Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 描述了设置在纤维素 BBB (血脑屏障)-minibrain 聚酯多孔膜培养插入系统, 以评估生物分子或传染因子在人类 BBB 的运输和对邻近脑细胞的生理影响。
Abstract
早期筛选神经系统药物在一个相关和可靠的蜂窝 BBB 模型, 为他们的渗透和他们与障碍和脑实质的相互作用仍然是一个未得到满足的需求。为了填补这一空白, 我们设计了一个2D 在蜂窝模型, BBB-Minibrain, 通过结合聚酯多孔膜培养插入人类 BBB 模型与由人类脑细胞 (神经元, 星形胶质细胞和微胶质细胞) 形成的三培养形成的微型 Bbb 模型。BBB-Minibrain 允许我们测试神经保护药物候选物 (例如, Neurovita) 通过 BBB 的迁移情况, 以确定这种分子对神经元的特定靶向性, 并表明药物的神经保护性能在之后得到了保留药物已经越过了 BBB。我们还证明了 BBB-Minibrain 是一个有趣的模型, 用于检测病毒颗粒通过内皮细胞屏障的过程, 并监测微博病毒颗粒对微根病毒的感染。BBB-Minibrain 是一个可靠的系统, 易于处理的研究人员在细胞培养技术和预测脑细胞表型治疗或侮辱后。这种对纤维素检测的兴趣将是双重的: 一方面是在药物开发的早期引入了嘲讽步骤, 另一方面减少了动物试验的使用。
Introduction
大脑与全身循环分离, 这种结构是不可渗透的结构, 它限制了大脑实质与血液之间的交流, 称为血脑屏障 (BBB)。BBB 主要由大脑内皮细胞组成, 与星形胶质细胞、血管周围微胶质细胞和邻近脑实质的神经元动态相互作用。Bbb 的三大功能是创造和维持离子稳态的神经元功能, 为大脑提供营养, 并防止有毒伤害或病原体进入1, 2,这有助于维持大脑的稳态及其功能3。这个屏障是如此有效, 只有少数药物可以越过 bbb4,5。目前, 预测分子是否会通过 BBB 并扩散到大脑的现有方法包括对尸检材料的体外研究、MRI (磁共振成像) 或 PET (位置发射) 对人类志愿者大脑中的图像跟踪断层扫描) 或药物动力学和药物动力学在临床前研究动物 6,7,8。这些技术和模型有一些局限性, 如 pet 的分辨率有限, mri6,8的灵敏度较低, 难以量化的分子 (例如, 基于抗体的分子)穿透大脑7, 并为临床前研究他们的高成本和动物试验的手段。
最后一点很重要, 因为根据3R 的规定, (动物试验的替代、减少和细化) 监管部门要求研究人员紧急开发出科学上准确的动物替代品实验9,10,11,12,13, 14,15.
在过去的几十年里, 通过在滤膜上培养小鼠、大鼠、牛和猪等不同物种的内皮细胞, 提出了几种 bovine 体外模型。就人类物种而言, 原代细胞的稀缺和困难促使研究人员开发了基于永生脑内皮细胞或人类干细胞19,20的人类模型。 21岁这些屏障是适当的 BBB 体外代药, 只要它们表达内皮细胞标记, 紧密的连接标记, 外流转运, 溶质载体, 受体, 并对内皮刺激20的反应. 一些使用滤膜的 bbb 模型与内皮细胞和其他细胞类型 (即星形胶质细胞、神经元或周细胞22,23,24) 进行了检测。这些共培养的目的是利用星形胶质细胞分泌可溶性因子或过氧化物酶来增加 BBB 的物理特性。
然而, 这些模型都不包括脑实质, 以研究和预测药物候选人一旦通过障碍后的命运。因此, 我们的目标是建立一个蜂窝血大脑界面, BBB-Minibrain, 结合 bbb 模型和混合脑细胞的培养成一个单一的套件。BBB-Minibrain 使用的培养系统由插入多井细胞培养板井中的多孔过滤器组成。该过滤器涂有 hcmece/d3 细胞, 这是一种人类大脑内皮细胞系, 已被证明对 bbb 药物检测25、26、27非常可靠, 以形成 bbb。Minibrain 是一种共同分化的人类神经元和星形胶质细胞, 其来源来自 nterae/cl2 细胞系28、29与人类微胶质细胞系 chmey-cl530的比率与微胶质细胞与神经星形胶质细胞的大脑31的比率, 是在盘的底部培养良好的。
除了研究药物在 BBB 上的传播及其在实质中的命运外, 纤维素模型中的血脑界面可以成为解决病原体进入大脑 (神经入侵)、扩散到大脑 (神经性) 的有力工具以及它们对脑实质细胞的毒性 (神经毒力)。神经毒力和神经侵袭性研究将受益于纤维素模型中高效的开发, 并有利于取代动物模型。使用 bbb-minibrain 工具包 32, 我们展示了在法国神经质病毒黄热病毒株 (即 fnv-yfv33,34) 中积累的罕见病毒突变体的神经侵入型表型, 用于制备停止活 YFV 疫苗和神经生成和神经保护生物分子的通过称为神经免疫 (下称 NV 在手稿中)35。由于 NV 既不自然穿过细胞膜, 也不自然穿过 BBB, 因此 NV 与 Llama 单链抗体的可变部分 (VHH) 融合在一起, 该抗体穿过包括 BBB 在内的生物膜, 并起到细胞穿透分子 (CPM)36的作用。VHH 的 CPM 特性似乎取决于等电点和 VHH37 的长度.
在蜂窝测试中, 这应该可以在动物进行药代动力学和药效学分析之前对可能横穿 BBB 的分子进行分类, 最好同时进行, 以便能够预测它们在神经中的行为实质。该系统在生物学上相关, 易于由在 26、29、30、38受过良好培训的专业人员建立和处理。这种对纤维素检测的兴趣将有两个方面: 一方面降低临床前检测的成本, 另一方面减少动物试验的使用。
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Protocol
1. Ntera/CL2 的细胞培养工作。D1 准备有丝分裂后的 hNeurons 和 Hastrocyes (NT2-NNA) 的共培养
注: 这是微型的组成部分 (图 1)。
- 培育 nterasne2. d1
- 从液氮罐中取出一小瓶冷冻细胞。继续冰上。
- 在37°c 的水浴中快速解冻细胞。
- 将细胞转移到含有10毫升完整 DMEM F12 培养基的 15 mL 管中 (Dulbecco 的改良鹰介质: 营养混合物 F-12 培养基), 辅以10% 的胎牛血清 (FBS)、2 mM 谷氨酰胺、100 IU 青霉素和100微克链霉素 (即完整)DMEM F12 介质)。
- 在室温 (RT) 下, 以 200 x g 离心5分钟。将颗粒在全 DMEM F12 培养基中的2毫升中分离。
- 在聚苯乙烯 T75 组织培养瓶中转移, 并对含有13毫升完整 DMEM F12 培养基的敏感粘附细胞 (T75 Cell+) 进行特殊处理。
- 在孵化器中培养细胞, 保持在37°c、5% co 2 和 95% 的湿度, 直到90% 的融合 (即大约 5天)。每2-3天更换一次介质。
- 地下培养 nteras2. d1 和扩增
- 从烧瓶中取出介质。
- 用10毫升磷酸盐缓冲碱 (PBS) 冲洗细胞单层, 辅以 Ca2 +和 mg2 +。
- 用10毫升的 EDTA 溶液冲洗细胞单层 (保存在 RT)。
- 加入3毫升胰蛋白酶 edta 溶液 (0.05% 胰蛋白酶, 0.02% EDTA), 在 RT 孵育2分钟。
- 摇一摇烧瓶, 确保细胞与塑料表面分离。
- 加入10毫升的完整 DMEM F12 介质, 以灭活胰蛋白酶, 在15毫升的管和离心机中转移 5分钟, 在 200 x克的 rt。
- 将颗粒与10毫升的全介质分离, 并使用1毫升接种每个含有14毫升完整 DMEM F12 培养基的新烧瓶。
注: 每个分化都需要30T75 电池+烧瓶。 - 在37°c、5% CO2和95% 的湿度下将烧瓶孵化至90% 的汇合处。
- Nterax2. d1 在人神经元星形胶质细胞共培养中的鉴别
注: 这是迷你银行的主要组成部分。- 在第0天, 用步骤1.2 中描述的胰蛋白酶 edta 分离细胞, 用2毫升完整的 DMEM F12 培养基分离每个烧瓶的细胞颗粒。
- 在直径85毫米的60个塑料培养皿中加入1毫升的细胞悬浮液 (相当于 5 x 10 6 细胞), 其中含有11毫升的完整 Dmem f12 介质。
注: 细胞不会附着在塑料上, 并聚集在一起形成假神经球 (参见图1下面板中的照片)。在37°c、5% CO2和95% 湿度下培养 60个 petri 培养皿一天。 - 在第1天, 加入1毫升的完整 DMEM F12 培养基, 每个 Petri 培养皿中加入130μm 的全反式维甲酸 (ATRA) (最终浓度 ATRA 10 微米), 并将盘中的盘送回37°c、5% co2和95% 湿度为24小时。
- 第2天, 非常小心地将每个 Petri 盘的细胞球体的培养基转移到 50 mL 管中, 离心机 10分钟, 50 x g和 rt. 小心地将松散的颗粒与 Dmem 完全 f12 培养基的13毫升分离, 并添加 10Μm atra 并添加e 13 毫升在一个新的85毫米直径 Petri 盘。
注: 在不同的通道中, 将球体密度保持在第2天获得的密度 (即密度为70% 左右) 是极其重要的。因此, 如果球体密度降低, 根据细胞数量减少培养皿的总数。 - 在第4天、第6天和第8天重复上述过程 (步骤 1.3.4)。
- 在第10天, 重复上述过程, 但将球体添加到 T75 Cell+瓶中, 而不是 petri 培养皿中。将一个培养皿中的细胞添加到一个 T75 细胞+烧瓶中。
- 在第11天、第13天、第15天和第17天, 用14毫升的完整 DMEM F12 改变使用的介质, 辅以 10Μm atra。
- 在第19天, 更换培养基与14毫升的完整 DMEM F12 介质没有 ATRA 每个烧瓶。
- 在第20天, 用胰蛋白酶/edta 轻轻分离细胞, 如下所示。
- 对于每个 T75 细胞+烧瓶, 用10毫升的 pbs 冲洗细胞, 辅以 ca2 +和 mg2 +;在 RT 用4毫升 EDTA 孵育细胞5分钟。
- 小心取出 EDTA, 加入2毫升的胰蛋白酶 edta, 在 RT 孵育 7分钟, 轻轻摇晃烧瓶, 小心加入8毫升的完整 DMEM F12 介质。
- 在 160 x g和 rt 中离心 10分钟, 将细胞颗粒分离在 Dmem f12 培养基的13毫升中, 并在 t75 电池 + 烧瓶中转移。
注: 与胰蛋白酶 edta 非常温和的离解将允许恢复 ATRA 分化细胞从原来的畸胎癌细胞, 这是强烈连接到塑料制品。
- 在第21天, 取出培养基和死细胞。加入14毫升的完整 DMEM F12 培养基, 辅以5% 的 FBS、2 mM 谷氨酰胺、100 Iu 青霉素、100微克链霉素和0.5Μm 的 Aroc (胞嘧啶β-d-阿拉伯不氟酮) (完整 5% FBS FEM F12-arac)。
- 在第23、25和28天, 将使用过的介质替换为14毫升的 5% fbs DMEM F12-arac。
- 在第29天至 49天 (每两天), 用14毫升的完整 DMEM F12 培养基取代使用过的培养基, 补充5% 的胎儿牛血清, 2 mM 谷氨酰胺、100 iu 青霉素、100微克链霉素、5Μm fudr (5-fluoro-2 ' 脱氧尿嘧啶) 和 10μm Urd (Uridine) (完全 5%)FBS DMEM F12-fudr-urd)。
- 在第50天, 用14毫升的完整 DMEM F12 培养基替换使用过的培养基, 补充5% 的 FBS、2 m 谷氨酰胺、100 Iu 青霉素、100微克链霉素和 10μm Urd (完整 5% FBS Dmem F12-urd)。
- 在第51天至第95天 (每周两次), 用14毫升的完整 FBS DMEM F12-urd 替换使用过的介质。
注: 单元格可用于第51天的实验, 但不得晚于第95天。使用有丝分裂抑制剂的连续治疗, 可以恢复有丝分裂后 hNeuron 和 Hastrocyes (NT2-N/A) 的纯共培养群体。 - 要给细胞播种, 请按照第20天的描述, 进行温和的胰蛋白酶化。
2. 人微胶质细胞 Chmee/cl5 的细胞培养工作
注: 这是微型的微胶质成分(图 1).
- 人微胶质细胞 Chmee/cl5 的培养
- 从液氮罐中取出一小瓶冷冻细胞。继续冰上。
- 在37°c 的水浴中快速解冻。
- 将细胞转移到含有10毫升完整 DMEM F12 培养基的 15 mL 管中, 辅以5% 的胎牛血清、2 mM 谷氨酰胺、100 Iu 青霉素和100微克链霉素 (即完全 5% FBS DMEM F12 培养基)。
- 在 rt 以 200 x克离心 5分钟, 将颗粒与2毫升的颗粒分离, 该颗粒具有2毫升的完整 5% Fbs Dmem f12 介质。
- 在 T75 细胞+烧瓶中转移, 含有13毫升的完整 5% FBS DMEM f12 培养基。
- 在37°c、5% CO2和95% 湿度下培养细胞, 直到90% 融合。每2-3天更换一次介质。
- 人微胶质细胞的亚培养
- 从烧瓶中取出介质。
- 用10毫升的 PBS 冲洗细胞单层, 再加上 Ca2 +和 mL2 +。
- 用10毫升的 EDTA 溶液冲洗细胞单层 (保存在 RT)。
- 加入3毫升的胰蛋白酶-edta 溶液, 在 RT 孵育2分钟。
- 摇一摇烧瓶, 确保细胞与塑料表面分离。
- 加入10毫升的完整的 5% FBS DMEM F12 介质, 以灭活胰蛋白酶, 转移在15毫升管和离心机5分钟在 200 x g 和rt。
- 将颗粒与10毫升的完全培养基分离, 并使用1毫升接种每个新的烧瓶, 其中含有14毫升的完整 5% FBS DMEM F12 培养基。
- 在37°c、5% CO2和95% 的湿度下将烧瓶孵化至90% 的汇合处。
3. 与 Hcmec/d3 一起进行培养, 对多孔刀片进行涂装, 制备 BBB
- 人内皮细胞的培养 (图 2)
- 用纯净水 (细胞培养等级) 稀释 i 型大鼠胶原蛋白至 1:30。
- 将 10 mL 转移到 T75 细胞+烧瓶中, 在37°c、5% co2和95% 湿度孵化器中孵育2小时。
- 去除胶原蛋白溶液, 代之以15毫升的内皮细胞培养基, 辅以 10 ML 的 HEPES (称为完整的内皮细胞培养基)。
- 从液氮罐中取出一个小瓶。继续冰上。
注: 细胞生长, 并作出了种子地段, 如制造商所述。细胞系受生物材料转移协议的管辖。这些细胞是在第25通道获得的, 不应超过第35段。 - 在37°c 的水浴中快速解冻。
- 转移 T75 电池+烧瓶中的电池, 并在37°c、5% co2和95% 湿度下返回烧瓶, 工作2至4小时。
- 小心取出介质, 而不会丢失或取出细胞。用10毫升的完整内皮细胞培养基冲洗细胞一次。
- 加入15毫升的完整内皮细胞培养基。
- 在37°c、5% CO2和95% 的湿度下培养细胞, 直到100% 融合 (不少于 4天), 而无需改变培养基。
- 植入 hCMEC/D3 以准备 BBB 的插入物
- 涂上新的 T75 细胞+烧瓶或插入类型 i 鼠胶原蛋白如上所述 (步骤 3.1)。
- 从烧瓶中取出介质。用10毫升的 PBS 冲洗细胞单层, 再加上 Ca2 +和 mL2 +。
- 加入2毫升色氨酸 edta 溶液, 在37°c 孵育5分钟。
- 摇一摇烧瓶, 确保电池与塑料表面完全分离。
- 加入4毫升完整的内皮细胞培养基来灭活胰蛋白酶。
- 使用5毫升塑料移液器, 通过吸气和冲洗细胞悬浮液, 同时将5毫升移液器保持在烧瓶底部至少 5次, 从而机械地分离细胞。
- 计数细胞, 并使用 5 x10 4 细胞插入12井聚酯膜培养插入插入和 2 x 10 6 细胞 t75细胞+ 烧瓶.也准备三个过滤器没有细胞的 peLoy (即, 内皮细胞渗透性到路西法黄色见下文第4.2 段) 与聚酯膜培养插入实验。
- 将烧瓶或刀片在37°c、5% CO 2 和95% 湿度下 , 直到100% 融合。
- 在新的通道之前, 不要更改 T75 细胞+烧瓶的介质。相反, 对于聚酯膜培养插入物的 BBB: 第2天和第4天更换介质, 第6天使用 BBB 进行实验。
4. BBB-Minibrain 的建造和质量控制 (图 2)
- 设置 bbb-米尼布兰聚酯膜培养插入装置 (图 2B)
- 在12口聚酯膜培养物中, 在内皮细胞培养基上插入过滤器 6天, 然后将其用于实验。
- 涂上12孔板, 配上聚 d-赖氨酸 (1 Ml/well, 10μgl, 4小时在 RT), 然后层压 (1 Ml/well, 1μgml, 隔夜在 RT)。
- 去除层压蛋白, 加入1毫升的内皮细胞培养基, 辅以5% 的 FBS (5% 的内皮细胞培养基)。
- 在37°c、5% CO2和95% 湿度下孵化1小时。
- 轻轻胰蛋白酶化 NT2-N/A (如步骤1.3.9 所述) 和 Chmeme-cl5 (如步骤2.2 中所述), 并用完整的内皮细胞培养基分离细胞颗粒。
- 计数细胞, 混合 3.6x 10 5 nt2-na 和 0.4 x 105 chmescl5 cells"井和种子12井板。
- 在 Teca 24小时 (播种后 24小时): 用新鲜的完整内皮细胞培养基 (微型细胞和内皮细胞) 改变使用的培养基, 并将 hcmaccmcs3 聚酯膜培养物插入微细胞顶部。在37°c、5% CO2和95% 湿度下培养 bbb-minibrain。
注: BBB-Minibrain 将由一层人内皮细胞 Hcmecce/d3 在过滤隔离腔室 (或 "血液" 隔间) 和混合培养的人体细胞 Hnt2-nse-nace/cl5 (Minibrain) 在井的底部(图 2b)。
- 验证 BBB-Minibrain 的内皮通透性 (质量控制) (图 2c)
- 准备运输缓冲液 (TB), 这是 HBSS (Hanks 的平衡盐溶液) 缓冲液与 ca 2+和 mg2 +补充 10 mm Hepes 和 1 mm 丙酮酸钠。
- 准备12个井板, 每个井有1.5 毫升的运输缓冲器。
- 在 T = 0时, 制作新鲜的运输缓冲液, 辅以50μm 的 Lubyfer 黄 (LY-TB)。
- 倒置每个过滤器, 在不影响内皮细胞屏障的情况下小心去除培养基。
- 将滤清器放在填充的12个井板上, 加入 0.5 mL 的 LY-TB。
- 在37°C、5% co2和95% 湿度的孵化器中孵育板材。
- 在 Tcis 10分钟内转移新结核病上的过滤器填充了12个井板, 并保留第一板的烧孔隔间进行 OD 读数。
- 在 T = 25分钟时, 重复步骤4.2.7。
- 在 T = 45分钟时, 通过从板材上卸下过滤器来停止传输。保持消融和腔隔间 od 措施。
- 在一个黑暗的96孔板转移样品: 10μl 与 190μl tb 为 LY-TB 和腔隔间, 200μl 样品为烧蚀隔间。
- 在不同样品中存在的 LY-TB 的荧光测量, 分别位于 428 nm 535 nm (激发和发射长度波) 上。
- 根据 Siflinger-Birnboim, a 等人 (1987) 39 和 da Costa, a 等人 (2018年)34 , 使用该公式计算内皮通透性 (pe):
(nppsst)-(nnpsf) 和 Pe ly =psese。
注: PSf 是无细胞过滤器的通透性, PSt 是具有细胞的过滤器的渗透性, PSe 是内皮渗透性时间单层表面的, S 是单层表面 (为12井滤清器的表面, 为1.12 厘米 2), 在 cm/min 中表示.对于 hCMEC/D3, Pely应在0.7 到 1.2 x 10-3 cmmin 之间, 这主要取决于实验中使用的 fbs。重要提示: 高于1.2 的pe ly 意味着 BBB 不够紧, 并且可以观察到一些泄漏。放弃这些障碍。
5. 使用 bbb-微型病毒来突出黄热病病毒疫苗样本、法国神经热带病毒 YFV-FNV 34中存在神经侵入性病毒颗粒的情况 (图 3)
- 迷你鱼中黄热病病毒的 BBB 杂交和繁殖
- 使用按照步骤 4.1.7 24小时前添加病毒时准备的 BBB-Minibrain;用2% 的 FBS 内皮细胞培养基取代培养基。
注: 在添加病毒之前, 避免更改介质是非常重要的。改变培养基可以激活人的内皮细胞, 并短暂打开屏障, 这将允许病毒的通过。在开始实验之前, 介质在这里被改变24小时。 - 在 T = 0时, 在腔室顶部非常小心地加入 3500 YFV-FNV 的斑块成型单元 (PFU), 在50μl 的 2% FBS 内皮细胞培养基中稀释。对照 BBB-Minibrain 接种50μl 的 2% FBS 内皮细胞培养基, 无病毒。在伴侣身上确定ly 的方法。
- 在37°c、5% CO2和95% 湿度的孵化器中孵育 BBB-Minibrain。
- 24小时后, 取出聚酯膜培养物插入过滤装置, 并确定 Pely, 样品1毫升从烧蚀室和滴定病毒所述的 a. da costa 等人 (2018)34。将培养基替换为新鲜的 2% FBS 内皮细胞培养基。
- 在37°c、5% CO2和95% 湿度下培养 bbb-minibrain。
- 72小时后, 从烧蚀室中取样, 并对病毒进行滴定, 或者从 Minibrain 细胞中提取 RNA, 以便进行 a. da Costa 等人 (2018年)34所述的基因表达分析。
- 使用按照步骤 4.1.7 24小时前添加病毒时准备的 BBB-Minibrain;用2% 的 FBS 内皮细胞培养基取代培养基。
- YFV-FNV 的神经热带变异在微型细胞上的连续通道扩增
- 使用 Minibrain 细胞涂覆12个井板 (即步骤4.1.6 和 4.1.7)。
- 在时间点0小时, 在细胞顶部 (腔室) 非常小心地加入 3, 500个 YFV-FNV 的斑块成型单元, 在50μl 的 2% FBS 内皮细胞培养基中稀释。
- 1小时后, 用接种病毒去除培养基, 代之以新鲜的 2% FBS 内皮细胞培养基。
- 48小时后, 对培养基进行500μl 的采样, 并感染新鲜的微型细胞
- 在120小时后, 对培养基进行500Μl 的采样, 并感染新鲜的微型细胞。
- 在192小时后, 保存培养基 (= 丰富的病毒存量), 并从 Minibrain 细胞中提取 RNA 进行基因表达分析, 如 A. da Costa 等人 (2018年)34所述。
6. 利用 BBB-Minibrain 研究生物分子的 BBB 交叉和脑细胞靶向
- 针对生物分子的神经元在 BBB 上的迁移
- 使用按照描述的步骤4.1.7 准备的微型 bbb。
- 在时间点 0时, 添加生物分子 (在结果部分提供的例子中, 每个 BBB-Minibrain 插入物中添加了 58. 75 Ng/BBB 的细胞蠕动的神经 Tag-nv 分子。
- 在37°c、5% CO2和95% 湿度下培养 bbb-minibrain。
- 24小时后, 取出聚酯膜培养物插入过滤装置, 确定 Pe ly,然后染色 hneurons 神经纤维 Nf200 的 minibrain 细胞, 并检测微叶中生物分子的存在 (在结果中提供的示例中部分, 神经 tag-nv 是使用一种抗体检测到的, 该抗体中含有35,40)。
- 在微叶肌中, 神经生成性生物分子的 BBB 的迁移和随后的神经保护检测。
- 使用步骤4.1.7 中描述的准备的微型 bbb。
注: 对于仅针对神经元的分子, 只能用神经元细胞 (NT2-N) 替换微型细胞. - 在时间点 0时, 添加 c. prehaud 等人 (2014年) 描述的细胞 PEM-NERCLAG-NV 分子 (活性形式 Cpm-neritch-nv, 非活性形式 Cpm-neritag-nve) 的强分子.
- 在37°c、5% CO2和95% 湿度的孵化器中孵育 BBB-Minibrain。
- 4小时后, 用注射针 (26GX1/2 英寸, 12-4.5, 比利时特鲁莫) 在微型细胞上进行个别伤口。在每个井上至少做10个划痕。确定在伴侣井上的 ly。
- 在37°c、5% CO2和95% 湿度的孵化器中孵育 BBB-Minibrain。
- 8小时后, 用新鲜完整的内皮细胞培养基取代烧蚀室中的培养基。
注: 在这一步更换培养基很重要, 因为 Minibrain 细胞的损伤会导致细胞死亡, 然后释放细胞毒性化合物。 - 在37°c、5% CO2和95% 湿度的孵化器中孵育 BBB-Minibrain。
- 48小时后, 对细胞进行染色, 以便 hNeurons 的轴突再生, 如 c. Prehaud 等人 (2013年)所述。
- 使用步骤4.1.7 中描述的准备的微型 bbb。
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Representative Results
BBB-Minibrain 是血脑界面的蜂窝实验模型。
BBB-Minibrain 设置在聚酯膜培养插入系统上, 以模拟上层的血室和血脑界面下层的大脑隔间 (图 2a, b)。它由一个腔隔间与 hCMEC/D3 内皮细胞在过滤器形成 BBB 和一个腔室, 其中包含微型人类三培养的脑细胞 (神经元, 星形细胞和微胶质细胞)。Minibrain 细胞表现出经典的三培养混合种群表型 (图 1, 右下角面板), 并表达了每种细胞的特定标记, 如 Da costa a. 等人所示, 2018年34。
在 BBB-Minibrain 中使用 Hcmece/d3 层可以获得一个强屏障,平均 pe ly 为 0.95 e-03 cm\ min, 平均跨内皮电阻 (teer) 为51.89 ω/厘米。这些值在这样的聚酯膜培养插入系统中所描述的人类内皮细胞系27,41的最佳值范围内 (图 2c)。这些细胞表达紧密连接蛋白标记, 如 ZO-1 和钙粘蛋白的渗透率定量预期 (数据未显示)。它们还表达受体的所有亚群, 流出转运体或转运体 [受体: LDLR, 低密度脂蛋白受体;LRP1, 低密度脂蛋白受体相关蛋白 1;INSR, 胰岛素受体;LEPTIN, 瘦素受体;LU, 基底细胞粘附分子;TFRC, CD71 抗原;先进的糖基化终产物受体。埃夫鲁克斯运输机: ABCB1 (P-g p);ABCG2 (BCRP);ABC1 (MRP1);ABC2 (MRP2);ABC4, ABCC4 蛋白;ABCC5, ABCC5 蛋白。转运体: STRA6, 受维甲酸基因6蛋白刺激;SLC2A1 型葡萄糖转运体 1;SLC7A5, 大中性氨基酸转运体 1;SLC1A1, 溶质载体家族1蛋白;SLC38A5, 溶质载体系列38成员5蛋白;SLC16A1, 单链虫转运蛋白 1], 是其生物功能的关键相关蛋白 (图 2d)21。
BBB-Minibrain 允许从活病毒疫苗制剂中选择、放大和表征罕见的神经入侵病毒变种。
BBB-Minibrain 培养装置被用作纤维素试验, 允许分离和扩增黄色热病毒 (YFV) 病毒活疫苗42中可能存在的罕见神经创磁/神经毒性变异。YFV 是一种针对肝脏的内脏病毒, 不能有效地越过 BBB。法国神经性病毒 fnv 一直被用作活的 yfv 疫苗, 直到 20世纪80年代33,43。Fnv 被发现导致儿童接种后神经发病机制 (疫苗中 0.3% 至 0.4%), 因此于1982年停药 33,43。我们在这里使用 fnv 作为 yf 病毒的原型, 它可能包含一个很高比例的神经侵袭性/神经毒性变种 42,44.在一个 Bb-minibrain 的腔隔间中添加了一种 FNV 病毒制剂 (即 3500 pusml), 该控制是一种模拟感染的 bbb-微型杆菌。病毒颗粒在腔室中的存在不会改变24小时后测量的屏障渗透性, 因为病毒井中的 Pe ly 与控制井的 Pely 没有区别 (0.80±0.09 x10-3 厘米/min )分别为在对照中的 Pe ly和 YFV-FNV 井中使用 0.86±0.09 x 10-3 cmcmmin)。在感染后24小时进行斑块分析, 评估了烧孔室的感染物的含量。Minibrain 细胞被孵育了两天, 以评估脑细胞中神经浸润变异体的扩增, 并监测图 3a 所示的漫画中所述的基因表达。
我们检测到一些 YFV-FNV 病毒, 这些病毒可以在 24小时 (即 43 puuml) 时穿过 BBB。这些病毒在接下来的两天里被扩增, 因为病毒在脑细胞内的增殖 (平均滴度为 4.69 x10 4 Puum\ (图 3b)。值得注意的是, 正如 da Costa a. 等人 (2018年) 34 所表明的那样, 不引起疫苗后神经发病机制的疫苗菌株制剂不会有效地越过该系统中的 BBB.我们确定了病毒增殖的两个生物标志物: 干扰素刺激基因 15 (ISG15) 和干扰素监管因子 7 (IRF7)。当这种神经入侵病毒群在 Minibrain 细胞上连续传递时, 这两个生物标志物的表达受到了刺激 (图 3C)。用 Q-RT-PCR 测量的这些隆起与病毒载量严格相关 ( Isg15的 pearson p 值为 0.0016, irf7为 0.0260)。
Bbb-minibrain 允许既分析了生物分子通过屏障的能力, 又同时测试了 BBB 交叉后生物分子功能是否得以保留.
NV 是一种来源于狂犬病毒的生物分子, 具有惊人的神经保护和神经再生特性.这种既不自然穿过细胞膜也不自然地与 BBB 交叉的小多肽与能够瞄准神经元的 CPM 融合在一起。我们的选择是使用 llama 单链抗体的可变部分 (vhh), 该抗体穿过生物膜, 包括 bbb36、45 和专门针对神经元的神经标签。NV 与 VHH 和神经标签相连, 构建一个 Cpm-neretateg-nv (图 4a) 和 VHH, 只是为了构建一个 Cpm-neretateghi-nv, 而缺乏特定的神经标记, 允许以神经元为目标 (图 4A)。在被添加到腔室后, Cpm-神经-神经 Tag-nv (绿点) 穿过 BBB, 能够瞄准人类神经元 (红色) (图 4C, d)。Cpm-神经黑格格-nv 穿过内皮细胞屏障 (绿点), 但目标效率较低的是人类神经元 (大多数绿点位于神经元之外) (图 4d)。
如上所述, NV 与 VHH 和神经标签连接, 以构建一个 Cpm-neretateg-nv。我们对 NV
图 1: minibrain 模型.NT2-NP/和 chmemescl5 培养物的时间表 (上板)。原始细胞系 (Ntera/cl2) 的照片 (下面板)。D1) 在左侧面板中, 在中间上部面板的 ATRA 治疗后获得的假神经球, CHME/Cl5, 在中间的下板和微型小学结构 (Cristal Violet 染色), 在右侧面板中, 导致 NT2-N传递和 CHME/A 的混合物CL5 区域性。刻度栏 100μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: bbb-minibrain 模型。A. hCMEC/D3 培养物的时间表和 bbb-minibrain 装置的照片: 在插入12口井细胞培养板的一口井之前, 用强制器固定有 Hcmec/d1/3 内皮屏障的聚酯膜培养物插入过滤器。B. 用含有内皮细胞屏障的腔 (血) 室和含有微型细胞的腔 (大脑) 室 (人神经元、星形胶质细胞和微胶质细胞) 描述该装置的动画片。C. 在三个器件上对 bbb-微管渗透性 (即, 经电内皮电阻) 的代表性措施, 或在五个过滤器上对 ly (即pely) 的渗透性的代表性措施。D. 受体、外排转运体和转运体对内皮细胞 hcmec/d3 的表达分析。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: bbb-minibrain 模型允许识别活的 YFV 疫苗制剂中的神经侵入性变异。A.实验时间表。B. 通过活体病毒的斑块形成单元 (pfu) 滴定法对穿越 bbb 的病毒进行量化 (每个点代表一个聚酯膜培养插入实验)。用q-RT-PCR 测量的Isg15和irf7基因表达图与病毒载量中的病毒颗粒数量的函数有关。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: bbb-微型生物可以测试神经生成的生物分子特性: 当 NV 与神经标签融合时, 神经元的特定靶向。A. 基于 CPM 的 nv (即 Cpm-neretat-nv) 的卡通, 包含专门针对神经元的特定神经标记。B. 基于 CPM 的 nv 的动画片删除了神经标签 (即, Cpm-neretath-nv)。C. 人类神经元的代表性免疫荧光照片。标度棒 50μm. NF 200 为红色, Cpm-nvcpm-nvcpm-nclagmm 为绿色, 细胞核为蓝色。D. Cpm-神经 Tag-nv 分子比 Cpm-神经-神经 tagtag-nv 更有效地穿过 bbb 并瞄准人类神经元。免疫标记后, 将受感染的神经元和神经元总数计算为三段滑块。总神经元对应于 NF200 阳性细胞 (红色)。与一个或多个绿点 (CPM-NV) 相关的任何红细胞都被视为正神经元。未配对学生的 t 测试两个尾 * ** p= 0.0002。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: BBB-Minibrain 允许测试神经生成的生物分子特性: BBB 交叉不会改变 NV 的神经再生特性。A. 基于 CPM 的 nv (即 cpm-nv) 和其残疾对应方 (即 CPM-NV
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Discussion
在这篇文章中, 我们演示了如何建立一个在蜂窝血/大脑界面, BBB-Minibrain, 结合 bbb 模型和混合脑细胞 (Minibrain) 的培养成一个单一的套件。该系统在生物学上是相关的, 易于建立和处理的实验者在细胞培养方面受过良好的训练。
对于 BBB 的任何其他体外模型, 如果对屏障的密封性进行严格控制, 都能获得可靠的结果。应仔细测试插入物的渗透率, 并应丢弃任何渗透率值不足的刀片 (即, 高于1.2 的 Pely )。
应仔细测试 FBS 样品, 以确定不禁用 BBB 特性的批次。对于病毒颗粒或生物分子被稀释的车辆介质, 也可以提出同样的建议。还建议保持尽可能小的生物分子或病毒悬浮液的体积, 以不改变流腔隔间的介质组成。人共培养神经元培养与 Ntera/cl2 的分化。D1 是一项久经考验的技术。与有丝分裂后的人类神经元不同, 星形胶质细胞仍在分裂细胞。有时观察到星形胶质细胞的高增殖。如果出现这种情况, 米尼布林文化就必须放弃。我们在实验室中使用的 chme变 cl5 细胞进行了表型, 以证明它们是人类的起源 (智人ccnt1 表型)。根据 Garcia-Mesa Y. 等人 (2017年) 46 的说法, 一些实验室使用的一些 CHME 批次可能来自老鼠 (诺维古西斯角鼠).因此, 建议检查 Chme-cl5 细胞系的来源。
包括有丝分裂后神经元 (主要是多巴胺能)、星形胶质细胞和微胶质细胞系在内的微型人类三培养系统模仿了简化的大脑环境。这个系统还是可以改进的。人们可以想象在培养中添加少突胶质细胞的目的是获得髓鞘轴突或原代微胶质细胞。迷你也可以用人类干细胞的混合培养 19、20、2 1 取代。然而, 不同数量的细胞之间的可变性将必须仔细掌握。BBB-Minibrain 的复杂性也可以通过添加果皮23来提高。在我们手中, 由于难以可靠地获得人类的, 这种改善受到阻碍。
我们已经证明了这个试剂盒的可行性和有用性, 它模仿血脑界面, i) 从黄热疫苗样本中分离出罕见的神经侵入性病毒颗粒, 这些病毒颗粒已经进化出通过 BBB 进入大脑的特性, 并且 ii)在米尼布雨三种培养中, 模仿简化的脑实质, 放大这些神经侵入性亚群。今后的应用可以是扩大对腮腺炎疫苗等其他活疫苗的质量控制, 并促进 BBB-Minibrain 作为体外研究神经毒力特征的手段。
第二项试点研究是为了表明, 一名候选药物通过 BBB, 到达 Minibrain, 同时不失去其神经再生特性。我们坚信, BBB-Minibrain 可以让分子的预处理取得重大进展, 然后再将其释放到临床前试验。使用 BBB-Minibrain 应有助于实施3Rs 措施, 以减少在补充试验和实验研究中使用动物试验。
加上硅胶方法 (计算机模型 ) 的下一个发展, 我们很快就能识别出具有很高概率穿越 BBB 的候选药物, 开发一个在蜂窝中模仿神经实质血液的三维模型界面将是很大的帮助。
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Disclosures
该系统的知识产权是32、 35和38项中提到的专利。
Acknowledgments
这项研究得到了巴斯德研究所内部赠款的支持, 包括一项煽动赠款 (PTR 435) 和赛诺菲巴斯德向巴斯德研究所提供的 "Contrat de Soutien la Recherche" 赠款。A. da Costa 得到 Sanofi-Pasteur 赠款的支持, Florian Bakoa 接受了国家研究和技术协会提供的博士赠款。我们感谢 Pr Pierre-Olivier Couraud 博士和 Florence miller 博士进行了有益的讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well plates | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
| Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
| Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
| Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
| Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |
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