Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

نموذج واجهة دماغ دم البشري لدراسة نقاط عبور الحاجز بمسببات الأمراض أو الأدوية وتفاعلاتها مع الدماغ

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59220
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 3, 1
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS
* These authors contributed equally

Summary

نقدم هنا بروتوكول وصف الإعداد سيلولو في بي بي بي (حاجز الدم في الدماغ)-إدراج الثقافة البوليستر مسامية الغشاء مينيبرين النظام بغية تقييم نقل الجزيئات الحيوية أو العوامل المعدية عبر BBB بشرية وعلى فسيولوجية تؤثر على خلايا المخ المجاورة.

Abstract

وقت مبكر فحص الأدوية العصبي على صلة وموثوق بها في طراز بي بي بي سيلولو على الاختراق وتفاعلها مع الحاجز ولحمة الدماغ ما زالت حاجة غير ملباة. ولسد هذه الفجوة، قمنا بتصميم 2D في نموذج سيلولو، بي بي بي-مينيبرين، من خلال الجمع بين من بوليستر في الأغشية المسامية الثقافة إدراج البشرية BBB النموذجي مع مينيبرين التي شكلتها ثقافة ثلاثي لخلايا الدماغ البشري (الخلايا العصبية وخلايا microglial astrocytes). BBB-مينيبرين سمح لنا باختبار نقل مرشح المخدرات محصن (على سبيل المثال، نيوروفيتا)، عن طريق بي بي بي، لتحديد استهداف محددة لهذا الجزيء على الخلايا العصبية، وإظهار أنه كان الحفاظ على الممتلكات محصن من المخدرات بعد المخدرات قد عبرت بي بي بي. كما أثبتنا أن BBB-مينيبراين يشكل نموذجا جديرا باهتمام للكشف عن مرور جزيئات الفيروس عبر حاجز غشائي الخلايا ومراقبة العدوى من مينيبراين بجسيمات الفيروس نيوروينفاسيفي. BBB-مينيبرين نظام موثوق به، سهلة للتعامل مع الباحثين المدربين في خلية ثقافة التكنولوجيا والتنبؤيه لتعمل خلايا الدماغ بعد العلاج أو الإهانة. الفائدة من هذا القبيل في اختبار سيلولو ستكون ذات شقين: إدخال ديريسكينج خطوات مبكرة في وضع المخدرات من جهة، والحد من استخدام الحيوانات في التجارب من ناحية أخرى.

Introduction

الدماغ يفصلها عن الدوران الجهازي بنية غير المسامية التي تحد من التبادل بين حمة المخ، والدم، ويسمى حاجز الدم في الدماغ (BBB). معظمها تتألف من خلايا بطانة الأوعية الدموية الدماغية، بي بي بي بشكل حيوي تتفاعل مع astrocytes وارتشاح microglia والخلايا العصبية من حمة المخ المجاورة. أن المهام الرئيسية الثلاث ل BBB هي إنشاء وصيانة التوازن الأيوني للوظائف العصبية، إمداد الدماغ بالمواد المغذية، والحماية من الإصابات السمية أو دخول مسببات الأمراض1،2، التي تسهم في الحفاظ على التوازن في الدماغ ولها وظائف3. هذا الحاجز كفاءة حتى أن المخدرات قليلة فقط يمكن عبر4،بي بي بي5. وفي الوقت الحاضر، الأساليب المتاحة للتنبؤ بما إذا كان جزيء سيتم تمرير BBB ومنتشر في المخ تتكون من السابقين فيفو الدراسات المتعلقة بتتبع الصورة المادية، تشريح الجثة في دماغ متطوعين من البشر بالتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) أو الحيوانات الأليفة (الانبعاث المركز التصوير المقطعي) أو الدوائية والدراسات السريرية الحرائك الدوائية في الحيوانات6،،من78. هذه التقنيات ونماذج لها بعض القيود، مثل القرار محدودة من الحيوانات الأليفة وانخفاض حساسية التصوير بالرنين المغناطيسي6،8، صعوبة تحديد حجم الجزيئات (أي جزيئات الأجسام المضادة التي تعتمد على سبيل المثال) أن سوء اختراق الدماغ7، الإكلينيكية دراسات تكلفة مرتفعة، ومنتجع للتجارب الحيوانية.

والنقطة الأخيرة مهم لأنه، حسب 3R القواعد (الاستبدال والحد وصقل التجارب الحيوانية) طلبت الإدارات التنظيمية أن الباحثين على وجه السرعة إيجاد بديل علمياً دقيقا للحيوان التجريب9،10،11،،من1213،،من1415.

على مدى العقود الماضية، واقترحت عدة نماذج في المختبر من بي بي بي16،،من1718 بزراعة على تصفية غشاء إدراج خلايا بطانية من مختلف الأنواع مثل الماوس والفئران والأبقار والخنازير. وبقدر ما يتعلق بالجنس البشري، توافر الخلايا الأولية النادرة والصعبة دفعت الباحثين تطوير نماذج البشرية تستند إلى خلايا الدماغ مخلدة بطانية أو الخلايا الجذعية المشتقة من الإنسان19،20، 21. هذه الحواجز هي البدائل المناسبة في المختبر من BBB شريطة أن يعربون عن علامات خلية بطانية، علامات تقاطع ضيق، والناقلين افلوكس، ذائبة الناقلين، المستقبلات، والاستجابة ل المحفزات غشائي 20. كانت جزيئي عدد قليل من النماذج بي بي بي باستخدام تصفية غشاء إدراجات المغلفة مع خلايا بطانية وأنواع الخلايا الأخرى (أي، أستروسيتيس، والخلايا العصبية أو بيريسيتيس22،23،24). والهدف من هذه الثقافات المشتركة زيادة الخصائص الفيزيائية BBB بالاستفادة من إفراز العوامل القابلة للذوبان astrocytes/الخلايا العصبية أو بيريسيتيس.

ومع ذلك، يتضمن أيا من هذه النماذج حمة الدماغ الدراسة والتنبؤ بمصير مرشح المخدرات بعد أن اجتاز الحاجز. ولذلك، كان هدفنا بناء سيلولو في الدم/الدماغ واجهة, BBB-مينيبرين، بالجمع بين نموذج BBB وثقافة من خلايا المخ المختلطة في مجموعة واحدة. BBB-مينيبرين يستخدم نظام ثقافة يتكون من عامل تصفية مسامية إدراجها في بئر لوحة الثقافة خلية مولتيويل. عامل التصفية فهي مغلفة بالخلايا هكميك/D3، خط خلية غشائي دماغ البشري قد ثبت موثوق بها للغاية لاختبار25،،من2627، لتشكيل BBB المخدرات بي بي بي. مينيبرين، التي هي ثقافة المشاركة متباينة من الخلايا العصبية البشرية و astrocytes المستمدة من28،خط الخلية NTera/Cl2.D129 مختلطة جنبا إلى جنب مع خط الخلية البشرية microglial Cl5 كم/30 بالنسبة المقابلة microglia مقابل نسب astrocytes العصبية ل الدماغ31، يزرع في الجزء السفلي من اللوحة جيدا.

