturlige omgivelser en kompleks kaskade av neurohormonal hendelser, kjent som en "fight or flight" respons9,10. Dette svaret på stress er en prosess som begynner i hjernen der hypothalamus-hypofysen-adrenal (HPA) aksen er aktivert11. En del av hjernen kalles hypothalamus utgivelser corticotrophin-lanserer Hormone (CRH), som deretter signaliserer fremre hypofysen til å løslate adrenocorticotrophic Hormone (ACTH)11. Dette i sin tur stimulerer glukokortikoid sekresjon fra binyrene forlengede. Kroppen sirkulerer glukokortikoider gjennom blodet, som viderekobling lagring av glukose fra glykogen og mobiliserer glukose fra lagret glykogen11. Dette kaskade av neurohormonal hendelser er responsen som brukes av dyret til å håndtere uforutsigbare stimuli11. Imidlertid, når glukokortikoider slippes og være opphøyet for en lengre periode av tid, det dyr er betraktet som å bli erfaring kronisk anstrengelse12,13. Denne prosessen innebærer viderekobling energi bort fra andre fysisk kroppsfunksjoner, som det er nødvendig for pågående glukokortikoid produksjon13. Som et resultat, kronisk stress kan forby vekst, reproduksjon og immunitet, alle er viktige fitness egenskaper som kreves for overlevelse14.
Måler en dyrene ' glukokortikoid produksjon er en vanlig indikatoren anvendt å avgjøre hvorvidt eller ikke det dyr er erfaring fysiologisk trykk15. For å gjøre dette, kan glukokortikoider måles i blodplasma, serum, spytt, urin eller avføring16. Imidlertid tyder tyder på at håret er en mye mer effektiv indikator på kronisk stress, i motsetning til de nevnte16. Dette er fordi håret er antatt å innlemme blod-borne hormoner i sin vekstfase; Det er relativt stabilt; og eventuelle kortisol oppdaget i håret reflekterer fysiologisk stress oppleves over perioden av hårvekst, som kan være uker gjennom til måneder16. Videre bør enhver samling av kortisol være ikke-invasiv for å minimere stress forbundet med fangst og håndtering16. Men noe stress opplevde i løpet av denne hendelsen ville ikke påvirke glukokortikoid nivåer i håret16. Det har vært mange studier som utforsker ferdighet av å bruke håret til å måle langsiktige stress i en rekke dyr, og inkluderer studier på reinsdyr, grizzly bjørner, rhesus aper, muskoxen, og brune bjørner17,18, 19 andre priser , 20 priser og , 21. Hair kortisol er vanligvis ekstrahert ved først å vaske prøven for å sikre svette og sebum-avledet kortisol avsatt på overflaten av håret er ikke co-ekstrahert med kortisol og deretter pulverizing prøven i en perle-visp22. Etter vask må prøven tørkes for å sikre fullstendig fordampning22. Til slutt, ved hjelp av et løsemiddel, kan prøven trekkes ut og rekonstituert å lette analysen av kortisol22. Den vanligste løsemiddel som brukes til å trekke ut kortisol fra pels er metanol21,23; Det er imidlertid noen studier som bruker etanol og isopropanol i sine kortisol utvinning teknikker. For eksempel, en studie som brukte etanol var vellykket for utpakking av kortisol fra humant fostervann væske24. I tillegg en studie som brukte isopropanol var vellykket for utpakking av kortisol fra menneskehår og negler25,26. Av denne grunn, denne studien testet alle tre løsningsmidler (metanol, etanol, og isopropanol) for å finne ut hvilke som var mest vellykket for ekstraksjon av kortisol fra prøver av Koala pels.
Det primære målet med denne studien var å bruke dagens teknikker for å validere en optimal hormon utvinning teknikk som skal brukes som en ikke-invasiv måling av kortisol fra Koala pels. Dette ble oppnådd ved å teste tre avsugs løsemidler (metanol, etanol og isopropanol). Vi hypotetisk gjennomsnitt at metanol vil være den optimale løsemiddel som brukes for utpakking av kortisol fra Koala pels fordi det er den anbefalte løsningsmiddel for ekstraksjon av Arbor analysen kortisol kits27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette prosjektet ble utført under strenge dyre-og omsorgs retningslinjer. Animal etikk ble gitt av Western Sydney University (A12373). I tillegg en lab risikovurdering og biosafety og stråling form ble presentert og akseptert av Western Sydney University for å trygt gjennomføre denne forskningen (B12366).
Merk: Koala pels prøver for dette prosjektet ble innhentet fra Adelaide Koala og Wildlife Hospital, som ligger på 282 Anzac Highway, Plympton South Australia. Fur var tatt fra ettall Koala hvilke fikk blitt innlagt å det gjestfrihet og euthanized på grunn av deres alvorlig skadene. Den avdøde Koala hadde blitt lagret i en fryser i en Body bag kort tid etter døden. Etter fjerner det avdød Koala fra kroppen bag, 1,2 g av fur var barbere fra det nakke av halsen benytter målestokk dyr avklipt. Pelsen var barbert så nær som mulig til huden, slik som å sikre at huden ikke ble kuttet. Når barbert, den avdøde Koala ble satt tilbake i kroppen posen og plassert i fryseren. Pelsen ble deretter plassert i en veske laget av aluminiumsfolie og lagret under-20 ° c. I transitt ble pelsen holdt ved omgivelsestemperatur, og ved ankomst til laboratoriet, ble pelsen lagret ved-80 ° c.
1. Koala pels kortisol ekstraksjon
- Fjern pelsen fra oppbevaring ved-80 ° c og gi tid til å tine.
- Veie pelsen på et laboratorium analytisk presisjon balanse.
- Plasser 60 mg av pelsen i en pre-veid og merket 1,5 mL sentrifuge slange og gjenta til 18 rør er fylt.
Merk: 18 pels prøver ble brukt til denne validerings studien. - Tilsett 1 mL 100% høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) grade isopropanol til hvert rør ved hjelp av en pipette.
- Vortex prøver for 30 s.
- Sil hver prøve ved hjelp av en 0,5 mm mikro presisjon sil for å oppnå separasjon av væske og pels.
- Kast væsken i en avfallsbeholder.
- Plasser hver pels prøve i en merket plast veiing båt, og deretter plassere i en vakuum desikator, la pelsen tørke i 3 dager.
- Når du er helt tørr, plasserer du hver prøve i en merket 1,5 mL mikrosentrifugen tube.
- Plasser hver prøve i en perle mølle med 3 krom stål perler (3,2 mm) og tre i to min ved 30 shakes per sekund.
- Pipetter 1,5 mL av den første utvinnings teknikken (100% analytisk klasse etanol) i 6 1,5 mL mikrosentrifugen rør som inneholder pels prøven.
- Utfør det samme for 100% analytisk karakter metanol og 100% analytisk grade isopropanol til atten 1,5 mL mikrosentrifugen rør er fylt.
- Cap hver 1,5 mL mikrosentrifugen rør og ruge ved romtemperatur (RT) med konstant pulserende ved hjelp av en shaker for 3 t.
- Ta ut og strekk prøver med en 0,5 mm mikro presisjon sil.
- Overfør væsken til en ny, merket 1,5 mL mikrosentrifugen slange med en pipette, samtidig som den sikrer at pelsen kastes på riktig måte.
- Helt tørt løsemiddel ekstrakt under en strøm av N2 Vapor under et avtrekksskap.
- Rekonstituer den tørkede prøven ekstrakt med 400 μL av analysen buffer (sammensetning gitt i det kommersielle kortisol Kit, se tabell over materialer) og 100 μL av 100% analytisk karakter etanol.
Merk: prøve ekstrakter kan lagres ved-80.
2. interne kontroller
- Å gjøre kontroller, lage en pool av utdraget prøver med høye hormonnivået. For å gjøre dette bassenget, Velg prøver fra dyr med kjent eksponering for stressor. For eksempel, Velg prøver fra koalabjørner som har blitt reddet fra miljømessige traumer som de vil vanligvis vise høy kortisol hormonnivået6.
- For å gjøre ekstrakt bassenget, ta 20 μL av ekstrakt fra hver prøve (n = 10) til et samlet volum på 200 μL er oppnådd. Ekstraktet bassenget kan lagres på-80 C til analysene. Kjør bassenget i hver analyse som lav eller høy intern kontroller (se trinn 2,2).
