Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En menneskelig blod-hjerne-grensesnitt modell å studere barriere kryssinger av patogener eller medisiner og deres samhandling med hjernen

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59220
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll som beskriver innstillingen for en i cellulo BBB (blod-hjernebarrieren)-Minibrain polyester porøs membran kultur sette system for å vurdere transport av biomolecules eller smittsomme stoffer over en menneskelig BBB og deres fysiologisk effekt på nærliggende hjernecellene.

Abstract

Tidlig screening nervesystemet legemidler på en relevant og pålitelige i cellulo BBB modell for gjennomtrenging og deres samspill med barrieren og hjernen parenchyma er fortsatt et udekket behov. For å fylle dette gapet, utviklet vi et 2D i cellulo modell, BBB-Minibrain, ved å kombinere en polyester porøs membran kultur sett inn menneskelige BBB modell med en Minibrain dannet av en tri-kultur for menneskelige hjerneceller (nevroner, astrocyttene og microglial celler). BBB-Minibrain tillatt oss å teste transport av neuroprotective stoffet kandidat (f.eks Neurovita), gjennom BBB, til å finne bestemte målretting av dette molekylet til neurons og viser at egenskapen neuroprotective av stoffet ble bevart etter stoffet hadde krysset BBB. Vi har også vist at BBB-Minibrain utgjør en interessant modell for å oppdage passering av viruspartikler over endotelceller barrieren og overvåke infeksjon av Minibrain av neuroinvasive viruspartikler. BBB-Minibrain er et pålitelig system, lett å håndtere for forsker utdannet i celle kultur teknologi og prediktiv av hjernen cellene fenotyper etter behandling eller fornærmelse. Interessen for slike cellulo testing ville være todelt: derisking trinnene tidlig i narkotika-utvikling på den ene siden og reduserer bruken av dyreforsøk derimot.

Introduction

Hjernen er separert fra systemisk sirkulasjonen av en ikke-permeable struktur som begrenser utveksling mellom hjernen parenchyma og blodet, kalles blod - hjerne barrieren (BBB). Meste består av cerebral endotelceller, samhandler BBB dynamisk med astrocyttene, perivascular microglia og nevroner i de nærliggende hjernen parenchyma. De tre store funksjonene i BBB er etablering og vedlikehold av ionisk homeostase for neuronal funksjoner, tilførsel av hjernen med næringsstoffer og beskyttelse fra giftige skader eller oppføring av patogener1,2, som bidrar til vedlikehold av hjernen homeostase og dens funksjoner3. Denne barrieren er så effektiv at bare noen medikamenter kan krysse BBB4,5. I dag er består de tilgjengelige metodene til å forutsi om et molekyl vil passere BBB og diffuse i hjernen av ex vivo studier på obduksjonen materiale, bilde sporing i hjernen av frivillige MRI (magnetisk resonans imaging) eller PET (posisjon utslipp tomografi) eller pharmacodynamics og farmakokinetiske prekliniske studier i dyr6,7,8. Disse teknikker og modeller har noen begrensninger, som begrenset oppløsningen av PET og lav følsomheten til Mr6,8, er vanskelig å kvantifisere molekyler (dvs. antistoff basert molekyler for eksempel) som dårlig trenge hjernen7, og for de prekliniske studier deres høye kostnader og feriestedet dyreforsøk.

Det siste punktet er viktig fordi 3R reglene, (erstatning, reduksjon og avgrensningen av dyreforsøk) de regulatoriske administrasjonene har spurt at forskerne raskt utvikle vitenskapelig nøyaktig alternativ til dyr eksperimentering9,10,11,12,13,14,15.

De siste tiårene, flere i vitro modeller av BBB har blitt foreslått16,17,18 av dyrking på filteret membran setter endotelceller fra ulike arter som mus, rotte, storfe og gris. Så langt som er opptatt av den menneskelige arten, bedt knappe og vanskelig anvendeligheten primære celler forskerne å utvikle human modeller basert på udødeliggjort hjernen endotelceller eller menneske-avledet stilk celler19,20, 21. Disse barrierene er riktig i vitro surrogater av BBB forutsatt at de uttrykker endothelial celle markører, tett krysset markører, middelklasseinnbyggere transportører, stoff bærere, reseptorer, og svare på endothelial stimuli 20. Noen BBB modeller bruker filteret membran setter belagt med endotelceller og andre celletyper (dvs. astrocyttene, nerveceller eller pericytes22,23,24) var assayed. Målet med disse co kulturer var å øke BBB kjennetegn ved å utnytte utskillelsen av løselig faktorer av astrocyttene/nerveceller eller pericytes.

Likevel inkluderer ingen av disse modellene hjernen parenchyma å studere og forutsi skjebnen til et medikament kandidat når det har gått barrieren. Derfor vårt mål var å bygge en i cellulo blod/hjernen grensesnitt, BBB-Minibrain, ved å kombinere en BBB modell og en kultur for blandet hjerneceller i et enkelt kit. BBB-Minibrain bruker en kultur-systemet består av et porøst filter i et godt av en multiwell celle kultur plate. Filteret er belagt med hCMEC/D3 celler, en menneskelig hjerne endothelial celle linje som har vist seg pålitelig for BBB narkotikatesting25,26,27, til BBB. Minibrain, som er en co differensiert kultur for menneskelig nevroner og astrocyttene avledet fra NTera/Cl2.D1 celle linje28,29 blandet sammen med menneskelige microglial celle linjen CHME/Cl530 forholdet tilsvarer den Microglia vs Nevron-astrocyttene prosenter av hjernen31, er dyrket i bunnen av platen godt.

I tillegg til å studere passering av narkotika over BBB og deres skjebne i parenchyma, kan blod-hjerne-grensesnitt i cellulo modell være et kraftig verktøy for å ta oppføring av patogener i hjernen (neuroinvasiveness), spredning i hjernen (neurotropism) og toksisitet (neurovirulence) de kan øve på parenchyma hjerneceller. Neurovirulence og neuroinvasiveness studier ville ha nytte av en effektiv i cellulo modellen utvikling og være en fordel å erstatte dyremodeller. Bruker de BBB-Minibrain kit32, vi viste neuroinvasive fenotypen av sjeldne viral mutanter som akkumulert i fransk Neurotropic virus belastningen av gulfeber viruset (dvs. FNV-YFV33,34) brukes til å forberede en avviklet live YFV vaksine og passering av en neuroregenerative og neuroprotective biomolecule kalt Neurovita (referert som NV heretter i manuskriptet)35. Fordi NV verken naturlig krysser cellemembranen eller BBB, NV var smeltet sammen med den variable delen (VHH) et enkelt kjede antistoff av Llama som krysser biologiske membraner inkludert BBB og fungerer som en celle gjennomtrengende molekyl (CPM)36. Egenskapen CPM for VHH synes å avhengige isoelectric punktet og lengden på VHH37.

Dette cellulo test bør gjør det mulig å sortere molekylene som potensielt kunne krysse BBB før gjennomføring farmakokinetiske og pharmacodynamics analyse i dyr, og samtidig kunne forutsi deres atferd i nervøse parenchyma. Dette systemet er biologisk relevant og enkelt å sette opp og håndtere av profesjonelle godt trent i cellen, kultur,26,,29,,30,,38. Interessen for slike cellulo testing ville være todelt: å redusere kostnadene ved prekliniske tester på den ene siden og redusere bruken av dyreforsøk derimot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle kultur arbeidet med Ntera/CL2. D1 å forberede en co kultur etter mitotisk hNeurons og hAstrocytes (NT2-/ t)

Merk: Dette er delen av Minibrain (figur 1).

  1. Dyrking av Ntera/Cl2.D1
    1. Fjerne ampuller av frosne celler fra flytende nitrogen tank. Hold på is.
    2. Tine cellene raskt i et 37 ° C vannbad.
    3. Overføre cellene i en 15 mL tube som inneholder 10 mL av komplett DMEM F12 medium (Dulbeccos endret Eagle Medium: næringsstoff blanding F-12 medium) med 10% fosterets bovin serum (FBS), 2 mM glutamin, 100 IU penicillin og 100 µg streptomycin (dvs. komplett DMEM F12 medium).
    4. Sentrifuge 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Distansere pellet i 2 mL av komplett DMEM F12 medium.
    5. Overføre en MT75 vev kultur kolbe i isopor med bestemt behandling for følsom tilhenger celler (T75Cell+) som inneholder 13 mL av komplett DMEM F12 medium.
    6. Kultur celler i en inkubator opprettholdt på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet til 90% samløpet (dvs. ca 5 dager). Endre medium hver 2-3 dager.
  2. Subculturing Ntera/Cl2.D1 og forsterkningsnivå
    1. Fjerne mediet fra flasken.
    2. Skyll den cellen monolayer med 10 mL fosfat buffer saltoppløsning (PBS) med Ca2 + og Mg2 +.
    3. Skyll den cellen monolayer med 10 mL EDTA (holdt på RT).
    4. Legge 3 mL trypsin-EDTA løsning (0,05% trypsin, 0.02% EDTA) og Inkuber 2 min på RT.
    5. Riste flasken og kontroller at cellene er løsrevet fra plast overflaten.
    6. Legge til 10 mL av komplett DMEM F12-medium for å deaktivere trypsin, overføring i en 15 mL rør og sentrifuge for 5 min på 200 x g ved RT.
    7. Distansere pellets med 10 mL av komplett medium og bruker 1 mL for å vaksinere hver nye kolbe som inneholder 14 mL av komplett DMEM F12 medium.
      Merk: Tretti MT75 celle+ flasker er nødvendig for hver differensiering.
    8. Inkuber flasker på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet til 90% samløpet.
  3. Differensiering av NTera/Cl2.D1 i menneskelig Nevron-astrocytter co kultur
    Merk: Dette er den viktigste komponenten av Minibrain.
    1. På dag 0 dissociate cellene med trypsin-EDTA som beskrevet i trinn 1.2 og dissociate celle pellet av hver kolbe med 2 mL komplett DMEM F12 medium.
    2. Legge 1 mL av cellen suspensjon (tilsvarende 5 x 106 celler) i 60 plast Petri retter av 85 mm diameter som inneholder 11 mL av komplett DMEM F12 medium.
      Merk: Cellene vil ikke legge til plast og samle til skjemaet pseudo neurospheres (se bilde i nedre panel i figur 1). Inkuber 60 Petri retter på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet for en dag.
    3. På dag 1, Legg 1 mL av komplett DMEM F12 medium med 130 µM av all-Trans retinsyre (ATRA) per Petriskål (siste konsentrasjon ATRA 10 µM) og returnere retter på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet for 24 timer.
    4. På dag 2, overføre nøye mediet som inneholder cellen sfærer av hver Petri Dish 50 mL tube og sentrifuge for 10 min 50 x g og RT. Dissociate nøye løs pellets med 13 mL av komplett DMEM F12 medium med 10 µM ATRA og legge th e 13 mL i nye 85 mm diameter Petriskål.
      Merk: Over ulike passasjer er det svært viktig å opprettholde kuler tetthet så høyt som tetthet innhentet på dag 2 (dvs. rundt en tetthet på 70%). Derfor hvis sfære tetthet er å senke, redusere antall Petri retter av antall celler.
    5. Gjenta fremgangsmåten ovenfor (trinn 1.3.4) dager 4, 6 og 8.
    6. På dag 10, gjenta fremgangsmåten ovenfor, men legge kulene til MT75 celle+ flasker i stedet for Petri retter. Legge til cellene fra ettall bensin fat til en MT75 celle+ kolbe.
    7. På dager 11 endre 13, 15 og 17, brukte medium med 14 mL komplett DMEM F12 supplert med 10 µM ATRA.
    8. På dag 19, endre medium med 14 mL komplett DMEM F12 medium uten ATRA per kolbe.
    9. På dag 20, distansere forsiktig cellene med trypsin/EDTA som følger.
      1. For hver MT75 celle+ kolbe, skyll cellene med 10 mL PBS med Ca2 + og Mg2 +; Inkuber cellene med 4 mL av EDTA i 5 min på RT.
      2. Fjerne nøye EDTA og Legg 2 mL trypsin-EDTA og ruge 7 minutter til RT. Shake svært forsiktig flasken og Legg nøye 8 mL av komplett DMEM F12 medium.
      3. Sentrifuge 10 for min på 160 x g og RT. Dissociate celle pellet i 13 mL av komplett DMEM F12 medium og overføre i en MT75 celle+ kolbe.
        Merk: Meget mild dissosiasjon med trypsin-EDTA kan gjenopprette ATRA differensierte celler fra de opprinnelige teratocarcinoma cellene, som er sterkt knyttet til den plast ware.
    10. På dag 21, fjerner du mediet og døde celler. Legge til 14 mL komplett DMEM F12 middels med 5% FBS, 2 mM glutamin, 100 IU penicillin, 100 µg streptomycin og 0,5 µM av AraC (Cytosine β-D-arabinofuranoside) (fullføre 5% FBS DMEM F12-AraC).
    11. Dager 23: 25 og 28 Erstatt brukte medium med 14 mL 5% FBS DMEM F12-AraC.
    12. Dager 29 til 49 (hver to dager), Erstatt brukte medium med 14 mL komplett DMEM F12 middels med 5% fosterets bovin serum, 2 mM glutamin, 100 IU penicillin, 100 µg streptomycin, 5 µM av FudR (5-fluoro-2' deoxyuridine) og 10 µM Urd (Uridine) (komplett 5% FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. På dagen 50, Erstatt brukes medium med 14 mL komplett DMEM F12 middels med 5% FBS, 2 mM glutamin, 100 IU penicillin, 100 µg streptomycin og 10 µM Urd (fullføre 5% FBS DMEM F12-Urd).
    14. Dager 51 opptil 95 (to ganger i uken), Erstatt brukte medium med 14 mL komplett 5% FBS DMEM F12-Urd.
      Merk: Celler kan være brukt for eksperimenter fra dag 51 men ikke senere enn dagen 95. Bruken av føljetong behandlinger med mitose hemmere kan utvinne ren befolkningen co kultur etter mitotisk hNeuron og hAstrocytes (NT2-/ t).
    15. For å frø cellene, fortsetter du med mild trypsinization som dag 20.

