Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59220
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 3, 1
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS
* These authors contributed equally

Summary

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll beschreibt die Einstellung einer in Cellulo BBB (Blut-Hirn-Schranke)-Minibrain aus Polyester poröse Membran Kultur einfügen System um den Transport von Biomolekülen oder infektiöse Erreger über eine menschliche BBB zu bewerten und ihre physiologische Wirkung auf die benachbarten Gehirnzellen.

Abstract

Die frühen screening Nervensystem Medikamente auf eine sachdienliche und zuverlässig in Cellulo BBB Modell für ihre Verbreitung und ihre Wechselwirkung mit der Barriere und die Anwesenheit von besteht noch ein ungedeckter Bedarf. Um diese Lücke zu füllen, entwarfen wir ein 2D in Cellulo Modell, die BBB-Minibrain, durch die Kombination einer Polyesters poröse Membran Kultur einfügen BBB Menschmodell mit einer Minibrain von einer Tri-Kultur der menschlichen Gehirnzellen (Neuronen, Astrozyten und Mikroglia-Zellen) gebildet. Die BBB-Minibrain erlaubt uns, testen Sie den Transport von eine neuroprotektive Arzneimittelkandidat (z. B. Neurovita), durch die BBB, bestimmen die spezifische Ausrichtung dieses Moleküls zu Neuronen und zu zeigen, dass die neuroprotektive Eigenschaft des Medikaments nach erhalten blieb das Medikament hatte die BBB überschritten. Wir haben auch gezeigt, dass BBB-Minibrain ein interessantes Modell stellt, im Laufe der Viruspartikel durch die Endothelzellen Schranke zu erkennen und die Infektion der Minibrain durch Neuroinvasive Viruspartikel zu überwachen. Die BBB-Minibrain ist ein zuverlässiges System, einfach zu handhaben für Forscher ausgebildet in Zellkulturtechnik und prädiktiv für die Gehirn-Zellen-Phänotypen nach Behandlung oder Beleidigung. Das Interesse eines solchen Cellulo testen wäre zweierlei: Einführung von Konzentrationsrisiken Schritte schon früh in der Entwicklung von Medikamenten auf der einen Seite und Verringerung des Einsatzes von Tierversuchen auf der anderen Seite.

Introduction

Das Gehirn wird von den Körperkreislauf durch eine nicht-durchlässigen Struktur getrennt, die den Austausch zwischen der Anwesenheit und das Blut, die Blut - Hirn-Schranke (BBB) genannt einschränkt. Meist bestehend aus zerebralen Endothelzellen, interagiert die BBB dynamisch mit perivaskuläre Mikroglia, Astrozyten und Neuronen in Anwesenheit von den benachbarten. Die drei Hauptfunktionen der BBB sind die Erstellung und Pflege der Ionischen Homöostase für neuronale Funktionen, Versorgung des Gehirns mit Nährstoffen und Schutz vor toxischen Verletzungen oder Eintrag von Krankheitserregern1,2, die dazu beitragen die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns und seiner Funktionen3. Diese Barriere ist so effizient, dass nur wenige Medikamente die BBB4,5überqueren können. Derzeit bestehen die verfügbaren Methoden vorhersagen, ob ein Molekül die BBB passieren und in das Gehirn diffundieren von ex-Vivo-Studien auf Autopsie, Bild Materialverfolgung in das Gehirn der Probanden mittels MRT (Magnet-Resonanz-Tomographie) oder PET (Position emission Tomographie) oder Pharmakodynamik und pharmakokinetischen präklinischen Studien im Tiere6,7,-8. Diese Techniken und Modelle haben einige Einschränkungen, z. B. der begrenzten Auflösung der PET und die geringe Sensitivität der MRT6,8, die Schwierigkeit zu Molekülen (z. B. basierend Antikörpermoleküle zum Beispiel) so schlecht quantifizieren dringen Sie die Gehirn-7, und für die präklinische Studien Sie, ihre hohen Kosten und Resort von Tierversuchen.

Der letzte Punkt ist wichtig, weil nach der 3R Regeln, (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung von Tierversuchen) die regulatorischen Behörden gebeten haben, entwickeln die Forscher dringend wissenschaftlich präzise Alternative zum Tier Experiment9,10,11,12,13,14,15.

In den letzten Jahrzehnten mehrere in-vitro-Modelle von BBB vorgeschlagen wurden16,17,18 durch den Anbau auf Filter Membran fügt Endothelzellen aus verschiedenen Arten wie Maus, Ratte, Rind und Schwein. Der menschlichen Spezies angeht, die knappe und schwere Verfügbarkeit von Primärzellen aufgefordert die Forscher menschliche Modelle basierend auf verewigt Gehirn endothelial Zellen oder menschliche Stammzellen19,20zu entwickeln, 21. Diese Barrieren sind richtige in-vitro-Surrogate von BBB, vorausgesetzt, dass sie Endothelzellen Marker, engen Kreuzung Marker, Efflux-Transporter, Solute Carrier, Rezeptoren ausdrücken, und reagieren auf die endotheliale Reize 20. Ein paar BBB-Modelle mit Membran Filtereinsätze beschichtet mit Endothelzellen und anderen Zelltypen (z.B. Astrozyten, Neuronen oder Perizyten22,23,24) wurden untersucht. Das Ziel dieser Co Kulturen war die BBB physikalischen Eigenschaften zu erhöhen, indem unter Ausnutzung der Sekretion der lösliche Faktoren von Astrozyten/Neuronen oder Perizyten.

Dennoch enthält keines dieser Modelle in Anwesenheit von zu studieren und das Schicksal der ein Arzneimittelkandidat vorherzusagen, sobald es die Barriere bestanden hat. Daher unser Ziel bestand darin, eine in Cellulo bauen Blut/Hirn-Schnittstelle, die BBB-Minibrain, durch die Kombination ein BBB-Modell und eine Kultur der gemischten Gehirnzellen in einem einzigen Kit. Die BBB-Minibrain verwendet ein Kultursystem bestehend aus einem porösen Filter in einen Brunnen von einem multiwell Zellplatte Kultur eingefügt. Der Filter ist mit hCMEC/D3 Zellen eines menschlichen Gehirns Endothelzellen Linie beschichtet, die hochzuverlässige für BBB Drogentests25,26,27, bilden die BBB nachgewiesen worden ist. Die Minibrain ist ein Co differenzierte Kultur der menschlichen Neuronen und Astrozyten, abgeleitet vom NTera/Cl2.D1 Zelle Zeile28,29 gemischt zusammen mit der menschlichen Mikroglia-Zell-Linie CHME/Cl530 im Verhältnis entspricht der Mikroglia vs. Neuron-Astrozyten Verhältnisse der Gehirn-31ist in der Unterseite der Platte gut kultiviert.