- For analysen, bruk bassenget for å lage aksjer for lave og høye kontroller som binder på 70% (C1) og 30% (C2), henholdsvis. Skaff deg fortynningsfaktoren for de 30% og 70% bindende punktene fra parallellisme grafen for ekstraktet mot kortisol standarden (figur 1). Bruk analyse bufferen for fortynning av utvalgs utvalg. Bruk for eksempel 60 μL av basseng ekstrakt og 60 μL av analysebuffer for 1:2-fortynning.
Merk: for metanol ekstrakt, var 30% bindende punkt på ryddig mens 70% bindende punkt var ca 1:2 som per figur 1. Således, disse forutsatt at fortynning faktor for den interne kontroller (C1 og C2 henholdsvis) for å kjøre i analysen.
3. kortisol analyse i Koala pels ekstrakter
- Bruk en kommersiell kortisol Kit (tabell av materialer) og sette opp 96 brønn stripe plate inkludert prøvene, kontroller, kortisol standarder, ikke-spesifikke bindende brønner, og maksimal bindende brønner etter leverandørens instruksjoner. Bruk plate oppsetts arket i sett heftet for å liste posisjonene til prøver, kontroller og standarder på plate kartet.
Merk: det anbefales at alle prøver, kontroller og standarder kjøres i duplikat for å tillate nøyaktigheten av resultatene. - Forbered prøver. Følg pels hormon ekstraksjon (§ 1) for å få 100% metanol ekstrahert Koala pels.
- Klargjør reagenser. Følg fremgangsmåten som er beskrevet i den kommersielle kortisol kit å forberede reagensene inkludert (1) analysen buffer, (2) vaskebuffer, og (3) standarder (komposisjoner gitt i kortisol Kit, tabell over materialer).
- I henhold til instruksjonene gitt i kortisol Kit, Pipet 50 μL av prøver eller standarder i brønner i platen. Pipet 75 μL og 50 μL av analysen buffer i de ikke-spesifikke bindende (NSB) brønner og maksimal binding (B0 eller null standard) brønner, henholdsvis.
- Tilsett 25 μL av kortisol bøye til hver brønn ved hjelp av en repeater Pipet. Deretter Pipet 25 μL av kortisol antistoff i hver brønn, unntatt NSB brønner. Trykk forsiktig på sidene av platen for å sikre at reagensene er godt blandet.
- Dekkplaten med platen sealer og rist ved romtemperatur for 1 t (ved langsom hastighet) ved hjelp av en orbital shaker.
- Fjern plate sealer og aspirer brønn platen ved å vaske hver brønn med 300 μL vaskebuffer 4 ganger.
- Tørk platen ved å trykke på platen på rene absorberende håndklær.
- Pipetter 100 μL av tetramethylbenzadine (TMB) substrat (sammensetning gitt i kortisol Kit, tabell av materialer) til hver brønn.
- Plasser platen sealer på brønnen plate og ruge på RT i 30 min.
- Pipetter 50 μL av stopp løsning til hver brønn.
- Plasser brønn platen i en plate leser som kan lese 450 nm.
- For å beregne den endelige hormon konsentrasjon, utlede den endelige pels kortisol konsentrasjon i ng/mg av prøven ved å multiplisere PG/mL hormon konsentrasjonen med det endelige ekstrakt volumet (0,5 mL) og dele av pelsen prøven massen (60 mg).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen deteksjon av hormon metabolitter av interesse bestemmes ved hjelp parallellisme. Ved hjelp av en parallellisme kurve bestemmer 50% bindings punktet også prøve fortynningsfaktoren på standardkurven (figur 1). Som vist i parallellisme grafen (figur 1), 100% etanol og 100% isopropanol ekstrakter ikke gi parallell forskyvning mot kortisol standarden. Men 100% metanol ekstrakt gitt parallell forskyvning mot kortisol standarden. Tørkede ekstrakter ble kjørt ryddig gjennom fortynning i analysen buffer (100 μL av 100% etanol og 400 μL av analysen buffer).