2. celle kultur arbeidet til menneskelige microglial celler CHME/Cl5

Merk: Dette er microglial komponenten av Minibrain (figur 1).

  1. Dyrking av menneskelig microglial celler CHME/Cl5
    1. Fjerne ampuller av frosne celler fra flytende nitrogen tanken. Hold på is.
    2. Tine raskt i et 37 ° C vannbad.
    3. Overføre cellene i en 15 mL tube som inneholder 10 mL av komplett DMEM F12 middels med 5% fosterets bovin serum, 2 mM glutamin, 100 IU penicillin og 100 µg streptomycin (dvs. fullstendig 5% FBS DMEM F12 medium).
    4. Sentrifuge 200 x g i 5 min på RT. Dissociate pellets med 2 mL komplett 5% FBS DMEM F12 medium.
    5. Overføre i en MT75 celle+ kolbe som inneholder 13 mL av komplette 5% FBS DMEM F12 medium.
    6. Kultur celler på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet til 90% samløpet. Endre medium hver 2-3 dager.
  2. Subculturing menneskelig microglial cellene CHME/Cl5
    1. Fjerne mediet fra flasken.
    2. Skyll den cellen monolayer med 10 mL PBS med Ca2 + og Mg2 +.
    3. Skyll den cellen monolayer med 10 mL EDTA (holdt på RT).
    4. Legge 3 mL trypsin-EDTA løsning og Inkuber 2 min på RT.
    5. Riste flasken og kontroller at cellene er løsrevet fra plast overflaten.
    6. Legge til 10 mL av komplette 5% FBS DMEM F12 medium for å deaktivere trypsin, overføring i en 15 mL rør og sentrifuge for 5 min 200 x g og RT.
    7. Distansere pellets med 10 mL av komplett medium og bruker 1 mL for å vaksinere hver nye kolbe som inneholder 14 mL av komplette 5% FBS DMEM F12 medium.
    8. Inkuber flasker på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet til 90% samløpet.

3. kultur arbeid med hCMEC/D3 pels porøse setter og klargjøre BBB

  1. Dyrking menneskelige endotelceller hCMEC/D3 (figur 2)
    1. Fortynne typen jeg rotte kollagen til 1:30 med ren sterilt vann (celle kultur grad).
    2. Overfør 10 mL til en MT75 celle+ kolbe og ruge 2 h 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet inkubator.
    3. Fjern kollagen løsningen og erstatte den med 15 mL av endothelial celle medium med 10 mM av HEPES (kalt komplett endothelial celle medium).
    4. Fjerne cryo ampuller med celler fra flytende nitrogen tanken. Hold på is.
      Merk: Cellene var vokst, og frø mye ble gjort som beskrevet av produsenten. Cellen linjen er dekket av en biologisk materiale overføringsavtale. Cellene er oppnådd ved passering tallet 25 og bør ikke brukes lenger enn passering 35.
    5. Tine raskt i et 37 ° C vannbad.
    6. Overføre cellene i MT75 celle+ kolbe og returnere flasken på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet for 2 til 4 h.
    7. Fjerne mediet nøye uten mister eller fjerne celler. Skyll cellene gang med 10 mL av komplett endothelial celle medium.
    8. Legge til 15 mL av komplett endothelial celle medium.
    9. Kultur celler på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet til 100% samløpet (ikke mindre enn 4 dager) uten å endre medium.
  2. Subculturing hCMEC/D3 ä sette av BBB
    1. Coat en ny MT75 celle+ kolbe eller setter inn typen jeg rotte kollagen som beskrevet ovenfor (trinn 3.1).
    2. Fjerne mediet fra flasken. Skyll den cellen monolayer med 10 mL PBS med Ca2 + og Mg2 +.
    3. Legg 2 mL trypsin-EDTA løsning og ruge 5 min på 37 ° C.
    4. Riste flasken og kontroller at cellene er helt løsrevet fra plast overflaten.
    5. Legge til 4 mL av komplett endothelial celle medium å deaktivere trypsin.
    6. Med en 5 mL plastikk pipe, mekanisk distansere cellene av aspirating og flushing celle suspensjon mens opprettholde 5 mL Pipetter til bunnen av flasken minst 5 ganger.
    7. Telle celler og bruk 5 x 10-4 celler/sett for en 12 vel polyester membran kultur setter innsetting og 2 x 106 celler for en MT75 celle+ kolbe. Forbered også tre filtre uten celler for PELy (dvs. endotelceller permeabilitet Lucifer gul se under avsnitt 4.2) eksperimenter med Polyester membran kultur skivene.
    8. Inkuber flasker eller setter på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet til 100% samløpet.
    9. Endre ikke mediet for MT75 celle+ kolbe til en ny passasje. Tvert for BBB polyester membran kultur setter: endre medium dager 2 og 4, bruke BBB for eksperimenter på dag 6.

