Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generazione, amplificazione e titolazione del virus sinciziale respiratorio ricombinante

Published: April 4, 2019 doi: 10.3791/59218
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,3, 1,3
1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

Summary

Descriviamo un metodo per la generazione e amplificando geneticamente modificate virus sinciziale respiratorio (ad) e un saggio della placca ottimizzato per ad. Illustriamo questo protocollo creando due virus ricombinanti che rispettivamente permettono di quantificazione della replica di RSV e live analisi dei corpi di inclusione di RSV e dinamiche di granuli di corpi di inclusione-collegata.

Abstract

L'uso di virus ricombinanti è diventato cruciale in virologia di base o applicata. Genetica inversa ha dimostrata di essere una tecnologia estremamente potente, sia per decifrare i meccanismi di replicazione virale e per studiare farmaci antivirali o fornire la piattaforma di sviluppo per i vaccini. La costruzione e la manipolazione di un sistema di genetico inverso per un negativo-strand RNA virus come un virus respiratorio sinciziale (RSV), tuttavia, rimane delicate e richiede particolare know-how. Il genoma di RSV è un RNA single-strand, senso negativo di circa 15 kb che serve come modello per sia virale RNA replicazione e trascrizione. Il nostro sistema di genetica inversa utilizza una copia del cDNA del genoma di ceppo lunga RSV (HRSV). Questo cDNA, come pure di cDNA codificanti proteine virali della polimerasi complessa (L, P, N e M2-1), vengono inseriti in vettori di espressione individuale sotto sequenze di controllo della polimerasi di T7. La transfezione di questi elementi in cellule di BSR-T7/5, che esprimono stabilmente della polimerasi T7, consente la replica citoplasmatica e trascrizione di RSV ricombinante, dando origine a virioni geneticamente. Una nuova RSV, che è presente alla superficie delle cellule e nel surnatante cultura di BSRT7/5, si è riunita per infettare cellule HEp-2 per l'amplificazione virale. Due o tre cicli di amplificazione sono necessari per ottenere stock virali contenenti 1 x 106 a 1 x 107 unità formanti placca (PFU) / mL. Metodi per l'ottimale raccolta, congelamento e la titolazione degli stock virali sono descritti qui in dettaglio. Illustriamo il protocollo presentato qui creando due virus ricombinante rispettivamente esprimendo gratis proteina fluorescente verde (GFP) (RSV-GFP) o virale M2-1 fuso a GFP (RSV-M2-1-GFP). Vi mostriamo come utilizzare RSV-GFP per quantificare RSV replica e la RSV-M2-1-GFP per visualizzare strutture virali, come pure le dinamiche di proteina virale in cellule vive, utilizzando tecniche di microscopia dei video.

Introduction

RSV umana è la principale causa di ricovero in ospedale per infezione acuta delle vie respiratorie nei neonati nel mondo1. Inoltre, RSV è associato a un onere notevole malattia negli adulti paragonabili all'influenza, con la maggior parte dell'ospedalizzazione e l'onere di mortalità in anziani2. Non esistono vaccini o farmaci antivirali specifici disponibili ancora contro RSV, ma promettendo nuovi farmaci sono in sviluppo3,4. La complessità e la pesantezza delle tecniche di quantificazione di moltiplicazione RSV ostacolare la ricerca di antivirali o vaccini nonostante i notevoli sforzi attuali. La quantificazione della moltiplicazione di RSV in vitro è generalmente basata su metodi laboriosi, lunghi e costosi, che consistono principalmente nell'analisi dell'effetto citopatico da microscopia, immunostaining, riduzione della placca saggi, quantitative trascrittasi inversa (qRT)-reazione a catena della polimerasi (PCR) ed enzima-collegata dell'immunosorbente test di analisi. Virus con genomi modificati e che esprimono i geni reporter, come quelli codificanti per la GFP, sono più adatti per tali proiezioni. Accoppiato all'uso di lettori di micropiastre automatizzati, virus ricombinante di reporter gene-trasportare può rendere queste analisi più adatta per scopi di alto-rendimento e standardizzazione.

RSV è un involucro,-senso virus a RNA che appartiene al genere di Orthopneumovirus di Pneumoviridae famiglia, ordine Mononegavirales5. Il genoma di RSV è un RNA single-strand, senso negativo di circa 15 kb, che contiene una regione non codificante alle estremità 3' e 5' chiamato Leader e Trailer e 10 unità trascrizionale codifica 11 proteine. I geni vengono ordinati come segue: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codifica per le proteine M2-1 e M2-2) e L-5'. il RNA genomico è strettamente confezionato dalla nucleoproteina N. Using il RNA genomico incapsidato come un modello, in modo virale RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp) trascrizione e replicazione del RNA virale. RdRp virale è composta da grande proteina L, che trasporta l'attività della polimerasi del nucleotide per sé, suo cofattore obbligatorio la fosfoproteina P e la proteina M2-1 che funziona come una trascrizione virale fattore6. Nelle cellule infette, RSV induce la formazione di inclusioni citoplasmiche chiamati corpi di inclusione (IBs). Le inclusioni citoplasmiche morfologicamente simili sono state osservate per diversi Mononegavirales7,8,9,10. Recenti studi sul virus della rabbia, virus della stomatite vescicolare (VSV), il virus di Ebola e RSV ha mostrato che la sintesi di RNA virale si presenta in IBs, che può dunque essere considerata come fabbriche virali8,9,11, 12. le fabbriche di virus concentrare il RNA e proteine virali, necessarie per la sintesi del RNA virale e contengono anche proteine cellulari13,14,15,16, 17. IBs esibiscono un subcompartment funzionale chiamato granuli IB-collegato (IBAGs), che si concentrano il recentemente sintetizzato mRNA virale nascente insieme con la proteina M2-1. il RNA genomico e la L, P e N non vengono rilevati in IBAGs. IBAGs sono piccole strutture sferiche dinamici all'interno di IBs che presentano le proprietà di organelli liquido12. Nonostante il ruolo centrale di IBs in moltiplicazione virale, pochissimo è conosciuto circa la natura, struttura interna, formazione e funzionamento di queste fabbriche virali.

L'espressione del genoma di un poliovirus da un cDNA ha permesso la produzione del primo clone virale infettiva nel 198118. Per singolo filamento negativo virus del RNA, non era fino al 1994 che la produzione di un primo virus di rabbia dopo trasfezione di plasmidi in cellule19 ha avuto luogo. Il sistema genetico inverso basato su plasmide primo per RSV è stato pubblicato nel 199520. Genetica inversa hanno portato a grandi progressi nel campo della virologia. La possibilità di introdurre modifiche specifiche nel genoma virale ha fornito le comprensioni critiche nella replica e nella patogenesi del virus del RNA. Questa tecnologia inoltre notevolmente ha facilitato lo sviluppo di vaccini permettendo attenuazione specifici attraverso una serie mirata di modifiche. Modifiche di genoma permettendo una rapida quantificazione della moltiplicazione virale notevolmente migliorato lo screening antivirale e studio della loro modalità di azione.