Intra-(innenfor) og inter-(mellom) analysen koeffisienter av variasjon (CV) ble bestemt fra høy-(ca 70%) og lav-(ca 30%) og bindende prøve ekstrakter kjøres i alle analysene. Basert på parallellisme grafen (figur 1), den 30% (lav) bindende interne kontroller var ryddig Koala ekstrakt bassenget mens 70% (høy) bindende interne kontroller var 1:2 fortynnet Koala ekstrakt bassenget. CV% for interne høye og lave interne kontroller ble < 15%.
Feilmargin i analysen kan bestemmes ved hjelp av kvalitetskontroll inkludert intra-og inter-analysen koeffisienter av variasjon, som bør være < 15%. Analysen følsomhet ble beregnet som verdien 2 standardavvik fra gjennomsnittet respons av blank (null bindende) prøver, og uttrykt som 81,26 PG/brønn.
Figur 1: parallellisme av samlede Koala pels ekstrahert ved hjelp av 3 forskjellige løsemidler (100% etanol, 100% isopropanol eller 100% metanol) mot kortisol standard kurve under en kortisol enzym-immunanalysen. B/TB er prosenten av binding over total binding. Den serielle fortynning faktor (f. eks 1:2X betyr fortynning faktor på 2) har blitt gitt sammen med konsentrasjonen av hver standard. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Dernest ble foreningen mellom hvert løsningsmiddel ekstrakt og kortisol standard bestemt ved hjelp av en regresjon plot (figur 2). Som vist i figur 2, ga 100% metanol-ekstrakt den beste linje av regresjon med den høyeste R2 -verdien sammenlignet med 100% etanol og 100% isopropanol ekstrakter.
Figur 2: regresjon tomter for prosentvis binding av kortisol standard mot hver av de 3 løsemidler (etanol, metanol og isopropanol) brukes til å trekke ut Koala pels. R2 -verdien ble Hentet fra linjen som passer best. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Videre, sub-sette av Koala fur utdraget benytter hver av det tre løsemidler var analyseres og det resultater er forsynt inne bord 1 neden. Som vist i tabell 1, var den observerte konsentrasjonen av kortisol standarden innenfor rekkevidden av 2879.61-125.70 PG/brønn. Verken etanol eller isopropanol utvinning metoden kunne oppnå konsistens i resultatet som pelsen ekstrakt konsentrasjoner innhentet ved hjelp av en av metodene resulterte i svært høy min-maks spekter av hormon konsentrasjoner (se tabell 1 tall merket i rødt), som var utenfor oppdagelsen grensen av kortisol analysen. Metanol-ekstrakter resulterte i kortisol konsentrasjoner i området av kortisol standarden (som vist i dristige svarte tall i tabell 1). Videre, konsentrasjonen av pels kortisol oppdages ved hjelp av metanol utvinning metoden var svært konsistent i forhold til resultatene innhentet ved hjelp av de to andre metodene (se tabell 1). Dermed aksepterer vi null hypotesen at metanol er den mest egnede løsemiddel for Koala pels hormon utvinning i forhold til etanol og isopropanol.
Tabell 1: den kortisol konsentrasjon (ng/mg) for Koala pels (n = 18) ekstrahert ved hjelp av 3 forskjellige løsemidler (etanol, isopropanol eller metanol) og kjøre mot kortisol standard kurve under en kortisol enzym-immunanalysen. Dristige røde tall viser inkonsekvente konsentrasjoner for etanol og isopropanol ekstrakter som var utenfor analyseområdet (PG/brønn). Fet svart tall viser konsentrasjonene for pels kortisol ekstrahert ved hjelp av metanol som falt innenfor rekkevidden av kortisol standarder (PG/brønn). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finnes en rekke studier som bruker en rekke teknikker for å oppdage kortisol i pattedyr pels. Denne studien presenterer resultater for påvisning av kortisol i pels samlet fra en vill Koala eksponert for dagens menneskeskapte stress. Denne banebrytende studien brukte pels for å teste hvilke av de tre brukte løsemidler er best på å utvinne kortisol, et mål på kronisk stress, fra Koala pels. Resultatene viste at 100% metanol var det anbefalte løsningsmidlet for kortisol ekstraksjon i denne type pattedyr pels.
Etanol, metanol og isopropanol er alle primære alkoholer som er limt av hydrogen molekyler og blir ofte brukt som løsemidler i hormon utvinning eksperimenter28. Vanligvis oppløses polare stoffer best i andre polare stoffer, mens ikke-polare stoffer oppløses best i andre ikke-polare stoffer. Alkohol gruppen som inneholder metanol er svært polare, mens alkohol gruppen som inneholder isopropanol er svært ikke-polare. På grunn av sin molekylære bygge, alkohol gruppen inneholder etanol har fordelen av å være både en Polar og ikke-polare løsemiddel. Steroid hormoner som kortisol anses ikke-Polar, noe som betyr at kortisol bør ha en sterk bindende tilknytning til polare løsemidler.
For en mer omfattende analyse av avsugs løsemidler som brukes til å vurdere fysiologisk stress i Koala pels, bør fremtidige forskningsprosjekter forsøke identiske metoder i den rekkefølgen som beskrevet i Figur 3. Lignende studier har historisk utført vask før sliping22, for å sikre at det ikke er utilsiktet svette og/eller sebum avledet kortisol avsatt i pelsen prøven. Videre er det viktig at måling av kortisol alene ikke kan garantere en fullstendig indikasjon på kronisk stress. Hår kortisol opplesninger er et verdifullt verktøy når du forsøker å forstå fysiologiske stress oppleves av et dyr, men forhøyet HPA aktivitet kan oppstå under en rekke forhold, inkludert fysisk trening, metabolske unormalt og tilstedeværelsen av smittsomme sykdommer22. Andre viktige faktorer som bør tas i betraktning til viktigste integriteten hormon data inkluderer følgende. (1) akseptabelt nivå av tilfeldig feil-koeffisienter av variasjon innhentet fra interne kontroller (CV1 og CV2) bør være gjennomsnitt til < 15% for alle analyser. (2) tilfeldig feil i prøve analysen – duplikat prøver kjøres på hver plate bør ha en CV% på < 15%; Hvis ikke, må prøven kjøres på nytt. (3) analysen deteksjon grense-konsentrasjon av hormon kvantifisert innenfor hver analysen bør være innenfor analysen oppdagelsen grensen (mellom målingene for høyeste fortynning og ryddig standard); ellers prøver kan kreve ytterligere fortynning (hvis nivåer oppdaget for prøvene er større enn konsentrasjonen av ryddig standard) eller ikke kan analyseres i analysen (hvis nivåer oppdaget for prøvene er mindre enn konsentrasjonen av de høyeste fortynnede som standard). (4) analysen følsomhet-dette kan bli påvirket av bakgrunnen lesing (ikke-spesifikk binding), derfor er det viktig å opprettholde den høyeste grad av kvalitetssikring for analysen (f. eks, utstyr som plate vaskemaskin og plate leser må betjenes regelmessig). (5) sample ekstrakt tørking-dette trinnet kan føre til potensiell krysskontaminering eller tap av prøver. Det anbefales at prøvene tørkes under damp av N2 gass individuelt og for å erstatte Pasteur-Pipetter som brukes til ekstraksjon mellom hver prøve.
Figur 3: konseptuelle Flow diagram som viser de viktigste trinnene som er involvert i Koala pels kortisol enzym-immunanalysen (EIA). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Prosedyren som er skissert i denne studien (Figur 3) er en som lett kan kopieres som det er relativt enkelt å utføre, trinn-for-trinn metodikk som inkorporerer lett tilgjengelige kjemikalier, reagenser, og forsyninger med utstyr som er sannsynlig å være finnes i et standard analytisk laboratorium. Anvendelsen av denne studien gjør en ikke-invasiv teknikk som skal brukes til å vurdere fysiologiske stress i både vill og fange koalabjørner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet gjennom oppstart forskningsmidler for Edward Narayan gjennom Western Sydney University, School of Science and Health. Forfatterne takker Jack Nakhoul for hjelp med prøven behandling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
| Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
| DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
| Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
| Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
| Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
| Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
| Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
| Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
| Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
| Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
| Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |
References
- Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
- Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
- Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World's Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615 (2017).
- MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
- Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
- Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
- Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).
- Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
- Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
- Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109 (2010).
- Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
- McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
- Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
- Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
- Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
- Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055 (2014).
- Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
- Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
- Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
- Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052 (2017).
- Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026 (2014).
- Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).
- Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
- Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177 (2016).
- Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
- Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).