4. konstruksjon og kvalitetskontroll av BBB-Minibrain (figur 2)

  1. Sette opp en BBB-Minibrain Polyester membran kultur sett enheten (figur 2B)
    1. Vokse hCMEC/D3 cellene på 12 vel Polyester membran kultur setter filtre for 6 dager på endothelial celle medium før du bruker dem for eksperimentet.
    2. Coat en 12 godt plate med poly-D-lysine (1 mL/godt, 10 µg/mL, 4 h på RT) og laminin (1 mL/godt, 1 µg/mL, overnatting på RT).
    3. Fjern laminin og tilsett 1 mL av endothelial celle middels med 5% FBS (5% endothelial celle medium).
    4. Inkuber 1t på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet.
    5. Forsiktig trypsinize NT2-N/A (som beskrevet i trinn 1.3.9) og CHME/Cl5 (som beskrevet i trinn 2.2) og dissociate celle pellets med komplett endothelial celle medium.
    6. Tell cellene, blanding 3.6 x 105 NT2-N/A og 0,4 x 105 CHME/Cl5 celler/godt og seed 12 godt plate.
    7. Ved T = 24 h (24 h etter seeding): endre brukte medium med fersk komplett endothelial celle medium (Minibrain celler og endotelceller) og overføre hCMEC/D3 Polyester membran kultur sett inn filteret på de Minibrain cellene. Inkuber BBB-Minibrain på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet.
      Merk: BBB-Minibrain vil deretter består av et lag av menneskelig endotelceller hCMEC/D3 på filteret isolere den luminal kupeen (eller "blod" kupé) og en blandet kultur for menneskelige celler hNT2-i/t og hCHME/Cl5 (Minibrain) på bunnen av det godt definere den abluminal kupeen (eller "hjernen" kupé) (figur 2B).
  2. Validering av endothelial permeabilitet av BBB-Minibrain (Quality Control) (figur 2C)
    1. Forberede transport bufferen (TB), som er HBSS (Hanks' balansert saltløsning) buffer med Ca2 + og Mg2 + med 10 mM HEPES og 1 mM natrium pyruvate.
    2. Forberede 12 bra plater med 1,5 mL transport buffer per brønn.
    3. Ved T = 0, gjøre fersk transport buffer supplert med 50 µM Lucifer gul (LY-TB).
    4. Tilbakeføre hvert filter opp ned for å fjerne nøye medium uten å påvirke endothelial celle barrieren.
    5. Plasser filteret på fylt 12 godt platen og Legg til 0,5 mL LY-TB.
    6. Inkuber plater i en inkubator på 37° C, 5% CO2 og 95% fuktighet.
    7. Ved T = 10 min overføring filtrene på nye TB fylt 12 bra plater og holde abluminal rommet av første plate for OD lesing.
    8. Ved T = 25 min, Gjenta trinn 4.2.7.
    9. Ved T = 45 min, stopp transporten ved å fjerne filtrene fra platene. Hold abluminal og luminal rom for OD tiltak.
    10. Overføringen i en mørk 96 godt plater prøvene: 10 µL med 190 µL TB for LY-TB og luminal seksjonene, 200 µL av utvalg for abluminal seksjonene.
    11. Måle fluorescens LY-TB i forskjellige eksemplene på λ428 nm λ535 nm (eksitasjon og utslipp bølger henholdsvis).
    12. Beregne endothelial permeabilitet (Pe) mot LY-TB (PeLY) Siflinger-Birnboim, A et al. (1987)39 og Da Costa, A et al. (2018)34 ved hjelp av formelen:
      1/PSe = (1/PSt)-(1/PSf) og PeLY= PSe/S.
      Merk: PSf er permeabilitet av filteret uten celler, PSt er permeabilitet av filteret med celler, PSe er permeabilitet av endotelial monolayer tiden overflaten av monolayer, S overflaten av monolayer (en 12 godt filteret = 1.12 cm2 ), PeLY uttrykkes i cm/min. For hCMEC/D3 PeLY bør være mellom 0,7 og 1.2 x 10 brukes-3 cm/min avhengig hovedsakelig av FBS i forsøkene. Viktig: en PeLY høyere enn 1.2 betyr at BBB er ikke tett og noen lekkasje kan observeres. Kast disse barrierene.

5. Bruk av BBB-Minibrain til å markere tilstedeværelsen av Nevro-invasiv virus partikler i en gulfeber Virus vaksine prøve, fransk Neurotropic virus, YFV-FNV 34 (figur 3)

  1. BBB krysset og multiplikasjon av gulfeber virus i Minibrain
    1. Bruke BBB-Minibrain forberedt som beskrevet i trinn 4.1.7 24 timer før en virus; Erstatt medium av 2% FBS endothelial celle medium.
      Merk: Det er svært viktig å unngå endring mediet bare ør viruset. Endre medium kan aktivere menneskelige endotelceller og transiently åpne barrieren som vil tillate passasje av viruset. Her er mediet endret 24 timer før du starter eksperimentet.
    2. Ved T = 0, kan du legge til 3500 plakk danner enheter (PFU) av YFV-FNV fortynnet i 50 µL av 2% FBS endothelial celle medium nøye på luminal rommet. Kontrollen BBB-Minibrain er inokulert med 50 µL av 2% FBS endothelial celle medium uten virus. Bestemme PeLY på companion godt.
    3. Inkuber BBB-Minibrain i en inkubator på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet.
    4. Etter 24 timer, fjerne polyester membran kultur setter filter enheten og bestemme PeLY, prøve 1 mL fra abluminal rommet og sjarmere viruset som beskrevet av A. da Costa et al. (2018)34. Erstatt medium med fersk 2% FBS endothelial celle medium.
    5. Inkuber BBB-Minibrain på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet.
    6. Etter 72 h, prøve mediet abluminal rommet og sjarmere virus og/eller trekke ut RNA fra Minibrain cellene for gene expression analyse som beskrevet av A. da Costa et al. (2018)34.
  2. Forsterkning av neurotropic varianter av YFV-FNV på Minibrain celler av føljetong passasjer
    1. Bruk Minibrain celler belagt 12 bra plater (dvs. trinn 4.1.6 og 4.1.7).
    2. Gangen pek 0 h, legge til 3500 plakk danner enheter av YFV-FNV fortynnet i 50 µL av 2% FBS endothelial celle medium nøye på cellene (luminal rom).
    3. Etter 1 h, fjerne mediet med virus inoculum og erstatte med fersk 2% FBS endothelial celle medium.
    4. Etter 48 timer, prøve 500 µL av kultur medium og infisere frisk Minibrain celler
    5. Etter 120 h, prøve 500 µL av kultur medium og infisere frisk Minibrain celler.
    6. Etter 192 h, lagre kultur medium (= virus lager beriket) og ekstra RNA fra Minibrain cellene for gene expression analyse som beskrevet av A. da Costa et al. (2018)34.

6. Bruk av BBB-Minibrain å studere BBB krysset og hjerne celle målretting av en biomolecule

  1. Transport over BBB av en Nevron målretting biomolecule
    1. Bruk Minibrain-BBB forberedt som beskrevet trinn 4.1.7.
    2. På tidspunkt 0t, legge til biomolecule (i eksempelet gitt i delen resultatet 58.75 ng/BBB av celle permeant NeuroTag-NV molekyler ble lagt per BBB-Minibrain sett.
    3. Inkuber BBB-Minibrain på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet.
    4. Etter 24 timer, fjerne polyester membran kultur setter filter enheten og bestemme PeLY, og flekker Minibrain cellene for hNeurons neurofilament Nf200 og finne biomolecule i Minibrain (i eksempelet i resultatet NeuroTag-NV-delen ble oppdaget ved hjelp av et antistoff rettet mot Strep-koden den inneholder35,40).
  2. Transport over BBB neuroregenerative biomolecule og senere neuroprotective analysen i Minibrain etter at biomolecule har krysset BBB
    1. Bruk Minibrain-BBB forberedt som beskrevet i trinn 4.1.7.
      Merk: For molekyler målretting neurons bare, Minibrain celler kan bli erstattet av Neurons celler (NT2-N) bare38.
    2. På tidspunkt 0t, legge 58.75 ng/BBB-Minibrain godt av celle permeant NV molekyler (aktiv form CPM-NeuroTag-NV, ikke-aktive formen CPM-NeuroTag-NVΔ) beskrevet av C. Prehaud et al. (2014)35.
    3. Inkuber BBB-Minibrain i en inkubator på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet.
    4. Etter 4 h, lage personlige sår med en injeksjon nål (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, Belgia) på Minibrain cellene. Gjøre minst 10 riper på hver enkelt også. Bestemme PeLY på companion godt.
    5. Inkuber BBB-Minibrain i en inkubator på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet.
    6. Etter 8 h, erstatte mediet i abluminal rommet av fersk komplett endothelial celle medium.
      Merk: Det er viktig å erstatte middels på dette trinnet siden sårer Minibrain cellene kan føre til celledød og utgivelsen av cytotoksiske forbindelser.
    7. Inkuber BBB-Minibrain i en inkubator på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet.
    8. Etter 48 timer, farget celler for axon regenerering av hNeurons som beskrevet av C. Prehaud et al. (2013)40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BBB-Minibrain er en i cellulo eksperimentell modell av blod-hjerne-grensesnitt.

BBB-Minibrain er satt opp på polyester membran kultur sett inn systemet å etterligne en blod kupé på øverste nivå og hjernen rom på lavere nivå av blod-hjerne-grensesnitt (figur 2AB). Det består av en luminal rom med hCMEC/D3 endotelceller på filter danner BBB og en abluminal rom, som inneholder den Minibrain menneskelig tri-kulturen av cerebral celler (nevroner, astrocyttene og microglial celler). Minibrain cellene forevise en klassisk tri-kultur blandet befolkning fenotypen (figur 1, nedre høyre panel) og uttrykke bestemt markører for hver type celle som vist av da Costa A. et al., 201834.

Bruken av hCMEC/D3 laget i BBB-Minibrain kan få en sterk barriere med en gjennomsnittlig PeLY av 0.95e-03 cm/min og en mener Trans Endothelial elektrisk motstand (TEER) 51.89 Ω/cm2. Disse verdiene er i rekken av de beste verdiene noensinne beskrevet for en menneskelig endothelial celle linje27,41 i slikt polyester membran kultur sett inn system (figur 2C). Disse cellene uttrykke tett krysset protein markører som ZO-1 og cadherin som forventet ved permeabilitet kvantifisering (data ikke vist). De uttrykker også alle delsett av reseptorer, middelklasseinnbyggere transportører eller transportører [reseptorer: LDLR, lav tetthet lipoprotein reseptor; LRP1, lav tetthet lipoprotein reseptor relatert protein 1; INSR, insulin receptor; LEPR, leptin reseptor; LU, basal celle vedheft molekyl; TFRC, CD71 antigen; AGER, avansert glykosylering sluttproduktet reseptor. Middelklasseinnbyggere transportører: ABCB1 (P-gp); ABCG2 (BCRP); ABCC1 (MRP1); ABCC2 (MRP2); ABCC4, ABCC4 proteiner; ABCC5, ABCC5 proteiner. Transportører: STRA6, stimulert av retinoic acid genet 6 protein; SLC2A1, glukose transporter type 1; SLC7A5, store nøytral aminosyre transporter 1; SLC1A1, stoff operatør familie 1 protein; SLC38A5, stoff operatør familie 38 medlem 5 protein; SLC16A1, monocarboxylate transport protein 1], som er viktige relevante proteiner for deres biologiske funksjoner (figur 2D)21.

BBB-Minibrain kan velge, forsterke og karakterisere sjeldne neuroinvasive viral varianter fra en levende virus vaksine forberedelse.

BBB-Minibrain kultur enheten ble brukt som en i cellulo test tillater isolasjon og forsterkning av sjeldne neuroinvasive/neurovirulent varianter potensielt tilstede i gulfeber virus (YFV) viral live vaksiner42. YFV er en viscerotropic virus målretting leveren som ikke effektivt krysser BBB. Det franske neurotropic viruset, FNV, ble brukt som en live YFV-vaksine til 1980-tallet33,43. FNV ble funnet at etter vaccinal neuropathogenesis i barn (0,3 0,4% blant vaccinees), og dermed ble avviklet i 198233,43. Vi brukte FNV her som en prototype av YF virus som kan inneholde en høy andel av neuroinvasive/neurovirulent varianter42,44. En FNV virus forberedelse (dvs. 3500 PFU/ml) ble lagt til i luminal rommet av en BBB-Minibrain, kontroll var en BBB-Minibrain som var uekte-infiserte. Tilstedeværelsen av viruspartikler i luminal rommet endrer ikke barriere permeabilitet som målte 24h senere siden PeLY i viral brønnene ikke var forskjellig fra PeLy av kontroll (0.80 ± 0.09 x 10-3 cm/min og 0,86 ± 0.09 x 10-3 cm/min for PeLY i kontroll og YFV-FNV brønner henholdsvis). Innholdet i abluminal rommet ble evaluert etter virus av plakk analysen, på 24 h innlegget infeksjon. Minibrain cellene var inkubert to dager mer å vurdere forsterkningen på neuroinvasive varianter i hjerneceller og å overvåke genuttrykk som beskrevet på tegneserie vises på figur 3A.

Vi fant noen YFV-FNV virus, som kan krysse BBB på 24 h (mener 43 PFU/mL). Virus ble forsterket for de neste to dagene av multiplikasjon av viruset inni hjernecellene (mener titer 4.69 x 104 PFU/mL), (figur 3B). Av notatet, ville en vaksine belastning blandingen som ikke forårsaker post vaccinal neuropathogenesis ikke effektivt krysse BBB i systemet som det har blitt demonstrert av da Costa A. et al. (2018)34. Vi identifisert to biomarkers av viruset: The Interferon stimulert Gene 15 (ISG15) og Interferon regulatoriske faktor 7 (IRF7). Av disse to biomarkers ble stimulert når neuroinvasive viral befolkningen var serielt passaged på Minibrain celler (Figur 3 c). Disse upregulations målt Q-RT-PCR var strengt korrelert til Virusmengden (Pearson p verdien 0.0016 for ISG15 og 0.0260 for IRF7).

BBB-Minibrain lar både assaying muligheten til en biomolecule skjedde barrieren og på samme tid testing om funksjonen biomolecule ble bevart etter BBB krysset.

NV er en biomolecule avledet fra rabiat virus som besitter forbløffende egenskaper neuroprotection og neuroregeneration40. Denne liten polypeptid at verken naturlig krysser cellemembranen eller BBB var smeltet sammen med en CPM målrette neurons. Vårt valg var å bruke den variable delen (VHH) et enkelt kjede antistoff av Llama som krysser biologiske membraner inkludert BBB36,45 og en NeuroTag rettet mot neurons spesielt. NV ble koblet til VHH og en NeuroTag, for å konstruere en CPM-NeuroTag-NV (figur 4A) og VHH bare for å konstruere en CPM-NeuroTagΔ-NV mangler den bestemte NeuroTag slik at målretting av Neurons (figur 4B). Etter dere legges luminal rommet, CPM-NeuroTag-NV (grønne prikker) krysser BBB og kunne målrette menneskelige neurons (i rødt) (figur 4C, D). CPM-NeuroTagΔ-NV krysser endothelial celle barrieren (grønne prikker) men mål mindre effektivt menneskelige neurons (flertallet av grønne prikker er plassert utenfor neurons) (Figur 4 d).

Som beskrevet ovenfor, ble NV koblet til en VHH og en NeuroTag for å konstruere en CPM-NeuroTag-NV. Vi gjorde det samme for NVΔ en uvirksom blankett av NV mangler den aktive delen av NV (CPM-NeuroTag-NVΔ) (figur 5A). Etter blir lagt Luminal rommet, CPM-NeuroTag-NV krysser BBB og klarte å regenerere axons av menneskelig neurons etter såret (figur 5B, høyre panel), tvert imot til CPM-NeuroTag-NV Δ det uvirksom blankett av NV (figur 5B, venstre panel)40. Disse egenskapene ble assayed i to typer protokoller; enten i en pre-eksponering (figur 5C) eller i en post-eksponering protokollen (figur 5 d). Når brukt før axon skrape (4 h, H4), CPM-NeuroTag-NV utløser neuroprotection av de sårede nervecellene og axonal fornyelse tvert av falske behandlet celler (dvs. kontroll) eller cellene behandlet med CPM-NeuroTag-NVΔ (gjennomsnitt gjenfødelse 91% og 12% - 10% henholdsvis figur 5C). Når biomolecule ble brukt etter axonal lesjoner (1 time, H1, figur 5 d) for å etterligne en terapeutisk etter eksponering protokoll, CPM-NeuroTag-NV er fremdeles å regenerere axons tvert imot deaktivert form av CPM-NeuroTag-NV Δ,) mener gjenfødelse 85% og 5.1% henholdsvis) (figur 5 d).

Figure 1
Figur 1: den Minibrain modellen. Tidstabell av NT2-i/t og CHME/Cl5 kulturer (øvre panel). Fotografier (nedre paneler) av den opprinnelige celle linjen (Ntera/cl2. D1) i venstre panel, pseudo-neurospheres innhentet etter ATRA behandling i midten øvre panelet, CHME/Cl5, midterste nedre panel og Minibrain triculture (Cristal Violet flekker), i høyre felt, som følge av blandingen av NT2-i/t og CHME / CL5 kulturer. Skala bar 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: BBB-Minibrain modellen. A. tidsplan hCMEC/D3 kulturer og fotografi av BBB-Minibrain enheten: et polyester membran kultur setter-filter med hCMEC/D3 endothelial barriere holdes med en tang før settes i en brønn en 12 brønner celle kultur plate. B. tegneserie som beskriver enheten med luminal (blod) rommet inneholder endothelial celle barrieren og abluminal (hjernen) rommet som inneholder de Minibrain cellene (menneskelige nerveceller, astrocyttene og microglial celler). C. representant tiltak av BBB-Minibrain permeabililty av TEER (dvs. TransEndothelial elektrisk motstand) på tre enheter eller permeabilitet til LY (dvs. PeLY) på fem filtre. D. uttrykk analyse av q-RT-PCR reseptorer, middelklasseinnbyggere transportører og transportører på endotelceller hCMEC/D3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: The BBB-Minibrain modell gjør identifikasjon av neuroinvasive varianter blant live YFV vaksine forberedelse. A. tidsplan for eksperimentet. B. kvantifisering av virus som har krysset BBB av plakk danner enhet (PFU) Serine levende virus (hvert punkt representerer en polyester membran kultur setter eksperimentet). C. handlingen av ISG15 og IRF7 genuttrykk målt ved q-RT-PCR som en funksjon av antall virus partikler i viral belastning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: The BBB-Minibrain lar testing av neuroregenerative biomolecule egenskaper: bestemt målretting av neurons da NV er smeltet til NeuroTag. A. tegneserie av CPM basert NV (dvs. CPM-NeuroTag-NV) som inneholder en bestemt NeuroTag for å målrette Nevron spesielt. B. tegneserie av CPM basert NV slettet av NeuroTag (dvs. CPM-NeuroTagΔ-NV). C. Representative immunofluorescence bilder av menneskelige neurons. Skalere bar 50 µm. NF 200 i rødt, CPM-NeuroTag-NV/CPM-NeuroTagΔ-NV i grønt, kjerner i blått. D. CPM-NeuroTag-NV molekyler kan krysse BBB og målrette menneskelige neurons mer effektivt enn CPM-NeuroTagΔ-NV. Infiserte neurons og totale befolkningen av neurons ble regnet på tre eksemplarer lysbildene etter immunolabeling. Totalt neurons tilsvarer NF200 positive celler (i rødt). Røde celler knyttet til én eller flere grønn prikk (CPM-NV) regnes som en positiv Nevron. Kort student t-test to tailed ***p = 0.0002. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: The BBB-Minibrain lar testing av neuroregenerative biomolecule egenskaper: BBB krysset endrer ikke neuroregenerative egenskapene til NV. A. tegneserie av CPM basert NV (dvs. CPM-NV) og motparten deaktivert (dvs. CPM-NVΔ). B. Axon gjenfødelse av CPM-NV i cellulo scratch analysen (høyre panel). CPM-NVΔ kan ikke utløse axon regeneration (venstre panel), skala bar 100 µm. C. CPM-NV kan krysse endothelial celle og regenerere axons på nervecellene i BBB-Minibrain når 4 h før lesjonen: (øvre panel) ordningen av eksperimentet. (nedre panel) kvantifisering av gjenfødelse. D. CPM-NV er også aktiv i en terapeutisk protokollen når den brukes 1t etter såret: (øvre panel) ordningen av eksperimentet. (nedre panel) kvantifisering av gjenfødelse. Kort student t-test to tailed ***p < 0,0001. Gjenfødelse ble beregnet fra tre eksemplarer eksperimenter (> 800 neurons telles) etter farging av neuronal cellene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen vi viste hvordan å bygge en i cellulo blod/hjernen grensesnitt, BBB-Minibrain, ved å kombinere en BBB modell og en blandet hjernen cerebral celler (Minibrain) i en enkelt kit. Dette systemet er biologisk relevant, enkel å sette opp og håndtere for forskere godt trent i cellekultur.

Som for alle andre i vitro modell av BBB, ville pålitelige resultater oppnås hvis drastisk kontroll av tetthet av barrieren. Setter inn bør testes nøye for permeabilitet og noen sett inn med utilstrekkelig permeabilitet verdier (dvs. en PeLY høyere enn 1.2) skal kastes.

FBS prøver skal testes nøye for å identifisere en satsvis jobb som ikke deaktiverer egenskapene til BBB. Samme råd kan gjøres om kjøretøy mediet i hvilke virus partikler eller biomolecules er utvannet. Det anbefales også å holde så liten som mulig volumet av biomolecule eller virus fjæring, for å ikke endre middels sammensetningen av luminal rommet. Differensiering av menneskelig co kultur Nevron/astrocyttene kultur fra Ntera/CL2. D1 er en velprøvd teknologi. I motsetning til menneskelige neurons som er etter mitotisk, er astrocyttene fortsatt dele celler. Høy spredning av astrocyttene cellene er noen ganger observert. Hvis dette skjer, har Minibrain kulturen forkastes. CHME/Cl5 cellene vi brukte i vårt laboratorium var phenotyped å bevise at de var menneskelige opprinnelse (Homo sapiens CCNT1 phenotyping). Det er en risiko som noen CHME mye brukt i noen laboratorier kan rotten (Rattus norvegicus) opprinnelse som hevdet av Garcia-Mesa Y. et al. (2017)46. Det anbefales derfor å kontrollere om opprinnelsen til CHME/Cl5 celle linjen.

Minibrain menneskelig tri-kultur systemet inkludert innlegg mitotisk nerveceller (hovedsakelig dopaminergic), etterligner astrocyttene og en microglial celle linje, et forenklet cerebral miljø. Dette systemet kan fortsatt bli bedre. Man kan forestille å legge oligodendrocytes til kulturen med mål å skaffe myelinated axons primære microglial celler. I minibrain kan også bli erstattet med en blandet kultur menneske-avledet stilk celler19,20,21. Likevel må variasjon mellom forskjellige partier av celler beherskes nøye. BBB-Minibrain kompleksitet kan også økes ved å legge pericytes23. I våre hender ble denne forbedringen hemmet av problemer pålitelig tilgang til pericytes av menneskets opprinnelse.

Vi har vist gjennomførbarhet og nytten av dette settet mimicking blod-hjerne-grensesnitt, for å i) isolere sjeldne neuroinvasive viruspartikler fra et gulfeber vaksine utvalg som har utviklet seg eiendommen for å inn i hjernen gjennom BBB, og ii). forsterke disse neuroinvasive Sub-populasjoner i Minibrain tri-kulturen etterligne en forenklet hjernen parenchyma. Framtidige applikasjoner kan være å utvide kvalitetssikringen av andre live vaksiner som kusma vaksinen og fremme BBB-Minibrain som et middel for å studere neurovirulence funksjoner i vitro.

Andre pilotstudien var å vise at et medikament kandidat passerer gjennom BBB og når Minibrain, uten å miste sin Nevro-regenererende egenskaper. Vi er sterkt overbevist om at BBB-Minibrain kan tillate store fremskritt i pre sorteringen av molekyler før slippe dem til prekliniske tester. Bruk av BBB-Minibrain skal lette gjennomføringen av 3Rs tiltak rettet mot å redusere bruken av dyr testing for både reglementary analyser og eksperimentell forskning.

Sammen med den neste utviklingen av i sili tilnærminger (datamaskinmodell), vil vi snart være identifisere narkotika kandidater med en høy sannsynlighet av å krysse BBB, utvikling av en 3D-modell i cellulo etterligne nervøs parenchyma blod grensesnittet ville være til stor hjelp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Opphavsrettighetene til systemet var patenter i 32, 35 og 38.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av interne tilskudd fra Institut Pasteur inkludert en Incitative grant (PTR 435) og stipend "Contrat de bra à la Recherche" gitt av Sanofi Pasteur til Institut Pasteur. A. da Costa ble støttet av Sanofi Pasteur grant og Florian Bakoa er mottaker av PhD stipend gitt av ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Vi er gjeld til Pr Pierre-Olivier Couraud og Dr Florence Miller for nyttig diskusjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 well plates Corning 3336
5-fluoro-2’deoxyuridine Merck-Sigma Aldrich F0503
85mm Petri Dish Sarstedt 83-3902-500
Anti-Nf200 Merck-Sigma Aldrich N4142
β-mercapto-ethanol Merck-Sigma Aldrich M3148
CHME/Cl5 Unité de Neuroimmunologie Virale On request to Dr Lafon
CMC Calbiochem 217274
Cytosine β-D-arabinofuranoside Merck-Sigma Aldrich C1768
Dark 96 well plates Corning 3915
DMEM F12 Thermofisher Scientific 31330-038
DMSO Merck-Sigma Aldrich D2650
Endogro IV Millipore SCME004 endothelial cell medium
Ethanol Carlo Erba 529121
FBS Hyclone SV30015-04
Formaldehyde Merck-Sigma Aldrich 252549
GIEMSA RAL Diagnostic 320310
Goat-Anti Mouse Jackson Immuno Research 115-545-003
Goat-Anti Rabbit Thermofisher Scientific R37117
HBSS with Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14025-100
hCMEC/D3 Cedarlane CLU512
Hepes 1M Thermofisher Scientific 15630-070
Hoescht 33342 Merck-Sigma Aldrich 33263
Laminine Merck-Sigma Aldrich L6274
L-glutamin Thermofisher Scientific 25030-024
Lucifer Yellow Merck-Sigma Aldrich L0259
MEM 10X Thermofisher Scientific 21430
MEM 1X Thermofisher Scientific 42360
Ntera/Cl2D.1 ATCC CRL-1973
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714
PBS without Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14190
PBS-Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14040-091
Pen/Strep Eurobio CXXPES00-07
Poly-d-Lysine Merck-Sigma Aldrich P1149
Prolong Gold Thermofisher Scientific P36930
Qiashredder QIAGEN 79656
Rat Collagen I Cultrex 3443-100-01
Retinoic Acid All-Trans Merck-Sigma Aldrich R2625
RNA purification kit QIAGEN 74104
SDS Merck-Sigma Aldrich L4509
Sodium bicarbonate 5.6% Eurobio CXXBIC00-07
Sodium Pyruvate Thermofisher Scientific 11360
T75 Cell+ Flask Sarstedt 83-1813-302 Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells
Transwell Corning 3460 polyester porous membrane culture inserts
Trypsin-EDTA Merck-Sigma Aldrich T3924
Ultra Pure Water Thermofisher Scientific 10977-035
Uridine Merck-Sigma Aldrich U3750
Versene Thermofisher Scientific 15040-033 EDTA
YFV-FNV IP Dakar Vaccine vial

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
  7. Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
  8. Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
  9. Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
  10. Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
  11. Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
  12. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
  13. Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
  14. Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
  15. Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
  16. Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
  17. Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37 (2017).
  18. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  19. Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
  20. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  21. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  22. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  23. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  24. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
  25. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  26. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
  27. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  28. Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
  29. Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
  30. Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671 (2014).
  33. Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
  34. da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
  35. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Lafaye, P. , EP3191510A1 (2014).
  36. Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
  37. Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
  38. Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
  39. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  40. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Wolff, N., Khan, Z., Terrien, E., Sanderine, V. , EP20110306454 (2011).
  41. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  42. Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408 (2018).
  43. Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
  44. Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
  45. Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
  46. Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).

Tags

Nevrovitenskap problemet 146 BBB-Minibrain i cellulo modell menneskelige endotelceller hCMEC/D3 Ntera/Cl2D.1 menneskelige Nevron menneskelige astrocytter menneskelige microglial celler CHME/Cl5
En menneskelig blod-hjerne-grensesnitt modell å studere barriere kryssinger av patogener eller medisiner og deres samhandling med hjernen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa,More

da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa, F., Afonso, P., Ceccaldi, P. E., Lafaye, P., Lafon, M. A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain. J. Vis. Exp. (146), e59220, doi:10.3791/59220 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter