Summary
Presentamos un protocolo para determinar el disolvente de extracción óptimo para medir el cortisol del pelaje de koala. Los disolventes utilizados en este protocolo son metanol, etanol e isopropanol. Determinar un disolvente de extracción óptimo ayudará a medir de forma fiable el pelaje para determinar el impacto del estrés crónico en las koalas.
Abstract
Los métodos óptimos de extracción hormonal utilizados para medir el estrés en animales a través de los tipos de muestra sin ser siempre los mismos. La icónica especie marsupial de Australia, el koala (Phascolarctos cinereus), se enfrenta a una exposición prolongada a factores de estrés inducidos por antropogénicos y la evaluación del estrés crónico en las poblaciones silvestres está justificada con urgencia. Una de las maneras más eficaces de medir el estrés crónico es a través del análisis de la hormona glucocorticoides cortisol en el cabello o el pelaje, ya que apoya las respuestas fisiológicas y conductuales. Este estudio de validación de laboratorio tiene como objetivo probar las técnicas actuales para validar un método óptimo de extracción hormonal que se utilizará como una medida no invasiva de cortisol en piel de koala. Se reconoce que el uso de técnicas no invasivas para medir las hormonas del estrés se prefiere sobre las técnicas tradicionales, invasivas debido a sus puntos de vista prácticos y éticos ideales. Además, es comparativamente más fácil adquirir piel de koalas que adquirir muestras de su sangre. Este estudio utilizó muestras de piel de koala adquiridas del Adelaide Koala and Wildlife Hospital para ejecutar una serie de técnicas de extracción de hormonas en un intento de validar un método óptimo de extracción de cortisol. Los resultados mostraron que el 100% de metanol proporcionaba la extracción de disolvente más óptima en comparación con 100% etanol o 100% isopropanol basado en resultados de paralelismo. En conclusión, este método de extracción de cortisol de piel de koala proporcionó un ensayo no invasivo fiable que podría utilizarse para estudiar el estrés crónico en koalas.
Introduction
Los ecosistemas australianos sostienen la vida humana mediante la prestación de servicios como alimentos y fibra entre muchas otras interacciones dinámicas1. Irónicamente, es la actividad humana la que actúacomo el motor dominante de la interrupción del ecosistema a través del cambio de biodiversidad 2. La fragmentación del hábitat, conocida como el proceso de dividir grandes hábitats continuos en pequeños parchesde tierra, aislados entre sí, es el principal cambio de biodiversidad antropogénica que amenaza los ecosistemas australianos 2. La fragmentación del hábitat modifica la estructura y diversidad de la composición de lasespecies en cualquier área dada, reduciendo así el área de hábitat necesaria para que estas especies mantengan poblaciones viables 2. El resultado de esto es una mayor competencia entre especiespor recursos como alimentos, combustible, fibra y agua 3. La destrucción de los ecosistemas australianos a través del cambio de biodiversidad está teniendo consecuencias catastróficas en muchas especies nativas australianas1.
La especie marsupial más icónica de Australia, el koala (Phascolarctos cinereus), depende de que los ecosistemas australianos permanezcan sanos para su supervivencia4. La introducción del Asentamiento Europeo provocó una rápida disminución de las poblaciones australianas de koalas, ya que fueron sacrificados por sus pelts en busca de beneficios en un gran comercio de exportación5. Esta práctica fue prohibida en la década de 1980 y las poblaciones de koalas fueron capaces de estabilizar5. Sin embargo, el crecimiento exponencial de la población humana ha dado lugar a que esta especie compita por gran parte de su hábitat, y su supervivencia está de nuevo bajo amenaza6. Según la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN), todas las poblaciones de koalas australianas están catalogadas como vulnerables a la extinción con una tendencia poblacional decreciente7. Esta lista se atribuye a la incertidumbre en torno a losparámetros de población relevantes y a la marcada variación de las tendencias de población de esta especie 7. Como los animales más emblemáticos y endémicos, los koalas benefician en gran medida a la economía australiana a través del turismo (Oficina de Medio Ambiente y Patrimonio 2018). Una estimación sugiere que el turismo relacionado con el koala ha generado aproximadamente 9.000 puestos de trabajo y contribuye entre $1.1 y $2.500 millones a la economía (Oficina de Medio Ambiente y Patrimonio de la NSW 2018). La eliminación de cualquier especie tiene el potencial de ser catastrófica, y se puede ver en el declive constante de la fauna nativa australiana6. Además, la economía de Australia sentirá las ramificaciones si las poblaciones de koalas australianos siguen disminuyendo al ritmo de6.
Se sugiere que la prevalencia de la muerte y laenfermedad en respuesta a la fragmentación del hábitat es el resultado del estrés crónico 8. Ya veinticuatro especies marsupiales han sido declaradas extintas en Australiadebido a la fragmentación del hábitat, con koalas siguiendo una tendencia similar 8. La complejidad de la fragmentación del hábitat y los sistemas biológicos es sinérgica, pero se puede desempaquetar mediante el análisis de la respuesta al estrés6. En general, cualquier perturbación en un entorno natural de los animales activa una compleja cascada de eventos neurohormonales, conocidos como respuesta de "lucha o huida"9,10. Esta respuesta al estrés es un proceso que comienza en el cerebro donde se activa el eje hipotalámico-hipófisis-adrenal (HPA)11. Un componente del cerebro llamado hipotálamo libera hormona liberadora de corticotrofina (CRH), que luego señala a la hipófisis anterior para liberar la hormona adrenocorticotrófica (ACTH)11. Esto a su vez estimula la secreción de glucocorticoides de la médula suprarrenal. El cuerpo circula glucocorticoides a través de la sangre, lo que desvía el almacenamiento de glucosa del glucógeno y moviliza la glucosa del glucógeno almacenado11. Esta cascada de eventos neurohormonales es la respuesta utilizada por el animal para hacer frente a estímulos impredecibles11. Sin embargo, cuando los glucocorticoides están siendo liberados y permanecen elevados durante un período prolongado de tiempo, el animal se considera que está experimentando estrés crónico12,13. Este proceso implica desviar la energía de otras funciones corporales corporales, ya que es necesaria para la producción continua de glucocorticoides13. Como resultado, el estrés crónico puede prohibir el crecimiento, la reproducción y la inmunidad, siendo todos los rasgos de aptitud clave necesarios para la supervivencia14.
Medir la producción de glucocorticoides de un animal es un indicador común utilizado para determinar si el animal está experimentando o no estrés fisiológico15. Para ello, los glucocorticoides se pueden medir en plasma sanguíneo, suero, saliva, orina o heces16. Sin embargo, la evidencia sugiere que el cabello es un indicador mucho más eficaz de estrés crónico, a diferencia de los16antes mencionados. Esto se debe a que el cabello se piensa para incorporar hormonas transmitidas por la sangre durante su fase de crecimiento; es relativamente estable; y cualquier cortisol detectado en el cabello refleja el estrés fisiológico experimentado durante el período de crecimiento del cabello, que puede ser semanas hasta los meses16. Además, cualquier colección de cortisol debe ser no invasiva para minimizar el estrés asociado con la captura y manipulación16. Sin embargo, cualquier estrés experimentado durante este evento no afectaría los niveles de glucocorticoides en el cabello16. Ha habido muchos estudios que exploran el dominio del uso del cabello para medir el estrés a largo plazo en un número de animales, e incluyen estudios sobre renos, osos pardos, monos rhesus, muskoxen, y osos marrones17,18, 19 , 20 , 21. El cortisol capilar generalmente se extrae lavando primero la muestra para asegurar que el sudor y el cortisol derivado del sebo depositados en la superficie del cabello no se extraigan con cortisol y luego pulverizan la muestra en un batidor de cuentas22. Después del lavado, la muestra debe secarse para asegurar la evaporación completa22. Por último, utilizando un disolvente, la muestra se puede extraer y reconstituir para facilitar el ensayo de cortisol22. El disolvente más común utilizado para extraer cortisol de piel es el metanol21,23; sin embargo, hay algunos estudios que utilizan etanol e isopropanol en sus técnicas de extracción de cortisol. Por ejemplo, un estudio que utilizó etanol tuvo éxito para extraer cortisol del líquido amniótico humano24. Además, un estudio que utilizó isopropanol fue exitoso para extraer cortisol del cabello humano y las uñas25,26. Por esta razón, este estudio probó los tres disolventes (metanol, etanol e isopropanol) para determinar cuál fue el más exitoso para la extracción de cortisol de muestras de piel de koala.
El objetivo principal de este estudio fue utilizar técnicas actuales para validar una técnica óptima de extracción hormonal que se utilizará como una medida no invasiva de cortisol de piel de koala. Esto se logró mediante el ensayo de tres disolventes de extracción (metanol, etanol e isopropanol). Hemos planteado la hipótesis de que el metanol será el disolvente óptimo utilizado para extraer cortisol de piel de koala porque es el disolvente recomendado de extracción por Arbor ensayo kits de cortisol27.
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Protocol
Este proyecto se llevó a cabo bajo estrictas pautas de cuidado animal y humano. La ética animal fue otorgada por la Western Sydney University (A12373). Además, la Universidad De Sídney presentó y aceptó una evaluación del riesgo de laboratorio y un formulario de bioseguridad y radiación para llevar a cabo esta investigación de forma segura (B12366).
NOTA: Las muestras de piel de Koala para este proyecto se obtuvieron del Adelaide Koala and Wildlife Hospital, ubicado en 282 Anzac Highway, Plympton South Australia. La piel fue tomada de un koala que había sido ingresado en el hospital y eutanasiado debido a sus graves lesiones. El koala fallecido había sido almacenado en un congelador dentro de una bolsa de cadáveres poco después de la muerte. Después de retirar el koala fallecido de la bolsa del cuerpo, 1,2 g de piel se asembocaó de la nuca utilizando cortadoras de animales estándar. El pelaje se asemhara lo más posible de la piel, con el fin de garantizar que la piel no se cortara. Una vez afeitado, el koala fallecido fue puesto de nuevo en la bolsa del cuerpo y colocado en el congelador. El pelaje se colocó entonces en una bolsa hecha de papel de aluminio y se almacena por debajo de -20 oC. En tránsito, el pelaje se mantuvo a temperatura ambiente, y a su llegada al laboratorio, el pelaje se almacenó a -80 oC.
1. Extracción de cortisol de piel de Koala
- Retirar el pelaje del almacenamiento a -80 oC y dejar tiempo para descongelar.
- Pesar el pelaje en una balanza de precisión analítica de laboratorio.
- Coloque 60 mg de piel en un tubo centrífugo de 1,5 ml prepesado y etiquetado y repita hasta que se llenen 18 tubos.
NOTA: Se utilizaron 18 submuestras de piel para este estudio de validación. - Añadir 1 ml de isopropanol de grado 100% de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) a cada tubo utilizando una pipeta.
- Muestras de vórtice para 30 s.
- Cuele cada muestra con un tamiz de microprecisión de 0,5 mm para lograr la separación del líquido y el pelaje.
- Deseche el líquido en un contenedor de residuos.
- Coloque cada muestra de piel en un bote de pesaje de plástico etiquetado, luego colóquelo en un desecador al vacío, deje que el pelaje se seque durante 3 días.
- Una vez completamente seca, coloque cada muestra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml etiquetado.
- Coloque cada muestra en un molino de cuentas con 3 perlas de acero cromado (3,2 mm) y pulverizar durante 2 minutos a 30 batidos por segundo.
- Pipeta 1,5 ml de la primera técnica de extracción (100% etanol de grado analítico) en tubos de microcentrífuga de 6 1,5 ml que contienen la muestra de piel.
- Realice lo mismo para el metanol de grado 100% analítico y el isopropanol de grado analítico 100% hasta que se llenen dieciocho tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Tapar cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e incubar a temperatura ambiente (RT) con pulsación constante utilizando una coctelera durante 3 h.
- Retire y estrese las muestras con un tamiz de microprecisión de 0,5 mm.
- Transfiera el líquido a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml etiquetado con una pipeta, asegurándose de que el pelaje se deseche adecuadamente.
- Extracto de disolvente completamente seco bajo una corriente de vapor N2 bajo un armario de humos.
- Reconstituir el extracto de muestra seca utilizando 400 ml de tampón de ensayo (composición proporcionada en el kit comercial de cortisol; ver Tabla de materiales)y 100 l de etanol de grado analítico 100%.
NOTA: Los extractos de muestra se pueden almacenar en -80 .
2. Controles internos
- Para hacer controles, hacer un grupo de muestras extraídas con altos niveles hormonales. Para hacer esta piscina, seleccione muestras de animales con exposición conocida al estresante. Por ejemplo, seleccione muestras de koalas que han sido rescatadas de traumaambiental, ya que generalmente mostrarán altos niveles de hormona cortisol6.
- Para hacer la agrupación de extractos, tome 20 ml de extracto de cada muestra (n a 10) hasta obtener un volumen total de 200 l. La piscina de extractos se puede almacenar en -80 C hasta ensayos. Ejecute el grupo en cada ensayo como controles internos bajos o altos (consulte el paso 2.2).
- Para el ensayo, utilice la piscina para realizar existencias para controles bajos y altos que se unen al 70% (C1) y 30% (C2), respectivamente. Obtener el factor de dilución para los puntos de unión del 30% y 70% del gráfico de paralelismo para el extracto contra el estándar de cortisol (Figura1). Utilice el búfer de ensayo para la dilución del grupo de muestras. Por ejemplo, utilice 60 ml del extracto de la piscina y 60 ml de búfer de ensayo para la dilución 1:2.
NOTA: Para el extracto de metanol, el punto de unión del 30% estaba limpio, mientras que el punto de unión del 70% era aproximadamente 1:2 según la Figura1. Por lo tanto, estos proporcionaron el factor de dilución para los controles internos (C1 y C2 respectivamente) para ejecutarse dentro del ensayo.
3. Análisis de cortisol en extractos de piel de koala
- Utilice un kit comercial de cortisol (Tablade materiales)y configure la placa de tira de 96 pozos que incluye las muestras, controles, estándares de cortisol, pozos de unión no específicos y pozos de unión máximos siguiendo las instrucciones del proveedor. Utilice la hoja de diseño de placas proporcionada en el folleto del kit para enumerar las posiciones de las muestras, controles y estándares en el mapa de placas.
NOTA: Se recomienda que todas las muestras, controles y estándares se ejecuten por duplicado para permitir la precisión de los resultados. - Prepare muestras. Siga la extracción de la hormona de piel (sección 1) para obtener 100% de piel de koala extraída de metanol.
- Preparen reactivos. Siga el procedimiento descrito en el kit comercial de cortisol para preparar los reactivos, incluidos (1) tampón de ensayo, (2) tampón de lavado y (3) normas (composiciones proporcionadas en el kit de cortisol, Tabla de materiales).
- De conformidad con las instrucciones proporcionadas en el kit de cortisol, pipeteo de 50 ml de muestras o estándares en pozos en la placa. Pipet 75 l y 50 l de tampón de ensayo en los pozos de unión no específicos (NSB) y los pozos de unión máxima (estándar B0 o cero), respectivamente.
- Añadir 25 l de conjugado de cortisol a cada pocal utilizando un pipeta repetidor. A continuación, pipetee 25 l del anticuerpo cortisol en cada poca, excepto los pozos NSB. Toque suavemente los lados de la placa para asegurarse de que los reactivos estén bien mezclados.
- Cubra la placa con el sellador de placas y agite a temperatura ambiente durante 1 h (a velocidad lenta) utilizando un agitador orbital.
- Retire el sellador de placas y aspire la placa del pozo lavando cada pocador con 300 ml de tampón de lavado 4 veces.
- Seque la placa tocando la placa en toallas absorbentes limpias.
- Pipeta de 100 l de sustrato de tetrametilbenzadina (TMB) (composición proporcionada en el kit de cortisol, Tabla de materiales)a cada pocal.
- Coloque el sellador de placas en la placa del pozo e incubar a RT durante 30 minutos.
- Pipetear 50 l de solución de tope para cada poca.
- Coloque la placa de pozo en un lector de placas capaz de leer 450 nm.
- Para calcular la concentración final de la hormona, derive la concentración final de cortisol de piel en ng/mg de la muestra multiplicando la concentración de la hormona pg/ml con el volumen final del extracto (0,5 ml) y dividiendo por la masa de la muestra de pelaje (60 mg).
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Representative Results
La detección de ensayos de metabolitos hormonales de interés se determina mediante paralelismo. Utilizando una curva de paralelismo, el punto de unión del 50% también determina el factor de dilución de la muestra en la curva estándar (Figura1). Como se muestra en el gráfico de paralelismo (Figura1), los extractos de 100% etanol y 100% isopropanol no proporcionaron desplazamiento paralelo contra el estándar de cortisol. Sin embargo, el extracto de metanol 100% proporcionó desplazamiento paralelo contra el estándar de cortisol. Los extractos secos se ejecutaron limpios a través de la dilución en el tampón de ensayo (100 ml de etanol 100% y 400 l de tampón de ensayo).
Los coeficientes de variación (CV) intra-(dentro) e inter- (entre) se determinaron a partir de alta- y baja- (aproximadamente el 30%) extractos de muestra de enlace se ejecutan en todos los ensayos. Basado en el gráfico de paralelismo (Figura1), los controles internos de unión de 30% (bajo) fueron ordenados grupo de extracto sin koala, mientras que los controles internos de unión de 70% (alto) fueron 1:2 diluido grupo de extracto de koala. CV% para controles internos internos internos altos y bajos fueron <15%.
El margen de error dentro del ensayo se puede determinar utilizando el control de calidad, incluidos los coeficientes de variación entre vías intra e interensayos, que deben ser <15%. La sensibilidad del ensayo se calculó como el valor 2 desviaciones estándar de la respuesta media de las muestras en blanco (enlace cero), y se expresó como 81,26 pg/pozo.
Figura 1: Paralelismo de piel de koala agrupada extraída utilizando 3 disolventes diferentes (100% etanol, 100% isopropanol o 100% metanol) contra la curva estándar de cortisol bajo una enzima-inmunoensayo de cortisol. B/TB es el porcentaje de enlace sobre el enlace total. El factor de dilución en serie (por ejemplo, 1:2X factor medio de dilución de 2) se ha proporcionado junto con la concentración de cada norma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En segundo lugar, la asociación entre cada extracto de disolvente y el estándar de cortisol se determinó utilizando una gráfica de regresión (Figura2). Como se muestra en la Figura2, el extracto de metanol 100% proporcionó la mejor línea de regresión con el valor R2 más alto en comparación con los extractos de etanol 100% y 100% isopropanol.
Figura 2: Gráficas de regresión para la unión porcentual del estándar de cortisol contra cada uno de los 3 disolventes (etanol, metanol e isopropanol) utilizados para extraer el pelaje de koala. El valor R2 se obtuvo de la línea de mejor ajuste. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Además, se ensayó el subconjunto de piel de koala extraída utilizando cada uno de los tres disolventes y los resultados se proporcionan en la Tabla 1 a continuación. Como se muestra en la Tabla 1, la concentración observada de la norma de cortisol estaba dentro del rango de 2879.61-125.70 pg/well. Ni el método de extracción de etanol o isopropanol podría lograr consistencia en el resultado, ya que las concentraciones de extracto de piel obtenidas utilizando cualquiera de los métodos dieron lugar a un rango mínimo-máximo muy alto de concentraciones hormonales (ver números marcados en la Tabla 1 en rojo), que estaban más allá del límite de detección del ensayo de cortisol. Sin embargo, los extractos de metanol dieron lugar a concentraciones de cortisol dentro del rango del estándar de cortisol (como se muestra en números negros en negrita en la Tabla1). Además, las concentraciones de cortisol de piel detectadas mediante el método de extracción de metanol fueron muy consistentes en comparación con los resultados obtenidos utilizando los otros dos métodos (véase el Cuadro 1). Por lo tanto, aceptamos la hipótesis nula de que el metanol es el disolvente más adecuado para la extracción de la hormona de piel de koala en comparación con el etanol y el isopropanol.
Tabla 1: La concentración de cortisol (ng/mg) para el pelaje de koala (n x 18) extraído utilizando 3 disolventes diferentes (etanol, isopropanol o metanol) y se ejecuta contra la curva estándar de cortisol bajo una enzima-inmunoensayo de cortisol. Los números rojos audaces muestran concentraciones inconsistentes para extractos de etanol e isopropanol que estaban más allá del rango de ensayo (pg/well). Los números negros audaces muestran las concentraciones de cortisol de piel extraído utilizando metanol que se enamoró del rango de los estándares de cortisol (pg/well). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay una serie de estudios que utilizan una serie de técnicas para detectar cortisol en piel de mamífero. Este estudio presenta resultados para la detección de cortisol en pieles recogidas de un koala salvaje expuesto al estrés antropogénico actual. Este estudio innovador utilizó el pelaje para probar cuáles de los tres disolventes comúnmente utilizados son los mejores en la extracción de cortisol, una medida de estrés crónico, de piel de koala. Los resultados mostraron que el 100% de metanol era el disolvente recomendado para la extracción de cortisol en este tipo de piel de mamífero.
Etanol, metanol e isopropanol son todos los alcoholes primarios que están unidos por moléculas de hidrógeno y se utilizan comúnmente como disolventes en experimentos de extracción de hormonas28. Generalmente, las sustancias polares se disuelven mejor en otras sustancias polares, mientras que las sustancias no polares se disuelven mejor en otras sustancias no polares. El grupo alcohólico que contiene metanol es muy polar, mientras que el grupo alcohólico que contiene isopropanol es muy no polar. Debido a su construcción molecular, el grupo alcohólico que contiene etanol tiene la ventaja de ser un disolvente polar y no polar. Las hormonas esteroides como el cortisol se consideran no polares, lo que significa que el cortisol debe tener una fuerte asociación de unión con disolventes polares.
Para un análisis más completo de los disolventes de extracción utilizados para evaluar el estrés fisiológico en el pelaje de koala, los futuros proyectos de investigación deben intentar métodos idénticos en ese orden como se describe en la Figura 3. Estudios similares han realizado históricamente el lavado antes de moler22,con el fin de asegurar que no haya sudor involuntario y / o cortisol derivado de sebo depositado en la muestra de piel. Además, es importante que la medición del cortisol por sí sola no pueda garantizar una indicación completa del estrés crónico. Las lecturas de cortisol capilar son una herramienta valiosa al intentar entender el estrés fisiológico experimentado por un animal, pero la actividad elevada de la HPA puede ocurrir bajo una variedad de condiciones, incluyendo ejercicio físico, anomalías metabólicas y la presencia de enfermedad infecciosa22. Otros factores importantes que deben tenerse en cuenta a la integridad principal de los datos hormonales incluyen los siguientes. (1) Nivel aceptable de error aleatorio: los coeficientes de variación obtenidos de los controles internos (CV1 y CV2) deben promediarse en <15% para todos los ensayos. (2) Error aleatorio dentro del ensayo de muestra- las muestras duplicadas que se ejecuten en cada placa deben tener un CV% de <15%; de lo contrario, la muestra tendrá que volver a ejecutarse. (3) Límite de detección de ensayos: la concentración de hormonas cuantificadas en cada ensayo debe estar dentro del límite de detección de ensayos (entre las lecturas para la dilución más alta y el estándar limpio); de lo contrario, las muestras pueden requerir una dilución adicional (si los niveles detectados para las muestras son superiores a la concentración de estándar limpio) o no pueden analizarse dentro del ensayo (si los niveles detectados para las muestras son inferiores a la concentración del nivel más alto diluido estándar). (4) Sensibilidad del ensayo - esto puede verse afectado por la lectura de fondo (encuadernación no específica), por lo tanto, es importante mantener el más alto nivel de garantía de calidad para el ensayo (por ejemplo, equipos como la lavadora de placas y el lector de placas deben ser reparados regularmente). (5) Secado de extracto de muestra - este paso podría resultar en una posible contaminación cruzada o pérdida de muestras. Se recomienda que las muestras se sequen a vapor de gas N2 individualmente y que sustituyan la pipeta Pasteur utilizada para la extracción entre cada muestra.
Figura 3: Diagrama de flujo conceptual que muestra los pasos clave involucrados en el inmunoensayo-inmunoensayo de enzimas de cortisol de piel de koala (EIA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El procedimiento descrito en este estudio (Figura3) es uno que se puede replicar fácilmente, ya que es relativamente fácil de realizar, metodología paso a paso que incorpora productos químicos, reactivos y suministros fácilmente disponibles con equipos que probablemente sean en un laboratorio analítico estándar. La aplicación de este estudio permite utilizar una técnica no invasiva para evaluar el estrés fisiológico tanto en koalas silvestres como en koalas cautivas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado a través de fondos de investigación para Edward Narayan a través de la Western Sydney University, School of Science and Health. Los autores agradecen a Jack Nakhoul por su ayuda con el procesamiento de muestras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
| Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
| DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
| Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
| Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
| Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
| Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
| Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
| Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
| Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
| Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
| Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |
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