Anche se descritto in precedenza, ottenendo geneticamente ad rimane delicato. Qui, dettagliamo un protocollo per creare due tipi di HRSV ricombinante, che esprimono rispettivamente RSV-GFP o RSV-M2-1-GFP. In questo protocollo, descriviamo le condizioni di transfezione necessarie per salvare i nuovi virus ricombinanti, come pure la loro amplificazione per ottenere stock virali con alto titolo, adatto per sperimentazioni riproducibile. La costruzione di vettori di genetica inversa di per sé non è descritto qui. Descriviamo i metodi per la raccolta ottimale e il blocco di stock virali. Il metodo più preciso per quantificare le particelle virali infettive rimane saggio della placca. Le cellule sono infettate con diluizioni seriali della sospensione analizzata e incubate con un overlay che vieta la diffusione di particelle virali libere nel surnatante. In tali condizioni, il virus infetterà solo celle contigue, formando una "targa" per ogni particella infettiva. Nell'analisi della titolazione RSV convenzionale, le piastre sono rivelate immunostaining e conteggiate sotto osservazione microscopica. Questo metodo è costoso e richiede tempo. Qui abbiamo descritto un protocollo molto semplice per un saggio della placca di RSV mediante sovrapposizione di cellulosa microcristallina che consente la formazione di placche visibili ad occhio nudo. Vi mostriamo come RSV-GFP può essere utilizzato per misura RSV replica e, quindi, di quantificare l'impatto di antivirali. Combinazione di genetica inversa e diretta tecnologia di imaging, dimostriamo come RSV-M2-1-GFP permette agli scienziati di visualizzare M2-1 in cellule vive e di seguire la dinamica di strutture virali intracellulari, come IBs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. materiale preparazione

  1. Acquisto di media delle cellule (siero ridotto mezzi di comunicazione, minimo essenziale [MEM], 10 x MEM e Dulbecco s modified esente Eagle [DMEM]), reagente di transfezione e cellulosa microcristallina (Vedi Tabella materiali).
  2. Ottenere i seguenti vettori per genetica inversa: la genomica tutt'e i vettori di espressione che codifica la proteina di N e le proteine del complesso della polimerasi. I vettori genomici contengono il genoma completo del cDNA della RSV-GFP (GFP-RSV-p) e della RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) a valle dal promotore del batteriofago T7 RNA polimerasi (T7 pol). I vettori di espressione (designato come p-N, p -P, p-L e p-M2-1) contengono la sequenza di codificazione di N, P, L o M2-1 a valle il pol T7 (Vedi Rincheval et al.12 e Rameix-Welti et al.21 per i dettagli riguardanti i costrutti di plasmide).
  3. Preparare i supporti per una coltura cellulare in un ambiente sterile e per la transfezione e infezione. Uso DMEM con 2 mM L-Glutammina completati con 10% siero fetale di vitello (FCS), 1.000 unità/mL di penicillina e streptomicina 1 mg/mL (o senza antibiotici) e MEM con 2 mM L-Glutammina completati con 0%, 2% o 10% FCS, 1.000 unità/mL di penicillina e 1 mg/mL streptomicina, designata come "medie completa" il seguente protocollo.
  4. Ottenere cellule22 BSRT7/5 e fanno scorte in completa supplementato con 10% di dimetilsolfossido (DMSO) a 1-2 x 106 cellule/mL. Conservare le scorte delle cellule in azoto liquido. Ottenere cellule HEp-2. Cellule di BSRT7/5 di cultura in DMEM completo e cellule HEp-2 in MEM completa a 37 ° C e 5% di CO2 in un ambiente sterile.
  5. Preparare una soluzione di conservazione 10x RSV (0,5 M HEPES e 1m MgSO4 [pH 7.5] in acqua) in un ambiente sterile.
  6. Ottenere un microscopio a fluorescenza invertito compatibile con misure di fluorescenza di GFP e compatibile con live imaging se è necessario monitorare un'infezione. Ottenere un lettore di micropiastre compatibile con misure di fluorescenza di GFP per la quantificazione di replica RSV-GFP.

2. salvataggio e primo passaggio dei Virus ricombinante

Nota: Eseguire le seguenti operazioni in un ambiente sterile, utilizzando una classe di sicurezza II gabinetto.

  1. Il giorno prima di transfezione, fare una sospensione della linea cellulare BSRT7/5 a 5 x 105 cellule/mL in mezzo completo. Distribuire 2 mL della sospensione di cellule per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Preparare un pozzetto al virus che sta per essere salvato e un ulteriore pozzetto per il controllo negativo. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% CO2. Verificare che le cellule siano in una confluenza di 80 – 90% il giorno successivo.
  2. Sbloccare la genetica inversa vettori (dal punto 1.2) p-RSV-GFP e p-RSV-M2-1-GFP, così come p-N, p -P, p-L e p-M2-1. Mix, per ogni virus di salvataggio, 1 µ g di p-N e p -P, 0,5 µ g di p-L, 0,25 µ g di p-M2-1 e 1.25 µ g di p-RSV (GFP o GFP M2-1) in un tubo.
    Nota: Possono essere utilizzati diversi vettori per N, P, L e M2-1; Tuttavia, il rapporto tra le proteine deve essere mantenuto. Eseguire il controllo negativo sostituendo il vettore p-RSV con un vettore vuoto.
  3. Procedere alla transfezione, seguendo il protocollo del produttore del reagente di transfezione (Vedi tabella materiali).
    1. Aggiungere 250 µ l di siero riduttore terreno per i vettori misti. In un altro tubo, diluire 10 µ l di reagente di transfezione in 250 µ l di siero riduttore terreno. Vortice delicatamente tubi e aspettare per 5 min, miscela il contenuto di entrambe tubi e aspettare 20 minuti a temperatura ambiente.
    2. Sciacquare le cellule BSRT7/5 con 1 mL di siero riduttore terreno e distribuire 1,5 mL di MEM con 10% FCS senza antibiotici per pozzetto. Se necessario, incubare a 37 ° C e 5% CO2 finché non viene completata l'incubazione descritto al punto 2.3.1.
    3. Aggiungere 500 µ l della miscela transfezione preparata al punto 2.3.1 ad un pozzo, quando il tempo di incubazione di 20 min. Posizionare le cellule nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per 3 giorni. Non modificare il terreno di coltura delle cellule durante la transfezione.
  4. Osservare la fluorescenza di GFP (eccitazione a 488 nm) e emissione a 515 – 535 nm sotto un microscopio a fluorescenza invertito a 20 ingrandimenti 1 x al giorno per monitorare l'efficienza di salvataggio, utilizzando la GFP filtrare.
  5. Il secondo giorno dopo la trasfezione, le cellule per il primo passaggio dei virus hanno salvato del seme. Preparare una sospensione di cellule HEp-2 a 5 x 105 cellule/mL in terreno completo. Distribuire 2 mL della sospensione di cellule per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (un pozzetto al virus di salvataggio e un controllo negativo).
  6. Il terzo giorno di transfezione, gratta e Vinci cellule in ciascun pozzetto della piastra 6 pozzetti BSRT7/5 transfettata, utilizzando un raschietto differente per ciascun pozzetto. Trasferire ogni contenuto ben (cellule e surnatante) in una provetta da microcentrifuga sterile mL 2. Vortexare ciascuna provetta vigorosamente per almeno 30 s per rilasciare il virus hanno salvato dalle membrane cellulari.
    Nota: Questo corrisponde al passaggio 0 (P0) del virus hanno salvato (Figura 1).
  7. Utilizzare la sospensione virale fresca di P0 per eseguire il primo amplificazione dei virus hanno salvato.
    1. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra a 6 pozzetti HEp-2 teste di serie il giorno prima (Vedi punto 2.5) e rapidamente aggiungere 500 µ l della sospensione per pozzetto P0 (dal punto 2.6). Posizionare la piastra di HEp-2 a 37 ° C su un rocker di altalena per agitazione morbido per 2 h.
    2. Rimuovere e scartare i 500 µ l di inoculo e aggiungere 2 mL di MEM con 2% di FCS. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% CO2 per 3 giorni. Questo produrrà il primo passaggio (P1) dei virus hanno salvato (Figura 1).
  8. Aggiungere 1/10 del volume di soluzione di conservazione di RSV x 10 (0,5 M HEPES e 1m MgSO4 [pH 7.5]) nella sospensione rimanente P0 (dal punto 2.6). Vortice microprovette vigorosamente per 5 s e aliquota il contenuto nei tubi criogenici etichettati con tag resistente all'alcool. Immergere le provette per almeno 1 h in alcool preraffreddata a-80 ° C e conservarli a-80 ° C.
  9. Titolo lo stock di P0 (Vedi punto 2.6) di ogni virus hanno salvato (vedere sezione 4 per la titolazione di cellulosa microcristallina).
  10. Osservare la fluorescenza di GFP (eccitazione a 488 nm) e emissione a 515 – 535 nm delle cellule HEp-2 infettati con la sospensione di P0 sotto un microscopio a fluorescenza invertito a 20 ingrandimenti 1 x al giorno per controllare l'infezione. Osservare sotto un microscopio a campo chiaro l'aspetto di piccoli sincizi e distacco che riflette l'effetto citopatogeno RSV (CPE) di cella (Vedi Figura 2).
  11. Si noti che il salvataggio non è riuscita se fluorescenza né CPE è visibile dopo 2 – 3 giorni.
  12. Raccogliere il primo passaggio (P1) al giorno 3 o 4 come descritto al punto 2.6. In breve, raschiare le cellule, raccogliere le cellule e il surnatante insieme, vortice, aggiungere la soluzione di conservazione come descritto al punto 2.8, aliquota del campione e congelarlo.
  13. Titolo (vedere sezione 4 per il dosaggio di titolazione) e amplificare il primo passaggio (vedere la sezione 3 per l'amplificazione).

3. amplificazione dei virus hanno salvato

Nota: Il seguente protocollo descrive l'amplificazione dei virus salvati in una boccetta di2 cm 75. Adattare le dimensioni della muffola per il volume necessario e la necessaria molteplicità di infezione (MOI). La tabella 1 indica volumi per Boccette differenti. Eseguire le seguenti operazioni in un ambiente sterile in un armadietto di sicurezza II classe.

  1. Preparare una sospensione di cellule HEp-2 a 5 x 105 cellule/mL in terreno completo, il giorno prima l'amplificazione. Distribuire 15 mL della sospensione delle cellule per fiaschetta2 75 cm e incubare i matracci a 37 ° C e 5% CO2. Preparare una boccetta al virus per amplificare.
  2. Il giorno dopo l'inizio dell'incubazione, verifica che le cellule sono 80% – 100% confluenti.
  3. Diluire la sospensione virale dal punto 2.12 in MEM senza FCS per ottenere una sospensione di 3 mL alle 50.000 PFU/mL (corrispondente a un MOI di 0.01 PFU/cella).
  4. Rimuovere il mezzo e di aggiungere rapidamente il 3 mL di sospensione virale. Posizionare il pallone a 37 ° C su un rocker di altalena per agitazione morbido per 2 h.
  5. Rimuovere e scartare l'inoculo e aggiungere 15 mL di MEM con 2% di FCS. Incubare a 37 ° C e 5% CO2 per 2 – 4 giorni.
  6. Controllare la morfologia delle cellule e la fluorescenza di GFP (eccitazione a 488 nm) e emissione a 515 – 535 nm sotto un microscopio a fluorescenza invertito a 20 ingrandimenti al fine di stimare il momento giusto per raccogliere i virus. Si noti che questo è di solito quando 50% – 80% dello strato di cellule HEp-2 è staccato a causa del CPE di RSV che si verifica tra 48 e 72 h postinfection (p.i.) (Vedi Figura 3).
  7. Raschiare tutte le celle utilizzando un raschietto di cella. Raccogliere insieme sia le cellule e il surnatante e trasferirli in una provetta da centrifuga 50 mL.
  8. Aggiungere 1/10 del volume di 10 x soluzione di conservazione RSV (0,5 M HEPES e 1m MgSO4 [pH 7.5]). Vortice i tubi energicamente per 5 s e chiarire la sospensione di una centrifugazione di 5 min a 200 x g.
  9. Trasferire il surnatante in una provetta 50 mL. Vortex brevemente e aliquota della sospensione in provette criogeniche etichettati con tag resistente all'alcool. Immergere le provette in alcool preraffreddato-80 ° C per almeno 1 h e conservarli a-80 ° C.
  10. Sblocca una delle aliquote a titolare la sospensione virale (Vedi sezione 4).

4. placca titolazione dosaggio

  1. Preparare 12-pozzetti piastre per la titolazione il giorno prima che venga eseguito il test di titolazione (sei pozzi saranno necessario titolo uno tubo di virus). I pozzetti con 1 mL di cellule HEp-2 a 5 x 105 cellule/mL in sostanza completa del seme.
  2. Il giorno successivo, preparare una sospensione sterile cellulosa microcristallina (2,4% [p/v] in acqua) (Vedi tabella materiali).
    1. Disperdere 2,4 g di polvere di cellulosa microcristallina in 100 mL di acqua distillata, utilizzando un agitatore magnetico standard, fino al completo scioglimento della polvere (solitamente 4 – 12 h). Autoclave la sospensione a 121 ° C per 20 min e conservarla a temperatura ambiente prima dell'uso.
      Nota: In tali condizioni, la sospensione è stabile per 1 anno.
    2. Dopo aver aperto la soluzione in un ambiente sterile, conservarlo a 4 ° C per 6 mesi. Mescolare sempre la sospensione prima dell'uso (con mano tremante o Vortex) per assicurarsi che sia omogeneo.
  3. Preparare il 2 x MEM in un ambiente sterile. Diluire commerciale MEM 10 x con acqua sterile e aggiungere L-glutamina, 1.000 unità/mL di penicillina e streptomicina 1 mg/mL. Agitare energicamente la diluizione e conservarla a 4 ° C.
    Nota: Eseguire passaggi 4.4 – 4.10 in un ambiente sterile utilizzando una classe di sicurezza II gabinetto.
  4. Preparare sei provette contenenti 900 µ l di MEM senza FCS per virus da dosare (i tubi di titolazione). Scongelare le aliquote di virus, vortexare vigorosamente per 5 s e trasferire 100 µ l alla titolazione prima provetta.
  5. Eseguire una diluizione dieci volte 6 x, come indicato di seguito. Aggiungere 100 μL di virus a 900 μL di mezzo nel primo tubo, mettere il tappo sul tubo e mescolare il contenuto nel Vortex per pochi secondi. Cambiare la punta sulla pipetta, aggiungere 100 µ l della diluizione prima a 900 µ l di terreno nel secondo tubo, mettere il tappo sul tubo e vortice. Ripetere la procedura fino a quando il tubo di Sesto.
    Nota: È molto importante cambiare la punta per ogni diluizione.
  6. Scrivere il virus nome e le diluizioni di piega sulle piastre 12-pozzetti HEp-2. Aggiungere un segno per abbinare la piastra e la sua copertura, perché possono essere separate durante la colorazione (passo 4.9). Rimuovere il mezzo delle placche e distribuire 400 µ l di una diluizione per pozzetto. Incubare le piastre a 37 ° C per 2 h, per adsorbimento del virus.
    Nota: Cambiare la punta della pipetta tra ciascun inoculo o procedere dalla più bassa alla più alta concentrazione con la stessa punta. Inoculare una serie limitata di piastre (1 o 2) contemporaneamente per evitare le celle di essiccazione.
  7. Preparare la sovrapposizione di cellulosa microcristallina durante l'adsorbimento del virus (preparazione estemporanea). Per ottenere 100 mL di sovrapposizione, mescolare 10 mL di sospensione 2,4% cellulosa microcristallina, 10 mL di 2x MEM e 80 mL di MEM con 2% di FCS.
    1. Regolare il pH del 2 x MEM per circa 7,2 con una soluzione di bicarbonato di sodio sterile al 7,5%, seguono l'indicatore di colore. Aggiungere la sospensione di cellulosa microcristallina e la MEM e mescolare energicamente.
  8. Alla fine dell'incubazione 2h, aggiungere 2 o 3 mL di sovrapposizione in tutti i pozzetti delle piastre 12-pozzetti senza rimuovere l'inoculo. Fare attenzione a evitare la contaminazione dei pozzetti adiacenti con Inoculanti da alto titolo virale. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% CO2 per 6 giorni. Non spostare la piastra e non spostare l'incubatore durante l'incubazione.
  9. Procedere a macchiare le celle, utilizzando la soluzione al cristalvioletto (8% cristallo viola [v/v], 2% formaldeide [v/v] e [v/v] etanolo al 20% in acqua).
    1. Proteggere la superficie di lavoro della cappa di biosicurezza con un foglio (la viola di cristallo colori fortemente superfici).
    2. Agitare delicatamente le piastre a decollare la sovrapposizione di cellulosa microcristallina. I surnatanti di rimuovere e lavare le cellule 2 x con 1x tampone fosfato salino (PBS). Gestire i piatti uno per uno per evitare le celle di essiccazione. Aggiungere 1 – 2 mL della soluzione di cristalvioletto e attendere 10 – 15 min. Rimuovi la soluzione, che può essere riutilizzata per successiva piastra di colorazione.
    3. Immergere i piatti e coperchi in candeggina fresco per pochi secondi e, quindi, lavarle accuratamente con acqua del rubinetto. Si noti che le piastre e le coperture sono decontaminate dalla candeggina.
    4. Mettere i piatti e coperchi su carta assorbente e lasciarli asciugare. Dopo il risciacquo con acqua, asciugare le piastre a temperatura ambiente e conservarle a temperatura ambiente. Per lunghi periodi di stoccaggio (mesi), tenere le piastre al riparo dalla luce per proteggere il colore. Si noti che se le cellule perdono la loro colorazione, può essere macchiati nuovamente con cristallo viola.
  10. Calcolare i titoli del virus. Contare le placche nei pozzetti delle piastre asciutte, che sono visibili ad occhio nudo. Verifica che il numero delle placche delle diluizioni differenti è coerente (fattore 10 tra ogni diluizione). Scegliere il bene su cui le targhe sono il metodo più semplice per contare. Valutare il numero delle placche contro il volume di inoculo e la diluizione.
    Nota: Nell'esempio riportato in Figura 4, 21 placche sono contate con la diluizione 10-5 . Questi corrispondono a un titolo di
    Equation
    Equation

5. l'uso di Virus ricombinanti HRSV-GFP per monitorare la replica virale nelle cellule trattate con piccolo RNA interferente o antivirali

Nota: Eseguire tutti i passaggi tranne 5.1 e 5.2.5 in un ambiente sterile utilizzando una classe di sicurezza II gabinetto.

  1. L'effetto di silenziamento genico cellulare sulla moltiplicazione di RSV di monitoraggio
    Nota: Il protocollo di transfezione dipende il reagente (Vedi Tabella materiali).
    1. Preparare piastre da 96 pozzetti per la misurazione di GFP. Due giorni prima del saggio, per dato piccolo RNA interferente (siRNA), preparare una soluzione di supporto riduttore del siero contenente siRNA ad una concentrazione di 100 nM e un reagente di transfezione di siRNA diluito a 1/500. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 30 minuti.
    2. Aggiungere 25 µ l della soluzione ai pozzetti della piastra preparato in 5.1.1 (in triplice copia). Seme i pozzetti con 75 µ l di una sospensione di cellule A549 a 4 x 105 cellule/mL in terreno completo senza antibiotici per ottenere una concentrazione finale delle cellule di 3 x 105 cellule/mL. Incubare la piastra per 48 h a 37 ° C e 5% CO2.
      Nota: La concentrazione finale siRNA è di 25 nM e il volume di reagente di transfezione finale è 0,5 µ l/pozzetto).
    3. Infettare le cellule come segue. Rimuovere il supporto dai pozzi. Aggiungere 100 µ l della sospensione di RSV-GFP a 50.000 PFU/mL e incubare per 2 ore a 37 ° C e 5% CO2. Rimuovere la sospensione virale e aggiungere 100 µ l di DMEM con 2% FCS e senza rosso fenolo. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% CO2.
    4. Alle h 24 e 48 h p.i., misurare la fluorescenza, utilizzando una Spettrofluorimetro impostata su lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione di 488 e 520 nm, rispettivamente (fluorescenza è espressa in unità di fluorescenza relativa). Utilizzare non infette cellule A549 come standard per i livelli di fluorescenza e sfondo.
      Nota: Le cellule hanno bisogno di essere fissato con paraformaldeide al 4% (PFA) prima di misurare la loro senza il coperchio della piastra.
  2. Valutazione dell'inibizione della droga usando RSV-GFP
    1. Preparare piastre da 96 pozzetti per la misurazione di GFP. Il giorno prima del saggio, del seme i pozzetti con 100 µ l di una sospensione di cellule HEp-2 a 5 x 105 cellule/mL in terreno completo senza rosso fenolo.
    2. Preparare una diluizione seriale della testata (AZ4316 in questo esempio) la droga in MEM completata con 2% FCS e antibiotici (50 µ l per pozzetto). Preparare una sospensione virale a 10.000 PFU/mL in MEM senza fattore vascolare stromal (SVF) e senza rosso fenolo (50 µ l per pozzetto).
    3. Rimuovere il mezzo da 96 pozzetti HEp-2 piastra e aggiungere 50 µ l della sospensione di droga e 50 µ l della sospensione virale (in triplice copia). Eseguire un'infezione fittizia in parallelo come un controllo.
      Nota: La diluizione di droga e sospensione virale possono essere mescolati prima della loro aggiunta sulle cellule, o possono essere aggiunti in sequenza.
    4. Incubare la piastra per 48 h a 37 ° C e 5% CO2.
    5. Misurare la fluorescenza, utilizzando una spettrofluorimetro come descritto al punto 5.1.4. Utilizzare mock-infettato cellule HEp-2 come standard per livelli di fluorescenza di fondo.

6. caratterizzazione di M2-1 localizzazione In Vivo con il Virus ricombinante RSV-M2-1-GFP

Nota: Eseguire i passaggi 6.1 e 6.2 in un ambiente sterile, utilizzando una classe di sicurezza II gabinetto.

  1. Preparare una sospensione di cellule HEp-2 a 5 x 105 cellule/mL in terreno completo. Seme di 1,5 mL di sospensione cellulare in un 35 mm di Petri permeante di CO2 e adattato per live imaging.
  2. Eseguire l'infezione il giorno dopo la semina con il virus RSV-M2-1-GFP a MOI 1, come descritto nei passaggi 3.3 – 3,5 (rimuovere il mezzo, aggiungere 500 µ l ad 1 mL di inoculo e incubare il campione a 37 ° C agitando delicatamente per 2 h; rimuovere l'inoculo e aggiungere 1,5 mL di MEM con 2 % FCS). Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO2 per il tempo desiderato (IBs inizieranno ad apparire da 10 h p.i.).
  3. Preriscaldare la camera di incubazione di un microscopio invertito dotato di 40 x 100 obiettivi x a 37 ° C, prima di mettere la capsula di Petri contenente le cellule infette sul palco. Aprire l'alimentazione di CO2 e attendere per la stabilizzazione di messa a fuoco.
  4. Eseguire imaging con filtri di GFP-compatibile, sotto una frequenza di eccitazione di bassa intensità e immagine (da 1 a 0,1 immagine al minuto) per ridurre al minimo la fototossicità.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In questo lavoro, abbiamo descritto un protocollo dettagliato per produrre ricombinanti virus RSV che esprime una proteina fluorescente (Figura 2). OSPRO-GFP, il gene GFP è stato introdotto tra i geni P e M, come descritto per il gene della ciliegio in lavoro precedentemente pubblicato21. In OSPRO-M2-1-GFP, il gene di M2 è stato lasciato intatto e un ulteriore gene che codifica per M2-1-GFP è stata inserita tra i geni12SH e G. Il primo passo, corrispondente per il salvataggio del virus nelle cellule BSRT7/5, è mostrato nella Figura 2A. Piccoli grappoli di cellule fluorescenti verde erano posttransfection di 72h visibile nei pozzetti corrispondenti a salvataggio RSV-GFP e RSV-M2-1-GFP. Il segnale fluorescente potrebbe essere osservato in nuclei in cellule infettate da RSV-GFP, corrispondente all'espressione della GFP gratis e citoplasma. Al contrario, al salvataggio di RSV-M2-1-GFP, piccoli punti fluorescente citoplasmici potrebbero essere osservati, corrispondente all'accumulo di M2-1-GFP in IBs. Nessun CPE (sincizi, cellule indipendente) viene generalmente osservata in questa fase. Al contrario, durante la seconda fase, corrispondente all'amplificazione di virus (primo passaggio) su cellule HEp-2, il CPE era visibile in cellule infettate a 72 h p.i. (Figura 2B). Figura 3A B indica il CPE forte dell'infezione RSV, caratterizzata da grande sincizi, scollegati o non e molte cellule galleggiante. Sincizi e cellule entrambi esposti brillante fluorescenza verde. Figura 3A Mostra l'evoluzione dell'effetto citopatico tra 24 e 72 h p.i. in cellule infettate con il virus RSV-M2-1-GFP. Alcune cellule sparse fluorescente erano visibili a 24 h p.i. senza un CPE rilevabile. Piccoli sincizi (cluster di cellule fluorescenti) e poche cellule indipendente/sincizi cominciarono ad apparire a sincizi fluorescente grande di 48 h p.i. e cellule galleggianti erano chiaramente visibili a 72 h p.i.

Immagini del saggio di titolazione della placca e titoli virali corrispondente all'intero processo di produzione di RSV sono mostrate in Figura 5. Esecuzione del saggio di placca sul controllo negativo, trasfettato con solo i plasmidi di espressione di N, P, L e M2-1, ha rivelato nessuna piastra alla diluizione più bassa. I titoli ottenuti da cellule transfected dovevano essere superiori a 100 PFU/mL se il salvataggio è stato efficiente, come mostrato nella Figura 5. Quindi, i titoli aumentati sopra i passaggi, per raggiungere 106– 107 PFU/mL al passaggio 1 o 2. Si noti che i titoli virali erano simili tra i due virus ricombinanti.

Le cellule sono state trasfettate con siRNA targeting il mRNA di una proteina virale (N) o di due proteine cellulari (inosina-5'-monofosfato deidrogenasi [IMPDH] e gliceraldeide 3'-fosfato deidrogenasi [GAPDH]). Le cellule inoltre sono state trasfettate con siRNA nontargeting. Figura 6 Mostra il monitoraggio della moltiplicazione di RSV utilizzando virus RSV-GFP in cellule trattate con siRNA. Un forte segnale GFP è stato osservato (Figura 6A) e misurati (Figura 6B) sulle cellule di controllo trasfettate con siRNA nontargeting o cellule trasfettate con siRNA contro GAPDH mRNA. Al contrario, l'espressione della GFP è stato diminuito in cellule infettate esprimendo siRNA targeting N o IMPDH. Si noti che abbiamo verificato che il segnale fluorescente GFP in cellule infettate da RSV-GFP a 48h p.i. è stato correlato con la dose virale come precedentemente dimostrato per un simile RSV ricombinante esprimendo Cherry (RSV-Cherry)21. Per valutare l'efficienza di droga sulla moltiplicazione di RSV, cellule HEp-2 sono state infettate con RSV-GFP per 48 h in presenza di diverse concentrazioni di farmaco. Abbiamo osservato una forte diminuzione del segnale GFP, che ha raggiunto il rumore di fondo (c'era un segnale osservato sulle cellule non infette), in presenza di una concentrazione di farmaco maggiore, come mostrato nella Figura 7. Il IC50 osservati per AZD4316 era circa 4 nM, simile alla CE50 pubblicati di circa 2 – 40 nM contro diversi ceppi HRSV23. L'analisi delle dinamiche di IBs e IBAGs in cellule viventi, grazie alla RSV-M2-1-GFP, sono mostrati in Figura 8 e Figura 9 (e Movie 1 e 2 di film). IBs appaiono come strutture sferiche mobile in grado di fondere, formando una maggiore inclusione sferica. IBAGs sono molto dinamici. Sottoposte a cicli di montaggio-smontaggio continuo con la formazione di piccoli IBAGs che crescono, fusibile in grande IBAGs e poi scompaiono.

Piastra o boccetta Cellule HEp-2 per essere seminato il giorno prima Medio volume (mL) Volume di inoculo di virus (mL)
pallone da2 di 150 cm 15 x 106 30 5
pallone da 75 cm2 7,5 x 106 15 3
pallone da 25 cm2 2,5 x 106 5 1
piastra a 6 pozzetti 1 x 106 2 0,5

Tabella 1: Numero di celle e volume di inoculo da utilizzare in boccette differenti.

Figure 1
Figura 1: rappresentazione schematica delle operazioni di salvataggio e amplificazione. Transfezione del vettore di espressione di N, P, L, M2-1 e RSV antigenomic RNA nelle cellule BSRT5/7 (Rescue). Espressione del RNA antigenomic RSV e del mRNA di N, P, L e M2-1, da parte della polimerasi T7 RNA. Le proteine N, P, L e M2-1 replicano e trascrivono il RNA genomico, avviando un ciclo di moltiplicazione virale. Nuove particelle virali sono prodotte e si moltiplicano, dando luogo a P0. Il virus raccolto dal salvataggio (P0) è poi amplificato su cellule HEp-2 per produrre una sospensione virale di titolo superiore (P1) (amplificazione). Questo è poi amplificato per ottenere stock virali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: CPE e il pattern di fluorescenza osservata durante il salvataggio della RSV-GFP e RSV-M2-1-GFP. (A) BSRT5/7 celle transfected con i vettori dei genetica inversa come indicato, e immagini di fluorescenza e contrasto di fase sono state scattate a 72 h posttransfection. Il controllo negativo (Neg Ctrl) corrisponde alle cellule transfettate con i vettori di espressione di N, P, L e M2-1 senza il vettore di genetico inverso. (B) cellule HEp-2 sono state infettate con il virus raccolto dalle cellule transfected BSRT5/7 (il zero passaggio, posttransfection 72 h) e immagini sono state scattate 72h postinfection. Le immagini mostrate sono di campi rappresentante; Barra della scala = 100 µm. L'area circoscritta racchiude cellule indicate in ingrandimento; Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: evoluzione della CPE e la fluorescenza osservata durante l'amplificazione di RSV ricombinante. Cellule HEp-2 sono state infettate in un MOI di 0,01 PFU/celle per 72 h con il primo passaggio della RSV-M2-1-GFP (A) o (B) RSV-GFP. Immagini di fluorescenza e contrasto di fase sono state prese a 24h, 48h e 72h postinfection. Le immagini mostrate sono di un campo rappresentativo; Barra della scala = 100 µm. L'area circoscritta racchiude cellule indicate in ingrandimento; Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: determinazione del titolo di RSV usando l'analisi di placca. (A) risultati del dosaggio titolazione della placca in un piatto di 12-pozzetti. I sei pozzi infettati con diluizioni seriali di uno stock virale sono mostrati. Diluizioni sono indicati in un logaritmo in base 10. Le cellule infettate con le tre diluizioni prime sono tutti staccate. I numeri di targa osservata con il 10-4, 10-5, e 10-6 diluizioni sono coerenti. (B) illustrazione dell'enumerazione placca (numeri gialli). La stella verde indica graffi sullo strato delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: titolazione di un virus hanno salvato e amplificato. Fenotipi di placca della RSV-GFP e RSV-M2-1-GFP presso i vari passaggi analizzati su cellule HEp-2 in un piatto di 12-pozzetti (le immagini mostrano la totalità dei pozzi). Nella tabella sono indicati i titoli dei brani successivi. Vengono visualizzati dati rappresentativi. Diluizioni degli stock virali sono indicate in un logaritmo in base 10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: inibizione dell'espressione di siRNA targeting RSV N o IMPDH RSV-GFP. Le cellule A549 sono state trattate con controllo nontargeting siRNA (NT) (barra blu chiaro) o siRNA targeting GAPDH (barra blu), RSV N (barra arancione) o IMPDH2 (barra verde) per 48 h e quindi infettati con RSV-GFP presso un MOI di 0,05 PFU/cella. La fluorescenza verde è stata letta presso un postinfection di 48 h. (A) immagini rappresentative delle cellule RSV-GFP-infettati a 48 h p.i., trattati con siRNA, come si vede sulle foto. Barra della scala = 100 µm. (B) dati sono la media ± SD di due esperimenti indipendenti effettuati in triplice copia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: inibizione della moltiplicazione di RSV-GFP di composti AZD4136. Cellule HEp-2 in piastre da 96 pozzetti sono state infettate con RSV-GFP presso un MOI di 0,05 PFU/cellula in presenza di diluizioni seriali del AZD4316 composto o controllo DMSO. La fluorescenza verde è stata letta a 48 h p.i. che dati sono la media ± deviazione standard di due esperimenti indipendenti eseguite in triplice copia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: analisi delle dinamiche di IBs monitorando la proteina fluorescente M2-1-GFP in cellule HEp-2-infettate da microscopia del lasso di tempo. A 18 h p.i., le cellule erano imaged ogni 5 min per 5 h con un microscopio a fluorescenza, in una camera riscaldata a 37 ° C. L'IBs è fluorescente (verde), perché essi ospitano M2-1-GFP e nuclei sono colorati con Hoechst (blu). Le frecce bianche indicano IBs in fase di fusione. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: analisi delle dinamiche di IBAGs in cellule RSV-M2-1-GFP-infettate da microscopia del lasso di tempo. A 18 h p.i., le cellule erano imaged con un microscopio a fluorescenza, in una camera riscaldata a 37 ° C. La proteina M2-1-GFP è stata visualizzata da fluorescenza verde. Le frecce bianche indicano IBs che subiscono una fusione di IBAGs. Barra della scala = 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Movie 1
Movie 1: analisi In vivo delle dinamiche di IBs in RSV-M2-1-GFP in cellule HEp-2-infected. A 18 h p.i., le cellule erano imaged ogni 5 min per 5 h con microscopio a fluorescenza, in una camera riscaldata a 37 ° C. Barra della scala = 10 µm. Il filmato risultante Mostra 7 fps (fps). Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Movie 2
Movie 2: analisi In vivo delle dinamiche di IBAGs in cellule RSV-M2-1-GFP-infettate. A 18 h p.i., le cellule erano imaged ogni 5 min per 3 h e 40 min con microscopio a fluorescenza, in una camera riscaldata a 37 ° C. Barra della scala = 2 µm. Il filmato risultante Mostra 4 fps. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Qui presentiamo un metodo di salvataggio del ricombinante ad da cinque plasmidi e la loro amplificazione. La capacità di manipolare il genoma del virus ha rivoluzionato la ricerca virologia per testare le mutazioni ed esprimere un ulteriore gene o una proteina virale taggata. La RSV abbiamo descritto e utilizzato come esempio in questo articolo è un virus che esprime un gene reporter, RSV-GFP (non pubblicati) ed esprime una proteina M2-1 fuso a un tag GFP12. Salvataggio di RSV è impegnativo e richiede pratica. L'efficienza di trasfezione è critica, a seconda di una sapiente selezione di reagente di transfezione e un'ottimizzazione preventiva del protocollo di transfezione. L'uso di cellule esprimenti pol fago T7 è obbligatorio perché il cDNA virale è collocato a valle del promotore di pol T7 nella maggior parte del vettore di genetica inversa. Un'alternativa consiste nell'esprimere il pol T7 da un virus di vaccinia virus helper. Tuttavia, l'uso di cellule che esprimono stabilmente il pol T7 evita la necessità di separare i due virus e previene possibili interferenze di vaccinia virus con il salvataggio. È importante eseguire il primo passaggio di genetica inversa (P0 a P1) senza l'inoculo per garantire l'efficienza massima salvataggio di congelamento. Ciò implica che il MOI non è controllato. Tuttavia, in questa fase, i titoli rimangono molto bassi, risultante in un basso MOI per il primo passaggio. Per ottenere scorte di RSV con alti titoli infettive (106– 107 PFU/mL), è importante attendere un forte CPE e raschiare le cellule per raccogliere le particelle virali collegate alle celle. In questo studio, i titoli non sono aumentato dopo 96 h p.i. Il raffreddamento rapido della sospensione virale è importante mantenere alti titoli. Invece di per un'immersione in alcool preraffreddata a-80 ° C, ciò può anche essere realizzata mediante immersione in una miscela di ghiaccio secco/etanolo o in azoto liquido. L'aggiunta della soluzione di conservazione garantirà una maggiore stabilità della sospensione virus a-80 ° C. La conservazione a-80 ° C è critica, poiché il virus verrà rapidamente perdita sua infettività quando conservato a-20 ° C o in azoto liquido. Abbiamo descritto l'amplificazione di RSV su cellule HEp-2, che è la linea cellulare più popolare a crescere RSV, ma è anche in grado di crescere in modo efficiente su numerose altre linee cellulari in vitro. Si noti, tuttavia, che la crescita su cellule Vero può provocare un'alterazione nell'espressione G24.

Abbiamo descritto un protocollo molto semplice di titolazione di placca di RSV utilizzando una sovrapposizione di cellulosa microcristallina. Per quanto riguarda tutti i saggi di titolazione, è sensibile alla contaminazione con sospensioni di alto titolo, che richiedono la manipolazione attenta. Convenzionale RSV titolazione saggi utilizzano agarosio o carbossimetil cellulosa (CMC) sovrapposizioni e richiedono immunostaining e osservazioni al microscopio per la determinazione del titolo. Un protocollo usando agarosio per immunodiffusione è stato descritto che permette la visualizzazione diretta delle placche senza immunostaining25. Tuttavia, le cellule HEp-2 sono molto sensibili a una sovrapposizione di agar riscaldata, che rende difficile da usare per titolazioni di virus più questo protocollo (ad esempio, una sovrapposizione di troppo calda distrugge lo strato delle cellule); d'altra parte, quando è non abbastanza caldo, si solidifica dopo la prima distribuzione di piastra. L'uso di cellulosa microcristallina per un saggio della placca è stato prima descritto da Matrosovich et per un virus di riossidazione A titolazione dosaggio26. Grazie alla sua bassa viscosità, la sovrapposizione di cellulosa microcristallina è facile da erogare e da rimuovere da pozzetti della piastra, che lo rende compatibile con piastre da 96 pozzetti. È, quindi, particolarmente adattabile a sierologici studi e analisi di sensibilità di droga. Si noti che poiché la cellulosa microcristallina non ha bisogno di essere riscaldata, le droghe possono essere facilmente incorporate nella sovrapposizione. Tuttavia, è importante che le piastrine ancora perfettamente durante l'incubazione; in caso contrario, i fuochi a forma di cometa grandi formerà invece le piastre rotonde. Rivelazione di placca con cristalvioletto è semplice ed economico, ma questa soluzione è tossica e deve essere correttamente smaltito. Il riciclo della soluzione limita la produzione di rifiuti. Inoltre, questo metodo è sensibile al danno del monostrato cellulare che apparirà come macchie bianche falsi che non sono placche virale. Un esempio è mostrato in Figura 4 (stella verde). Per evitare questa distorsione, 1) le cellule devono essere maneggiate con cautela per evitare di graffiare o vampate di calore strato monomolecolare della cellula, 2) aspirazione ed erogazione sempre fatto nello stesso punto a circoscrivere il danno ad una zona conosciuta, e 3) false macchie bianche possono essere identificati Grazie alla loro forma (non sferico), loro bordi taglienti e la loro posizione. Abbiamo usato prima Avicel RC 581, come precedentemente pubblicati21,26. Tuttavia, il 581 RC non è più disponibile, e abbiamo sostituito con successo da RC 591. Per adattare questo test ad altre coppie di virus e cellula, la concentrazione di cellulosa microcristallina deve essere determinato a seconda del virus e le cellule. Troppa cellulosa microcristallina può essere tossico per le cellule e portare a piccole placche, troppo poco porterà alla diffusione del virus nel mezzo.

Abbiamo descritto due esempi di utilizzo del virus RSV-GFP per monitorare la moltiplicazione di RSV: in presenza di un farmaco antivirale o quando una proteina cellulare di silenziamento. Abbiamo dimostrato che il segnale GFP è correlato con la moltiplicazione virale. Il metodo presentato qui permette la valutazione senza sforzo della moltiplicazione virale in tempo reale. Permette agli scienziati di determinare facilmente il IC50 di un farmaco antivirale, come illustrato nella Figura 7. D'importanza, questa misura è adatta per l'impiego su supporto o a banda larga, in particolare per lo screening di librerie chimiche. Questo virus che esprimono reporter può anche essere utile per valutare l'effetto sulla moltiplicazione del virus di una modulazione dell'espressione della proteina cellulare. Interferenza del RNA è un processo biologico per cui un mRNA specifico è degradata in seguito al suo riconoscimento specifico di siRNA, riducendo o, idealmente, abolendo l'espressione della proteina corrispondente27. Nell'esempio fornito qui, monitorando l'intensità del segnale GFP in cellule infettate da RSV-GFP, abbiamo valutato l'impatto di mettere a tacere il nucleocapside virale mRNA (N) o l'host IMPDH mRNA sulla moltiplicazione di RSV. IMPDH2 è un enzima biosintetico di purina che catalizza un passaggio limitante nei confronti di biosintesi de novo dei nucleotidi della guanina da IMP28. Così è un regolatore della piscina del nucleotide guanina intracellulare. Inibitori IMPDH, come ribavirina, esercitano effetti inibitori su virus del RNA, compreso RSV infezione29,30,31. Come illustrato nella Figura 6, l'inibizione dell'espressione di IMPDH altera la moltiplicazione virale come indicato dalla riduzione del segnale GFP, che imita gli effetti della ribavirina sulla crescita di RSV. Allo stesso modo, la moltiplicazione virale è abolita quasi in presenza di siRNA targeting la proteina virale di N. Questo risultato era atteso poiché siRNA targeting la proteina N era previsto per impedire assembly nucleocapside virale e ha dimostrato di alterare fortemente la replicazione virale32. L'amministrazione di questi siRNA di nebulizzazione ha inibito la successiva infezione da RSV in adulti in buona salute33. L'effetto di N o IMPDH siRNA è specifico poiché l'inibizione dell'espressione GAPDH, scelto come un gene di controllo, non altera la moltiplicazione virale rispetto gli siRNA nontargeting. Si noti che nessuna tossicità delle cellule è stata rilevata in qualsiasi condizione. Presi insieme, questi risultati confermano la strategia presentata qui, che potrebbe essere fino scalata a high throughput screening utilizzando siRNA librerie o altri metodi di eliminazione diretta, ad esempio CRISPR-Cas9 tecnologia34.

Virus ricombinanti che esprimono una proteina fluorescente di fusione rappresentano potenti strumenti per lo studio di proteine virali e dinamiche di strutture virali. RSV che esprime una proteina fluorescente M2-1 consente l'osservazione delle dinamiche di IBs e di IBAGs. IBs, che può essere considerato come fabbriche virali RSV, appaiono come strutture sferiche dinamici. Essi sono in grado di fondere insieme per formare le strutture sferiche più grandi (Figura 8 e Movie 1). Questi dati suggeriscono che la RSV IBs sono organelli liquidi, simili a quello che è stato descritto per la rabbia virus35. IBAGs rappresentano un subcompartment all'interno di IBs, in cui mRNA virali e M2-1 concentrato di proteine, come il RNA genomico, il nucleocapside e la polimerasi, presenti solo nel resto della IBs12. Esperimenti di video microscopia rivelano che IBAGs sono strutture molto dinamiche che esibiscono proprietà del liquido (Figura 9 e Movie 2). Possono essere considerati come compartimenti liquidi derivanti dalla transizione di fase liquido-liquido.

La possibilità di manipolare geneticamente il virus rimane uno strumento di scelta per lo studio di entrambi i meccanismi della loro moltiplicazione e la loro sensibilità ai farmaci. Genetica inversa potrebbe ora essere considerata come parte delle tecniche "classiche" di virologia. Tuttavia, rimane arduo per alcuni virus, come RSV. Ecco perché questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per salvare e amplificare ricombinante ad con successo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Dr. Qin Yu da AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, per la fornitura di droga AZD4316. Gli autori sono grati alla piattaforma Cymages per l'accesso al microscopio ScanR Olympus, che è stata sostenuta da sovvenzioni dalla regione Ile-de-France (DIM ONE HEALTH). Gli autori riconoscono supporto da INSERM e l'Università di Versailles Saint-Quentin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm µ dish for live cell imaging Ibidi 81156
A549 ATCC ATCC CCL-185
Avicel RC-591 FMC BioPolymer Avicel RC-591 Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5 not commercially available See reference 22. Buchholz et al. 1999
Crystal violet solution Sigma HT90132
Fluorescence microscope for observations Olympus IX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopy Olympus ScanR Olympus microscope
HEp-2 ATCC ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5% Sigma H3375
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT ThermoFisher Scientific 11668019 Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10x), no glutamine ThermoFisher Scientific 11430030
MEM, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% Sigma M7506
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
Plasmids not commercially available See reference 21. Rameix-Welti et al. 2014
See Saw Rocker VWR 444-0341
Si RNA GAPDH Dharmacon ON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		 SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2 Dharmacon ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		 SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Individual references and sequences
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV N Dharmacon ON-TARGETplus custom siRNA UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NT Dharmacon ON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagent Dharmacon DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution ThermoFisher Scientific 25080094
Spectrofluorometer Tecan Tecan infinite M200PRO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
  3. DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
  4. DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
  5. Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
  6. Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
  7. Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
  8. Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).
  9. Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
  10. Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
  11. Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
  12. Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).
  13. Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
  14. Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
  15. Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
  16. Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
  17. Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
  18. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  19. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
  20. Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
  21. Rameix-Welti, M. -A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104 (2014).
  22. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
  23. Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
  24. Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
  25. McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
  26. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
  27. Novina, C. D., Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).
  28. Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
  29. Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
  30. Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
  31. Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
  32. Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
  33. DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
  34. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  35. Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).

Tags

Immunologia e genetica inversa l'infezione numero 146 virus respiratorio sinciziale infezione virus ricombinante amplificazione titolazione tag fluorescenza quantificazione video microscopia
Generazione, amplificazione e titolazione del virus sinciziale respiratorio ricombinante
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bouillier, C., Rincheval, V.,… More

Bouillier, C., Rincheval, V., Sitterlin, D., Blouquit-Laye, S., Desquesnes, A., Eléouët, J. F., Gault, E., Rameix-Welti, M. A. Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses. J. Vis. Exp. (146), e59218, doi:10.3791/59218 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter