Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo descreve a configuração de um cellulo em BBB (barreira hemato-encefálica)-cultura de poliéster membrana porosa Minibrain inserir o sistema a fim de avaliar o transporte de biomoléculas ou agentes infecciosos em um BBB humana e seus fisiológico impacto sobre as células cerebrais vizinhas.
Abstract
Início da triagem de medicamentos do sistema nervoso em uma pertinente e fiável no modelo BBB cellulo para sua penetração e sua interação com a barreira e o parênquima cerebral é ainda uma necessidade insatisfeita. Para preencher esta lacuna, nós projetamos um 2D no modelo cellulo, o BBB-Minibrain, combinando um poliéster membrana porosa cultura inserir BBB modelo humano com um Minibrain formado por uma tri-cultura de células do cérebro humano (neurônios, astrócitos e células microglial). O BBB-Minibrain nos permitiu testar o transporte de um candidato de medicamento neuroprotetor (por exemplo, Neurovita), através do BBB, para determinar o direcionamento específico desta molécula de neurônios e para mostrar que a propriedade neuroprotetor da droga foi preservada após a droga tinha atravessado o BBB. Também demonstrámos que BBB-Minibrain constitui um modelo interessante para detectar a passagem de partículas de vírus através da barreira de células endoteliais e monitorar a infecção do Minibrain por neuroinvasive partículas de vírus. O BBB-Minibrain é um sistema confiável, fácil de manusear para pesquisador treinado em tecnologia de cultura de células e preditiva de fenótipos de células do cérebro após tratamento ou insulto. O interesse de tais testes cellulo seria dupla: introdução derisking passos no início do desenvolvimento da droga, por um lado e reduzindo o uso da experimentação por outro animal.
Introduction
O cérebro é separado da circulação sistêmica por uma estrutura não-permeável que restringe as trocas entre o parênquima cerebral e o sangue, chamado a barreira hemato - encefálica (BBB). Na sua maioria composta de células endoteliais cerebrais, o BBB dinamicamente interage com astrócitos, micróglia perivascular e neurônios do parênquima cerebral vizinhas. As três principais funções do BBB são a criação e a manutenção da homeostase iónica para funções neuronais, fornecimento do cérebro com nutrientes e proteção contra lesões tóxicas ou entrada de patógenos1,2, que contribuem para a manutenção da homeostase do cérebro e suas funções3. Esta barreira é tão eficiente que apenas alguns medicamentos podem atravessar o BBB4,5. Actualmente, os métodos disponíveis para prever se uma molécula irá passar o BBB e se espalham o cérebro consistem em ex vivo estudos sobre rastreamento de imagem material, autópsia do cérebro de voluntários humanos por ressonância magnética (ressonância magnética) ou PET (posição de emissão tomografia computadorizada) ou farmacodinâmica e farmacocinéticos estudos pré-clínicos em animais6,7,8. Estas técnicas e modelos têm algumas limitações, como a resolução limitada do animal de estimação e a baixa sensibilidade de MRI6,8, a dificuldade de quantificar as moléculas (ou seja, moléculas de anticorpo com base, por exemplo) que mal penetrar o cérebro7e para o pré-clínicos estudos seu alto custo e estância de testes em animais.
O último ponto é importante porque, de acordo com a 3R regras, (substituição, redução e refinamento de experimentação animal) as administrações reguladoras pediram que os pesquisadores desenvolvem urgentemente alternativa cientificamente precisa ao animal experimentação9,10,11,12,13,14,15.
Nas últimas décadas, têm sido propostos vários modelos in vitro de BBB16,17,18 cultivando em filtro de membrana insere células endoteliais de diferentes espécies como o rato, rato, bovinos e suínos. Quanto a espécie humana é, a disponibilidade escassa e difícil de células primárias levou os pesquisadores a desenvolver modelos humanos baseados em células endoteliais do cérebro imortalizado ou células-tronco derivadas humanos19,20, 21. Estas barreiras são substitutos in-vitro adequados do BBB desde que eles expressam marcadores de célula endotelial, marcadores de junção apertada, transportadores de efluxo, portadores de soluto, receptores e responder a estímulos endotelial 20. Alguns modelos BBB usando inserções de filtro membrana revestidas com células endoteliais e outros tipos de células (ou seja, astrócitos, neurônios ou pericitos22,23,24) foram analisados. O objetivo dessas culturas co era aumentar as características físicas do BBB, aproveitando a secreção de fatores solúveis por astrócitos/neurônios ou pericitos.
No entanto, nenhum destes modelos inclui o parênquima cerebral para estudar e prever o destino de um candidato de drogas, uma vez que passou a barreira. Portanto, nosso objetivo era construir um cellulo em interface de sangue/cérebro, o BBB-Minibrain, combinando-se um modelo BBB e uma cultura de células cerebrais mistas em um único kit. O BBB-Minibrain usa um sistema de cultura que consiste em um filtro poroso, inserido em um poço de uma placa de cultura de células do multiwell. O filtro é revestido com células hCMEC/D3, uma linhagem de células endoteliais de cérebro humano que tem sido provada altamente confiável para droga BBB teste25,26,27, para formar o BBB. O Minibrain, que é uma cultura co diferenciada dos neurônios humanos e astrócitos derivados de28,o NTera/Cl2.D1 célula linha29 misturado junto com a linha de celular humana microglial CHME/Cl530 em proporção correspondente a microglia vs rácios de neurônio-astrócitos do cérebro31, é cultivada na parte inferior da placa bem.
Além de estudar a passagem de drogas através do BBB e o destino no parênquima, a interface de sangue-cérebro em cellulo modelo poderia ser uma ferramenta poderosa para lidar com a entrada de agentes patogénicos para o cérebro (neuroinvasiveness), a dispersão para o cérebro (neurotropismo) e a toxicidade (neurovirulence) podem exercer em células do parênquima cerebral. Estudos de Neurovirulence e neuroinvasiveness iria beneficiar o desenvolvimento de um eficiente no modelo cellulo e ser vantajoso para substituir os modelos animais. Usando o kit de BBB-Minibrain32, demonstrámos que o fenótipo neuroinvasive de raros mutantes virais que acumulados na francês neurotrópica estirpe do vírus do vírus da febre amarela (ou seja, FNV-YFV33,34) usada para preparar um descontinuados vacina viva YFV e a passagem de uma biomolécula neuroregenerative e neuroprotetor chamada Neurovita (conhecido como NV doravante no manuscrito)35. Porque NV nem naturalmente atravessa a membrana celular nem o BBB, NV foi fundida com a parte variável (VHH) de um anticorpo de cadeia única de lhama que atravessa as membranas biológicas incluindo o BBB e funciona como uma célula penetrante molécula (CPM)36. A propriedade CPM de VHH parece depender o ponto isoelétrico e o comprimento da VHH37.
Isto em cellulo teste deve tornar possível classificar as moléculas que potencialmente poderiam cruzar o BBB antes da realização de farmacocinética e análise farmacodinâmica em animais e, idealmente, ao mesmo tempo ser capaz de prever seu comportamento no sistema nervoso parênquima. Este sistema é fácil de configurar e manipular por profissionais bem treinados em cultura celular26,29,30,de38e biologicamente relevantes. O interesse de tais testes cellulo seria dupla: reduzindo os custos dos testes pré-clínicos de um lado e reduzir a utilização de testes em animais por outro lado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celular cultura trabalho da Ntera/CL2. D1 para preparar uma cultura co de hNeurons pós-mitótica e hAstrocytes (NT2-n/a)
Nota: Este é o componente da Minibrain (Figura 1).
- Cultivo do Ntera/Cl2.D1
- Remova um frasco de células congeladas de tanque de nitrogênio líquido. Manter-se no gelo.
- Descongele as células rapidamente em banho maria a 37 ° C.
- Transferir as células em um tubo de 15 mL contendo 10 mL de meio DMEM F12 completo (o meio Eagle modificado de Dulbecco: meio nutriente mistura F-12) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM, 100 UI de penicilina e 100 µ g estreptomicina (i.e., completa Meio DMEM F12).
- Centrifugar a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Dissocia a pelota em 2 mL de meio DMEM F12 completo.
- Transferência em um frasco de cultura de tecidos T75 em poliestireno com tratamento específico para as células aderentes sensíveis (T75Cell+) contendo 13 mL de meio DMEM F12 completo.
- Cultura de células em uma incubadora mantida a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade até confluência de 90% (ou seja, cerca de 5 dias). Médio de mudança a cada 2-3 dias.
- Repicagem o Ntera/Cl2.D1 e amplificação
- Retire o meio do balão.
- Enxágue a monocamada de células com 10 mL de solução salina tampão fosfato (PBS) suplementada com Ca2 + e Mg2 +.
- Enxágue a monocamada de células com 10 mL de solução de EDTA (mantida na RT).
- Adicionar 3 mL de solução de tripsina-EDTA (tripsina 0,05%, EDTA 0,02%) e incube a 2 min no RT
- Agitar o frasco e certifique-se que as células são separadas da superfície de plástico.
- Adicionar 10 mL de meio DMEM F12 completo para inactivar a tripsina, a transferência em um tubo de 15 mL e centrifugar durante 5 min à 200 x g em RT
- Dissociar a pelota com 10 mL de meio completo e use 1 mL para inocular cada novo frasco contendo 14 mL de meio DMEM F12 completo.
Nota: Trinta balões T75 celular+ são necessários para cada diferenciação. - Incube os frascos em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade até 90% de confluência.
- Diferenciação de NTera/Cl2.D1 em co-cultura neurônio humano-astrocyte
Nota: Este é o componente principal da Minibrain.- No dia 0, dissociar as células com tripsina-EDTA, conforme descrito na etapa 1.2 e dissociar o centrifugado de cada frasco com 2 mL de meio DMEM F12 completo.
- Adicione 1 mL de suspensão de célula (correspondente a 5 x 106 células) em 60 pratos de Petri plástico de 85 mm de diâmetro contendo 11 mL de meio DMEM F12 completo.
Nota: As células não é compatível com o plástico e agregarão a forma pseudo neurospheres (ver fotografia no painel inferior da Figura 1). Incube os 60 pratos de Petri em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade por um dia. - No dia 1, adicionar 1 mL de meio DMEM F12 completo suplementado com 130 µM de all-Trans ácido retinoico (ATRA) por placa de Petri (concentração final ATRA 10 µM) e retornar os pratos em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade por 24 h.
- No dia 2, transferir cuidadosamente a mídia que contém esferas de célula de cada Petri Dish em um tubo de 50 mL e centrifugar por 10 min a 50 x g e RT. se cuidadosamente o sedimento solto com 13 mL de meio DMEM F12 completo suplementado com 10 µM ATRA e adicionar th e 13 mL em um novo diâmetro de 85 mm placa de Petri.
Nota: Sobre as passagens diferentes, é extremamente importante manter a densidade de esferas tão alta quanto a densidade obtida no dia 2 (ou seja, em torno de uma densidade de 70%). Portanto, se a densidade da esfera está baixando, reduza o número total de placas de Petri de acordo com o número de células. - Repita o procedimento acima (passo 1.3.4) nos dias 4, 6 e 8.
- No dia 10, repita o procedimento acima, mas adicione as esferas para os frascos de célula T75+ em vez de placas de Petri. Adicione as células de uma placa de Petri para um balão de célula T75+ .
- No dias 11, 13, 15 e 17, mude o meio usado com 14 mL de completa DMEM F12 suplementadas com 10 µM ATRA.
- No dia 19, mude o meio com 14 mL de meio DMEM F12 completo, sem ATRA por balão.
- No dia 20, dissocia suavemente as células com tripsina/EDTA como segue.
- Para cada frasco de célula T75+ , enxágue as células com 10 mL de PBS suplementado com Ca2 + e Mg2 +; Incube as celulas com 4 mL de EDTA durante 5 min à RT
- Retire cuidadosamente o EDTA e adicionar 2 mL de EDTA-tripsina e incubar 7 min em RT. agitar suavemente o frasco e adicione cuidadosamente a 8 mL de meio DMEM F12 completo.
- Centrífuga de 10 minutos a 160 x g e RT. dissociar o centrifugado em 13 mL de meio DMEM F12 completo e transferência em um balão de célula T75+ .
Nota: A dissociação muito suave com tripsina-EDTA permitirá recuperar o ATRA células de células teratocarcinoma original, que estão fortemente conectadas para o ware plástico diferenciadas.
- No dia 21, remova o meio e as células mortas. 14 ml de meio DMEM F12 completo suplementado com 5% FBS, glutamina 2 mM, 100 UI penicilina, 100 µ g estreptomicina e 0,5 µM de AraC (citosina β-D-arabinofuranoside) (completar 5% FBS DMEM F12-AraC).
- No dias 23, 25 e 28, substituir usado médio com 14 mL de 5% FBS DMEM F12-AraC.
- Aos 29 dias até 49 (a cada dois dias), substituir usado médio com 14 mL de meio DMEM F12 completo suplementado com 5% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 UI de penicilina, 100 µ g estreptomicina, 5 µM de FudR (5-fluoro-2' desoxiuridina) e 10 µM Urd (uridina) (5% completa FBS DMEM F12-FudR-Urd).
- Em 50 dias, substituir usado médio com 14 mL de meio DMEM F12 completo suplementado com 5% FBS, glutamina 2 mM, 100 UI de penicilina, 100 µ g estreptomicina e 10 µM Urd (completar 5% FBS DMEM F12-Urd).
- Em 51 dias até 95 (duas vezes por semana), substituir usado médio com 14 mL de completa 5% FBS DMEM F12-Urd.
Nota: As células podem ser usado para experiências do dia 51 mas tardar dia 95. O uso de tratamentos seriais com inibidores da mitose permite recuperar a população pura de co-cultura de pós mitótica hNeuron e hAstrocytes (NT2-n/a). - Para propagar as células, com suave tripsinização seguir o procedimento descrito por dia 20.
2. célula cultura trabalho de humano microglial células CHME/Cl5
Nota: Este é o componente microglial do Minibrain (Figura 1).
- Cultivo a microglial humana células CHME/Cl5
- Remova o tanque de nitrogênio líquido, um frasco de células congeladas. Manter-se no gelo.
- Descongelar rapidamente em banho maria a 37 ° C.
- Transferi as células em um tubo de 15 mL contendo 10 mL de meio DMEM F12 completo suplementado com 5% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 UI de penicilina e 100 µ g estreptomicina (ou seja, 5% FBS DMEM F12 meio completo).
- Centrifugar a 200 x g por 5 min na RT. se a pelota com 2 mL de meio de FBS DMEM F12 5% completo.
- Transferir um balão de T75 celular+ contendo 13 mL de meio de FBS DMEM F12 5% completo.
- Células de cultura a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade até 90% de confluência. Médio de mudança a cada 2-3 dias.
- Repicagem as células humanas microglial CHME/Cl5
- Remova o frasco médio.
- Enxágue a monocamada de células com 10 mL de PBS suplementado com Ca2 + e Mg2 +.
- Enxágue a monocamada de células com 10 mL de solução de EDTA (mantida na RT).
- Adicionar 3 mL de solução de tripsina-EDTA e incubar a 2 min no RT
- Agitar o frasco e certifique-se que as células são separadas da superfície de plástico.
- Adicionar 10 mL de meio de FBS DMEM F12 5% completo para inactivar a tripsina, a transferência em um tubo de 15 mL e centrifugar durante 5 min à 200 x g e RT
- Dissociar a pelota com 10 mL de meio completo e use 1 mL para inocular cada novo frasco contendo 14 mL de meio de FBS DMEM F12 5% completo.
- Incube os frascos em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade até 90% de confluência.
3. cultura trabalho com o hCMEC/D3 para o revestimento porosas inserções e preparar BBB
- Cultivo de células endoteliais humanas hCMEC/D3 (Figura 2)
- Dilua o tipo eu rato colágeno para 01:30 com pura água estéril (grau de cultura de células).
- Transferir 10 mL para um balão de célula T75+ e incubar a 2 h em 37 ° C, 5% de CO2 e incubadora de umidade de 95%.
- Remover a solução de colágeno e substituí-lo com 15 mL de meio de célula endotelial suplementado com 10 mM de HEPES (conhecido como meio de célula endotelial completa).
- Remova um frasco de cryo de células do tanque de nitrogênio líquido. Manter-se no gelo.
Nota: As células foram cultivadas, e um lote de sementes foi feito conforme descrito pelo fabricante. A linha celular é coberta por um acordo de transferência de material biológico. As células são obtidas no número de passagem 25 e não devem ser utilizadas mais do que 35 de passagem. - Descongelar rapidamente em banho maria a 37 ° C.
- Transferir as células no frasco T75 celular+ e retornar o frasco a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade para 2 a 4 h.
- Retire cuidadosamente o meio sem perder ou removendo células. Enxague as células uma vez com 10 mL de meio de célula endotelial completa.
- Adicione 15 mL de meio de célula endotelial completa.
- Células de cultura a 37 ° C, 5% de CO2 e umidade de 95% até 100% confluência (não menos de 4 dias) sem alterar o meio.
- Repicagem o hCMEC/D3 para preparar a inserção do BBB
- Revestir um novo balão T75 celular+ ou insere com o tipo rato colágeno como descrito acima (passo 3.1).
- Retire o meio do balão. Enxágue a monocamada de células com 10 mL de PBS suplementado com Ca2 + e Mg2 +.
- Adicionar 2 mL de solução de tripsina-EDTA e incubar 5 min a 37 ° C.
- Agitar o frasco e certifique-se que as células são totalmente separadas da superfície de plástico.
- Adicione 4 mL de meio de célula endotelial completa para inactivar a tripsina.
- Com uma pipeta de 5 mL de plástico, dissocia mecanicamente as células por aspiração e irrigando a suspensão de células, enquanto mantendo a pipeta de 5 mL para o fundo do recipiente de pelo menos 5 vezes.
- Contar as células e uso 5 x 104 células/inserção para uma cultura de membrana de poliéster bem 12 insere inserir e 2 x 106 células para um balão de célula T75+ . Prepare-se também três filtros sem células para os experimentos de PELy (i.e., permeabilidade de células endoteliais para ver Lúcifer amarelo abaixo n º 4.2) com as inserções de cultura de membrana de poliéster.
- Incube os frascos ou inserções em 37 ° C, 5% de CO2 e umidade de 95% até 100% de confluência.
- Não altere o meio para balão T75 celular+ até uma nova passagem. Ao contrário de BBB na cultura de membrana de poliéster insere: alterar médio nos dias 2 e 4, use o BBB para experiências no dia 6.
4. construção e controle de qualidade do BBB-Minibrain (Figura 2)
- Criação de um poliéster de BBB-Minibrain cultura de membrana inserir dispositivo (Figura 2B)
- Crescem as células hCMEC/D3 em 12 bem poliéster cultura membrana inserir filtros por 6 dias no meio da célula endotelial antes de usá-los para o experimento.
- Revesti uma placa bem 12 com poli-D-lisina (1 mL/bem, 10 µ g/mL, 4 h em RT) e, em seguida, laminina (1 mL/poço, 1 µ g/mL, a noite no RT).
- Remover laminina e adicionar 1 mL de meio de célula endotelial suplementado com 5% FBS (média de 5% de células endoteliais).
- Incube durante 1 h a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
- Delicadamente trypsinize o NT2-n/d (conforme descrito na etapa 1.3.9) e CHME/Cl5 (conforme descrito no passo 2.2) e dissociar as pelotas de célula com o meio de célula endotelial completa.
- Conte as células, mistura 3,6 x 105 NT2-N/A e 0,4 x 105 CHME/Cl5 células/poço e bem placa semente a 12.
- Em T = 24 h (24 h após a semeadura): alterar o meio usado com meio fresco completa célula endotelial (células Minibrain e células endoteliais) e transferir o filtro de inserção da membrana de poliéster hCMEC/D3 cultura na parte superior das células Minibrain. Incube a BBB-Minibrain em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
Nota: O Minibrain-BBB então consistirá em uma camada de células endoteliais humanas hCMEC/D3 no filtro, isolando o compartimento luminal (ou compartimento "sangue") e de uma cultura mista de células humanas hNT2-n/d e hCHME/Cl5 (Minibrain) na parte inferior da definição bem o compartimento de abluminal (ou compartimento de "cérebro") (Figura 2B).
- Validação de permeabilidade endotelial do BBB-Minibrain (controle de qualidade) (Figura 2)
- Prepare a reserva de transporte (TB), que é o buffer HBSS (Hanks equilibrada solução salina) com Ca2 + e Mg2 + suplementado com piruvato de sódio HEPES e 1mm de 10 mM.
- Prepare-se 12 placas bem com 1,5 mL de tampão de transporte por bem.
- Em T = 0, fazer nova reserva transporte suplementado com 50 µM amarelo de Lúcifer (LY-TB).
- Reverta cada filtro de cabeça para baixo para remover cuidadosamente o meio sem afetar a barreira de células endoteliais.
- Coloque o filtro na placa 12 bem preenchida e adicionar 0,5 mL de LY-TB.
- Incube as placas em uma incubadora a 37° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
- A transferência de T = 10 min os filtros na nova TB encheu 12 placas bem e mantém o compartimento das abluminal da primeira placa para leitura de OD.
- Em T = 25 min, repita a etapa 4.2.7.
- Em T = 45 min, pare o transporte removendo os filtros das placas. Manter abluminal e compartimentos luminal para medidas de OD.
- Transferência em um escuro 96 placas bem as amostras: 10 µ l com 190 TB µ l para o LY-TB e os compartimentos de luminal, 200 µ l de amostra para os compartimentos de abluminal.
- Medir a fluorescência de LY-TB presente nas amostras de diferentes λ428 nm λ535 nm (comprimento de excitação e emissão de ondas respectivamente).
- Calcule a permeabilidade endotelial (Pe) em direção a LY-TB (PeLY) de acordo com Siflinger-Birnboim, A et al. (1987)39 e Da Costa, A. et al (2018)34 usando a fórmula:
1/PSe = (1/PSt) – (1/PSf) e PeLY= PSe/S.
Nota: O PSf é a permeabilidade do filtro sem células, PSt é a permeabilidade do filtro com células, PSe é a permeabilidade do tempo monocamada endotelial a superfície da monocamada, S é a superfície da monocamada (para um filtro bem 12 = 1,12 cm2 ), PeLY é expresso em cm/min. Para hCMEC/D3 o PeLY deve ser entre 0,7 e 1,2 x 10-3 cm/min dependendo principalmente o FBS utilizados nos experimentos. Importante: um PeLY superior 1.2 significa que o BBB não está apertado o suficiente e pode-se observar algum vazamento. Descarte essas barreiras.
5. uso do BBB-Minibrain para destacar a presença de partículas virais neuro-invasiva em uma amostra de vacina contra vírus da febre amarela, o vírus francês neurotrópica, YFV-FNV 34 (Figura 3)
- Cruzamento de BBB e multiplicação do vírus da febre amarela na Minibrain
- Usar o BBB-Minibrain preparado conforme descrito na etapa 4.1.7 24 h antes da adição do vírus; Substitua o médio por meio de célula endotelial FBS 2%.
Nota: É extremamente importante evitar alterar o meio apenas antes de adicionar o vírus. Mudar o meio pode ativar as células endoteliais humanas e transitoriamente abrir a barreira que permitirá a passagem do vírus. Aqui o meio é alterado 24 h antes de iniciar o experimento. - Em T = 0, adicione 3500 placa formando unidades (PFU) de YFV-FNV diluído em 50 µ l de 2% médio de célula endotelial FBS cuidadosamente na parte superior do compartimento luminal. O controle Minibrain-BBB é inoculado com 50 µ l de meio de célula endotelial de FBS 2% sem vírus. Determine PeLY , companheiro bem.
- Incube a BBB-Minibrain em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
- Após 24h, retire o dispositivo de filtro membrana de poliéster inserções de cultura e determinar PeLY, amostra de 1 mL do compartimento de abluminal e titula-se o vírus como descrito pela. da Costa et al (2018)34. Substitua o meio meio de célula endotelial FBS fresco 2%.
- Incube a BBB-Minibrain em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
- Depois de 72 h, o meio do compartimento do abluminal da amostra e titula-se o vírus, e/ou extrair o RNA das células Minibrain para análise de expressão do gene como descrito pela. da Costa et al (2018)34.
- Usar o BBB-Minibrain preparado conforme descrito na etapa 4.1.7 24 h antes da adição do vírus; Substitua o médio por meio de célula endotelial FBS 2%.
- Amplificação de variantes neurotrópica YFV-FNV em células Minibrain por passagens seriais
- Uso Minibrain células revestido 12 placas bem (ou seja, as etapas 4.1.6 e 4.1.7).
- Em tempo de ponto h 0, adicionar 3.500 placa formando unidades de YFV-FNV diluído em 50 µ l de meio de célula endotelial 2% FBS cuidadosamente na parte superior das células (compartimento luminal).
- Depois de 1 h, remover o meio com a inoculação do vírus e substitua por meio de células endoteliais FBS fresco 2%.
- Após 48 h, 500 µ l do meio de cultura da amostra e infectar células frescas de Minibrain
- Após 120h, 500 µ l do meio de cultura da amostra e infectar células frescas de Minibrain.
- Após 192 h, salvar o meio de cultura (= estoque de vírus enriquecido) e extrair o RNA das células Minibrain para análise de expressão do gene como descrito pela. da Costa et al (2018)34.
6. uso de BBB-Minibrain para estudar a passagem de BBB e cérebro célula alvo de uma biomolécula
- Transportar através do BBB de um neurônio direcionamento biomolécula
- Use o Minibrain-BBB preparado como descrito passo 4.1.7.
- No ponto de altura h 0, adicionar a biomolécula (no exemplo fornecido na seção de resultado, 58.75 ng/BBB das moléculas NeuroTag-NV permeant célula foram adicionados por BBB-Minibrain inserir.
- Incube a BBB-Minibrain em 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
- Após 24h, retire o dispositivo de filtro membrana de poliéster inserções de cultura e determinar PeLY, manchar as células Minibrain para Neurofilamento hNeurons Nf200 e detectar a presença da biomolécula no Minibrain (no exemplo fornecido no resultado seção, NeuroTag-NV foi detectada usar um anticorpo dirigido contra o estreptococo-Tag contém35,,40).
- Transportar através do BBB de uma biomolécula neuroregenerative e ensaio subsequente neuroprotective no Minibrain depois a biomolécula cruzou o BBB
- Use o Minibrain-BBB preparado conforme descrito na etapa 4.1.7.
Nota: Para moléculas visando apenas neurônios, células de Minibrain podem ser substituídas por apenas os neurônios células (NT2-N),38. - No ponto de altura h 0, adicione 58.75 ng/BBB-Minibrain bem das células permeant NV moléculas (formulário ativo CPM-NeuroTag-NV, forma não-ativa CPM-NeuroTag-NVΔ) descrito por C. Prehaud et al (2014)35.
- Incube a BBB-Minibrain em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
- Após 4 h, fazer feridas individuais com uma agulha de injeção (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, Bélgica) nas células Minibrain. Fazer pelo menos 10 arranhões em cada indivíduo bem. Determine PeLY , o companheiro bem.
- Incube a BBB-Minibrain em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
- Após 8 h, substitua o medium no compartimento de abluminal por meio de célula endotelial completa fresco.
Nota: É importante substituir o médio a este passo, desde o ferimento das células Minibrain pode levar à morte celular e, em seguida, a liberação de compostos citotóxicos. - Incube a BBB-Minibrain em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade.
- Após 48 h, manchado as células para a regeneração do axônio de hNeurons como descrito por C. Prehaud et al (2013)40.
- Use o Minibrain-BBB preparado conforme descrito na etapa 4.1.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O BBB-Minibrain é uma em cellulo experimental modelo de interface de sangue-cérebro.
O BBB-Minibrain está configurado no sistema de inserção de cultura de membrana de poliéster para imitar um compartimento de sangue no piso superior e um compartimento de cérebro no piso inferior da interface do sangue-cérebro (Figura 2AB). Consiste em um compartimento luminal com as células endoteliais hCMEC/D3 no filtro formando o BBB e um compartimento de abluminal, que contém a Minibrain humano tri-cultura de células cerebrais (neurônios, astrócitos e células microglial). As células Minibrain apresentam uma tri-cultura clássica misturada população fenótipo (Figura 1, painel canto inferior direito) e marcadores expressam específicos de cada tipo de célula, como mostrado da Costa, r. et al, 201834.
O uso da camada de hCMEC/D3 no BBB-Minibrain permite a obtenção de uma barreira forte com um Pe significaLY de 0.95e-03 cm/min e um mau Trans endotelial elétrico resistência (TEER) de 51.89 Ω/cm2. Esses valores estão na faixa dos melhores valores já descrito por uma linha de células endoteliais humanas27,41 em tal membrana de poliéster cultura inserir sistema (Figura 2). Estas células expressam marcadores de proteína junção apertada como ZO-1 e caderina como esperado pela quantificação da permeabilidade (dados não mostrados). Eles expressam também todos os subconjuntos de receptores, efluxo transportadores ou transportadores [receptores: LDLR, do receptor da lipoproteína de baixa densidade; LRP1, do receptor da lipoproteína de baixa densidade relacionados a proteína 1; Rei, receptor de insulina; LEPR, receptor de leptina; LU, molécula de adesão de célula basal; TFRC, CD71 do antígeno; AGER, avançado do receptor do produto final de glicosilação. Transportadores de efluxo: ABCB1 (P-gp); ABCG2 (BCRP); ABCC1 (MRP1); ABCC2 (MRP2); ABCC4, ABCC4 de proteína; ABCC5, ABCC5 proteína. Transportadores: STRA6, estimulada pela proteína de 6 de gene ácido retinoico; SLC2A1, transportador de glicose tipo 1; SLC7A5, grandes aminoácidos neutros transportador 1; SLC1A1, proteína da família 1 portador de soluto; SLC38A5, soluto transportador família 38 membro 5 de proteínas; SLC16A1, monocarboxylate transportes proteína 1], que são chaves relevantes proteínas para suas funções biológicas (Figura 2D)21.
O BBB-Minibrain permite selecionar, amplificando e caracterizando neuroinvasive raras variantes virais de uma preparação de vacina de vírus vivo.
O dispositivo de cultura BBB-Minibrain foi usado como um cellulo em teste permitindo isolamento e amplificação de raras variantes de neuroinvasive/neurovirulent potencialmente presentes no vírus da febre amarela de vacinas virais vivas (YFV)42. YFV é um vírus viscerotrópica segmentação do fígado que não atravessa eficientemente o BBB. O vírus neurotrópica francês, FNV, foi usado como uma vacina viva do YFV até a década de 198033,43. Fábrica nacional de vagões foi encontrado para causar neuropatogênese pós-vacinal em crianças (0,3 a 0,4% entre vacinados) e assim foi descontinuada em 198233,43. Nós usamos FNV aqui como um protótipo de vírus YF que podem conter uma elevada proporção de variantes de neuroinvasive/neurovirulent42,44. Uma preparação de vírus FNV (ou seja, 3500 PFU/ml) foi adicionado no compartimento luminal de um BBB-Minibrain, o controle era um BBB-Minibrain que foi infectado por simulação. Presença de partículas de vírus no compartimento luminal não altera a permeabilidade da barreira como medido 24h mais tarde desde que o PeLY em poços virais não era diferente do PeLy de poços de controle (0,80 ± 0,09 x 10-3 cm/min e 0,86 ± 0,09 x 10-3 cm/min. para PeLY no controle e YFV-FNV poços respectivamente). O conteúdo do compartimento de abluminal foi avaliado a presença de vírus por ensaio de placa, na infecção de post de 24 h. As células de Minibrain foram incubados a dois dias para avaliar a amplificação das variantes de neuroinvasive nas células do cérebro e monitorar a expressão de gene, como descrito no desenho animado mostrado na Figura 3A.
Nós detectamos alguns vírus YFV-fábrica nacional de vagões, que podem cruzar o BBB em 24 h (quer dizer 43 PFU/mL). Os vírus foram ampliados para os próximos dois dias, pela multiplicação do vírus dentro das células do cérebro (quer dizer o título de 4.69 x 104 PFU/mL), (Figura 3B). Digno de nota, uma preparação de estirpe de vacina que não provoque neuropatogênese pós-vacinal não eficientemente atravessaria o BBB neste sistema como foi demonstrado da Costa, r. et al (2018)34. Nós identificamos dois biomarcadores da multiplicação do vírus: O Interferon estimulada Gene 15 (ISG15) e o Interferon regulamentar fator 7 (IRF7). As expressões de biomarcadores estes dois foram estimuladas quando esta população viral neuroinvasive em série foi passada em células de Minibrain (Figura 3). Estes upregulations medidos pela Q-RT-PCR foram estritamente correlacionados com a carga viral (Pearson p valor 0.0016 para ISG15 e 0.0260 para IRF7).
BBB-Minibrain permite ambos de análise a capacidade de uma biomolécula para passar a barreira e ao mesmo tempo testar se a função biomolécula foi preservada após cruzamento de BBB.
NV é uma biomolécula derivada do vírus da raiva, que possui propriedades impressionantes de neuroproteção e Epilepsias40. Este pequeno polipeptídeo que naturalmente também não atravessa a membrana celular nem o BBB foi fundido com um CPM capaz de direcionar os neurônios. Nossa escolha foi usar a parte variável (VHH) de um anticorpo de cadeia única de lhama que atravessa as membranas biológicas incluindo o BBB36,45 e um NeuroTag como alvo os neurônios especificamente. NV foi ligado para o VHH e um NeuroTag, para construir um CPM-NeuroTag-NV (Figura 4A) e o VHH apenas para construir um CPM-NeuroTagΔ-NV falta o NeuroTag específico, permitindo o direcionamento dos neurônios (Figura 4B). Após ser adicionado ao compartimento luminal, CPM-NeuroTag-NV (pontos verdes) cruza o BBB e foi capaz de alvo humanos neurônios (em vermelho) (Figura 4, D). CPM-NeuroTagΔ-NV atravessa a barreira de células endoteliais (pontos verdes), mas metas menos eficientemente os neurônios humanos (a maioria dos pontos verdes estão localizados fora os neurônios) (Figura 4).
Conforme descrito acima, NV foi ligado a um VHH e um NeuroTag para construir um CPM-NeuroTag-NV. Fizemos o mesmo para NVΔ uma forma inactiva de NV falta a parte ativa do NV (CPM-NeuroTag-NVΔ) (Figura 5A). Após ser adicionado ao compartimento Luminal, CPM-NeuroTag-NV cruza o BBB e foi capaz de se regenerar axônios de neurônios humanos após ferimento (Figura 5B, painel direito), ao contrário de CPM-NeuroTag-NV Δ a forma inativa de NV (Figura 5B, à esquerda painel)40. Essas propriedades foram doseadas em dois tipos de protocolos; em uma pré-exposição (Figura 5) ou no protocolo de exposição post (Figura 5). Quando aplicado antes do axônio coçar (4h, H4), CPM-NeuroTag-NV desencadeia a neuroproteção dos neurônios feridos e a regeneração axonal ao contrário do mock tratados células (ou seja, controle) ou as células tratadocom com CPM-NeuroTag-NVΔ (média regeneração 91% e 12% - 10% respectivamente, Figura 5). Quando a biomolécula foi aplicada após as lesões axonal (1 hora, H1, Figura 5), a fim de imitar um protocolo terapêutico pós-exposição, o CPM-NeuroTag-NV ainda é capaz de regenerar axônios ao contrário da forma deficiente de CPM-NeuroTag-NV Δ ( significa regeneração 85% e 5,1%, respectivamente) (Figura 5).
Figura 1: modelo de Minibrain a. Tabela de tempo das culturas NT2-n/d e CHME/Cl5 (painel superior). Fotografias (painéis inferiores) da linha de célula original (Ntera/cl2. D1) no painel a esquerda, o pseudo neurospheres obtidos após tratamento ATRA no painel superior médio, o CHME/Cl5, no painel inferior médio e o triculture de Minibrain (Cristal violeta mancha), no painel direito, resultante da mistura de NT2-n/d e CHME / CL5 culturas. Escala da barra 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: o modelo de BBB-Minibrain. A. calendário das culturas hCMEC/D3 e fotografia do dispositivo BBB-Minibrain: um poliéster cultura inserções-filtro de membrana com barreira endotelial hCMEC/D3 é realizado com uma pinça antes de ser inserido em um poço de 12 poços celular placa de cultura. B. Cartoon descrevendo o dispositivo com compartimento de luminal (sangue), contendo a barreira da célula endotelial e o compartimento abluminal (cérebro), que contém as células de Minibrain (humanos neurônios, astrócitos e células microglial). C. medidas representativas do BBB-Minibrain permeabililty por TEER (i.e., TransEndothelial resistência elétrica) em três dispositivos ou permeabilidade ao LY (i.e., PeLY) em cinco filtros. D. análise de expressão pela q-RT-PCR, dos receptores, transportadores de efluxo e transportadores sobre as células endoteliais hCMEC/D3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: modelo do BBB-Minibrain permite a identificação de variantes de neuroinvasive entre a preparação de vacina YFV ao vivo. R. agenda do experimento. B. quantificação dos vírus que cruzaram o BBB pela placa formando titulação de unidade (PFU) de vírus vivo (cada ponto representa um experimento de inserções de cultura de membrana de poliéster). C. trama da expressão do gene ISG15 e IRF7 medido pelo q-RT-PCR em função do número de partículas virais na carga viral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O BBB-Minibrain permite o teste de neuroregenerative biomolécula Propriedades: direcionamento específico dos neurônios quando NV é fundido para NeuroTag. A. Cartoon do CPM baseado NV (ou seja, CPM-NeuroTag-NV), contendo um NeuroTag específico para neurônio-alvo especificamente. B. Cartoon do CPM baseado NV excluído da NeuroTag (ou seja, CPM-NeuroTagΔ-NV). C. fotografias de imunofluorescência representativa dos neurônios humanos. Escala da barra 50 µm. 200 NF em vermelho, CPM-NeuroTag-NV/CPM-NeuroTagΔ-NV em verdes, núcleos em azul. D. moléculas de CPM-NeuroTag-NV podem atravessar o BBB e alvo humanos neurônios mais eficientemente do que CPM-NeuroTagΔ-NV. Neurônios infectados e população total de neurônios foram contados em triplicado slides após immunolabeling. Neurônios totais correspondem às células positivas NF200 (em vermelho). Qualquer eritrócitos associados com um ou mais ponto verde (CPM-NV) é contado como um neurônio positivo. Não emparelhadas teste t de student-dois de cauda * * *p = 0,0002. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: O BBB-Minibrain permite o teste de neuroregenerative biomolécula Propriedades: travessia do BBB não altera as propriedades de neuroregenerative do NV. A. Cartoon do CPM baseado NV (ou seja, CPM-NV) e sua contraparte com deficiência (ou seja, CPM-NVΔ). B. regeneração do axônio de CPM-NV em um em cellulo zero ensaio (painel direito). CPM-NVΔ não pode acionar a regeneração do axônio (painel esquerdo), escala bar 100 µm. C. CPM-NV pode atravessar a célula endotelial e regenerar axônios sobre os neurônios do BBB-Minibrain quando aplicado 4 h antes da lesão: esquema (painel superior) do experimento; (painel inferior) a quantificação da regeneração. D. CPM-NV também é ativa em um protocolo terapêutico quando é aplicado 1 h após o ferimento: esquema (painel superior) do experimento; (painel inferior) a quantificação da regeneração. Não emparelhadas teste t de student-dois de cauda * * *p < 0,0001. Regeneração foi calculada a partir de experiências de três vias (> 800 neurônios contados) depois da coloração das células neuronais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste artigo demonstramos como construir um cellulo em interface de sangue/cérebro, o BBB-Minibrain, combinando-se um modelo BBB e uma cultura de misturado cérebro células cerebrais (Minibrain) em um único kit. Este sistema é fácil de configurar e manipular para experimentadores bem treinados em cultura de células, biologicamente relevantes.
Quanto a qualquer outro modelo in vitro de BBB, seria obtidos resultados fiáveis se drástico controle da tensão da barreira é aplicado. Inserções devem ser cuidadosamente testadas para permeabilidade e qualquer inserção com valores de permeabilidade inadequada (ou seja, um PeLY superior 1.2) devem ser descartados.
Amostras FBS devem ser testadas cuidadosamente para identificar um lote que não desativa as características do BBB. O mesmo Conselho pode ser feito em relação a veículo médio no qual vírus partículas ou biomoléculas são diluídas. Também é aconselhável manter o volume de suspensão biomolécula ou vírus, tão pequena quanto possível a fim de não alterar a composição média do compartimento luminal. Diferenciação de cultura de neurônio/astrócitos co-cultura humana desde o Ntera/CL2. D1 é uma tecnologia comprovada. Em contraste com neurônios humanos que são pós mitóticos, astrócitos ainda dividir células. Às vezes observa-se alta proliferação das células astrócitos. Neste caso, a cultura de Minibrain tem que ser descartados. As células CHME/Cl5 que usamos no nosso laboratório foram phenotyped para provar que eles eram de origem humana (Homo sapiens CCNT1 fenotipagem). Há um risco que alguns lotes CHME usados em alguns laboratórios podem ser de origem de rato (Rattus norvegicus), como alegado por Garcia-Mesa Y. et al. (2017)46. Portanto, é recomendável para verificar a origem da linhagem celular CHME/Cl5.
O sistema de tri-cultura humana Minibrain incluindo post mitótica neurônios (principalmente dopaminérgico), astrócitos e uma linha de celular microglial, imita um ambiente simplificado e cerebral. Este sistema ainda pode ser melhorado. Pode-se imaginar adicionando oligodendrócitos à cultura com o objetivo de obter dendritos ou pilhas microglial primário. O minibrain também pode ser substituído por uma cultura mista de células-tronco derivadas humanos19,20,21. No entanto, a variabilidade entre diferentes lotes de células terá de ser cuidadosamente dominado. A complexidade de BBB-Minibrain também pode ser aumentada pela adição de pericitos23. Em nossas mãos, esta melhoria foi impedida pela dificuldade de ter acesso confiável ao pericitos de origem humana.
Temos demonstrado a viabilidade e a utilidade deste kit imitando a interface de sangue-cérebro, para i) isolar partículas de vírus raro neuroinvasive partir de uma amostra de vacina de febre amarela que evoluíram a propriedade para entrar no cérebro através do BBB, e ii). amplifica estas sub-populações de neuroinvasive na Minibrain tri-cultura imitando uma parênquima cerebral simplificado. Futuras aplicações podem ser para estender o controle de qualidade de outras vacinas vivas como a vacina da papeira e para promover o BBB-Minibrain como um meio para estudar características de neurovirulence in vitro.
O segundo estudo piloto foi para mostrar que um candidato droga atravessa o BBB e atinge o Minibrain, sem perder suas propriedades neuro-regenerativa. Estamos firmemente convencidos de que o BBB-Minibrain pode permitir grandes avanços na pré-triagem das moléculas antes de liberá-los para testes pré-clínicos. O uso do BBB-Minibrain deve facilitar a execução do 3Rs medidas destinadas a reduzir o uso de testes para ensaios regulamentado e pesquisa experimental com animais.
Completamente com o próximo desenvolvimento em silico abordagens (modelo de computador), logo seremos capazes de identificar candidatos da droga com uma probabilidade alta de cruzar o BBB, o desenvolvimento de um modelo 3D em cellulo imitando o sangue do parênquima nervoso interface seria de grande ajuda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A propriedade intelectual do sistema foi as patentes referenciados em 32, 35 e 38.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado por concessões internas do Institut Pasteur incluindo uma subvenção Incitative (PTR 435) e por uma concessão "Contrat de Soutien à la Recherche" fornecido pela Sanofi Pasteur ao Institut Pasteur. A. da Costa foi apoiado pela concessão de Sanofi-Pasteur e Florian Bakoa é beneficiário de uma bolsa de doutoramento fornecida pelo ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Estamos em dívida para Pr Pierre-Olivier Couraud e Dr Florença Miller para debates úteis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well plates | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
| Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
| Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
| Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
| Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
- Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
- Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
- Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
- Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
- Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
- Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
- Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
- Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
- Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
- Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37 (2017).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
- Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
- Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
- Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671 (2014).
- Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
- da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
- Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Lafaye, P. , EP3191510A1 (2014).
- Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
- Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
- Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
- Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
- High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Wolff, N., Khan, Z., Terrien, E., Sanderine, V. , EP20110306454 (2011).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408 (2018).
- Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
- Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
- Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
- Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).
