Brug af open source-MALDI TOF-MS IDBac-rørledningen til analyse af mikrobiel protein og specialiserede metabolit data

Summary

IDBac er en open-source massespektrometrisk-baseret Bioinformatik pipeline, der integrerer data fra både intakt protein og specialiseret metabolit Spectra, indsamlet på cellemateriale skrabet fra bakterielle kolonier. Rørledningen giver forskerne mulighed for hurtigt at organisere hundreder til tusinder af bakterielle kolonier i formodede taksonomiske grupper, og yderligere differentiere dem baseret på specialiserede metabolit produktion.

Abstract

For at visualisere forholdet mellem bakterielle fylogeny og specialiserede metabolit produktion af bakterielle kolonier vokser på næringsstof agar, vi udviklet IDBac — en lavpris og høj gennemløb matrix-assisteret Laser Desorption/ionisering Time-of-Flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) Bioinformatik pipeline. IDBac software er designet til ikke-eksperter, er frit tilgængelige, og i stand til at analysere et par til tusindvis af bakterielle kolonier. Her præsenterer vi procedurer for fremstilling af bakterielle kolonier for MALDI-TOF MS analyse, MS instrument operation, og databehandling og visualisering i IDBac. Vi instruerer især brugerne i at klynge bakterier ind i dendrogrammer baseret på protein MS fingeraftryk og interaktivt oprette metabolit Associations netværk (MANs) fra specialiserede metabolit data.

Introduction

En stor barriere for forskere, der studerer bakteriel funktion er evnen til hurtigt og samtidig vurdere den taksonomiske identitet af en mikroorganisme og dens evne til at producere specialiserede metabolitter. Dette har forhindret betydelige fremskridt i forståelsen af forholdet mellem bakteriel fylogeny og specialiseret metabolit produktion i de fleste af bakterier isoleret fra miljøet. Selv om MS-baserede metoder, der bruger protein fingeraftryk til at gruppere og identificere bakterier er godt beskrevet^1,2,3,4, disse undersøgelser er generelt blevet udført på små grupper af isolater, på en artsspecifik måde. Det er vigtigt, at oplysningerne om den specialiserede metabolit produktion, som er en vigtig drivkraft for mikrobiel funktion i miljøet, ikke er indarbejdet i disse undersøgelser. Silva et al.⁵ har for nylig givet en omfattende historie, der beskriver underudnyttelsen af MALDI-TOF MS til at analysere specialiserede metabolitter og manglen på software til at lindre aktuelle Bioinformatik flaskehalse. For at afhjælpe disse mangler, skabte vi IDBac, en Bioinformatik rørledning, der integrerer både lineære og reflectron tilstande af MALDI-TOF MS⁶. Dette giver brugerne mulighed for hurtigt at visualisere og differentiere bakterielle isolater baseret på både protein og specialiserede metabolit MS fingeraftryk, hhv.

IDBac er omkostningseffektiv, høj gennemløb, og designet til lægbrugeren. Den er frit tilgængelig (chasemc.github.io/IDBac) og kræver kun adgang til et MALDI-TOF-massespektrometer (reflekectron-tilstand kræves til analyse af specialiserede metabolit). Prøveforberedelse er baseret på den enkle metode med "udvidet direkte overførsel"^7,8 , og der indsamles data med fortløbende lineære og reflectron-opkøb på et enkelt MALDI-målpunkt. Med IDBac er det muligt at analysere den formodede fylogeny og specialiserede metabolit produktion af hundredvis af kolonier på under fire timer, herunder prøveforberedelse, dataindsamling, og datavisualisering. Dette giver en betydelig tids-og omkostningsfordel i forhold til traditionelle metoder til at identificere bakterier (såsom gensekvensering) og analyse af metabolisk udgang (væskekromatografi-massespektrometri [LCMS] og lignende kromatografiske metoder).

Ved hjælp af data, som er indhentet i lineær tilstandsanalyse, anvender IDBac hierarkisk klyngedannelse til at repræsentere protein Spectra-relatens. Da spektrene for det meste repræsenterer ioniserede ribosomale proteiner, giver de en repræsentation af den fylogenetiske mangfoldighed, der findes i en prøve. Desuden inkorporerer IDBac reflekectron-tilstandsdata for at vise specialiserede metabolits fingeraftryk som metabolit Associations Networks (MANs). MANs er tosidede netværk, der giver mulighed for nem visualisering af delt og unik metabolit produktion mellem bakterielle isolater. Den IDBac platform giver forskerne mulighed for at analysere både protein og specialiserede metabolit data i tandem, men også individuelt, hvis der kun én data-type er erhvervet. Vigtigere, IDBac processer rå data fra Bruker og Xiamen instrumenter, samt txt, tab, CSV, mzXML, og mzML. Dette eliminerer behovet for manuel konvertering og formatering af datasæt og reducerer i væsentlig grad risikoen for bruger fejl eller forkert håndtering af MS-data.

Protocol

1. klargøring af MALDI matrix

1. Forbered 10 mg/mL MALDI-grade og/eller omkrystalliseret α-cyano-4-hydroxycinnaminsyre (CHCA) i MS-grade opløsningsmidler: 50% acetonitril (ACN), 47,5% vand (H₂O), 2,5% trifluoroeddikesyre (TFA). Eksempel: 100 μL opløsning = 50 μL ACN + 47,5 μL H₂O + 2,5 ΜL TFA + 1 mg chca
   1. Forbered mindst 1 μL matrix opløsning pr. MALDI-plade spot og vortex eller sonikering indtil i opløsning (ca. 5 minutters lydbehandling eller ingen synlige faste stoffer).
      Forsigtig: TFA er en stærk syre, der skal håndteres i en kemisk røg hætte, mens iført passende personlige værnemidler, da det kan beskadige hud, øjne og luftveje med kontakt eller indånding.
      Bemærk: CHCA er hygroskopisk og lysfølsomt og bør opbevares i ravfarvede hætteglas i en desiccator. Der er mange MALDI matrix muligheder til rådighed. CHCA er mest almindeligt for protein profilering af bakterier, men virker også for specialiseret metabolit analyse. Matrix valg afhænger af individuelle bruger/eksperiment behov.

2. klargøring af MALDI-målplader

Bemærk: Se Sauer et al.⁷for at få flere oplysninger.

1. Skyl MALDI-pladen med methanol (HPLC-kvalitet eller højere), og tør den af med bløde papirservietter. Brug ikke slibebørster ved rengøring af målpladerne, da dette kan beskadige målpladens overflade permanent.
2. Tildel protein og specialiserede metabolit kalibrant pletter. Organiser kalibrerings pletter jævnt på tværs af prøven population, at højde for MALDI-plade-uregelmæssigheder og instrument drift over tid. Tildel et passende antal medier/matrix-blanke pletter til studiet; disse pletter vil kun indeholde medier og matrix, eller kun matrix.
3. Ved hjælp af et sterilt tandstikker overføres en lille del af en bakterie koloni til det rette sted på MALDI-pladen. Sprede bakterien koloni jævnt over stedet. Stedet skal fremstå så fladt som muligt.
   Bemærk: det vil være lettere at samkopiere bakterielle kolonier, der er mere mucoid/amorfe. For mere stive/solide kolonier, undgå at efterlade synlige klynger af cellemasse på MALDI spot (figur 1).

Figur 1: MALDI-målplade, der viser to forskellige isolater før tilsætning af myresyre og MALDI matrix (top 3 pletter- Bacillus Sp.; bottom 3 pletter- Streptomyces Sp.). For begge repræsenterer kolonne 3 en overskydende prøve; kolonne 2 repræsenterer den passende mængde stikprøve; kolonne 1 repræsenterer utilstrækkelig prøve til MALDI-analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

4. Forbered en matrix/mediekontrol ved at bruge et sterilt tandstikker til at overføre en minimal mængde agar/medier til de (t) relevante sted (r) på MALDI-pladen.
5. Overlejring 1 μL 70% massespektrometri-kvalitet myresyre på hver prøve plads, herunder matrix kontrol pletter. Lad syre lufttørre helt i en kemisk røg hætte (ca. 5 min).
   Forsigtig: myresyre er et kaustisk kemikalie og bør håndteres i kemiske røgudemhætter. Det kan beskadige luftvejene ved indånding.
6. Tilsæt 1 μL af den tilberedte MALDI matrix opløsning til hvert prøve sted samt til matrix/mediekontrol pletter. Lad matrix opløsningen lufttørre helt (ca. 5 min.).
   Bemærk: det er muligt at opbevare pladen i en desiccator, i mørket, indtil den kan analyseres på et MALDI-TOF-massespektrometer. De tilladte opbevaringstider kan variere afhængigt af prøve stabiliteten.
7. Der tilsættes 0,5 – 1,0 μL kalibrant til de tildelte kalibreringspunkter efterfulgt af 1 μL MALDI matrix opløsning. Pipette den resulterende opløsning op og ned for at blande. Lad alle pletter lufttørre helt før indføring i MALDI-TOF massespektrometer.
   Bemærk: kalibranterne af protein og specialiseret metabolit bør tilsættes inden for 30 minutter af MALDI-analysen, da begge er modtagelige for nedbrydning.

3. data indsamling

Bemærk: de generelle parametre for dataindsamling er angivet i tabel 1.

Parameter	Protein	Specialiseret metabolit
Masse start (da)	1920	60
Mass end (da)	21000	2700
Masse afbøjning (da)	1900	50
Skud	500	1000
Frekvens (Hz)	2000	2000
Laser størrelse	Store	Medium
MaxStdDev (ppm)	300	30

Tabel 1.

1. Efter de protokoller, der er specifikke for det anvendte instrument, skal kalibreringer af både protein og specialiseret metabolit indstilles.
2. Test et par forskellige målpunkter for at bestemme den optimale laser effekt og detektor gevinst, der skal bruges, når du erhverver Spectra (dette vil variere fra dag til dag og efter instrument).
   Bemærk: figur 2a og figur 3a viser optimale spektre, mens figur 2D og figur 3D er eksempler på dårlig kvalitet Spectra.

Figur 2: Eksempel protein Spectra viser effekten af at ændre laser effekt og detektor gevinst. Spectra kvalitet er bedst i panel A, og falder indtil utilstrækkelig spektrkvalitet i paneler C og D. Mens spektret i panel B kan resultere i brugbare toppe, viser panel A optimale data. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Eksempel specialiserede metabolit Spectra viser effekten af at ændre laser effekt og detektor gevinst. Spectra kvalitet er bedst i panel A og falder indtil utilstrækkelig spektrkvalitet i paneler C og D. Mens spektret i panel B kan resultere i brugbare toppe, viser panel A optimale data. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

3. Erhverve Spectra, gemme protein Spectra i en mappe og specialiserede metabolit Spectra i en anden, separat mappe.

4. rengøring af MALDI-målpladen (tilpasset fra Sauer et al.⁷)

1. Fjern MALDI-målpladen fra holderen, og skyl med acetone.
2. Vask med en ikke-slibende flydende sæbe til at fjerne spor proteiner og lipider, og bløde papirservietter/blødt-bristled tandbørste.
3. Skyl med afioniseret vand i ca. 2 min. for helt at fjerne sæbe.
4. Du sonicerer målpladen i vand (HPLC-kvalitet eller højere) i 5 minutter.
5. Skyl målpladen med vand (HPLC-kvalitet eller højere).
6. Skyl målpladen med methanol (HPLC-kvalitet eller højere).

5. installation af IDBac-softwaren

1. Download IDBac-softwaren.
   Bemærk: permanente, versioneret backups er også tilgængelige for download (Se tabellen over materialer).
2. Dobbeltklik på den hentede "Install_IDBac. exe" for at starte installationsprogrammet og følge instruktionerne på skærmen.

6. startende med rå data

Bemærk: detaljerede forklaringer og instruktioner for hvert databehandlings trin er indlejret i IDBac, men de vigtigste analyser og interaktive input er beskrevet nedenfor.

1. Dobbeltklik på genvejen til IDBac-skrivebordet for at starte IDBac. IDBac åbnes som standard under fanen Introduktion .
2. Brug knappen Søg efter opdateringer for at sikre, at den nyeste version af idbac bruges (kræver internetadgang). Hvis en nyere version er tilgængelig, vil IDBac automatisk hente og installere opdateringen, hvorefter IDBac anmoder om at blive genstartet.
3. Klik på Start med RAW data fanen og vælg fra menuen den type data, der skal bruges med idbac; Fortsæt ved at følge instruktionerne i appen.
4. Når du konfigurerer konvertering og behandling af datafiler, Indtast et beskrivende navn for eksperimentet, hvor du bliver bedt om det (Se figur 4). Eksperimenter vil senere blive vist alfabetisk, så en hjælpsom strategi er at starte eksperiment navne med en gruppe-attribut (fx "Bacillus-trials_experiment-1"; "Bacillus-trials_experiment-2").

Figur 4: IDBac-datakonvertering og forbehandlings trin. IDBac konverterer RAW-spektre til det åbne mzML-format og gemmer mzML-, Peak-lister og eksempel oplysninger i en database for hvert eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

7. arbejde med tidligere eksperimenter

1. Efter konvertering af filer og behandling af dem med IDBac, eller når som helst man ønsker at analysere et eksperiment, skal du navigere til siden arbejde med tidligere eksperimenter og vælge et eksperiment, du vil arbejde med (figur 5).

Figur 5: siden "Arbejd med tidligere eksperimenter". Brug IDBac-siden "Arbejd med tidligere eksperimenter" til at vælge et eksperiment, du vil analysere eller ændre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

2. Valgfri Tilføj oplysninger om prøver ved hjælp af menuen Klik her for at ændre det valgte eksperiment. Indtast oplysninger i det automatisk udfyldte regneark, og tryk på Save (figur 6). Denne indstilling giver brugeren mulighed for at farvekode data under analyser.

Figur 6: oplysninger om input eksempler. På siden "Arbejd med tidligere eksperimenter" kan brugerne indtaste oplysninger om prøver såsom taksonomisk identitet, samlings placering, isolations betingelser osv. Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Valgfri Overfør alle eller en delmængde af prøver til et nyt eller et andet eksperiment ved at klikke på Overfør prøver fra tidligere eksperimenter til nye/andre eksperimenter og følge de medfølgende anvisninger (figur 7).

Figur 7: Overfør data. Siden "Arbejd med tidligere eksperimenter" indeholder muligheden for at overføre data mellem eksisterende eksperimenter og nye eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

4. Når du er klar til at begynde analysen, skal du sikre dig, at eksperimentet arbejde med er valgt. Vælg enten protein dataanalyse eller lille molekyle dataanalyse.

8. opsætning af protein dataanalyse og oprettelse af spejl plot

1. Hvis du analyserer protein data, skal du først navigere til siden med analyse af protein data . Vælg peak-picking indstillinger og evaluere protein spektre af prøver via de viste spejl plots (figur 8).
   Bemærk: i spejlet plots, en rød spids betyder tilstedeværelsen af denne peak kun i det øverste spektrum, mens blå toppe repræsenterer dem, der forekommer i begge Spectra.

Figur 8: Vælg, hvordan toppe bevares til analyse. Når du har valgt et eksperiment, der skal analyseres, kan du besøge siden "protein data analyse" og derefter åbne menuen "Vælg, hvordan toppe bevares til analyse" for at vælge indstillinger som signal-til-støj-forhold for at fastholde toppe. Det viste Spejlings plot (eller dendrogram) opdateres automatisk, så det afspejler de valgte indstillinger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

2. Juster den procentdel af replikater, hvor et højdepunkt skal være til stede, for at det kan medtages til analyser (f. eks. Hvis tærsklen er sat til 70%, og et højdepunkt forekommer i mindst 7 ud af 10 replikater, medtages det).
3. Brug spejlet plots som visuel vejledning, justere signalet til støj cutoff, der bevarer de mest "ægte" toppe og den mindste støj, bemærke, at flere replikater og en højere "procentdel peak tilstedeværelse" værdi vil tillade udvælgelse af et lavere signal til støj cutoff.
4. Angiv de nedre og øvre m/z -cutoffs, der dikterer intervallet af Masseværdier inden for hvert spektrum, der skal anvendes i yderligere analyser af idbac.

9. klynge dannende prøver ved hjælp af protein data

1. På siden protein data analyse skal du vælge fanen dendrogram . Dette gør det muligt at gruppere prøver i et dendrogram i henhold til brugervalgte afstandsmålinger og klynge algoritmer.
2. Klik på Vælg eksempler i menuen, og følg instruktionerne for at vælge de prøver, der skal medtages i analyserne. Kun prøver, der indeholder protein spektre, vil blive vist i boksen tilgængelige prøver (figur 9).

Figur 9: Vælg prøver fra det valgte eksperiment, der skal inkluderes i det viste dendrogram. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

3. Brug standardværdierne, eller Vælg den ønskede distance og klynge algoritmer, der skal anvendes på genereringen af dendrogram, under Vælg indstillinger for klyngedannelse.
4. Vælg tilstedeværelse/fravær som input. Alternativt kan du, hvis du er sikker på tophøjden af prøverne (f. eks. efter at have udført en undersøgelse for at vurdere variabiliteten af spids intensitet), vælge intensiteter som input.
   Bemærk: på udgivelsestidspunktet giver IDBac fleksibilitet i indstillingerne for klyngedannelse og stoler på, at brugerne vælger de relevante kombinationer. Hvis ikke bekendt med disse muligheder, foreslås det at parre enten en: "cosinus" afstand, og "gennemsnitlig (UPGMA)" Clustering; eller B: "euklidisk" distance og "Ward. D2" Clustering.
5. Hvis du vil have vist bootstrap-værdier på dendrogram, skal du indtaste et tal mellem 2 og 1000 under bootstraps.
6. Når du rapporterer resultater, kopierer du teksten i afsnittet forslag til rapportering af protein analyse . Dette giver de brugerdefinerede indstillinger, der genererede det specifikke dendrogram.

10. tilpasning af protein dendrogram

1. Hvis du vil begynde at tilpasse dendrogram, skal du åbne menuen Juster dendrogram (figur 10).

Figur 10: Justér dendrogram. IDBac giver et par muligheder for at ændre, hvordan dendrogram udseende, disse kan findes i menuen "Juster Dendrogram". Dette omfatter farvelægning grene og etiketter ved k-midler, eller ved at "skære" dendrogram på en bruger-forudsat højde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

2. Hvis du vil farvelægge dendrograms linjer og/eller etiketter, skal du vælge den relevante knap: Klik for at ændre linjer eller Klik for at ændre etiketter og vælge de ønskede indstillinger.
3. Hvis du vil afbilde oplysninger fra regnearket ved siden af dendrogram (Se trin 7,2), skal du vælge knappen Medtag oplysninger om eksempler. Dette vil åbne et panel, hvor en kategori (kolonne i regnearket) vil selv befolke baseret på de indtastede værdier (Figur 11).

Figur 11: Medtag oplysninger om prøver. Inden for "Juster Dendrogram" menuen er indstillingen "indarbejde info om prøver". Hvis du vælger dette, vil du kunne afbilde oplysninger om prøver ved siden af dendrogram. Eksempel oplysninger er input i siden "arbejde med tidligere eksperimenter". Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

11. Indsæt prøver fra et separat eksperiment i dendrogram

1. Hvis du vil indsætte eksempler fra et andet eksperiment, skal du vælge menuknappen Indsæt eksempler fra et andet eksperiment. Følg anvisningerne i det nyåbnede panel (figur 12).

Figur 12: Indsæt prøver fra en anden eksperiment menu. Nogle gange er det nyttigt at sammenligne prøver fra et andet eksperiment. Brug menuen "Indsæt eksempler fra et andet eksperiment" til at vælge eksempler, der skal inkluderes i det aktuelt viste dendrogram. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

12. analyse af specialiserede metabolit data og metabolit Association Networks (MANs)

1. Fortsæt til metabolitten Association Network (lille molekyle) side. Denne side giver mulighed for datavisualisering af principielle komponenter Analysis (PCA) og MANs, som bruger tosidede netværk til at vise korrelationen mellem små molekyle m/z værdier med prøver.
2. Hvis der blev oprettet et protein dendrogram (afsnit 9), vil det også blive vist på denne side. Klik og træk på dendrogram for at fremhæve udvalgte prøver af interesse, der skal analyseres. Hvis ingen prøver er fremhævet eller ingen protein dendrogram blev oprettet, en mand af en enten en tilfældig delmængde eller alle prøver vil blive vist, respektfuldt (Figur 13).

Figur 13: side med data analyse for små molekyler. Hvis et dendrogram blev oprettet fra protein Spectra, vil det blive vist i "Small molekyle data analysis" siden. Denne side vil også vise metabolit Associate Networks (MANs) og princip komponenter Analysis (PCA) for små molekyle data. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

3. Hvis du vil trække et matrix/medie tomt i manden, skal du åbne menuen Vælg et eksempel for at trække og vælge det relevante eksempel, der skal bruges som tomt.
4. Åbn menuen Vis/Skjul man indstillinger for at vælge de ønskede værdier for procentdel af peak tilstedeværelse i replikater, signal til støj, og øvre og nedre masse cutoffs, som det blev gjort for protein Spectra i afsnit 9. Brug de små molekyle spejl plots til at guide udvælgelsen af disse indstillinger.
5. Vælg "Download aktuelle netværksdata" for at gemme dataene for den mand, der vises i øjeblikket. Disse data kan bruges i andre netværksanalyse programmer end IDBac.
6. For at rapportere resultater, kopiere teksten i forslag til rapportering man analyse afsnit. Dette giver de brugerdefinerede indstillinger, der bruges til at generere den oprettede mand.

13. deling af data

1. Hvert IDBac "eksperiment" gemmes som en enkelt SQLite-database. Den indeholder den konverterede mzML RAW Spectra, detekterede toppe, og alle brugerinput oplysninger om prøver. For at dele et IDBac-eksperiment skal du derfor blot dele SQlite-filen, der har samme navn som eksperimentet (filplaceringen vises på siden arbejde med tidligere eksperimenter ).

Representative Results

Vi analyserede seks stammer af Micromonospora chokoriensis og to stammer af Bacillus subtilis, som tidligere var karakteriseret⁶, ved hjælp af data til rådighed på Doi: 10.5281/zenodo. 2574096. Følgende anvisninger i Start med RAW data fanen, vi valgte indstillingen Klik her for at konvertere Bruker filer og fulgte idbac-leverede instruktioner for hvert datasæt (Figur 14).

Efter den automatiserede konvertering og forbehandling/peak-Peaking trin blev afsluttet, vi fortsatte med at skabe et nyt kombineret IDBac eksperiment ved at overføre prøver fra de to eksperimenter i et enkelt eksperiment, der indeholder både Bacillus og Prøver af micromonosopora (Figur 15). Den resulterende analyse indebar sammenligning af protein spektre ved hjælp af spejl parceller, som billedet i Figur 16, som var nyttigt til at evaluere spektrkvalitet og justere peak-picking indstillinger. Figur 17 viser et skærmbillede af resultaterne af protein klyngedannelse med valgte standardindstillinger. Dendrogram var farvet ved at justere tærsklen på plottet (vises som en punkteret linje). Af note er den klare adskillelse mellem SLOM, med både M. chokoriensis og B. subtilis isolerer klyngedannelse separat.

Figur 18, figur 19, og figur 20 fremhæve evnen til at generere Mans af bruger-udvalgte regioner ved at klikke og trække på tværs af protein dendrogram. Med dette var vi i stand til hurtigt at oprette MANs til kun at sammenligne B. subtilis stammer (figur 18), kun M. chokoriensis stammer (figur 19), og alle de stammer samtidigt (figur 20). Disse nets primære funktion er at give forskerne et bredt overblik over graden af specialiseret metabolits overlap mellem bakterier. Med disse data i hånden, har forskerne nu kapacitet til at træffe informerede beslutninger fra kun en lille mængde materiale skrabet fra en bakteriel koloni.

Figur 14: Spectra Processing. Downloadede Bruker autoFlex Spectra blev konverteret og behandlet ved hjælp af IDBac. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 15: kombineret IDBac-eksperiment. Da Micromonospora og Bacillus Spectra blev indsamlet på forskellige MALDI-målplader, blev de to eksperimenter efterfølgende kombineret i et enkelt eksperiment-"Bacillus_Micromonsopora". Dette blev gjort inden for "arbejde med tidligere eksperimenter" fanen, efterretninger i menuen "Overfør prøver fra tidligere eksperimenter til nye/andre eksperimenter". Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 16: sammenligning. Micromonspora og Bacillus Spectra blev sammenlignet ved hjælp af spejlet parceller inden for "protein data analysis" side. I sidste ende, standard peak indstillinger blev valgt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 17: hierarkisk klyngedannelse. Hierarkisk klyngedannelse, ved hjælp af standardindstillinger, korrekt grupperet Bacillus og Micromonospora isolater. Dendrogram var farvet af "skæring" dendrogram i en vilkårlig højde (vises som en stiplet-linje) og 100 på bruges til at vise tillid i forgreningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 18: mand skabt ved at vælge Bacillus Sp. stammer fra protein dendrogram viste differentiel produktion af specialiserede metabolitter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 19: mand skabt ved at vælge de seks Micromonospora Sp. stammer fra protein dendrogram viste differentiel produktion af specialiserede metabolitter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 20: mand af Bacillus Sp. og Micromonospora Sp. stammer, der viser en differentieret produktion af specialiserede metabolitter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

IDBac-protokollen beskriver bakterielle proteiner og specialiserede metabolit data erhvervelse og analyse af op til 384 bakterielle isolater i 4 timer af en enkelt forsker. Med IDBac er der ingen grund til at udtrække DNA fra bakterielle isolater eller generere specialiserede metabolit ekstrakter fra flydende fermenterings bouillon og analysere dem ved hjælp af kromatografiske metoder. I stedet indsamles proteiner og specialiserede metabolit data ved blot at sprede materiale fra bakterielle kolonier direkte på en MALDI-målplade. Dette reducerer i høj grad tid og omkostninger forbundet med alternative teknikker såsom 16S rRNA-gensekvensering og LCMS⁹.

Det er vigtigt at tilføje en matrix blank og kalibrerings pletter til MALDI pladen, og vi anbefaler at bruge et passende antal replikater for at sikre reproducerbarhed og statistisk tillid. Antallet af replikater vil være eksperiment afhængig. For eksempel, hvis en bruger har til hensigt at skelne tusinder af kolonier fra en samling af miljømæssige diversitet plader, kan færre replikater være nødvendige (vores laboratorium indsamler tre tekniske replikater pr koloni). Alternativt, hvis en bruger ønsker at oprette en brugerdefineret database af stammer fra specifikke bakterielle taxa til hurtigt at bestemme sub-arter klassifikationer af ukendte isolater, så flere replikater er passende (vores laboratorium indsamler otte biologiske replikater per stamme).

IDBac er et værktøj til hurtigt at differentiere meget-relaterede bakterielle isolater baseret på formodede taksonomiske oplysninger og specialiseret metabolit produktion. Det kan supplere eller tjene som en forløber for ortogonale metoder såsom dybtgående genetiske analyser, undersøgelser, der involverer metabolit produktion og funktion, eller karakterisering af specialiserede metabolit struktur ved nuklear magnetisk resonansspektroskopi og/eller LC-MS/MS.

Specialiseret metabolit produktion (IDBac MANs) er meget modtagelig for bakterielle vækstbetingelser, især ved hjælp af forskellige medier, som er en potentiel begrænsning af metoden. Men disse træk kan udnyttes af brugeren, som IDBac kan let generere MANs viser forskellene i specialiserede metabolit produktion under en række vækstbetingelser. Det er vigtigt at bemærke, at mens specialiserede metabolit fingeraftryk kan variere efter vækst tilstand, har vi tidligere vist, at protein fingeraftryk forbliver relativt stabile på tværs af disse variabler (Se Clark et al.⁶). Når vi beskæftiger os med miljø mangfoldigheds plader, anbefaler vi at rense bakterie isolater før analyse for at reducere mulige bidrag fra nærliggende bakteriel Cross-Talk.

Endelig, manglen på en søgbar offentlig database af protein MS fingeraftryk er en stor mangel i brugen af denne metode til at klassificere ukendte miljømæssige bakterier. Vi skabte idbac med dette i tankerne, og omfattede automatiseret konvertering af data til et Fællesskabs godkendt open source-format (mzml)^10,11,12 og designede softwaren til at tillade søgning, deling og oprettelse af brugerdefinerede databaser. Vi er i færd med at skabe en stor offentlig database (> 10000 fuldt karakteriserede stammer), som vil gøre det muligt at klassificere nogle isolater til artsniveau, herunder links til Genbanks tiltrædelses numre, når de foreligger.

IDBac er open source og koden er tilgængelig for alle til at tilpasse deres dataanalyse og visualisering behov. Vi anbefaler, at brugerne konsulterer en omfattende litteratur (Sauer et al.⁷, Silva et al.⁵) for at hjælpe med at støtte og designe deres eksperimentelle mål. Vi er vært for et diskussionsforum på: https://groups.Google.com/Forum/#!forum/idbac og et middel til at rapportere problemer med softwaren på: https://github.com/chasemc/IDBacApp/Issues.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Fisher	60-002-65	LC-MS Ultra CHROMASOLV
Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument	Bruker Daltonics
Bruker Daltonics Bacterial test standard	Fisher	NC0884024	Bruker Daltonics 8604530
Bruker Peptide Calibration standard	Fisher	NC9846988	Bruker Daltonics 8206195
Formic Acid	Fisher Chemical	A117-50	99.5+%, Optima LC/MS Grade
MALDI-TOF target Plate	Bruker Daltonics
Methanol	Fisher Chemical	A456-500	Optima LC/MS Grade
Toothpicks			any is ok
Trifluoroacetic acid	Fisher	AC293810010	99.5%, for biochemistry, ACROS Organics
Water	VWR	7732-18-5	LC-MS
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma	28166-41-8	(C2020-25G) ≥98% (TLC), powder