إلى جانب دراسة مرور المخدرات عبر BBB ومصيرهم في حمة، واجهة الدم في الدماغ في طراز سيلولو يمكن أن تكون أداة قوية لمعالجة دخول مسببات الأمراض في الدماغ (نيوروينفاسيفينيس)، التشتت في الدماغ (نيوروتروبيسم) والسمية (الفوعة العصبية) أنها يمكن أن تمارس على خلايا المخ الحشوي. ستستفيد من تطوير الكفاءة في نموذج سيلولو الدراسات الفوعة العصبية ونيوروينفاسيفينيس ويكون مفيداً لتحل محل النماذج الحيوانية. استخدام طقم BBB-مينيبرين32، أثبتنا النمط الظاهري نيوروينفاسيفي من طفرات الفيروسية النادرة التي تراكمت في سلالة الفيروس "تم الفرنسية" من "فيروس الحمى الصفراء" (أي، الهولندي-يفف،من3334) المستخدمة لإعداد وقف لقاح يفف الحي ومرور بيوموليكولي نيوروريجينيراتيفي ومحصن تسمى نيوروفيتا (يشار بولاية نيفادا من الآن فصاعدا في المخطوطة)35. لأن NV بطبيعة الحال لا يعبر غشاء الخلية ولا بي بي بي، نيفادا تنصهر مع الجزء المتغير (فة) من جسم واحد في سلسلة من اللاما تعبر الأغشية البيولوجية بما في ذلك بي بي بي ويعمل كخلية اختراق جزيء (CPM)36. ويبدو ممتلكات CPM فة يتوقف عند نقطة isoelectric وطول فة37.

هذا في اختبار سيلولو يجب أن تجعل من الممكن لفرز الجزيئات التي يمكن أن يحتمل أن تعبر BBB قبل الاضطلاع الحرائك الدوائية وتحليل الدوائية في الحيوانات، ومن الناحية المثالية في نفس الوقت لتكون قادرة على التنبؤ بسلوكهم في الجهاز العصبي حمة. هذا النظام بيولوجيا ذات الصلة ويسهل إعداد والتعامل مع من مهنيين مدربين تدريبا جيدا في خلية ثقافة26،29،،من3038. الفائدة من هذا القبيل في اختبار سيلولو سيكون من شقين هما: خفض تكاليف الاختبارات الإكلينيكية من ناحية، والحد من استخدام اختبار الحيوانات من ناحية أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-خلية ثقافة عمل نتيرا/CL2. D1 إلى إعداد ثقافة المشارك هنيورونس بعد الانقسامية وهاستروسيتيس (NT2-n/A)

ملاحظة: هذا هو مكون مينيبرين (الشكل 1).

  1. استزراع في Ntera/Cl2.D1
    1. إزالة قنينة خلايا المجمدة من خزان النتروجين السائل. الحفاظ على الجليد.
    2. ذوبان الجليد الخلايا سرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    3. نقل الخلايا في أنبوب 15 مل تحتوي على 10 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة (تعديل النسر المتوسطة دولبيكو: المتوسطة F-12 مزيج المغذيات) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، الجلوتامين 2 مم، والبنسلين 100 وحدة دولية و 100 ميكروغرام ستربتوميسين (أي إكمال دميم F12 المتوسطة).
    4. الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). ننأى بيليه في 2 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة.
    5. نقل في قارورة زراعة الأنسجة T75 في البوليسترين مع معاملة محددة للخلايا ملتصقة الحساسة (T75Cell+) التي تحتوي على 13 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة.
    6. الثقافة الخلايا في حاضنة الحفاظ على 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة حتى التقاء 90% (أي حوالي 5 أيام). تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
  2. سوبكولتورينج Ntera/Cl2.D1 والتضخيم
    1. إزالة المتوسطة من قارورة.
    2. شطف أحادي الخلية في الطبقة مع 10 مل من الفوسفات المخزن المؤقت المالحة (PBS) وتستكمل مع Ca2 + و Mg2 +.
    3. شطف المونولاير الخلية مع 10 مل من محلول يدتا (أبقى على RT).
    4. أضف 3 مل من محلول يدتا التربسين (0.05% التربسين، يدتا 0.02 في المائة)، واحتضان 2 دقيقة في الرايت
    5. اهتز قارورة وتأكد من أن يتم فصل الخلايا من سطح البلاستيك.
    6. أضف 10 مل متوسطة F12 دميم كاملة لإلغاء تنشيط التربسين، ونقل في أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ز في الرايت
    7. فصل بيليه مع 10 مل متوسطة كاملة واستخدام 1 مل لتطعيم كل قارورة جديدة التي تحتوي على 14 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة.
      ملاحظة: ثلاثين خلية T75+ قوارير مطلوبة لكل الاختلاف.
    8. احتضان قوارير في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة حتى التقاء 90%.
  3. التفريق بين NTera/Cl2.D1 في أستروسيتي الخلايا العصبية البشرية ثقافة المشارك
    ملاحظة: هذا هو العنصر الرئيسي مينيبراين.
    1. في اليوم 0، فصل الخلايا مع التربسين-يدتا كما هو موضح في الخطوة 1، 2 وتنأى بيليه خلية لكل قارورة مع 2 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة.
    2. أضف 1 مل تعليق خلية (الموافق 5 × 106 خلايا) في أطباق بيتري بلاستيكية 60 من 85 مم تحتوي على 11 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة.
      ملاحظة: الخلايا سوف لا نعلق على البلاستيك وسيتم تجميعها بشكل زائف نيوروسفيريس (انظر الصورة في اللوحة السفلي من الشكل 1). احتضان أطباق بيتري 60 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة لمدة يوم واحد.
    3. في يوم 1، أضف 1 مل من كاملة F12 دميم المتوسطة وتستكمل مع 130 ميكرون لكل-ترانس حمض الريتينويك (ATRA) كل طبق بتري (تركيز نهائي ATRA 10 ميكرومتر) وعودة الأطباق على 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة ح 24.
    4. في يوم 2، نقل المتوسطة التي تحتوي على مجالات خلية لكل Petri Dish في أنبوب 50 مل والطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 50 س ز والرايت ديسوسياتي بعناية بيليه فضفاضة مع 13 مل من كامل F12 دميم المتوسطة وتستكمل مع 10 ميكرون ATRA بعناية فائقة وإضافة ال (ه) 13 مل في قطر 85 ملم جديدة طبق بيتري.
      ملاحظة: عبر الممرات المختلفة، بالغة الأهمية للحفاظ على كثافة مجالات ترتفع كثافة الحصول عليها في اليوم 2 (أي، حول كثافة 70%). ولذلك، إذا كان يتم تخفيض كثافة المجال، تقليل العدد الإجمالي من أطباق بيتري وفقا لعدد الخلايا.
    5. تكرار الإجراء أعلاه (الخطوة 1.3.4) في أيام 4 و 6 و 8.
    6. في يوم 10، كرر الإجراء أعلاه ولكن إضافة المجالات بقوارير T75 خلية+ بدلاً من أطباق بتري. إضافة الخلايا من صحن بيتري واحد إلى واحد خلية T75+ قارورة.
    7. في 11 يوما، 13 و 15 و 17، تغيير الوسيطة المستخدمة مع 14 مل من F12 دميم كاملة وتستكمل مع 10 ميكرون ATRA.
    8. في يوم 19، تغيير المتوسطة مع 14 مل متوسطة F12 دميم كاملة دون ATRA كل قارورة.
    9. وفي يوم 20 ننأى بلطف الخلايا مع التربسين/يدتا على النحو التالي.
      1. لكل قارورة T75 خلية+ ، شطف الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع Ca2 + و Mg2 +؛ احتضان الخلايا مع 4 مل يدتا لمدة 5 دقائق في الرايت
      2. إزالة بعناية يدتا وإضافة 2 مل يدتا التربسين واحتضان 7 دقيقة في الرايت هزة بلطف جداً قارورة وإضافة بعناية 8 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة.
      3. أجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة على 160 × ز والرايت ننأى بيليه الخلية في 13 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة ونقل في قارورة T75 خلية+ .
        ملاحظة: سيسمح تفارق لطيف جداً مع التربسين يدتا يتعافى ATRA متباينة من الخلايا من الخلايا تيراتوكارسينوما الأصلية، والتي ترتبط بشدة البلاستيك وير.
    10. وفي يوم 21، إزالة المتوسطة والخلايا الميتة. إضافة 14 مل من كامل F12 دميم المتوسطة وتستكمل مع 5% FBS، الجلوتامين 2 مم والبنسلين 100 وحدة دولية، 100 ميكروغرام ستربتوميسين و 0.5 ميكرومتر من أراك (سيتوزين β-د-أرابينوفورانوسيدي) (إكمال 5% FBS دميم F12-أراك).
    11. في 23 يوما، 25 و 28، تستخدم استبدال المتوسطة مع 14 مل من 5% FBS دميم F12-أراك.
    12. في 29 يوما ما يصل إلى 49 (كل يوم اثنين)، تستخدم استبدال المتوسطة مع 14 مل من إكمال المتوسطة F12 دميم تستكمل مع 5% مصل بقرى الجنين، الجلوتامين 2 مم، البنسلين 100 وحدة دولية، 100 ميكروغرام ستربتوميسين، 5 ميكرون من فودر (2-5-مخفضات ' ديوكسيوريديني) و 10 ميكرون Urd (أردين) (الكامل 5% FBS دميم F12-فودر-Urd).
    13. في 50 يوما، المتوسطة استبدال المستخدمة مع 14 مل من كامل F12 دميم المتوسطة وتستكمل مع 5% FBS، الجلوتامين 2 مم، 100 وحدة دولية البنسلين، 100 ميكروغرام ستربتوميسين و 10 ميكرون Urd (إكمال 5% FBS دميم F12-Urd).
    14. في 51 يوما ما يصل إلى 95 (مرتين في أسبوع)، تستخدم استبدال المتوسطة مع 14 مل كاملة 5% FBS دميم F12-Urd.
      ملاحظة: يمكن أن تكون الخلايا المستخدمة لإجراء التجارب من يوم 51 لكن لا يتجاوز اليوم 95. يسمح استخدام علاجات التسلسلي مع مثبطات الانقسام استرداد السكان نقية من ثقافة المشارك هنيورون بعد الانقسامية وهاستروسيتيس (NT2-n/A).
    15. أن البذور الخلايا، المضي قدما في تريبسينيزيشن لطيف كما هو موضح ليوم 20.