Neben dem Studium Durchgang von Drogen über die BBB und ihr Schicksal in das Parenchym, könnte die Blut-Hirn-Schnittstelle in Cellulo Modell ein mächtiges Werkzeug, um den Eintrag von Krankheitserregern in das Gehirn (Neuroinvasiveness), die Dispersion ins Gehirn (Neurotropism) Adresse und die Toxizität (Neurovirulence), die sie auf Gehirn Parenchymzellen ausüben können. Neurovirulence und Neuroinvasiveness Studien würde profitieren von der Entwicklung eines effizienten Cellulo Modell und vorteilhaft sein, Tiermodellen zu ersetzen. Mit der BBB-Minibrain Kit32, wir bewiesen Neuroinvasive Phänotyp selten viral Mutanten, die angesammelt in French Neurotropic Virus-Stamm des Gelbfieber-Virus (z.B. FNV-YFV33,34) zur Vorbereitung einer Lebendimpfstoff YFV und den Durchgang von einem neurogenerative und neuroprotektive Biomolekül genannt Neurovita (bezeichnet als NV fortan im Manuskript)35eingestellt. Da NV weder kreuzt natürlich die Zellmembran noch die BBB, NV wurde eine einzelne Kette Antikörpers von Lamas, die Kreuze der biologischen Membranen, einschließlich der BBB und fungiert als eine Zelle eindringen Molekül (CPM)36mit der Variable Teil (LHKW) verschmolzen. Die CPM-Eigenschaft des FHKW scheint der isoelektrischen Punkt und die Länge der LHKW37abhängen.

In diesem Cellulo Test sollen es ermöglichen, die Moleküle zu sortieren, die potenziell die BBB vor Durchführung der pharmakokinetischen und Pharmakodynamik Analyse bei Tieren, und im Idealfall in der gleichen Zeit in der Lage sein, ihr Verhalten in der nervösen vorherzusagen kreuzen könnte Parenchym. Dieses System ist biologisch relevante und einfach einrichten und verarbeiten von Fachleuten gut ausgebildet in Zelle Kultur26,29,30,38. Das Interesse eines solchen Cellulo testen wäre zweifach: Reduzierung der Kosten der präklinischen Tests auf der einen Seite und Verringerung des Einsatzes von Tierversuchen auf der anderen Seite.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

(1) Zelle Kultur Arbeit der Ntera/CL2. D1 zur Vorbereitung einer Kokultur Post-mitotische hNeurons und hAstrocytes (NT2-n/a)

Hinweis: Dies ist die Komponente des Minibrain (Abbildung 1).

  1. Kultivierung der Ntera/Cl2.D1
    1. Entfernen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen Zellen aus flüssigem Stickstoff-Tank. Halten Sie auf dem Eis.
    2. Auftauen der Zellen schnell in einem 37 ° C-Wasserbad.
    3. Die Zellen in einer 15 mL Tube mit 10 mL der kompletten DMEM-F12 Medium zu übertragen (Dulbeccos geändert Eagle Medium: Nährstoff-Mischung f-12 Medium) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM Glutamin, 100 IE Penicillin und 100 µg Streptomycin ergänzt (d.h., vollständig DMEM-F12-Medium).
    4. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Das Pellet in 2 mL des kompletten DMEM-F12 Medium zu distanzieren.
    5. In einem T75 Gewebekultur Kolben aus Polystyrol mit spezifischen Behandlung für sensible adhärente Zellen übertragen (T75Cell+), enthält 13 mL des kompletten DMEM-F12 Medium.
    6. Kulturzellen im Brutschrank bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit bis 90 % Zusammenfluss beibehalten (d. h. ca. 5 Tage). Verändern Sie alle 2-3 Tage Medium.
  2. Subkultivieren Ntera/Cl2.D1 und Verstärkung
    1. Entfernen Sie das Medium aus der Flasche.
    2. Spülen Sie die Zelle monomolekularen Film mit 10 mL von Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2 + und Mg2 +ergänzt.
    3. Spülen Sie die Zelle monomolekularen Film mit 10 mL EDTA-Lösung (bei RT gehalten).
    4. 3 mL Trypsin-EDTA-Lösung (0,05 % Trypsin, 0,02 % EDTA) zugeben und 2 min bei RT inkubieren
    5. Schütteln Sie die Flasche und stellen Sie sicher, dass die Zellen von der Kunststoffoberfläche getrennt sind.
    6. Fügen Sie 10 mL des kompletten DMEM-F12 Medium inaktivieren die Trypsin, transfer in einem 15 mL-Tube und Zentrifuge für 5 min bei 200 X g bei RT
    7. Distanzieren Sie das Pellet mit 10 mL der kompletten Medium und verwenden Sie 1 mL zu, um jede neue Flasche mit 14 mL des kompletten DMEM-F12 Medium zu impfen.
      Hinweis: Dreißig T75 Zelle+ -Flaschen sind für jede Differenzierung erforderlich.
    8. Inkubieren Sie die Fläschchen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit bis 90 % Zusammenfluss.
  3. Differenzierung von NTera/Cl2.D1 in menschlichen Neuron-Astrozyten Kokultur
    Hinweis: Dies ist die wichtigste Komponente der Minibrain.
    1. Am Tag 0 Zellen mit Trypsin-EDTA, wie unter Punkt 1.2 beschrieben distanzieren und die Zelle Pellet von jedem Kolben mit 2 mL des kompletten DMEM-F12 Medium zu distanzieren.
    2. Fügen Sie 1 mL Zellsuspension (entspricht 5 x 106 Zellen) in 60 Kunststoff Petrischalen mit 85 mm Durchmesser, enthält 11 mL des kompletten DMEM-F12 Medium.
      Hinweis: Die Zellen werden der Kunststoff nicht befestigen und werden zu aggregieren, Form-Pseudo-Neurosphären (siehe Foto im unteren Bereich der Abbildung 1). Eines Tages inkubieren Sie der 60 Petrischalen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    3. Am 1. Tag fügen Sie 1 mL der kompletten DMEM-F12 Medium ergänzt mit 130 µM von All-Trans-Retinsäure (ATRA) pro Petrischale (Endkonzentration ATRA 10 µM) und die Gerichte bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit für 24 h zurück.
    4. Am Tag2 übertragen Sie sehr sorgfältig Zelle Sphären der einzelnen Petri Dish in einer 50 mL-Tube und Zentrifuge für 10 min bei 50 X g und RT. LG Lose Pellets mit 13 mL des kompletten DMEM-F12 Medium ergänzt mit 10 µM ATRA sorgfältig-haltigem Medium geben Sie und th e 13 mL in einen neuen 85 mm Durchmesser Petrischale.
      Hinweis: Über die verschiedenen Passagen ist es extrem wichtig, die Kugeln Dichte so hoch wie die Dichte am Tag2 (d. h. um eine Dichte von 70 %) erhalten. Die Dichte der Kugel zu senken ist, verringert sich die Gesamtzahl der Petrischalen nach der Anzahl der Zellen.
    5. Wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren (Schritt 1.3.4) Tage, 4, 6 und 8.
    6. Am 10. Tag wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren aber T75 Zelle+ Flaschen statt Petrischalen fügen Sie die Kugeln hinzu. Die Zellen in einem T75 Zelle+ Kolben aus einer Petrischale hinzufügen.
    7. Tage 11, 13, 15 und 17, ändern Sie das eingesetzte Medium mit 14 mL komplette DMEM-F12 mit 10 µM ATRA ergänzt.
    8. Am Tag 19 verändern Sie Medium mit kompletten DMEM-F12-Medium ohne ATRA pro Flasche 14 mL.
    9. Am Tag 20 distanzieren Sie die Zellen mit Trypsin/EDTA sanft wie folgt.
      1. Spülen Sie für jede T75 Zelle+ -Kolben die Zellen mit 10 mL PBS mit Ca2 + und Mg2 +ergänzt; inkubieren Sie die Zellen mit 4 mL EDTA für 5 min bei RT
      2. Entfernen Sie vorsichtig die EDTA und fügen Sie 2 mL Trypsin-EDTA und inkubieren Sie 7 min bei RT. Shake sehr vorsichtig die Flasche und sorgfältig 8 mL komplette DMEM-F12 Medium.
      3. Zentrifuge 10 min bei 160 x g und RT distanzieren die Zelle Pellet in 13 mL komplette DMEM-F12 Medium und Transfer in ein Auffanggefäß T75 Zelle+ .
        Hinweis: Die sehr sanfte Spaltung mit Trypsin-EDTA ermöglicht Wiederherstellung der ATRA differenzierten Zellen aus den ursprünglichen Teratocarcinoma Zellen, die stark an die Kunststoff-Ware angebracht werden.
    10. Am Tag 21 entfernen Sie das Medium und die abgestorbenen Zellen. Fügen Sie 14 mL des kompletten DMEM-F12 Medium ergänzt mit 5 % FBS, 2 mM Glutamin, 100 IE Penicillin, 100 µg Streptomycin und 0,5 µM von AraC (Cytosin β-D-Arabinofuranoside) (komplette 5 % FBS DMEM-F12-AraC).
    11. Bei Tage 23, 25 und 28, verwendet ersetzen Medium mit 14 mL 5 % FBS DMEM-F12-AraC.
    12. Am Tage 29 bis 49 (alle zwei Tage), verwendet ersetzen Medium mit 14 mL des kompletten DMEM-F12-Medium mit 5 % fötalen Rinderserum, 2 mM Glutamin, 100 IE Penicillin, 100 µg Streptomycin, 5 µM von FudR (5-Fluoro-2' Deoxyuridine) und 10 µM ergänzt Urd (Uridin) (5 % abgeschlossen FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. Am Tag 50, ersetzen verwendet Medium mit 14 mL des kompletten DMEM-F12-Medium mit 5 % FBS, 2 mM Glutamin, 100 IE Penicillin, ergänzt 100 µg Streptomycin und 10 µM Urd (komplette 5 % FBS DMEM-F12-Urd).
    14. Am Tage 51 bis zu 95 (zweimal wöchentlich), verwendet ersetzen Medium mit 14 mL komplett 5 % FBS DMEM-F12-Urd.
      Hinweis: Zellen können von 51. Tag für Experimente verwendet aber nicht später als Tag 95 sein. Die Verwendung von seriellen Behandlungen mit Mitose Inhibitoren ermöglicht Rückgewinnung reinen Bevölkerung von Kokulturen von Post-mitotische hNeuron und hAstrocytes (NT2-n/a).
    15. Um die Zellen zu Saatgut, mit sanften Trypsinization wie für Tag 20 beschrieben vorgehen.

(2) Zelle Kultur Arbeit der menschlichen Microglial Zellen CHME/Cl5

Hinweis: Dies ist der Mikroglia Bestandteil der Minibrain (Abbildung 1).

  1. Kultivierung der menschlichen Microglial Zellen CHME/Cl5
    1. Entfernen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen Zellen aus dem flüssigen Stickstoff-Tank. Halten Sie auf dem Eis.
    2. Tauen Sie schnell im Wasserbad 37 ° C auf.
    3. Übertragen Sie die Zellen in einer 15 mL Tube mit 10 mL der kompletten DMEM-F12-Medium mit 5 % fötalen Rinderserum, 2 mM Glutamin, 100 IE Penicillin und 100 µg Streptomycin (d.h. komplette 5 % FBS DMEM-F12 Medium) ergänzt.
    4. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min bei RT. LG das Pellet mit 2 mL des kompletten 5 % FBS DMEM-F12 Medium.
    5. In einem T75 Zelle+ -Kolben mit 13 mL komplett 5 % FBS DMEM-F12 Medium übertragen.
    6. Zellkulturen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit bis 90 % Zusammenfluss. Verändern Sie alle 2-3 Tage Medium.
  2. Subkultivieren der menschlichen Mikroglia-Zellen CHME/Cl5
    1. Medium aus der Flasche zu entfernen.
    2. Spülen Sie die Zelle monomolekularen Film mit 10 mL PBS mit Ca2 + und Mg2 +ergänzt.
    3. Spülen Sie die Zelle monomolekularen Film mit 10 mL EDTA-Lösung (bei RT gehalten).
    4. 3 mL Trypsin-EDTA-Lösung zugeben und 2 min bei RT inkubieren
    5. Schütteln Sie die Flasche und stellen Sie sicher, dass die Zellen von der Kunststoffoberfläche getrennt sind.
    6. Fügen Sie 10 mL der kompletten 5 % FBS DMEM-F12 Medium inaktivieren die Trypsin, transfer in einem 15 mL-Tube und Zentrifuge für 5 min bei 200 x g und RT.
    7. Distanzieren Sie das Pellet mit 10 mL der kompletten Medium und verwenden Sie 1 mL zu, um jede neue Flasche mit 14 mL komplett 5 % FBS DMEM-F12 Medium zu impfen.
    8. Inkubieren Sie die Fläschchen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit bis 90 % Zusammenfluss.

3. Kultur-Arbeit mit der hCMEC/D3 Mantel porös Einsätze und BBB vorbereiten

  1. Kultivierung der menschlichen Endothelzellen hCMEC/D3 (Abbildung 2)
    1. Verdünnen Sie den Typ ich Ratte Kollagen um 01:30 mit reinen sterilem Wasser (Zelle Kultur Klasse).
    2. 10 mL in einem T75 Zelle+ Kolben übertragen und 2 h bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit Inkubator inkubieren.
    3. Entfernen Sie die Kollagen-Lösung und ersetzen Sie es mit 15 mL Endothelzellen Medium mit 10 mM HEPES (bezeichnet als komplette Endothelzellen Medium) ergänzt.
    4. Ein Kryo-Fläschchen mit Zellen aus dem flüssigen Stickstoff-Tank zu entfernen. Halten Sie auf dem Eis.
      Hinweis: Die Zellen wurden angebaut, und viel Samen gemacht wurde, wie vom Hersteller beschrieben. Die Zell-Linie wird durch eine biologische Werkstoffübergang Vereinbarung abgedeckt. Die Zellen werden Passage Hausnummer 25 gewonnen und sollte nicht weiter als Durchgang 35 verwendet werden.
    5. Tauen Sie schnell im Wasserbad 37 ° C auf.
    6. Die Zellen in der Zelle T75+ Kolben übertragen und den Kolben bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit für 2 bis 4 h zurück.
    7. Entfernen Sie vorsichtig das Medium ohne zu verlieren oder Zellen entfernt. Spülen Sie die Zellen einmal mit 10 mL der komplette Endothelzellen Medium.
    8. 15 mL komplette Endothelzellen Medium hinzugeben.
    9. Zellkulturen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit bis 100 % Zusammenfluss (nicht weniger als 4 Tage) ohne Ändern des Mediums.
  2. Subkultivieren hCMEC/D3 um den Einsatz der BBB vorzubereiten
    1. Einen neuen T75 Zelle+ Kolben Beschichten oder fügt mit dem Typ ich Ratte Kollagen wie beschrieben (Schritt 3.1).
    2. Entfernen Sie das Medium aus der Flasche. Spülen Sie die Zelle monomolekularen Film mit 10 mL PBS mit Ca2 + und Mg2 +ergänzt.
    3. 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung zugeben und 5 min bei 37 ° c inkubieren
    4. Schütteln Sie die Flasche und stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig losgelöst von der Kunststoffoberfläche.
    5. Fügen Sie 4 mL komplette Endothelzellen Medium, die Trypsin zu inaktivieren.
    6. Mit einer 5 mL-Kunststoff-Pipette mechanisch distanzieren Sie die Zellen durch Absaugen und spülen die Zellsuspension gleichzeitig 5-mL-Pipette auf den Boden der Flasche mindestens 5 Mal.
    7. Zählen der Zellen und Verwendung 5 x 104 Zellen/Insert für eine 12 gut Polyester Membran Kultur fügt einfügen und 2 x 106 Zellen für eine Flasche T75 Zelle+ . Auch drei Filter ohne Zellen für die PELy (d. h. Endothelzellen Durchlässigkeit für Luzifer gelb siehe unten Absatz 4.2) Experimente mit Polyester Membran Kultur Einsätze vorzubereiten.
    8. Inkubieren Sie das Fläschchen oder Einsätze bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit bis 100 % Zusammenfluss.
    9. Ändern Sie das Medium für T75 Zelle+ Kolben nicht bis eine neue Passage. Im Gegenteil bei BBB auf Polyester Membran Kultur fügt: Medium am Tag 2 und 4 zu ändern, verwenden Sie die BBB für Experimente am Tag 6.

(4) Konstruktion und Qualitätskontrolle von der BBB-Minibrain (Abbildung 2)

  1. Einrichten einer BBB-Minibrain Polyester Membran Kultur einfügen Gerät (Abb. 2 b)
    1. Wachsen die hCMEC/D3 Zellen auf 12 gut Polyester Membran Kultur legen Sie Filter für 6 Tage auf Endothelzellen Medium vor der Verwendung für das Experiment.
    2. Bestreichen Sie eine 12-well-Platte mit Poly-D-Lysin (1 mL/Brunnen, 10 µg/mL, 4 h bei RT) und dann Laminin (1 mL/Brunnen, 1 µg/mL, über Nacht bei RT).
    3. Laminin zu entfernen und fügen Sie 1 mL der Endothelzellen Medium ergänzt mit 5 % FBS (5 % Endothelzellen Medium).
    4. Inkubation für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    5. Sanft trypsinize NT2-n/a (wie in Schritt 1.3.9 beschrieben) und CHME/Cl5 (wie in Schritt 2.2 beschrieben) und die Zelle Pellets mit kompletten Endothelzellen Medium zu distanzieren.
    6. Zählen der Zellen, Mix 3,6 x 105 NT2-n/a und 0,4 x 105 CHME/Cl5 Zellen/gut und Samen der 12-well-Platte.
    7. Bei T = 24 h (24 h nach Aussaat): ändern Sie das eingesetzte Medium mit frischen komplette Endothelzellen Medium (Minibrain Zellen und Endothelzellen) und hCMEC/D3 Polyester Kultur einfügen Membranfilter auf der Oberseite der Minibrain Zellen zu übertragen. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
      Hinweis: Der BBB-Minibrain wird dann aus einer Schicht von menschlichen Endothelzellen hCMEC/D3 auf Filter der luminalen Fach (oder "Blut" Fach) zu isolieren und eine Mischkultur aus menschlichen Zellen hNT2-n/a und hCHME/Cl5 (Minibrain) am unteren Rand der gut definierenden bestehen. der abluminalen Fach (oder "Gehirn" Fach) (Abb. 2 b).
  2. Validierung der endothelialen Durchlässigkeit des BBB-Minibrain (Qualitätskontrolle) (Abbildung 2)
    1. Bereiten Sie den Transportpuffer (TB), der HBSS (Hanks' Balanced Salzlösung) Puffer mit Ca2 + und Mg2 + mit 10 mM HEPES und 1 mM Natrium Pyruvat ergänzt ist.
    2. 12-well-Platten mit 1,5 mL Transportpuffer pro Bohrloch vorzubereiten.
    3. Bei T = 0, frisch machen Transportpuffer ergänzt mit 50 µM Luzifer gelb (LY-TB).
    4. Umzukehren Sie jeder Filter Kopf, um das Medium sorgfältig entfernen, ohne die Endothelzellen Barriere.
    5. Setzen Sie den Filter auf die gefüllten 12-well-Platte und 0,5 mL LY-TB.
    6. Inkubieren Sie die Platten in einem Inkubator bei 37° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    7. Bei T = 10 min Transfer Filter auf neue TB gefüllt 12-well-Platten und halten das abluminalen Fach der ersten Platte für OD lesen.
    8. Wiederholen Sie bei T = 25 min den Schritt 4.2.7.
    9. T = 45 min, Halt den Transport durch die Filter von den Platten zu entfernen. Halten Sie abluminalen und luminalen Fächer für OD Maßnahmen.
    10. Transfer in eine dunkle 96 Platten auch die Proben: 10 µL mit 190 µL TB für die LY-TB und der luminalen Fächer 200 µL der Probe für die abluminalen Fächer.
    11. Messung die Fluoreszenz von LY-TB vorhanden in den verschiedenen Proben bei λ428 nm λ535 nm (Anregung und Emission Länge bzw. Wellen).
    12. Die endotheliale Durchlässigkeit (Pe) in Richtung LY-TB (PeLY) nach Siflinger-Birnboim, A Et Al. (1987)39 und Da Costa, A Et Al. (2018)34 mithilfe der Formel zu berechnen:
      1/PSe = (1/PSt) – (1/PSf) und PeLY= PSe/S.
      Hinweis: PSf ist die Durchlässigkeit des Filters ohne Zellen, PST-Datei ist die Durchlässigkeit des Filters mit Zellen, PSe ist die Durchlässigkeit der endothelialen Monolage Zeit die Oberfläche der Monolage, S die Oberfläche der Monolayer ist (für einen 12 gut Filter = 1,12 cm2 ), PeLY drückt sich in cm/min. Für hCMEC/D3 PeLY zwischen 0,7 und 1,2 x 10 sein sollte verwendet-3 cm/min abhängig vor allem von der FBS in den Experimenten. Wichtig: eine PE-DateiLY höher als 1,2 bedeutet, dass die BBB nicht fest genug ist und einige Leckage beobachtet werden kann. Entsorgen Sie diese Barrieren.

5. Nutzung der BBB-Minibrain, markieren Sie das Vorhandensein von Neuro-invasive Viruspartikel in einer Gelbfieber-Virus-Impfstoff Probe, das French Neurotropic Virus YFV FNV 34 (Abbildung 3)

  1. BBB-Kreuzung und Vermehrung von Gelbfieber-Viren in der Minibrain
    1. Verwenden Sie die BBB-Minibrain wie in Schritt 4.1.7 24 h vor der Zugabe des Virus beschrieben; ersetzen Sie das Medium durch 2 % FBS Endothelzellen Medium.
      Hinweis: Es ist äußerst wichtig, zu vermeiden, ändern des Mediums nur vor dem Hinzufügen des Virus. Ändern des Mediums der menschlichen Endothelzellen aktivieren und vorübergehend öffnen die Schranke, die den Durchgang des Virus ermöglichen wird. Hier wird das Medium 24 h vor Beginn des Experiments geändert.
    2. Fügen Sie bei T = 0 3500 Plaque Forming Units (PFU) von YFV FNV in 50 µL 2 % FBS Endothelzellen Medium sehr sorgfältig auf die Oberseite der luminalen fach verdünnt. Das Steuerelement BBB-Minibrain ist mit 50 µL 2 % FBS Endothelzellen Medium ohne Virus geimpft. PeLY auch auf Begleiter zu bestimmen.
    3. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain in einem Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    4. Entfernen Sie nach 24 h Polyester Membran Kultur fügt Filter Gerät und bestimmen Sie PeLY, Probe 1 mL aus dem Fach abluminalen und titrieren Sie Virus von A. da Costa Et Al. (2018)34beschrieben. Ersetzen Sie das Medium mit frischen 2 % FBS Endothelzellen Medium.
    5. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    6. Probieren Sie nach 72 h das Medium aus dem Fach abluminalen und titrieren das Virus bzw. Extrahieren der RNS aus den Minibrain Zellen für gen Expressionsanalyse wie von A. da Costa Et Al. (2018)34beschrieben.
  2. Verstärkung der neurotropic Varianten der YFV FNV auf Minibrain Zellen durch serielle Passagen
    1. Verwendung Minibrain Zellen beschichtet 12-well-Platten (d. h., Schritte 4.1.6 und 4.1.7).
    2. 0 h, Punkt hinzufügen 3.500 Plaque bilden Einheiten von YFV-FNV in 50 µL 2 % FBS Endothelzellen Medium sehr sorgfältig auf die Oberseite der Zellen (luminalen Fach) verdünnt.
    3. Entfernen Sie nach 1 h das Medium mit der Virus-Inokulum und ersetzen Sie mit frischen 2 % FBS Endothelzellen Medium.
    4. Nach 48 h 500 µL des Kulturmediums probieren und frische Minibrain Zellen infizieren
    5. Probieren Sie nach 120 h 500 µL des Kulturmediums und infizieren Sie frische Minibrain Zellen.
    6. Nach 192 h Kulturmedium (= Virus bestand bereichert) speichern und Extrahieren der RNS aus den Minibrain Zellen für gen Expressionsanalyse wie von A. da Costa Et Al. (2018)34beschrieben.

6. Nutzung der BBB-Minibrain BBB kreuzen und Gehirn Zelle gezielt ein Biomolekül studieren

  1. Transport über die BBB eines Neurons targeting Biomolekül
    1. Verwenden Sie die Minibrain-BBB als beschriebenen Schritt 4.1.7 vorbereitet.
    2. Zum Zeitpunkt 0 h, fügen Sie das Biomolekül (im Beispiel vorausgesetzt, im Abschnitt Ergebnis kamen 58.75 ng/BBB der Zelle permeationsfähigen NeuroTag-NV Moleküle pro BBB-Minibrain einfügen.
    3. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    4. Nach 24 h Polyester Membran Kultur fügt Filter Gerät entfernen und bestimmen PeLY, dann färben die Minibrain Zellen für hNeurons Neurofilament Nf200 und das Vorhandensein von das Biomolekül in der Minibrain (In dem Beispiel im Ergebnis Abschnitt, NeuroTag-NV wurde erkannt, dass mit einem Antikörper gegen Strep-Tag gerichtet, es enthält35,40).
  2. Transport über die BBB neurogenerative Biomolekül und anschließende neuroprotektive Assay in der Minibrain, nachdem das Biomolekül die BBB überquert hat
    1. Verwenden Sie die Minibrain-BBB wie in Schritt 4.1.7 beschrieben.
      Hinweis: Für Moleküle gezielt nur Neuronen, können Minibrain Zellen durch die Neuronen-Zellen (NT2-N) nur38ersetzt werden.
    2. Fügen Sie zum Zeitpunkt 0 h 58.75 ng/BBB-Minibrain gut der Zelle permeationsfähigen NV Moleküle (Wirkform CPM-NeuroTag-NV, inaktive Form CPM-NeuroTag-NVΔ) von C. Prehaud Et Al. (2014)35beschrieben.
    3. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain in einem Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    4. Nach 4 h, stellen einzelne Wunden mit einer Injektionsnadel (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, Belgien) auf die Minibrain Zellen. Mindestens 10 Kratzer gut auf jeden einzelnen Menschen zu machen. PeLY gut auf der Begleiter zu bestimmen.
    5. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain in einem Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    6. Ersetzen Sie nach 8 h das Medium in der abluminalen Fach durch frische komplette Endothelzellen Medium.
      Hinweis: Es ist wichtig, das Medium bei diesem Schritt zu ersetzen, da die Verwundung der Minibrain Zellen zu Zelltod und dann die Freisetzung von zytotoxischen Verbindungen führen kann.
    7. Inkubieren Sie die BBB-Minibrain in einem Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
    8. Nach 48 h gefärbten Zellen für Axon Regeneration von hNeurons wie von C. Prehaud Et Al. (2013)40beschrieben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Die BBB-Minibrain ist ein in Cellulo experimentellen Modell der Blut-Hirn-Schnittstelle.

Die BBB-Minibrain ist das Polyester Membran Kultur einfügen System eingerichtet, ein Blut-Fach auf der oberen Ebene und ein Gehirn-Fach auf der unteren Ebene der Blut-Hirn-Schnittstelle (Abb. 2AB) zu imitieren. Es besteht aus einem luminalen Fach mit hCMEC/D3 Endothelzellen auf dem Filter bilden die BBB und ein abluminalen Fach, das die Minibrain menschlichen Tri-Kultur der zerebralen Zellen (Neuronen, Astrozyten und Mikroglia-Zellen) enthält. Die Minibrain Zellen weisen eine klassische Tri-Kultur gemischte Bevölkerung Phänotyp (Abbildung 1, unteren rechten Bereich) und Ausdruck spezifischer Marker jeder Art von Zelle wie Dady A. Et Al., 201834gezeigt.

Die Verwendung von hCMEC/D3-Schicht in der BBB-Minibrain erlaubt die Erlangung einer Schranke mit einem mittleren PeLY von 0.95e-03 cm/min und eine mittlere Trans endotheliale elektrischen Widerstand (TEER) 51.89 Ω/cm2. Diese Werte liegen im Bereich der besten Werte, die jemals für einen menschlichen Endothelzellen Linie27,41 in einem solchen Polyester Membran Kultur Insert System (Abbildung 2) beschrieben. Diese Zellen express tight Junction Protein Marker wie ZO-1 und Cadherin erwartungsgemäß durch die Durchlässigkeit Quantifizierung (Daten nicht gezeigt). Sie drücken auch die Teilmengen von Rezeptoren, Ausfluss Transportunternehmen oder Transporter [Rezeptoren: LDLR, geringer Dichte Lipoprotein-Rezeptor; LRP1, Bezug geringer Dichte Lipoprotein Rezeptor Protein 1; INSR, Insulin-Rezeptor; LEPR, Leptin-Rezeptor; LU, Basalzellkarzinom Adhäsionsmolekül; TFRC, CD71 Antigen; AGER, fortgeschrittenen Glykosylierung Endprodukte Rezeptor. Efflux-Transporter: ABCB1 (P-Gp); ABCG2 (BCRP); ABCC1 (MRP1); ABCC2 (MRP2); ABCC4, ABCC4 Protein; ABCC5, ABCC5 Protein. Transporter: STRA6, angeregt durch Retinoic Säure Gen 6 Protein; SLC2A1, Glukose-Transporter Typ 1; SLC7A5, große neutrale Aminosäure-Transporter 1; SLC1A1, gelöste Trägerprotein Familie 1; SLC38A5, gelöste Trägerprotein Familie 38 Mitglied 5; SLC16A1, Monocarboxylate transport Protein 1], sind die wichtigsten relevanten Proteine für ihre biologischen Funktionen (Abb. 2D)21.

BBB-Minibrain ermöglicht die Auswahl, verstärken und Charakterisierung von seltenen Neuroinvasive viralen Varianten von einer live-Virus-Impfstoff-Vorbereitung.

Die BBB-Minibrain-Kultur-Gerät wurde als ein in Cellulo Testen ermöglicht Isolation und Verstärkung des seltenen Neuroinvasive/Neurovirulent Varianten potenziell in Gelbfieber-Viren (YFV) viralen Lebendimpfstoffen42verwendet. YFV ist ein Viscerotropic Virus auf die Leber, die nicht effizient die BBB überquert. Das französische neurotropic Virus, FNV, diente als ein Lebendimpfstoff YFV bis zu den 1980er Jahren33,43. FNV wurde festgestellt, dass Post-lyophilisiertem Neuropathogenesis bei Kindern (0,3 bis 0,4 % der geimpften) verursachen und so wurde 198233,43eingestellt. Wir verwendeten FNV hier als Prototyp YF-Virus enthalten einen hohen Anteil an Neuroinvasive/Neurovirulent Varianten42,44. FNV Virus Vorbereitung (z.B. 3500 PFU/ml) wurde hinzugefügt, in der luminalen Fach ein BBB-Minibrain, das Steuerelement ein BBB-Minibrain war, die Mock-infiziert war. Präsenz von Viruspartikeln in der luminalen Fach ändert nicht die Barriere Permeabilität als gemessene 24 h später, da PeLY in der viralen Wells nicht anders als die Pe-Ly von Kontroll-Vertiefungen (0,80 ± 0,09 x 10-3 cm/min war und 0,86 ± 0,09 x 10-3 cm/min für PeLY in der Steuerung und YFV FNV Brunnen bzw.). Der Inhalt von abluminalen Fach war auf das Vorhandensein des Virus durch Plaque-Assay, bei 24 h Post Infektion ausgewertet. Die Minibrain Zellen wurden inkubierten zwei Tage im Anschluss an die Verstärkung der Neuroinvasive Varianten in den Gehirnzellen zu bewerten und zur Überwachung der gen-Expression als beschrieben auf der Zeichentrickserie auf Abbildung 3Agezeigt.

Wir haben festgestellt, einige YFV FNV-Viren, die die BBB bei 24 h überschreiten können (meine 43 PFU/mL). Die Viren wurden verstärkt für die nächsten zwei Tage durch die Vermehrung des Virus in die Gehirnzellen (meine Titer von 4,69 x 104 PFU/mL), (Abb. 3 b). Der Hinweis würde eine Impfstoff Stamm Zubereitung, die keine Post-lyophilisiertem Neuropathogenesis verursacht nicht effizient die BBB in diesem System überschreiten, wie von dady A. Et Al. (2018)34nachgewiesen wurde. Wir haben zwei Biomarker für die Vermehrung des Virus identifiziert: die Interferon stimuliert Gen 15 (ISG15) und Interferon Regulatory Factor 7 (IRF7). Die Ausdrücke von diesen zwei Biomarker wurden angeregt, wenn dieser Neuroinvasive virale Population auf Minibrain Zellen (Abbildung 3) seriell passagiert war. Diese Upregulations von Q-RT-PCR gemessen wurden streng auf die Viruslast (Pearson p Wert 0,0016 für ISG15 und 0.0260 für IRF7) korreliert.

BBB-Minibrain ermöglicht beide prüfen die Fähigkeit ein Biomolekül die Schranke passieren und in der gleichen Zeit testen, ob die Biomolekül-Funktion nach BBB Kreuzung konserviert wurde.

NV ist ein Biomolekül, abgeleitet von Tollwut-Virus die erstaunliche Eigenschaften der Neuroprotektion und Neuroregeneration40besitzt. Diese kleinen Polypeptid, dass weder natürlich die Zellmembran noch die BBB überquert wurde mit einem CPM in der Lage die Neuronen verschmolzen. Unsere Wahl war den variablen Teil (LHKW) verwenden eine einzelne Kette Antikörpers von Lamas, die die biologischen Membranen, einschließlich der BBB36,45 und eine Ausrichtung auf Neuronen spezifisch NeuroTag überquert. NV war die LHKW und eine NeuroTag, eine CPM-NeuroTag-NV (Abb. 4A) zu konstruieren und die LHKW nur um eine CPM-NeuroTagΔ-NV fehlt die spezielle NeuroTag ermöglicht die Ausrichtung der Neuronen (Abbildung 4 b) konstruieren verbunden. Nach Aufnahme in den luminalen Fach, CPM-NeuroTag-NV (grüne Punkte) kreuzt die BBB und war in der Lage menschliche Neuronen (in rot) (Abbildung 4, D). CPM-NeuroTagΔ-NV die Endothelzellen Schranke (grüne Punkte), sondern richtet sich an die menschlichen Neuronen (die Mehrheit der grünen Punkte befinden sich außerhalb der Neuronen) weniger effizient (Abbildung 4).

Wie oben beschrieben, war ein LHKW und eine NeuroTag zu konstruieren eine CPM-NeuroTag-NV NV verbunden. Wir haben das gleiche für NVΔ eine inaktive Form des NV fehlt des aktiven Teils des NV (CPM-NeuroTag-NVΔ) (Abb. 5A). Nach Aufnahme in den luminalen Fach, CPM-NeuroTag-NV kreuzt die BBB und war in der Lage, Axone der menschlichen Neuronen zu regenerieren, nach Verwundung (Abbildung 5 b, rechts), im Gegenteil zu CPM-NeuroTag-NV Δ die inaktive Form der NV (Abbildung 5 b, links Panel)40. Diese Eigenschaften wurden in zwei Arten von Protokollen untersucht; entweder in einem Pre-Exposition (Abbildung 5) oder in einem Post-Exposition-Protokoll (Abbildung 5). Wenn angewendet, bevor das Axon kratzen (4 h, H4), CPM-NeuroTag-NV löst die Neuroprotektion der verletzten Nervenzellen und die axonale Regeneration im Gegenteil das Mock behandelt (z.B. Steuern) oder die Zellen behandelt mit CPM-NeuroTag-NVΔ (Mittelwert Regenerierung 91 % und 12 % - 10 % bzw. Abbildung 5). Wann das Biomolekül nach der axonalen Läsionen (1 Stunde, H1, Abbildung 5) angewendet wurde, um ein therapeutisch Post-Exposition-Protokoll, die CPM-NeuroTag-NV zu imitieren ist noch in der Lage, Axone im Gegenteil der Behinderten Form der CPM-NeuroTag-NV Δ, (zu regenerieren meine Regeneration 85 % und 5,1 % beziehungsweise) (Abbildung 5).

Figure 1
Abbildung 1: Modell der Minibrain. Zeittafel der NT2-n/a und CHME/Cl5 Kulturen (obere Leiste). Fotografien (untere Platten) der ursprünglichen Zelllinie (Ntera/cl2. D1) in der linken Leiste die Pseudo-Neurosphären nach ATRA Behandlung im mittleren oberen Bereich CHME/Cl5, im mittleren unteren Bereich und die Minibrain Triculture (Cristal violette Färbung), auf der rechten Seite erhalten aufgrund der Mischung von NT2-n/a und CHME / CL5 Kulturen. Skala bar 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: das BBB-Minibrain-Modell. A. Zeitplan der hCMEC/D3 Kulturen und Foto von der BBB-Minibrain-Gerät: ein Polyester Kultur Einsätze-Membranfilter mit hCMEC/D3 endotheliale Barriere ist mit einem Forcep gehalten, bevor in ein gut einer 12 eingefügt werden Brunnen-Kultur-Platte Zell. B. Cartoon, beschreibt das Gerät mit der luminalen (Blut)-Depot mit Endothelzellen Barriere und der abluminalen (Gehirn)-Depot mit Minibrain Zellen (menschliche Neuronen, Astrozyten und Mikroglia-Zellen). C. repräsentative Maßnahmen von der BBB-Minibrain-Permeabililty von TEER (d. h. TransEndothelial elektrischer Widerstand) auf drei Geräten oder Durchlässigkeit zu LY (d. h. PeLY) auf fünf Filter. D. Expressionsanalyse von Q-RT-PCR der Rezeptoren und Transporter Efflux-Transporter auf der Endothelzellen hCMEC/D3. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: die BBB-Minibrain-Modell ermöglicht die Identifizierung von Neuroinvasive Varianten unter live YFV Impfstoff Vorbereitung. A. Zeitplan des Experiments. B. Quantifizierung von den Viren, die die BBB durch Plaque forming Unit (PFU) Titration von live-Virus (jeder Punkt entspricht einem Polyester Membran Kultur Einsätze Experiment) überschritten haben. C. Grundstück von ISG15 und IRF7 -gen-Expression in Abhängigkeit von der Anzahl der Viruspartikel in der Viruslast durch Q-RT-PCR gemessen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: die BBB-Minibrain ermöglicht die Prüfung der neurogenerative Biomolekül Eigenschaften: spezifische Ausrichtung der Neuronen bei NV, NeuroTag verschmolzen wird. A. Cartoon der CPM basiert NV (z.B. CPM-NeuroTag-NV) mit einer speziellen NeuroTag um Neuron gezielt. B. Cartoon der CPM basiert NV von NeuroTag (z.B. CPM-NeuroTagΔ-NV) gelöscht. C. repräsentative Immunfluoreszenz Fotografien der menschlichen Neuronen. Skala bar 50 µm. NF 200 rot, CPM-NeuroTag-NV/CPM-NeuroTagΔ-NV in grün, Zellkerne blau. D. CPM-NeuroTag-NV-Moleküle können die BBB zu überqueren und Ziel menschliche Neuronen effizienter als CPM-NeuroTagΔ-NV. Infizierten Nervenzellen und Gesamtbevölkerung von Neuronen wurden auf dreifacher Folien nach Immunolabeling gezählt. Insgesamt Neuronen entsprechen NF200 positive Zellen (in rot). Roten Blutkörperchen verbunden mit einem oder mehreren grünen Punkt (CPM-NV) wird als eine positive Neuron gezählt. Ungepaarte Student t-Test zwei tailed ***p = 0,0002. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: die BBB-Minibrain ermöglicht die Prüfung der neurogenerative Biomolekül Eigenschaften: BBB Kreuzung ändert nicht die Neuroregenerative Eigenschaften des NV. A. Cartoon der CPM basiert NV (z.B. CPM-NV) und ihrem behinderten Gegenstück (z.B. CPM-NVΔ). B. Axon Regeneration von CPM-NV in einem in Cellulo Scratch Assay (rechte Abbildung). CPM-NVΔ kann nicht Axon Regeneration (linken), Skala Bar 100 µm. Causlösen. CPM-NV überqueren die Endothelzellen und regenerieren Axone auf die Neuronen des BBB-Minibrain bei 4 h vor der Läsion: (obere Abdeckung) Regelung des Experiments; (untere Leiste) Quantifizierung der Regeneration. D. CPM-NV ist auch aktiv in einer therapeutisch Protokoll, wenn es 1 h nach der Verwundung angewendet wird: (obere Abdeckung) Regelung des Experiments; (untere Leiste) Quantifizierung der Regeneration. Ungepaarte Student t-Test zwei tailed ***p < 0,0001. Regeneration von dreifacher Experimente berechnet wurde (> 800 Neuronen gezählt) nach der Färbung der neuronalen Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In diesem Artikel wir gezeigt, wie man eine in Cellulo bauen Blut/Hirn-Schnittstelle, die BBB-Minibrain, durch die Kombination einer BBB-Modell und eine Kultur des Gehirn zerebrale Zellen (Minibrain) in einem einzigen Kit gemischt. Dieses System ist biologisch relevante, einfach einzurichten und für Experimentatoren, die gut ausgebildet in der Zellkultur zu behandeln.

Wie für jedes andere in-vitro-Modell von BBB würde zuverlässige Ergebnisse erzielt werden, wenn drastische Kontrolle der Dichtigkeit der Barriere angewendet wird. Beilagen sollten sorgfältig geprüft werden, für Durchlässigkeit und jeder Einsatz mit unzureichenden Durchlässigkeit Werte (d. h. eine PeLY höher als 1,2) verworfen werden sollte.

FBS Proben sollten sorgfältig geprüft werden, um einen Stapel zu identifizieren, der deaktiviert nicht die Merkmale der BBB. Der gleiche Rat kann über die Fahrzeug-Medium getroffen werden, in welcher Virus Partikel oder Biomoleküle verdünnt werden. Es wird auch empfohlen, so klein wie möglich das Volumen der Biomolekül oder Virus Aussetzung zu halten, um die mittlere Zusammensetzung der luminalen Fach nicht verändern. Differenzierung der menschlichen Kokultur Neuron/Astrozyten Kultur von Ntera/CL2. D1 ist eine bewährte Technologie. Im Gegensatz zu menschlichen Neuronen, die Post-mitotische sind, sind die Astrozyten noch Zellen teilen. Hohe Verbreitung der Astrozyten Zellen wird manchmal beobachtet. In diesem Fall muss die Minibrain Kultur verworfen werden. Die CHME/Cl5-Zellen, die wir in unserem Labor verwendet wurden Wildreben zu beweisen, dass sie der menschlichen Ursprungs (Homo Sapiens CCNT1 Phänotypisierung) waren. Besteht die Gefahr, die einige CHME lose verwendet in einigen Laboratorien Ratte (Rattus Norvegicus) Ursprungs wie von Garcia-Mesa Y. Et Al. (2017)46behauptet werden können. Daher empfiehlt es sich, nach dem Ursprung der CHME/Cl5 Zelllinie zu überprüfen.

Minibrain menschlichen Tri-Kultur Systems einschließlich Post mitotischen Neuronen (hauptsächlich dopaminerge), imitiert Astrozyten und eine Zelllinie Mikroglia eine vereinfachte zerebrale Umgebung. Dieses System kann noch verbessert werden. Man kann sich vorstellen, Hinzufügen von Oligodendrozyten, die Kultur mit dem Ziel, Markhaltige Axone oder primären Mikroglia-Zellen zu erhalten. Die Minibrain kann auch mit einer Mischkultur aus menschlichen Stammzellen19,20,21ersetzt werden. Die Variabilität zwischen verschiedenen Chargen von Zellen müssen jedoch sorgfältig gemeistert werden. Die BBB-Minibrain Komplexität kann auch durch Zugabe von Perizyten23erhöht werden. In unseren Händen wurde diese Verbesserung durch die Schwierigkeit, zuverlässigen Zugriff auf Perizyten menschlichen Ursprungs zu behindert.

Wir haben bewiesen, die Machbarkeit und den Nutzen dieses Kits imitiert die Blut-Hirn-Schnittstelle, um (i) selten Neuroinvasive Viruspartikel aus einem Gelbfieber-Impfstoff-Sample zu isolieren, die die Eigenschaft, um das Gehirn durch die BBB entwickelt haben und (Ii). verstärken Sie diese Neuroinvasive Sub-Populationen in der Minibrain Tri-Kultur in Anwesenheit von einem vereinfachten imitiert. Zukünftige Anwendungen kann, die Qualitätskontrolle von anderen Lebendimpfstoffen wie die Mumps-Impfstoff zu verlängern und die BBB-Minibrain als ein Mittel, um Neurovirulence Funktionen in-vitro-Studie zu fördern.

Die zweite pilot-Studie war es zu zeigen, dass ein Arzneimittelkandidat die BBB durchläuft und die Minibrain erreicht ohne die Neuro-regenerative Eigenschaften zu verlieren. Wir sind fest davon überzeugt, dass die BBB-Minibrain große Fortschritte in der Vorsortierung von Molekülen vor der Freigabe zu präklinischen Tests erlauben kann. Die Verwendung von BBB-Minibrain sollte die Umsetzung der 3R Maßnahmen zur Verringerung des Einsatzes von Tierversuchen für Reglementary Assays und experimentelle Forschung erleichtern.

Insgesamt wird mit der nächsten Entwicklung in Silico Ansätze (Computermodell), wir bald Arzneimittelkandidaten mit einer hohen Wahrscheinlichkeit des Überschreitens der BBB, die Entwicklung eines 3D-Modells In Cellulo imitiert das nervös Parenchym Blut zu identifizieren können Schnittstelle wäre eine große Hilfe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Das geistige Eigentum des Systems war die Patente in 32, 35 und 38verwiesen wird.

Acknowledgments

Diese Studie wurde unterstützt durch interne Zuschüsse vom Institut Pasteur, darunter einen förderlich Grant (PTR-435) und durch einen Zuschuss "Contrat de Soutien à la Recherche" zur Verfügung gestellt von Sanofi Pasteur, Institut Pasteur. A. da Costa wurde unterstützt von der Sanofi-Pasteur Grant und Florian Bakoa ist Empfänger von einem Promotionsstipendium zur Verfügung gestellt von ANRT (Association Nationale De La Recherche et De La Technologie). Wir sind verpflichtet, Pr Pierre-Olivier Couraud und Dr Florence Miller für hilfreiche Diskussionen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 well plates Corning 3336
5-fluoro-2’deoxyuridine Merck-Sigma Aldrich F0503
85mm Petri Dish Sarstedt 83-3902-500
Anti-Nf200 Merck-Sigma Aldrich N4142
β-mercapto-ethanol Merck-Sigma Aldrich M3148
CHME/Cl5 Unité de Neuroimmunologie Virale On request to Dr Lafon
CMC Calbiochem 217274
Cytosine β-D-arabinofuranoside Merck-Sigma Aldrich C1768
Dark 96 well plates Corning 3915
DMEM F12 Thermofisher Scientific 31330-038
DMSO Merck-Sigma Aldrich D2650
Endogro IV Millipore SCME004 endothelial cell medium
Ethanol Carlo Erba 529121
FBS Hyclone SV30015-04
Formaldehyde Merck-Sigma Aldrich 252549
GIEMSA RAL Diagnostic 320310
Goat-Anti Mouse Jackson Immuno Research 115-545-003
Goat-Anti Rabbit Thermofisher Scientific R37117
HBSS with Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14025-100
hCMEC/D3 Cedarlane CLU512
Hepes 1M Thermofisher Scientific 15630-070
Hoescht 33342 Merck-Sigma Aldrich 33263
Laminine Merck-Sigma Aldrich L6274
L-glutamin Thermofisher Scientific 25030-024
Lucifer Yellow Merck-Sigma Aldrich L0259
MEM 10X Thermofisher Scientific 21430
MEM 1X Thermofisher Scientific 42360
Ntera/Cl2D.1 ATCC CRL-1973
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714
PBS without Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14190
PBS-Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14040-091
Pen/Strep Eurobio CXXPES00-07
Poly-d-Lysine Merck-Sigma Aldrich P1149
Prolong Gold Thermofisher Scientific P36930
Qiashredder QIAGEN 79656
Rat Collagen I Cultrex 3443-100-01
Retinoic Acid All-Trans Merck-Sigma Aldrich R2625
RNA purification kit QIAGEN 74104
SDS Merck-Sigma Aldrich L4509
Sodium bicarbonate 5.6% Eurobio CXXBIC00-07
Sodium Pyruvate Thermofisher Scientific 11360
T75 Cell+ Flask Sarstedt 83-1813-302 Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells
Transwell Corning 3460 polyester porous membrane culture inserts
Trypsin-EDTA Merck-Sigma Aldrich T3924
Ultra Pure Water Thermofisher Scientific 10977-035
Uridine Merck-Sigma Aldrich U3750
Versene Thermofisher Scientific 15040-033 EDTA
YFV-FNV IP Dakar Vaccine vial

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
  7. Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
  8. Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
  9. Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
  10. Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
  11. Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
  12. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
  13. Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
  14. Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
  15. Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
  16. Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
  17. Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37 (2017).
  18. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  19. Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
  20. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  21. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  22. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  23. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  24. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
  25. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  26. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
  27. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  28. Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
  29. Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
  30. Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671 (2014).
  33. Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
  34. da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
  35. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Lafaye, P. , EP3191510A1 (2014).
  36. Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
  37. Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
  38. Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
  39. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  40. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Wolff, N., Khan, Z., Terrien, E., Sanderine, V. , EP20110306454 (2011).
  41. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  42. Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408 (2018).
  43. Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
  44. Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
  45. Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
  46. Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).

Tags

Neurowissenschaften Ausgabe 146 BBB-Minibrain in Cellulo Modell menschliche Endothelzellen hCMEC/D3 Ntera/Cl2D.1 menschliche Nervenzelle menschliche Astrozyten menschliche Microglial Zellen CHME/Cl5
Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa,… More

da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa, F., Afonso, P., Ceccaldi, P. E., Lafaye, P., Lafon, M. A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain. J. Vis. Exp. (146), e59220, doi:10.3791/59220 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter