Summary
IDBac는 박테리아 식민지에서 긁어낸 세포 물질에 수집된 손상되지 않은 단백질과 특수 대사 산물 스펙트럼의 데이터를 통합하는 오픈 소스 질량 분석 기반 생물 정보학 파이프라인입니다. 이 파이프라인을 통해 연구원들은 수백 에서 수천 개의 세균 식민지를 분류학 그룹으로 신속하게 구성하고 전문 대사 산물 생산을 기반으로 이를 더욱 차별화 할 수 있습니다.
Abstract
영양한 분한에서 자라는 세균 성 콜로니의 세균 생리와 특수 대사 산물 생산 사이의 관계를 시각화하기 위해, 우리는 IDBac - 저비용 및 고처리량 매트릭스 염착 지원 레이저 탈착 /이온화를 개발했습니다. 비행 시간 질량 분석법 (MALDI-TOF MS) 생물 정보학 파이프 라인. IDBac 소프트웨어는 비 전문가를 위해 설계, 자유롭게 사용할 수 있으며, 세균 식민지의 몇 ~ 수천을 분석 할 수있다. 여기에서는 MALDI-TOF MS 분석, MS 기기 작동 및 IDBac의 데이터 처리 및 시각화를 위한 세균 식민지 제조 절차를 제시합니다. 특히, 우리는 단백질 MS 지문에 근거를 둔 dendrograms로 박테리아를 클러스터하는 방법을 사용자에게 지시하고 전문화한 대사 산물 데이터에서 대사 산물 협회 네트워크 (MAN)를 대화식으로 만듭니다.
Introduction
세균 기능을 연구하는 연구원에 대한 주요 장벽은 미생물의 분류학적 정체성과 특수 대사 산물을 생산하는 능력을 신속하고 동시에 평가하는 능력입니다. 이것은 환경에서 격리된 박테리아의 대다수에 있는 세균성 생리와 전문화한 대사 산물 생산 사이 관계를 이해에 있는 중요한 어드밴스를 방지했습니다. 단백질 지문을 사용하여 박테리아를 그룹화하고 식별하는 MS기반 방법이 잘 설명되어 있지만 1, 2,3,4,이러한 연구는 일반적으로 소집단 분리군에서 수행되어 왔으며, 종별 방식으로. 중요한 것은, 환경에 있는 미생물 기능의 주요 동인인 전문화한 대사산물 생산에 대한 정보는, 이 연구 결과에 통합되지 않은 남아 있습니다. Silva 등 5는 최근 MALDI-TOF MS의 미사용과 현재의 생물정보학 병목 현상을 완화하기 위한 소프트웨어의 부족을 분석하는 포괄적인 역사를 제공했습니다. 이러한 단점을 해결하기 위해 MALDI-TOF MS 6의 선형 및 반사 모드 모두를 통합하는 생물 정보학파이프라인인 IDBac을 만들었습니다. 이를 통해 사용자는 단백질과 특수 대사 산물 MS 지문에 따라 세균 분리를 신속하게 시각화하고 차별화 할 수 있습니다.
IDBac은 비용 효율적이고 처리량이 높으며 평신도 사용자를 위해 설계되었습니다. 자유롭게 사용할 수 있으며(chasemc.github.io/IDBac) MALDI-TOF 질량 분석기만 이에 액세스해야 합니다(전문 대사 산물 분석에는 반사 모드가 필요합니다). 샘플 전제제는 간단한 "확장된 직접전달" 방법 7,8및 데이터가 단일 MALDI 표적 스팟에서 연속적인 선형 및 반사론 획득으로 수집됩니다. IDBac를 사용하면 샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 시각화를 포함하여 4 시간 이내에 수백 개의 식민지의 가설 생리 및 전문 대사 산물 생산을 분석 할 수 있습니다. 이것은 박테리아를 식별하는 전통적인 방법 (예 : 유전자 염기서열 분석) 및 대사 출력분석 (액체 크로마토그래피 질량 분광법 [LCMS] 및 유사한 크로마토그래피 방법)에 비해 상당한 시간과 비용 이점을 제시합니다.
선형 모드 분석에서 얻은 데이터를 사용하여 IDBac은 계층적 클러스터링을 사용하여 단백질 스펙트럼의 관련성을 나타냅니다. 스펙트럼은 대부분 이온화된 리보좀 단백질을 나타내기 때문에, 샘플에 존재하는 계통학적 다양성의 표현을 제공한다. 또한 IDBac은 리플렉트론 모드 데이터를 통합하여 대사산물 협회 네트워크(MAN)와 같은 특수 대사 산물 지문을 표시합니다. MAN은 박테리아 분리물 간의 공유 및 고유 대사 산물 생산을 쉽게 시각화 할 수있는 이분형 네트워크입니다. IDBac 플랫폼을 통해 연구원은 단백질 및 특수 대사 산물 데이터를 나란히 분석할 수 있지만 하나의 데이터 유형만 획득하는 경우에도 개별적으로 분석할 수 있습니다. 중요한 것은 IDBac은 브루커 및 샤먼 계측기뿐만 아니라 txt, 탭, csv, mzXML 및 mzML의 원시 데이터를 처리합니다. 따라서 데이터 집합의 수동 변환 및 서식 지정이 필요하지 않으며 사용자 오류 또는 MS 데이터의 잘못된 취급 의 위험이 크게 줄어듭니다.
Protocol
1. MALDI 매트릭스의 준비
- MS 등급 용매에서 10 mg /mL MALDI 등급 및 / 또는 재결정 된 α-cyano-4-hydroxycinic 산 (CHCA)을 준비하십시오 : 50 % 아세토니트릴 (ACN), 47.5 % 물 (H2O), 2.5 % 트리플루오로 아세트산 (TFA). 예: 100 μL 솔루션 = 50 μL ACN + 47.5 μL H2O + 2.5 μL TFA + 1 mg CHCA
- MALDI 플레이트 스팟 및 소용돌이 또는 초음파 처리(약 5분 초음파 처리 또는 눈에 보이는 고체 없음)까지 MALDI 플레이트 스팟 및 소용돌이 당 적어도 1 μL의 매트릭스 용액을 준비합니다.
주의: TFA는 접촉이나 흡입으로 피부, 눈 및 기도를 손상시킬 수 있으므로 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 동안 화학 연기 후드에서 처리해야 하는 강한 산입니다.
참고: CHCA는 흡습성 및 빛에 민감하며 건조제에 앰버 바이알에 보관해야 합니다. 사용 가능한 많은 MALDI 행렬 옵션이 있습니다. CHCA는 박테리아의 단백질 프로파일링에 가장 흔하지만, 또한 전문화한 대사 산물 분석을 위해 작동합니다. 매트릭스 선택은 개별 사용자/실험 요구에 따라 달라집니다.
- MALDI 플레이트 스팟 및 소용돌이 또는 초음파 처리(약 5분 초음파 처리 또는 눈에 보이는 고체 없음)까지 MALDI 플레이트 스팟 및 소용돌이 당 적어도 1 μL의 매트릭스 용액을 준비합니다.
2. MALDI 대상 플레이트 의 준비
참고: 자세한 내용은 Sauer 외7을참조하십시오.
- 메탄올(HPLC 등급 이상)으로 MALDI 플레이트를 헹구고 부드러운 종이 물티슈로 닦아냅니다. 대상 플레이트의 표면을 영구적으로 손상시킬 수 있기 때문에 대상 플레이트를 청소할 때는 연마 브러시를 사용하지 마십시오.
- 단백질과 특수 대사 산물 교정 반점을 할당합니다. 시간 지남에 따라 MALDI 플레이트 불규칙성 및 계측기 드리프트를 고려하여 샘플 모집단 전체에 걸쳐 교정 지점을 균등하게 구성합니다. 스터디에 적합한 수의 미디어/매트릭스 빈 스팟을 할당합니다. 이러한 스팟에는 미디어 및 행렬또는 행렬만 포함됩니다.
- 멸균 이쑤시개를 사용하여, MALDI 플레이트의 적절한 자리에 세균 성 콜로니의 작은 부분을 전송합니다. 세균성 식민지를 그 자리에 고르게 펴발라. 스팟은 가능한 한 평평하게 나타납니다.
참고 : 더 점막 / 무정형 인 세균 성 식민지를 평평하게하는 것이 더 쉬울 것입니다. 더 단단하고 단단한 콜로니의 경우 MALDI 스팟에 눈에 보이는셀 덩어리를 남기지 마십시오(그림 1).
그림 1: 포름산 및 MALDI 매트릭스를 추가하기 전에 두 개의 상이한 분리를 나타내는 MALDI-표적 플레이트(상위 3개 지점 - 바실러스 sp.; 하단 3개 반점 - 연쇄상 구균 sp.). 둘 다에 대해 열 3은 초과 샘플을 나타냅니다. 열 2는 적절한 양의 샘플을 나타냅니다. 열 1은 MALDI 분석에 대한 샘플이 부족합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 멸균 이쑤시개를 사용하여 MALDI 플레이트의 적절한 지점에 최소한의 한천/미디어를 전송하여 매트릭스/미디어 제어를 준비합니다.
- 매트릭스 제어 스팟을 포함하여 각 샘플 스팟에 70% 질량 분석 등급 포매산을 1 μL 오버레이합니다. 화학 연기 후드 (약 5 분)에서 산을 완전히 건조시키십시오.
주의: 포름산은 부식성 화학물질이며 화학 연기 후드에서 취급해야 합니다. 흡입하면 기도가 손상될 수 있습니다. - 준비된 MALDI 매트릭스 솔루션의 1 μL을 각 샘플 스팟과 매트릭스/미디어 제어 스팟에 추가합니다. 매트릭스 용액이 완전히 건조되도록 하십시오(약 5분).
참고 : MALDI-TOF 질량 분석기에서 분석 할 수있을 때까지 어둠 속에서 건조기에 플레이트를 저장할 수 있습니다. 허용 보관 시간은 샘플 안정성에 따라 달라질 수 있습니다. - 지정된 교정 지점에 0.5-1.0 μL 교정제를 추가한 다음 1 μL MALDI 매트릭스 솔루션을 추가합니다. 결과 용액을 위아래로 파이펫하여 혼합합니다. MALDI-TOF 질량 분석기로 도입하기 전에 모든 반점이 완전히 건조되도록 하십시오.
참고: 단백질과 특수 대사산물 교정란트는 MALDI 분석의 30분 이내에 첨가되어야 하며, 둘 다 열화되기 쉽습니다.
3. 데이터 수집
참고: 데이터 수집에 대한 일반적인 매개 변수는 표1에 나열되어 있습니다.
| 매개 변수 | 단백질 | 전문 대사 산물 |
| 매스 스타트(다) | 1920년 | 60 |
| 매스 엔드 (다) | 21000년 | 2700년 |
| 매스 편향(다) | 1900년 | 50개 |
| 촬영 | 500개 | 1000년 |
| 주파수(Hz) | 2000년 | 2000년 |
| 레이저 크기 | 큰 | 매체 |
| 맥스스테드데브 (ppm) | 300개 | 30개 |
표 1.
- 사용되는 기기에 특정한 프로토콜에 따라 단백질 과 특수 대사 산물 교정을 모두 설정합니다.
- 몇 가지 개별 대상 스팟을 테스트하여 스펙트럼을 획득할 때 사용할 최적의 레이저 전력 및 검출기 게인을 결정합니다(이는 일상적인 및 기기에 따라 다릅니다).
참고: 그림 2A 및 그림 3A는 최적의 스펙트럼을 보여 주며 그림 2D 및 그림 3D는 품질이 좋지 않은 스펙트럼의 예입니다.
그림 2: 레이저 전력 및 검출기 게인을 수정하는 효과를 나타내는 단백질 스펙트럼을 예로 들 수 있습니다. 스펙트럼 품질은 패널 A에서가장 적합하며 패널 C 및 D에서스펙트럼 품질이 부족할 때까지 감소합니다. 패널 B의 스펙트럼으로 인해 사용 가능한 피크가 발생할 수 있지만 패널 A는 최적의 데이터를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 레이저 전력 및 검출기 게인을 수정하는 효과를 나타내는 특수 대사 산물 스펙트럼을 예로 들 수 있습니다. 스펙트럼 품질은 패널 A에서 가장 적합하며 패널 C 및 D에서스펙트럼 품질이 부족할 때까지 감소합니다. 패널 B의 스펙트럼으로 인해 사용 가능한 피크가 발생할 수 있지만 패널 A는 최적의 데이터를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 스펙트럼을 획득하여 단백질 스펙트럼을 하나의 폴더에 저장하고 특수 대사 산물 스펙트럼을 두 번째 별도의 폴더로 저장합니다.
4. MALDI 대상 플레이트 청소 (Sauer 외7에서 적응)
- 홀더에서 MALDI 타겟 플레이트를 제거하고 아세톤으로 헹구어 보입니다.
- 미량 단백질과 지질을 제거하기 위해 비연마액 비누로 씻고 부드러운 종이 물티슈/부드러운 칫솔을 제거합니다.
- 탈이온수로 약 2분 간 헹구어 비누를 완전히 제거합니다.
- 대상 플레이트를 물(HPLC 등급 이상)에서 5분 동안 초음파 처리합니다.
- 대상 플레이트를 물(HPLC 등급 이상)으로 헹구어 보시고 있습니다.
- 대상 플레이트를 메탄올(HPLC 등급 이상)으로 헹구고 있습니다.
5. IDBac 소프트웨어 설치
- IDBac 소프트웨어를 다운로드합니다.
참고: 영구 적이 고 버전이 있는 백업도 다운로드할 수 있습니다(자료 표참조). - 다운로드한 "Install_IDBac.exe"를 두 번 클릭하여 설치 프로그램을 시작하고 화면의 지침을 따릅니다.
6. 원시 데이터로 시작
참고: 각 데이터 처리 단계에 대한 자세한 설명과 지침은 IDBac에 포함되어 있지만 주요 분석 및 대화형 입력은 아래에 설명되어 있습니다.
- IDBac 바로 가기를 두 번 클릭하여 IDBac를 시작합니다. IDBac은 기본적으로 소개 탭에서 열립니다.
- 업데이트 확인 단추를 사용하여 최신 버전의 IDBac가 사용되고 있는지 확인합니다(인터넷 액세스 필요). 최신 버전을 사용할 수 있는 경우 IDBac은 자동으로 업데이트를 다운로드하여 설치한 후 IDBac을 다시 시작하도록 요청합니다.
- 원시 데이터 로 시작 탭을 클릭하고 메뉴에서 IDBac와 함께 사용할 데이터 유형을 선택합니다. 인앱 지침에 따라 계속합니다.
- 데이터 파일의 변환 및 처리를 설정할 때 프롬프트가 있는 실험에 대한 설명이름을 입력합니다(그림 4참조). 실험은 나중에 사전순으로 표시되므로 유용한 전략은 그룹 속성(예: "간균 시험_실험-1")으로 실험 이름을 시작하는 것입니다. "간균 시험_실험-2").
그림 4: IDBac 데이터 변환 및 전처리 단계. IDBac은 원시 스펙트럼을 개방형 mzML 형식으로 변환하고 각 실험에 대한 데이터베이스에 mzML, 피크 목록 및 샘플 정보를 저장합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
7. 이전 실험작업
- 파일을 변환하고 IDBac으로 처리한 후 또는 실험을 다시 분석하려는 경우 이전 실험 페이지로 이동하여 작업할 실험을 선택합니다(그림 5).
그림 5: "이전 실험 작업" 페이지. IDBac의 "이전 실험 작업" 페이지를 사용하여 실험을 선택하여 분석하거나 수정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- (선택 사항) 선택한 실험을 수정하려면 메뉴를사용하여 샘플에 대한 정보를 추가하십시오. 자동 채워진 스프레드시트에 정보를 입력하고 저장을 누릅니다(그림 6). 이 옵션을 사용하면 분석 중에 데이터를 색상 코드화할 수 있습니다.
그림 6: 입력 샘플 정보입니다. "이전 실험 작업" 페이지에서 사용자는 분류학적 ID, 수집 위치, 격리 조건 등과 같은 샘플에 대한 정보를 입력할 수 있습니다.
- (선택 사항) 이전 실험에서 새/다른 실험으로 샘플 전송을 클릭하고 제공된 지침에 따라 샘플의 전부 또는 하위 집합을 새 실험또는 다른 실험으로 전송합니다(그림 7).
그림 7: 데이터 전송. '이전 실험 작업' 페이지에는 기존 실험과 새 실험 간에 데이터를 전송하는 옵션이 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 분석을 시작할 준비가 되면 작업할 실험이 선택되어 있는지 확인합니다. 단백질 데이터 분석 또는 소분자 데이터 분석을선택합니다.
8. 단백질 데이터 분석 설정 및 거울 플롯 생성
- 단백질 데이터를 분석하는 경우 먼저 단백질 데이터 분석 페이지로 이동합니다. 피크 피킹 설정을 선택하고 표시된 미러 플롯을 통해 샘플의단백질 스펙트럼을 평가합니다(그림 8).
참고: 미러 플롯에서 빨간색 피크는 최상위 스펙트럼에서만 해당 피크의 존재를 나타내고 파란색 피크는 두 스펙트럼모두에서 발생하는 피크를 나타냅니다.
그림 8: 분석을 위해 피크를 보존하는 방법을 선택합니다. 분석할 실험을 선택한 후 "단백질 데이터 분석" 페이지를 방문한 후 "피크가 분석을 위해 유지되는 방법 선택" 메뉴를 열어 사용자는 피크를 유지하기 위한 신호 대 잡음 비율과 같은 설정을 선택할 수 있습니다. 표시된 미러 플롯(또는 덴드로그램)이 선택한 설정을 반영하도록 자동으로 업데이트됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 분석에 포함되기 위해 피크가 있어야 하는 복제물의 백분율을 조정합니다(예: 임계값이 70%로 설정되어 있고 피크가 10개 복제 중 적어도 7개에서 발생하는 경우 포함됩니다).
- 미러 플롯을 시각적 안내로 사용하여 가장 "정품" 피크와 최소 노이즈를 유지하는 노이즈 차단으로 신호를 조정하여 더 많은 복제와 더 높은 "백분율 피크 존재" 값을 통해 노이즈 차단에 대한 낮은 신호를 선택할 수 있습니다.
- IDBac의 추가 해석에 사용할 각 스펙트럼 내의 질량 값 범위를 지시하여 하부 및 상위 m/z 컷오프를 지정합니다.
9. 단백질 데이터를 사용하여 샘플을 클러스터링
- 단백질 데이터 분석 페이지에서 덴드로그램 탭을 선택합니다. 이를 통해 사용자가 선택한 거리 측정 및 클러스터링 알고리즘에 따라 샘플을 덴드로그램으로 그룹화할 수 있습니다.
- 메뉴에서 샘플 선택을 클릭하고 지침에 따라 분석에 포함할 샘플을 선택합니다. 단백질 스펙트럼을 포함하는 샘플만 사용 가능한 샘플 상자 내에 표시됩니다(그림 9).
그림 9: 표시된 덴드로그램 내에 포함할 선택한 실험에서 샘플을 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 기본값을 사용하거나 클러스터링 설정 선택에서덴드로그램 생성에 적용할 원하는 거리 및 군집 알고리즘을 선택합니다.
- 현재 상태/부재를 입력으로 선택합니다. 또는 샘플의 피크 높이에 대해 확신하는 경우(예: 피크 강도의 가변성을 평가하기 위한 연구를 수행한 후) 강도를 입력으로 선택합니다.
참고: 게시 시 IDBac은 사용자가 적절한 조합을 선택하는 데 의존하여 클러스터링 설정을 유연하게 제공합니다. 이러한 옵션에 익숙하지 않은 경우 A: "코사인" 거리 및 "평균(UPGMA)" 군집 중 하나를 페어링하는 것이 좋습니다. 또는 B: "유클리안" 거리 및 "와드.D2" 군집. - 덴드로그램에 부트스트랩 값을 표시하려면 부트스트랩아래에 2에서 1000 사이의 숫자를 입력합니다.
- 결과를 보고할 때 단백질 분석 보고 제안 단락 내의 텍스트를 복사합니다. 이렇게 하면 특정 덴드로그램을 생성한 사용자 정의 설정이 제공됩니다.
10. 단백질 덴드로그램을 사용자 정의
- 덴드로그램 사용자 지정을 시작하려면 덴드로그램 조정 메뉴(그림10)를엽니다.
그림 10: 덴드로그램을 조정합니다. IDBac는 덴드로그램의 모양을 수정하기위한 몇 가지 옵션을 제공합니다, 이들은 메뉴 "덴드로 그램 조정"에서 찾을 수 있습니다. 여기에는 k-means에 의한 착색 분기 및 라벨 또는 사용자가 제공한 높이에서 덴드로그램을 "절단"하는 것이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 덴드로그램의 선 및/또는 라벨에 색상을 지정하려면 적절한 단추를 선택합니다: 선을 수정하려면 클릭하거나 클릭하여 레이블을 수정하고 원하는 옵션을 선택합니다.
- 덴드로그램 옆에 있는 스프레드시트에서 정보를 플롯하려면(7.2단계 참조) 샘플에 대한 정보 통합 단추를선택합니다. 그러면 범주(스프레드시트의 열)가 입력된 값(그림 11)에 따라자체 채우는 패널이 열립니다.
그림 11: 샘플에 대한 정보를 통합합니다. "Dendrogram 조정" 메뉴에는 "샘플에 대한 정보 통합" 옵션이 있습니다. 이 옵션을 선택하면 덴드로그램 옆에 있는 샘플에 대한 정보를 플로팅할 수 있습니다. 샘플 정보는 "이전 실험 작업" 페이지에 입력됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
11. 별도의 실험에서 샘플을 덴드로그램에 삽입하십시오.
- 다른 실험에서 샘플을 삽입하려면 다른 실험에서 샘플 삽입메뉴 단추를 선택합니다. 새로 연 패널의 지침을 따릅니다(그림12).
그림 12: 다른 실험 메뉴에서 샘플을 삽입합니다. 때로는 다른 실험의 샘플을 비교하는 것이 유용합니다. "다른 실험에서 샘플 삽입" 메뉴를 사용하여 현재 표시된 덴드로그램 내에 포함할 샘플을 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
12. 전문 대사 산물 데이터 및 대사 산물 협회 네트워크 (MAN) 분석
- 대사 산물 협회 네트워크 (소분자) 페이지로 이동합니다. 이 페이지에서는 이중 분할 네트워크를 사용하여 샘플과 소분자 m/z 값의 상관 관계를 표시하는 원리 성분 분석(PCA) 및 MAN에 의한 데이터 시각화를 허용합니다.
- 단백질 덴드로그램이 생성된 경우(섹션 9), 이 페이지에도 표시됩니다. 분석할 관심 있는 샘플을 강조하기 위해 덴드로그램을 클릭하고 드래그합니다. 어떤 견본이 강조되지 않거나 단백질 dendrogram가 생성되지 않은 경우에, 임의의 서브세트 또는 모든견본의 MAN은 정중하게, 나타날 것입니다 (그림 13).
그림 13: 소분자 데이터 분석" 페이지. 덴드로그램이 단백질 스펙트럼에서 생성된 경우, "소분자 데이터 분석" 페이지에 표시됩니다. 이 페이지에는 소분자 데이터에 대한 대사산물 관련 네트워크(MAN) 및 원리 성분 분석(PCA)도 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- MAN에서 매트릭스/미디어 공백을 빼려면 메뉴를 열어 빼기 샘플을 선택하고 공백으로 사용할 적절한 샘플을 선택합니다.
- 섹션 9의 단백질 스펙트럼에 대해 수행된 것처럼 메뉴 표시/숨기기 MAN 설정을 열어 복제, 노이즈 신호 및 상부 및 하부 질량 차단에서 피크 존재 비율에 대해 원하는 값을 선택합니다. 소분자 미러 플롯을 사용하여 이러한 설정의 선택을 안내합니다.
- "현재 네트워크 데이터 다운로드"를 선택하여 현재 표시되는 MAN의 데이터를 저장합니다. 이러한 데이터는 IDBac 이외의 네트워크 분석 소프트웨어에 사용할 수 있습니다.
- 결과를 보고하기 위해 MAN 분석 보고 제안 단락 내의 텍스트를 복사합니다. 이렇게 하면 생성된 MAN을 생성하는 데 사용되는 사용자 정의 설정이 제공됩니다.
13. 데이터 공유
- 각 IDBac "실험"은 단일 SQLite 데이터베이스로 저장됩니다. 여기에는 변환된 mzML 원시 스펙트럼, 감지된 피크 및 샘플에 대한 모든 사용자 입력 정보가 포함됩니다. 따라서 IDBac 실험을 공유하려면 실험과 이름이 같은 SQlite 파일을 공유하기만 하면 됩니다(파일 위치는 이전 실험 작업 페이지에 표시됩니다).
Representative Results
우리는 Micromonospora chokoriensis의 6개의 긴장 및 이전에 DOI에서 유효한 데이터를 사용하여6를 특징으로 한 바실러스 subtilis의2개의 긴장을 분석했습니다: 10.5281/zenodo.2574096. 원시 데이터 로 시작 탭의 지침에 따라 브루커 파일을 변환하려면 여기를 클릭하고 각 데이터 집합에 대한 IDBac에서 제공한 지침을 따랐습니다(그림14).
자동화된 변환 및 전처리/피크 피크 단계가 완료된 후, 우리는 두 실험에서 샘플을 바실러스와 바실러스와 모두를 포함하는 단일 실험으로 전송하여 새로운 결합 IDBac 실험을 만들었습니다. 마이크로 모노포라 샘플(그림 15). 그 결과 분석결과, 그림 16에나타낸 바와 같이 거울 플롯을 사용하여 단백질 스펙트럼을 비교하는 것이 포함되었으며, 이는 스펙트럼 품질을 평가하고 피크 피킹 설정을 조정하는 데 유용했습니다. 그림 17은 기본 설정을 선택한 단백질 군집 결과의 스크린샷을 표시합니다. 덴드로그램은 플롯의 임계값을 조정하여 착색되었습니다(점선으로 표시). 주목할 점은 제네라 사이의 명확한 분리이며, M. chokoriensis와 B. subtilis는 별도로 군집체를 분리합니다.
도 18, 도 19및 도 20은 단백질 덴드로그램을 클릭하고 드래그하여 사용자가 선택한 영역의 MAN을 생성하는 기능을 강조한다. 이를 통해 B. 서브틸리스 균주만을 비교하여 신속하게 MAN을 생성할 수 있었습니다(도18), M. chokoriensis 균주(도19),모든 균주(도20)만동시에 비교할 수 있었습니다. 이 네트워크의 주요 기능은 박테리아 사이 전문화한 대사산물 중첩의 정도의 넓은 개요를 연구원에게 제공하는 것입니다. 이러한 데이터를 손에 들고, 연구원은 지금 세균성 식민지에서 긁어 낸 물자의 소량에서 정보에 입각한 결정을 내릴 수 있는 능력을 가지고 있습니다.
그림 14: 스펙트럼 처리. 다운로드 한 브루커 오토플렉스 스펙트럼은 IDBac을 사용하여 변환 및 처리되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 15: 결합된 IDBac 실험. 마이크로모노스포라 및 바실러스 스펙트럼이 상이한 MALDI 표적 플레이트상에서 수집되었기 때문에, 두 실험은 이후에 단일 실험-"바실러스_마이크로몬소포라"로 결합되었다. 이 작업은 "이전 실험 작업" 탭에서 "이전 실험에서 새/기타 실험으로 샘플을 전송"하는 메뉴의 지시에 따라 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 16: 비교. 마이크로몬스포라 와 바실러스 스펙트럼은 "단백질 데이터 분석" 페이지 내의 거울 플롯을 사용하여 비교되었다. 궁극적으로 기본 피크 설정이 선택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 17: 계층적 클러스터링. 기본 설정을 사용하여 계층적 클러스터링을 올바르게 그룹화한 바실러스와 Micromonospora 격리. 덴드로그램은 임의의 높이에서 덴드로그램을 "절단"하고(파선으로 표시) 및 분기에 대한 자신감을 표시하는 데 사용되는 100개의 부트스트랩으로 착색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 18: 단백질 덴드로그램으로부터 바실러스 sp. 균주를 선택하여 생성된 MAN은 특수 대사산물의 차등 생산을보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 19: 단백질 덴드로그램으로부터 6개의 마이크로모노스포라 스프. 균주를 선택하여 생성된 MAN은 특수 대사산물의 차등 생산을 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 20: MAN of Bacillus sp. 및 Micromonospora sp. 특수 대사 산물의 차등 생산을 보여주는 균주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
IDBac 프로토콜은 단일 연구원에 의해 4시간 동안 최대 384개의 세균 분리물의 박테리아 단백질 및 특수 대사산물 데이터 수집 및 분석을 자세히 설명합니다. IDBac을 사용하면 박테리아 분리물에서 DNA를 추출하거나 액체 발효 국물에서 특수 대사 산물 추출물을 생성하고 크로마토그래피 방법을 사용하여 분석 할 필요가 없습니다. 대신, 단백질 및 전문화한 대사 산물 데이터는 단순히 MALDI 표적 격판덮개에 세균성 식민지에서 직접 퍼지는 물자를 통해 집합됩니다. 이것은 크게 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 LCMS 9와같은 대체 기술과 관련되었던 시간 및 비용을 감소시킵니다.
MALDI 플레이트에 매트릭스 블랭크 및 교정 스팟을 추가하는 것이 중요하며 재현성과 통계적 신뢰도를 보장하기 위해 적절한 수의 복제본을 사용하는 것이 좋습니다. 복제 수에 따라 실험에 따라 다릅니다. 예를 들어 사용자가 수천 개의 식민지를 환경 다양성 플레이트 모음에서 차별화하려는 경우 더 적은 수의 복제가 필요할 수 있습니다(우리 실험실은 식민지당 세 개의 기술 복제본을 수집합니다). 또는 사용자가 특정 세균 성 taxa에서 균주의 사용자 지정 데이터베이스를 만들어 알려지지 않은 분리물의 하위 종 분류를 신속하게 결정하려는 경우 더 많은 복제가 적절합니다 (우리 실험실은 1 인당 8 개의 생물학적 복제본을 수집합니다. 변형)을 제공합니다.
IDBac는 가학적인 분류학적 정보와 특수 대사 산물 생산을 기반으로 고도로 관련된 세균 분리를 빠르게 차별화하는 도구입니다. 핵 자기 공명 분광법에 의한 심층적인 유전 분석, 대사 산물 생산 및 기능을 수반하는 연구, 또는 특수 대사 산물 구조의 특성화와 같은 직교 방법의 전구체 역할을 할 수 있습니다. LC-MS/MS.
특수 대사 산물 생산 (IDBac MAN)은 세균 성장 조건에 매우 민감하며, 특히 다른 매체를 사용하여 방법의 잠재적 한계입니다. 그러나 이러한 특성은 IDBac이 다양한 성장 조건 하에서 특수 대사 산물 생산의 차이를 보여주는 MA를 쉽게 생성 할 수 있기 때문에 사용자에 의해 악용 될 수 있습니다. 전문화한 대사산물 지문은 성장 조건에 따라 다를 수 있지만, 우리는 이전에 단백질 지문이 이러한 변수에 걸쳐 상대적으로 안정적으로 유지된다는 것을 보여주었습니다 (Clark et al.6참조). 환경 다양성 판을 다룰 때, 우리는 이웃 세균 크로스 토크에서 가능한 기여를 줄이기 위해 분석 하기 전에 세균 격리를 정화 하는 것이 좋습니다.
마지막으로, 단백질 MS 지문의 검색 가능한 공개 데이터베이스의 부족은 알려지지 않은 환경 박테리아를 분류하는이 방법의 사용에 큰 단점이다. 이를 염두에 두고 IDBac을 만들었으며, 데이터를 커뮤니티에서 허용하는 오픈 소스 형식(mzML)10,11,12로 자동 변환하고 검색, 공유 및 생성이 가능하도록 소프트웨어를 설계했습니다. 사용자 지정 데이터베이스. 우리는 큰 공공 데이터베이스를 만드는 과정에 (>10,000 완전히 특성화 균주), 종 수준에 일부 격리의 분류를 허용합니다, 가능한 경우 GenBank 가입 번호에 대한 링크를 포함.
IDBac은 오픈 소스이며 누구나 데이터 분석 및 시각화 요구 사항을 사용자 정의할 수 있는 코드를 사용할 수 있습니다. 우리는 사용자가 지원및 실험 목표를 설계하는 데 도움이문학의 광범위한 몸을 참조하는 것이 좋습니다 (Sauer 외 7, 실바 외 5). 우리는 에서 토론을위한 포럼을 개최 : https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac 및 에서 소프트웨어와 문제를보고하는 수단 : https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 일반 의료 과학 그랜트 R01 GM125943, 내셔널 지오그래픽 그랜트 CP-044R-17의 국립 연구소에 의해 지원되었다; 아이슬란드 연구 기금 교부금 152336-051; 일리노이 대학교 시카고 스타트업 펀드. 또한, 우리는 다음과 같은 기여자에게 감사드립니다: MALDI-TOF MS 단백질 획득 매개 변수에 대한 도움을 받은 아만다 불먼 박사; 테리 무어 박사와 아툴 자인 박사는 알파-시아노-4-하이드록시나믹 산 매트릭스(CHCA)를 재결정화했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher | 60-002-65 | LC-MS Ultra CHROMASOLV |
| Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument | Bruker Daltonics | ||
| Bruker Daltonics Bacterial test standard | Fisher | NC0884024 | Bruker Daltonics 8604530 |
| Bruker Peptide Calibration standard | Fisher | NC9846988 | Bruker Daltonics 8206195 |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | 99.5+%, Optima LC/MS Grade |
| MALDI-TOF target Plate | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemical | A456-500 | Optima LC/MS Grade |
| Toothpicks | any is ok | ||
| Trifluoroacetic acid | Fisher | AC293810010 | 99.5%, for biochemistry, ACROS Organics |
| Water | VWR | 7732-18-5 | LC-MS |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | (C2020-25G) ≥98% (TLC), powder |
References
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