2-خلية عمل الثقافة البشرية microglial الخلايا كم/Cl5

ملاحظة: هذا هو عنصر ميكروجليال مينيبرين (الشكل 1).

  1. Microglial البشرية استزراع الخلايا كم/Cl5
    1. إزالة قنينة خلايا المجمدة من خزان النتروجين السائل. الحفاظ على الجليد.
    2. تحسن سريع في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    3. نقل الخلايا في أنبوب 15 مل تحتوي على 10 مل من إكمال المتوسطة F12 دميم تستكمل مع 5% مصل بقرى الجنين، الجلوتامين 2 مم، والبنسلين 100 وحدة دولية و 100 ميكروغرام ستربتوميسين (أي، المتوسطة FBS دميم F12 5% كاملة).
    4. الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت ديسوسياتي بيليه مع 2 مل متوسطة FBS دميم F12 5% كاملة.
    5. نقل في قارورة T75 خلية+ التي تحتوي على 13 مل من 5% اكتمال F12 دميم FBS المتوسطة.
    6. خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة حتى التقاء 90%. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
  2. سوبكولتورينج الخلايا البشرية microglial كم/Cl5
    1. إزالة المتوسطة من قارورة.
    2. شطف أحادي الخلية في الطبقة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع Ca2 + و Mg2 +.
    3. شطف المونولاير الخلية مع 10 مل من محلول يدتا (أبقى على RT).
    4. أضف 3 مل من محلول يدتا التربسين واحتضان 2 دقيقة في الرايت
    5. اهتز قارورة وتأكد من أن يتم فصل الخلايا من سطح البلاستيك.
    6. أضف 10 مل من 5% FBS دميم F12 المتوسطة كاملة لإلغاء تنشيط التربسين، ونقل في أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز والرايت
    7. فصل بيليه مع 10 مل متوسطة كاملة واستخدام 1 مل لتطعيم كل قارورة جديدة تحتوي على 14 مل متوسطة FBS دميم F12 5% كاملة.
    8. احتضان قوارير في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة حتى التقاء 90%.

3-ثقافة العمل مع هكميك/D3 معطف إدراجات المليئة بالثغرات وإعداد بي بي بي

  1. استزراع الخلايا البطانية البشرية هكميك/D3 (الشكل 2)
    1. تمييع نوع أنا فأر الكولاجين إلى 01:30 مع الماء المعقم النقي (خلية ثقافة الصف).
    2. نقل 10 مل في قارورة T75 خلية+ واحتضان ح 2 في 37 درجة مئوية، ونسبة 5% CO2 وحاضنة الرطوبة 95%.
    3. إزالة الحل الكولاجين واستبدله مع 15 مل متوسطة غشائي خلية يكمل مع 10 ملم هيبيس (يشار إلى الخلية البطانية كاملة المتوسطة).
    4. إزالة البرد قنينة من الخلايا من خزان النتروجين السائل. الحفاظ على الجليد.
      ملاحظة: الخلايا المزروعة، وقدم الكثير بذور كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. خط الخلية مشمول باتفاق لنقل مواد بيولوجية. الخلايا يتم الحصول عليها في الممر رقم 25، ولا ينبغي أن تستخدم أكثر من مرور 35.
    5. تحسن سريع في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    6. نقل الخلايا في قارورة T75 خلية+ والعودة قارورة على 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة ح 2 إلى 4.
    7. إزالة المتوسطة بعناية دون فقدان أو إزالة الخلايا. شطف الخلايا مرة واحدة مع 10 مل متوسطة الخلية البطانية كاملة.
    8. إضافة 15 مل متوسطة الخلية البطانية كاملة.
    9. خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 95% رطوبة حتى التقاء 100% (لا تقل عن 4 أيام) دون تغيير في المتوسط.
  2. سوبكولتورينج هكميك/D3 لإعداد الإدراج من بي بي بي
    1. معطف قارورة T75 خلية+ جديدة أو إدراج مع النوع أنا "الكولاجين الفئران" كما هو موضح أعلاه (الخطوة 3.1).
    2. إزالة المتوسطة من قارورة. شطف أحادي الخلية في الطبقة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع Ca2 + و Mg2 +.
    3. إضافة 2 مل من محلول يدتا التربسين واحتضان 5 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. اهتز قارورة والتأكد من أن الخلايا بعيدة تماما عن سطح البلاستيك.
    5. إضافة 4 مل متوسطة الخلية البطانية كاملة لإلغاء تنشيط التربسين.
    6. مع 5 مل ماصة بلاستيكية، ميكانيكيا ننأى بالخلايا يسفط ومسح تعليق خلية في حين الحفاظ على ماصة 5 مل إلى أسفل قارورة 5 مرات على الأقل.
    7. عد الخلايا واستخدام 5 × 104 خلايا/إدراج ثقافة 12 غشاء بوليستر أيضا إدراج insert و 2 × 106 خلايا لقارورة T75 خلية+ . تعد أيضا ثلاث مرشحات دون خلايا لتجارب PELy (أي، نفاذية خلايا بطانية لإبليس الأصفر انظر أدناه الفقرة 4.2) مع إدراج الثقافة غشاء البوليستر.
    8. احتضان قوارير أو إدراج في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة حتى التقاء 100%.
    9. لا تقم بتغيير وسيلة لقارورة T75 خلية+ حتى مرور جديدة. على العكس من ذلك ل BBB على ثقافة غشاء البوليستر إدراج: تغيير متوسطة في أيام 2 و 4، استخدم بي بي بي لإجراء تجارب عليها في يوم 6.

4-البناء ومراقبة الجودة من BBB-مينيبرين (الشكل 2)

  1. إعداد "البوليستر" BBB-مينيبرين إدراج الثقافة غشاء الجهاز (الشكل 2)
    1. تنمو خلايا هكميك/D3 12 البوليستر إدراج الثقافة غشاء مرشحات لمدة 6 أيام في المتوسط غشائي خلية قبل استخدامها للتجربة.
    2. معطف 12 لوحة جيدا مع بولي-د-يسين (1 مل/حسنا، 10 ميكروغرام/مل، ح 4 في RT)، ثم لامينين (1 مل/حسنا، 1 ميكروغرام/ملليلتر، بين عشية وضحاها في RT).
    3. إزالة laminin وإضافة 1 مل من الخلية البطانية المتوسطة وتستكمل مع 5% FBS (متوسط الخلايا البطانية 5%).
    4. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    5. بلطف تريبسينيزي NT2-n/A (كما هو موضح في الخطوة 1.3.9) وكم/Cl5 (كما هو موضح في الخطوة 2، 2) وفصل الكريات الخلية مع خلية غشائي الكامل المتوسطة.
    6. عد الخلايا، ومزيج 3.6 × 105 NT2-n/A و 0.4 × 105 كم/Cl5 الخلايا/حسنا والبذور 12 لوحة جيدا.
    7. عند T = 24 ساعة (24 ساعة بعد البذر): تغيير المتوسطة المستخدمة مع الخلية البطانية كاملة الطازجة المتوسطة (مينيبرين الخلايا والخلايا البطانية) ونقل الثقافة غشاء البوليستر هكميك/D3 إدراج تصفية أعلى الخلايا مينيبرين. احتضان BBB-مينيبرين في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
      ملاحظة: ثم BBB-مينيبرين التي سوف تتألف من طبقة من الخلايا البطانية البشرية هكميك/D3 في تصفية عزل المقصورة لومينال (أو حجرة "الدم") وثقافة مختلطة للخلايا البشرية hNT2-n/A وحكم/Cl5 (مينيبرين) في الجزء السفلي من تعريف جيد حجرة أبلومينال (أو "الدماغ" حجرة) (الشكل 2).
  2. التحقق من صحة نفاذية غشائي BBB-مينيبرين (مراقبة الجودة) (الشكل 2)
    1. إعداد المخزن المؤقت النقل (السل)، وهو المخزن المؤقت لحبس (هانكس متوازن الملح حل) مع Ca2 + و Mg2 + تستكمل مع بيروفات صوديوم حبيس و 1 ملم 10 ملم.
    2. إعداد 12 لوحات جيدا مع 1.5 مل من المخزن المؤقت للنقل كل بئر.
    3. T = 0، جعل جديدة تستكمل نقل المخزن المؤقت مع 50 ميكرومتر إبليس الأصفر (LY-السل).
    4. عكس كل مرشح رأسا إزالة بعناية متوسطة دون التأثير على حاجز غشائي خلية.
    5. وضع عامل التصفية على اللوحة جيدا 12 شغلها وإضافة 0.5 مل لي السل.
    6. احتضان اللوحات في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    7. في نقل T = 10 دقيقة عوامل التصفية في السل الجديد شغل 12 لوحات جيدا والحفاظ على حجرة أبلومينال اللوحة الأولى للقراءة OD.
    8. T = 25 دقيقة، كرر الخطوة 4.2.7.
    9. T = 45 دقيقة، وقف النقل عن طريق إزالة عوامل التصفية من اللوحات. الحفاظ على أبلومينال ومقصورات لومينال لتدابير التطوير التنظيمي.
    10. نقل في 96 الظلام أيضا لوحات العينات: 10 ميليلتر مع 190 تيرابايت ميليلتر للي--السل والمقصورات لومينال، 200 ميكروليتر من عينة للمقصورات أبلومينال.
    11. قياس fluorescence LY-السل الموجودة في العينات المختلفة في λ428 شمال البحر الأبيض المتوسط λ535 شمال البحر الأبيض المتوسط (طول الإثارة وانبعاث أمواج، على التوالي).
    12. حساب نفاذية غشائي (Pe) تجاه LY-السل (PeLY) وفقا سيفلينجير-بيرنبويم، A et al. (1987)39 ودا كوستا، A et al. (2018)34 باستخدام الصيغة:
      1/السوق = (1/الباسيفيكي) – (1/PSf) و PeLY= PSe/س.
      ملاحظة: PSf هو نفاذية عامل التصفية دون خلايا، الباسيفيكي هو نفاذية عامل التصفية مع الخلايا، PSe هو نفاذية الوقت أحادي الطبقة غشائي سطح أحادي الطبقة، S هو سطح أحادي الطبقة (لعامل تصفية جيدا 12 = 1.12 سم2 )، وأعرب عن peLY في سم/دقيقة. هكميك/D3 Peلي ينبغي أن يكون بين 0.7 و 1.2 x 10-3 سم/دقيقة يتوقف أساسا من FBS استخدامها في التجارب. هام: Peلي أعلى مما يعني 1.2 BBB لا ضيق ما يكفي ويمكن ملاحظة بعض التسرب. تجاهل هذه الحواجز.

5-استخدام BBB-مينيبرين لتسليط الضوء على وجود الجزيئات الفيروسية العصبية الغازية في عينة لقاح "فيروس الحمى الصفراء"، أن الفيروس "تم الفرنسية"، يفف-الهولندية 34 (الشكل 3)

  1. معبر BBB وتكاثر فيروسات الحمى الصفراء في مينيبرين
    1. استخدام BBB-مينيبرين إعداد كما هو موضح في الخطوة 4.1.7 24 ساعة قبل إضافة هذا الفيروس؛ يستعاض عن المتوسط بواسطة الخلية البطانية FBS 2%.
      ملاحظة: أنها بالغة الأهمية لتجنب تغيير المتوسطة فقط قبل إضافة هذا الفيروس. تغيير الوسيلة يمكن تنشيط الخلايا البطانية البشرية وعابر فتح الحاجز الذي سيسمح بمرور الفيروس. هنا يتم تغيير المتوسطة 24 ساعة قبل البدء التجربة.
    2. T = 0, إضافة 3500 اللوحة تشكيل وحدات (بفو) من يفف-الهولندي المخفف في 50 ميليلتر من 2% FBS خلية غشائي المتوسطة بعناية شديدة على رأس المقصورة لومينال. يتم تلقيح تحكم BBB-مينيبرين مع 50 ميليلتر من 2% FBS خلية غشائي المتوسطة دون الفيروس. تحديد Peلي على رفيق جيد.
    3. احتضان BBB-مينيبرين في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    4. بعد 24 ساعة، إزالة جهاز عامل التصفية إدراج الثقافة غشاء البوليستر وتحديد PeLY، عينة 1 مل من حجرة أبلومينال وتيتراتي الفيروس كما هو موضح بألف دا كوستا وآخرون (2018)34. استبدال المتوسطة مع الطازجة 2% FBS غشائي الخلايا المتوسطة.
    5. احتضان BBB-مينيبرين في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    6. بعد 72 ساعة، عينة المتوسطة من حجرة أبلومينال وتيتراتي الفيروس، أو استخراج الجيش الملكي النيبالي من الخلايا مينيبراين لتحليل التعبير الجيني كما هو موضح بألف دا كوستا وآخرون (2018)34.
  2. تضخيم متغيرات تم من يفف-الهولندي على خلايا مينيبرين بمقاطع من المسلسل
    1. استخدام مينيبرين الخلايا المغلفة 12 لوحات جيدا (أي خطوات 4.1.6 و 4.1.7).
    2. الوقت أشر ح 0، إضافة 3,500 اللوحة تشكيل وحدات من يفف-الهولندي المخفف في 50 ميليلتر من 2% FBS خلية غشائي المتوسطة بعناية شديدة على رأس الخلايا (لومينال المقصورة).
    3. بعد ح 1، إزالة المتوسطة مع العدوى الفيروس واستبدال مع الطازجة 2% FBS غشائي الخلايا المتوسطة.
    4. بعد 48 ساعة، عينة من 500 ميليلتر من المتوسط الثقافة وتصيب الطازجة مينيبرين الخلايا
    5. بعد ح 120، عينة من 500 ميليلتر من المتوسط الثقافة وتصيب الطازجة مينيبرين الخلايا.
    6. بعد ح 192، حفظ الثقافة المتوسطة (= مخزون فيروس المخصب) واستخراج الجيش الملكي النيبالي من الخلايا مينيبرين لتحليل التعبير الجيني كما هو موضح بألف دا كوستا وآخرون (2018)34.

6-استخدام BBB-مينيبرين لدراسة عبور BBB والدماغ استهداف خلية بيوموليكولي

  1. النقل عبر BBB من خلية تستهدف بيوموليكولي
    1. استخدام مينيبرين-بي بي بي أعد كخطوة وصفت 4.1.7.
    2. في الوقت نقطة ح 0، إضافة بيوموليكولي (في المثال ينص في القسم نتيجة، أضيفت 58.75 نانوغرام/BBB من جزيئات نيوروتاج NV بيرمينت الخلية الواحدة BBB-مينيبرين إدراج.
    3. احتضان BBB-مينيبرين في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    4. بعد 24 ساعة، إزالة جهاز عامل التصفية إدراج الثقافة غشاء البوليستر وتحديد Peلي، ثم وصمة عار الخلايا مينيبراين على هنيورونس نيوروفيلامينت Nf200 والكشف عن وجود بيوموليكولي في مينيبراين (في المثال المتوفرة في النتيجة القسم، نيوروتاج NV تم الكشف عن استخدام جسم مضاد ضد بكتيريا العلامة أنه يحتوي على35،40).
  2. النقل عبر بي بي بي بيوموليكولي نيوروريجينيراتيفي والمقايسة محصن اللاحقة في مينيبراين بعد بيوموليكولي وقد عبرت بي بي بي
    1. استخدام مينيبرين-بي بي بي إعداد كما هو موضح في الخطوة 4.1.7.
      ملاحظة: لجزيئات تستهدف فقط من الخلايا العصبية، الخلايا مينيبراين يمكن الاستعاضة عن الخلايا العصبية فقط الخلايا (NT2-N)38.
    2. في الوقت نقطة ح 0، إضافة 58.75 نانوغرام/BBB-مينيبرين جيدا من الخلية بيرمينت NV جزيئات (النموذج النشط CPM-نيوروتاج-NV، النموذج غير نشط CPM-نيوروتاج-NVΔ) وصف جيم براد et al. (2014)35.
    3. احتضان BBB-مينيبرين في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    4. بعد ح 4، جعل الجروح الفردية مع إبرة حقن (26GX1/2 "، 12-4.5، تيرومو، بلجيكا) في الخلايا مينيبرين. جعل خدوش على الأقل 10 لكل فرد كذلك. تحديد Peلي على الرفيق جيد.
    5. احتضان BBB-مينيبرين في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    6. بعد ح 8، يستعاض عن المتوسط في حجرة أبلومينال بواسطة الخلايا غشائي كاملة جديدة.
      ملاحظة: من المهم استبدال المتوسطة في هذه الخطوة نظراً لإصابة الخلايا مينيبرين يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية، ومن ثم الإفراج عن المركبات السامة للخلايا.
    7. احتضان BBB-مينيبرين في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    8. بعد 48 ساعة، الملون الخلايا لتجديد إكسون هنيورونس كما هو موضح بجيم براد et al. (2013)40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BBB-مينيبرين سيلولو في تجريبية النموذجية لواجهة الدم في الدماغ.

يتم إعداد BBB-مينيبرين على نظام إدراج الثقافة غشاء البوليستر لتقليد حجرة دم في الطابق العلوي وحجرة الدماغ في الطابق السفلي من الواجهة الدم في الدماغ (الشكل 2 أ، ب). فإنه يتكون من حجرة لومينال مع خلايا البطانية هكميك/D3 على تصفية تشكيل بي بي بي ومقصورة أبلومينال، الذي يحتوي على مينيبرين البشرية الثلاثي-ثقافة خلايا المخ (الخلايا العصبية وخلايا microglial astrocytes). الخلايا مينيبرين يحمل ثقافة ثلاثي كلاسيكية مختلطة السكان النمط الظاهري (الشكل 1، اللوحة اليسرى السفلي) وعلامات صريحة محددة لكل نوع من الخلايا كما هو موضح دا كوستا ألف et al., 201834.

يسمح استخدام طبقة هكميك/D3 في BBB-مينيبرين الحصول على حاجزاً قويا مع Pe يعنيلي من 0.95e-03 سم/دقيقة، ويعني عبر البطانية الكهربائية المقاومة (طير) 51.89 Ω/سم2. تكون هذه القيم في نطاق القيم أفضل من أي وقت مضى ووصف27،خط خلايا بطانية بشرية41 في نظام من هذا القبيل غشاء بوليستر ثقافة إدراج (الشكل 2). هذه الخلايا عن علامات البروتين مفرق ضيق مثل زوي-1 وكادهيرين كما هو متوقع بالتحديد الكمي النفاذية (البيانات لا تظهر). كما يعربان عن جميع مجموعات فرعية من مستقبلات، efflux الناقلين أو الناقلين [مستقبلات: لدلر، مستقبلات بروتين دهني منخفض الكثافة؛ LRP1، مستقبلات بروتين دهني منخفض الكثافة المتعلقة بالبروتين 1؛ منصة، مستقبلات الأنسولين؛ قانون مباشرة الحقوق السياسية، مستقبلات اللبتين؛ لو، جزيء التصاق الخلايا القاعدية؛ التايلاندي، مستضد CD71؛ أجير، متقدمة glycosylation مستقبلات المنتج النهائي. الناقلين افلوكس: ABCB1 (ف-gp)؛ ABCG2 (بكرب)؛ ABCC1 (MRP1)؛ ABCC2 (MRP2)؛ ABCC4، ABCC4 البروتين؛ ABCC5، ABCC5 البروتين. النقل: STRA6، تحفزها الريتينويك الجينات حامض 6 بروتين؛ SLC2A1، اكتب نقل الجلوكوز 1؛ SLC7A5، كبيرة من الأحماض الأمينية محايدة الناقل 1؛ SLC1A1، الناقل ذائبة الأسرة 1 البروتين؛ SLC38A5، الناقل ذائبة الأسرة 38 الأعضاء 5 بروتين؛ SLC16A1، مونوكاربوكسيلاتي والنقل البروتين 1]، التي هي مفتاح البروتينات ذات الصلة لهذه الوظائف البيولوجية (الشكل 2D)21.

يسمح BBB-مينيبرين اختيار وتضخيم ووصف المتغيرات الفيروسية نيوروينفاسيفي نادرة من إعداد لقاح فيروس الحي.

وكان استخدام الجهاز الثقافة BBB-مينيبراين سيلولو في اختبار العزلة السماح والتضخيم من النادر نيوروينفاسيفي/نيوروفيرولينت المتغيرات يحتمل أن تكون موجودة في فيروسات الحمى الصفراء الفيروسية اللقاحات الحية (يفف)42. يفف هو فيروس الأحشاء استهداف الكبد التي لا كفاءة عبر بي بي بي. يستخدم الفيروس تم الفرنسية، والهولندية، كلقاح يفف يعيش حتى الثمانينات33،43. الهولندي وجد أن يسبب نيوروباثوجينيسيس ما بعد فاكسينال في الأطفال (0.3 إلى 0.4 في المائة بين طُعّموا) وهكذا قد توقف في عام 198233،43. ونحن كالهولندي هنا نموذجا أولياً للفيروس يلافن التي قد تحتوي على نسبة عالية من المتغيرات نيوروينفاسيفي/نيوروفيرولينت،من4244. تحضير فيروسات الهولندي (أي، 3500 بفو/ml) أضيف في حجرة لومينال من بي بي بي-مينيبرين، عنصر التحكم هو BBB-مينيبرين الذي كان مصاباً وهمية. وجود جزيئات الفيروس في حجرة لومينال لا يغير من نفاذية الجدار كقياس 24 ساعة في وقت لاحق حيث PeLY في الآبار الفيروسية لم يكن مختلفاً عن PeLy مراقبة الآبار (0.80 ± 0.09 x 10-3 سم/دقيقة والآبار 0.86 ± 0.09 x 10-3 سم/دقيقة ل PeLY في السيطرة ويفف-الهولندي على التوالي). تم تقييم محتوى المقصورة أبلومينال لوجود فيروس بمقايسة اللوحة، في 24 ساعة بعد الإصابة. وكانت الزنزانات مينيبرين يومين المحتضنة لتقييم تضخيم المتغيرات نيوروينفاسيفي في خلايا الدماغ ورصد التعبير الجيني كوصف على الكرتون هو موضح في الشكل 3 ألف.

أننا نكتشف بعض الفيروسات يفف-الهولندية، التي يمكن أن تعبر BBB في 24 ساعة (يعني 43 بفو/mL). الفيروسات تم تضخيمه لليومين القادمين من تكاثر الفيروس داخل خلايا المخ (يعني عيار 4.69 × 104 بفو/mL)، (الشكل 3B). من المذكرة، تحضير سلالة لقاح تسبب نيوروباثوجينيسيس فاكسينال بعد أن لا كفاءة عبر بي بي بي في هذا النظام كما أنها قد أثبتت دا كوستا ألف et al. (2018)34. وقد حددنا اثنين من المؤشرات الحيوية لتكاثر الفيروس: الانترفيرون حفزت الجينات 15 (ISG15) و 7 عامل تنظيمي انترفيرون (IRF7). التعبير عن هذه المؤشرات الحيوية هما حفز عندما كان متسلسل باساجيد هذا نيوروينفاسيفي السكان فيروسية في الخلايا مينيبرين (الشكل 3). كانت ترتبط هذه أوبريجوليشنز تقاس Q-RT-PCR صارما بالحمل الفيروسي (Pearson قيمة p 0.0016 ISG15 و 0.0260 ل IRF7).

يسمح BBB-مينيبرين كلا المعايرة على قدرة بيوموليكولي لاجتياز الحاجز وفي نفس الوقت اختبار ما إذا تمت المحافظة على الوظيفة بيوموليكولي بعد عبور BBB-

نيفادا هي بيوموليكولي المستمدة من فيروس داء الكلب الذي يمتلك خصائص مذهلة من نيوروبروتيكتيون ونيوروريجينيريشن40. وكان تنصهر هذه ببتيد صغير لا يعبر بطبيعة الحال غشاء الخلية ولا بي بي بي مع ألف ظهور قادرة على استهداف الخلايا العصبية. كان اختيارنا لاستخدام الجزء المتغير (فة) من جسم واحد في سلسلة من اللاما التي تعبر الأغشية البيولوجية بما في ذلك ال36،بي بي بي45 ونيوروتاج استهداف الخلايا العصبية على وجه التحديد. ترتبط NV فة و نيوروتاج، بناء ظهور-نيوروتاج-نيفادا (الشكل 4 أ) وفه فقط لبناء الاجتماع التحضيري للمؤتمر-NeuroTagΔ-NV تفتقر إلى نيوروتاج محددة مما يسمح استهداف الخلايا العصبية (الشكل 4 باء). بعد إضافة إلى حجرة لومينال، تعبر BBB CPM-نيوروتاج-نيفادا (النقاط الخضراء) وكان قادراً على استهداف الخلايا العصبية البشرية (باللون الأحمر) (الشكل 4، د). CPM-NeuroTagΔ-NV يعبر حاجز غشائي خلية (النقاط الخضراء)، لكن أهداف أقل كفاءة من الخلايا العصبية البشرية (أغلبية نقاط الخضراء الموجودة خارج الخلايا العصبية) (الشكل 4).

كما هو موضح أعلاه، ترتبط NV فة و نيوروتاج لتشييد CPM-نيوروتاج-NV. فعلنا نفس الشيء ل NVΔ شكل غير نشط NV تفتقر إلى الجزء النشط من نيفادا (CPM-نيوروتاج-NVΔ) (الشكل 5 ألف). بعد إضافة إلى حجرة لومينال، تعبر BBB CPM-نيوروتاج-NV وكان قادراً على إعادة إنشاء محاور عصبية من الخلايا العصبية البشرية بعد إصابة (الشكل 5B، اللوحة اليمنى)، على العكس من ذلك إلى ظهور-نيوروتاج-NV Δ الشكل غير نشط من نيفادا (الشكل 5B، غادر لوحة)40. هذه الخصائص كانت جزيئي في نوعين من البروتوكولات؛ أما في مرحلة ما قبل – تعرض (الشكل 5) أو في وظيفة بروتوكول تعرض (الشكل 5). عندما تطبق قبل إكسون الخدش (4 ح، H4)، مشغلات CPM-نيوروتاج-NV نيوروبروتيكتيون من الخلايا العصبية الجرحى وتجديد محواري بل على العكس موك تعامل الخلايا (أي، التحكم) أو الخلايا تعامل مع ظهور-نيوروتاج-NVΔ (يعني تجديد 91% و 12% إلى 10% على التوالي، الرقم 5). متى تم تطبيق بيوموليكولي بعد الآفات محواري (1 ساعة، H1، الرقم 5) بغية تقليد بروتوكول علاجية بعد تعرض، CPM-نيوروتاج-NV لا يزال قادراً على إعادة إنشاء محاور عصبية بل على العكس من ذوي شكل CPM-نيوروتاج-NV Δ، ( يعني التجدد 85 في المائة و 5.1 في المائة على التوالي) (الشكل 5).

Figure 1
رقم 1: نموذج "مينيبرين"- الجدول الزمني للثقافات NT2-n/A وكم/Cl5 (اللوحة العلوية). صور فوتوغرافية (أفرقة أقل) خط الخلية الأصلية (نتيرا/cl2. دال-1) في اللوحة اليسرى، نيوروسفيريس الزائفة التي تم الحصول عليها بعد العلاج ATRA في لوحة العلوي الأوسط، كم/Cl5، في تريكولتوري مينيبرين (كريستال فيوليت تلطيخ)، والفريق السفلي الأوسط في اللوحة اليسرى، الناتج من الخليط من NT2-n/A وكم/ الثقافات CL5. مقياس بار 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: نموذج BBB-مينيبرين. أ. الجدول الزمني للثقافات هكميك/D3 وصورة فوتوغرافية للجهاز BBB-مينيبرين: غشاء بوليستر ثقافة إدراج-مرشح بحاجز غشائي هكميك/D3 هو عقد مع فورسيب قبل لإدراجها في لبئر واحدة 12 خلية الآبار لوحة الثقافة. ب-الكرتون وصف الجهاز مع المقصورة لومينال (الدم) التي تحتوي على حاجز غشائي خلية وحجرة أبلومينال (الدماغ) تحتوي على خلايا مينيبرين (الخلايا العصبية البشرية وخلايا microglial astrocytes). ج. تدابير الممثل من بيرميبيليلتي BBB-مينيبرين بطير (أي، ترانسيندوثيليال المقاومة الكهربائية) على ثلاثة أجهزة أو النفاذية للي (أي بيأي) على خمسة عوامل التصفية. د-تحليل التعبير من-RT-PCR مستقبلات والناقلين افلوكس والناقلين في خلايا بطانية هكميك/D3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: نموذج مينيبرين بي بي بي يسمح تحديد المتغيرات نيوروينفاسيفي بين إعداد لقاح يفف حية. ألف الجدول الزمني للتجربة. ب-التحديد الكمي للفيروسات التي قد عبروا BBB باللوحة تشكيل وحدة (بفو) معايرة من الفيروسات الحية (كل نقطة تمثل تجربة إدراج الثقافة غشاء البوليستر واحدة). ج-تقاس قطعة تعبير الجيني ISG15 و IRF7 -RT-PCR كدالة لعدد الجسيمات الفيروسية في الحمل الفيروسي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: مينيبرين بي بي بي يسمح لاختبار خصائص بيوموليكولي نيوروريجينيراتيفي: استهداف محددة من الخلايا العصبية عندما يتم تنصهر NV إلى نيوروتاج. A-على أساس الرسوم المتحركة لألف ظهور نيفادا (CPM أي-نيوروتاج-NV) التي تحتوي على نيوروتاج محددة لاستهداف الخلايا العصبية على وجه التحديد. ب-على أساس الرسوم المتحركة لألف ظهور NV المحذوفة من نيوروتاج (أي، CPM-NeuroTagΔ-NV). ج-صور الفلورة الممثل للخلايا العصبية البشرية. مقياس بار 50 ميكرومتر. NF 200 باللون الأحمر، CPM-نيوروتاج-NV/CPM-NeuroTagΔ-نيفادا في نويات الخضراء، باللون الأزرق. د. يمكن أن تعبر BBB الجزيئات CPM-نيوروتاج-NV واستهداف الخلايا العصبية البشرية أكثر كفاءة من CPM-NeuroTagΔ-NV. تم عد الخلايا العصبية المصابة ومجموع السكان من الخلايا العصبية على ثلاث شرائح بعد إيمونولابيلينج. وتناظر مجموع الخلايا العصبية خلايا NF200 الإيجابية (باللون الأحمر). يتم عد الخلايا الحمراء أي المرتبطة بواحد أو أكثر من النقطة الخضراء (CPM-NV) كخلية إيجابية. اختبار t للطالب مزاوج اثنين الذيل * * *ف = 0.0002. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: مينيبرين بي بي بي يسمح لاختبار خصائص بيوموليكولي نيوروريجينيراتيفي: عبور BBB لا يغير من خصائص نيوروريجينيراتيفي NV. A-الكرتون لألف ظهور استناداً إلى نيفادا (أي، نيفادا-CPM) ونظيرتها ذوي (أي، CPM-NVΔ). ب-تجديد إكسون بظهور NV في في سيلولو الصفر مقايسة (اللوحة اليمنى). لا يمكن تحريك CPM-NVΔ إكسون التجدد (اللوحة اليمنى)، مقياس بار 100 جميكرومتر.. يمكن عبور الخلية البطانية CPM NV وتجديد محاور عصبية في الخلايا العصبية من BBB-مينيبرين عند تطبيق ح 4 قبل الآفة: مخطط (اللوحة العلوية) التجربة؛ (لوحة أقل) التحديد الكمي للتجديد. د. CPM-NV نشطة أيضا في علاجية البروتوكول عند تطبيقه بعد إصابة ح 1: مخطط (اللوحة العلوية) التجربة؛ (لوحة أقل) التحديد الكمي للتجديد. اختبار t للطالب مزاوج اثنين الذيل * * *ف < 0.0001. تم حساب التجديد من ثلاث تجارب (> الخلايا العصبية 800 عد) بعد تلطيخ الخلايا العصبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة قد دللنا على كيفية بناء سيلولو في الدم/الدماغ واجهة, BBB-مينيبرين، من خلال الجمع بين نموذج BBB وثقافة مختلطة الدماغ الخلايا الدماغية (مينيبرين) في مجموعة واحدة. وهذا النظام بيولوجيا ذات الصلة، من السهل إعداد والمجربون مدربة تدريبا جيدا في خلية ثقافة للتعامل.

أما بالنسبة لأي نموذج آخر في المختبر من بي بي بي، أن الحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها إذا تم تطبيق التحكم الشديد من ضيق الحاجز. وينبغي اختبار إدراج بعناية النفاذية وإدراج أي مع قيم النفاذية غير كافية (أي، PeLY أعلى من 1.2) يجب أن يتم تجاهل.

وينبغي اختبار عينات FBS بعناية لتحديد مجموعة التي لا تقم بتعطيل خصائص BBB. ويمكن إجراء نفس النصيحة بشأن المركبات المتوسطة في الفيروسات التي تضعف الجسيمات أو الجزيئات الحيوية. كما يوصي بإبقاء حجم تعليق بيوموليكولي أو الفيروسات، بغية عدم تغيير التكوين المتوسط لحجرة لومينال صغيرة بقدر الإمكان. التفريق بين ثقافة العصبية/astrocytes ثقافة الإنسان المشارك من نتيرا/CL2. D1 تكنولوجيا مجربة. وعلى النقيض من الخلايا العصبية البشرية التي يتم بعدها الانقسامية، astrocytes لا يزال تقسيم الخلايا. ويلاحظ أحياناً ارتفاع انتشار الخلايا أستروسيتيس. إذا حدث هذا، قد ثقافة مينيبرين لإهمالها. وكانت الزنزانات تشمي/Cl5 استخدمنا في المختبر فينوتيبيد لإثبات أنهم البشرية المنشأ (CCNT1الإنسان العاقل phenotyping). هناك خطر أن بعض الكثير كم المستخدمة في بعض المختبرات قد تكون من أصل الفأر (الجرذ النرويجي) كما ادعى بها غارسيا-ميسا Y. et al (2017)46. لذلك، من المستحسن للتحقق من منشأ خط الخلية كم/Cl5.

النظام ثلاثي-الثقافة البشرية مينيبرين بما في ذلك وظيفة الخلايا العصبية الانقسامية (تتميز أساسا)، أستروسيتيس، وخط خلية ميكروجليال، يحاكي بيئة دماغي مبسطة. لا يزال من الممكن تحسين هذا النظام. يمكن للمرء أن يتصور إضافة أوليجوديندروسيتيس إلى الثقافة بهدف الحصول على محاور عصبية ميليناتيد أو خلايا microglial الأولية. يمكن أيضا الاستعاضة عن مينيبرين ثقافة مختلطة من الخلايا الجذعية المشتقة من الإنسان19،،من2021. ومع ذلك، سوف يكون التفاوت بين مختلف الكثير من الخلايا أن يلم بعناية. ويمكن أيضا زيادة تعقيد BBB-مينيبرين بإضافة بيريسيتيس23. في أيدينا، تعرقلت هذا التحسن بسبب صعوبة الوصول الموثوق بها إلى بيريسيتيس أصل البشرية.

وقد أثبتنا بجدوى وفائدة هذا الطقم محاكاة واجهة الدم في الدماغ، ط) عزل جزيئات الفيروس نيوروينفاسيفي نادرة من عينة لقاح حمى الصفراء التي تطورت الملكية لدخول الدماغ عن طريق بي بي بي، والثاني). تضخيم هؤلاء السكان نيوروينفاسيفي الفرعية في مينيبرين الثلاثي-ثقافة محاكاة حمة الدماغ مبسطة. يمكن أن تكون التطبيقات المستقبلية لتوسيع نطاق مراقبة جودة اللقاحات الحية الأخرى مثل لقاح النكاف وتعزيز BBB-مينيبراين كوسيلة لدراسة الميزات الفوعة العصبية في المختبر.

وكان الدراسة التجريبية الثانية لإظهار أن مرشح المخدرات يمر عبر BBB وتصل إلى مينيبرين، دون أن يفقد خصائصه العصبية التجدد. ونحن مقتنعون اقتناعا راسخا بأن BBB-مينيبرين يمكن أن تتيح تقدما كبيرا في مجال الفرز قبل الجزيئات قبل إطلاق سراحهم للاختبارات الإكلينيكية. استخدام BBB-مينيبرين أن يسهل تنفيذ 3Rs تدابير تهدف إلى الحد من استخدام الحيوانات اختبار لفحوصات ريجليمينتاري والبحوث التجريبية.

تماما مع التطور المقبل في السيليكون النهج (طراز الكمبيوتر)، ونحن قريبا قادرة على تحديد المرشحين المخدرات مع وجود احتمال كبير لعبور BBB، وضع نموذج ثلاثي الأبعاد في سيلولو محاكاة الدم حمة العصبي واجهة سيكون عونا كبيرا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وكانت الملكية الفكرية للنظام براءات الاختراع المشار إليه في 32و 35 و 38.

Acknowledgments

هذه الدراسة وأيد بالمنح الداخلية من معهد باستور، بما في ذلك منحة إينسيتاتيفي (PTR 435) ومنحة قدمت "Contrat de مناصرة à la بحوث" سانوفي باستور لمعهد باستور. ) أ (دا كوستا وأيده منح شركة سانوفي-باستور وفلوريان باكا هو المستفيد منحة الدكتوراه المقدمة من ANRT (الرابطة الوطنية للبحوث وتكنولوجي de la). ونحن مدينون "العلاقات العامة" بيار أوليفييه كورو والدكتور ميلر فلورنسا لإجراء مناقشات مفيدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 well plates Corning 3336
5-fluoro-2’deoxyuridine Merck-Sigma Aldrich F0503
85mm Petri Dish Sarstedt 83-3902-500
Anti-Nf200 Merck-Sigma Aldrich N4142
β-mercapto-ethanol Merck-Sigma Aldrich M3148
CHME/Cl5 Unité de Neuroimmunologie Virale On request to Dr Lafon
CMC Calbiochem 217274
Cytosine β-D-arabinofuranoside Merck-Sigma Aldrich C1768
Dark 96 well plates Corning 3915
DMEM F12 Thermofisher Scientific 31330-038
DMSO Merck-Sigma Aldrich D2650
Endogro IV Millipore SCME004 endothelial cell medium
Ethanol Carlo Erba 529121
FBS Hyclone SV30015-04
Formaldehyde Merck-Sigma Aldrich 252549
GIEMSA RAL Diagnostic 320310
Goat-Anti Mouse Jackson Immuno Research 115-545-003
Goat-Anti Rabbit Thermofisher Scientific R37117
HBSS with Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14025-100
hCMEC/D3 Cedarlane CLU512
Hepes 1M Thermofisher Scientific 15630-070
Hoescht 33342 Merck-Sigma Aldrich 33263
Laminine Merck-Sigma Aldrich L6274
L-glutamin Thermofisher Scientific 25030-024
Lucifer Yellow Merck-Sigma Aldrich L0259
MEM 10X Thermofisher Scientific 21430
MEM 1X Thermofisher Scientific 42360
Ntera/Cl2D.1 ATCC CRL-1973
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714
PBS without Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14190
PBS-Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14040-091
Pen/Strep Eurobio CXXPES00-07
Poly-d-Lysine Merck-Sigma Aldrich P1149
Prolong Gold Thermofisher Scientific P36930
Qiashredder QIAGEN 79656
Rat Collagen I Cultrex 3443-100-01
Retinoic Acid All-Trans Merck-Sigma Aldrich R2625
RNA purification kit QIAGEN 74104
SDS Merck-Sigma Aldrich L4509
Sodium bicarbonate 5.6% Eurobio CXXBIC00-07
Sodium Pyruvate Thermofisher Scientific 11360
T75 Cell+ Flask Sarstedt 83-1813-302 Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells
Transwell Corning 3460 polyester porous membrane culture inserts
Trypsin-EDTA Merck-Sigma Aldrich T3924
Ultra Pure Water Thermofisher Scientific 10977-035
Uridine Merck-Sigma Aldrich U3750
Versene Thermofisher Scientific 15040-033 EDTA
YFV-FNV IP Dakar Vaccine vial

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
  7. Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
  8. Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
  9. Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
  10. Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
  11. Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
  12. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
  13. Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
  14. Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
  15. Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
  16. Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
  17. Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37 (2017).
  18. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  19. Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
  20. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  21. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  22. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  23. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  24. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
  25. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  26. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
  27. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  28. Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
  29. Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
  30. Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671 (2014).
  33. Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
  34. da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
  35. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Lafaye, P. , EP3191510A1 (2014).
  36. Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
  37. Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
  38. Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
  39. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  40. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Wolff, N., Khan, Z., Terrien, E., Sanderine, V. , EP20110306454 (2011).
  41. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  42. Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408 (2018).
  43. Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
  44. Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
  45. Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
  46. Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).

Tags

علم الأعصاب، العدد 146، بي بي بي-مينيبرين، في سيلولو نموذج، الخلايا البطانية البشرية هكميك/D3، Ntera/Cl2D.1، الخلايا العصبية البشرية، أستروسيتي البشرية، وخلايا microglial البشرية كم/Cl5
نموذج واجهة دماغ دم البشري لدراسة نقاط عبور الحاجز بمسببات الأمراض أو الأدوية وتفاعلاتها مع الدماغ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa,… More

da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa, F., Afonso, P., Ceccaldi, P. E., Lafaye, P., Lafon, M. A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain. J. Vis. Exp. (146), e59220, doi:10.3791/59220 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter