Summary
Aquí presentamos un protocolo que describe la configuración de un cellulo en BBB (barrera hematoencefálica)-cultura de membrana porosa poliester Minibrain insertar sistema para evaluar el transporte de biomoléculas o agentes infecciosos a través de una BBB humana y sus impacto fisiológico en las células cerebrales vecinas.
Abstract
Principios de detección de medicamentos del sistema nervioso en un pertinente y confiable en el modelo de cellulo BBB para su penetración y su interacción con la barrera y el parénquima cerebral sigue siendo una necesidad insatisfecha. Para llenar este vacío, hemos diseñado un 2D en modelo de cellulo, BBB-Minibrain, mediante la combinación de una membrana porosa cultura inserto humano BBB modelo un Minibrain formado por una tri-cultura de células de cerebro humano (neuronas, astrocitos y células de la microglía) de poliéster. El BBB-Minibrain nos permitió probar el transporte de un candidato a fármaco neuroprotector (p. ej., Neurovita), a través de la BBB, para determinar la focalización específica de esta molécula a las neuronas y para mostrar que la propiedad neuroprotectora de la droga se conserva después de la droga había cruzado el BBB. También hemos demostrado que BBB-Minibrain constituye un interesante modelo para detectar el paso de las partículas del virus a través de la barrera de las células endoteliales y a controlar la infección de la Minibrain neuroinvasive partículas del virus. El BBB-Minibrain es un sistema fiable, fácil de manejar para investigador entrenado en la tecnología de cultivo celular y predictivo de los fenotipos de las células del cerebro después del tratamiento o insulto. El interés de tales pruebas de cellulo sería doble: introducción de derisking pasos temprano en el desarrollo de drogas en una mano y reducir el uso de animales en experimentación por otro lado.
Introduction
El cerebro se separa de la circulación sistémica por una estructura no-permeable que restringe los intercambios entre el parénquima del cerebro y la sangre, llamada barrera blood - brain (BBB). Compuesto principalmente de células endoteliales cerebrales, el BBB interactúa dinámicamente con astrocitos, microglía perivascular y las neuronas del parénquima cerebral vecino. Las tres funciones principales de la BBB son la creación y mantenimiento de la homeostasis iónica de funciones neuronales, fuente del cerebro con nutrientes y protección de lesiones tóxicas o entrada de agentes patógenos1,2, que contribuyen a el mantenimiento de la homeostasis del cerebro y sus funciones3. Esta barrera es tan eficiente que sólo algunas drogas pueden cruzar el BBB4,5. En la actualidad, los métodos disponibles para predecir si una molécula pasará el BBB y difusa en el cerebro consisten en ex vivo estudios sobre seguimiento de imagen material, autopsia del cerebro de voluntarios humanos por MRI (resonancia magnética) o PET (posición de emisión tomografía) o farmacodinámica y farmacocinética preclínica en animales6,7,8. Estas técnicas y modelos tienen algunas limitaciones, tales como la limitada resolución del PET y la baja sensibilidad de MRI6,8, la dificultad para cuantificar moléculas (es decir, moléculas de anticuerpo base por ejemplo) que mal penetrar el cerebro7, para la preclínica estudios y su alto costo y su complejo de pruebas en animales.
El último punto es importante porque, según el 3R reglas (reemplazo, reducción y refinamiento de los experimentos con animales) han pedido a las administraciones reguladoras que los investigadores urgentemente desarrollan científicamente correcta alternativa a animal experimentación9,10,11,12,13,14,la15.
En las últimas décadas, varios modelos in vitro de BBB han propuesto16,17,18 por cultivar en filtro de membrana inserta las células endoteliales de diferentes especies como el ratón, rata, bovino y cerdo. En cuanto a la especie humana, la escasa y difícil disponibilidad de células primarias incitó a los investigadores a desarrollar modelos humanos basados en las células endoteliales de cerebro inmortalizado o células madre procedentes de humanos19,20, 21. Estas barreras son adecuadas in vitro sustitutos de BBB que expresan marcadores de células endoteliales, marcadores de ensambladura apretada, transportadores de eflujo, portadores de soluto, receptores y responder a los estímulos endotelial 20. Se ensayaron algunos modelos BBB mediante filtro membrana insertos recubiertos con células endoteliales y otros tipos de células (es decir, astrocitos, neuronas o del22,del pericitos23,24). El objetivo de estas culturas Co fue aumentar las características físicas de BBB aprovechándose de la secreción de factores solubles por astrocitos/neuronas o del pericitos.
Sin embargo, ninguno de estos modelos incluye tejido cerebral para estudiar y predecir el destino de un candidato una vez ha pasado la barrera. Por lo tanto, nuestro objetivo era construir un cellulo en interfaz de sangre, cerebro, BBB-Minibrain, combinando un modelo BBB y un cultivo de neuronas mezcladas en un solo equipo. El BBB-Minibrain utiliza un sistema de cultivo que consiste en un filtro poroso en un pozo de una placa de cultivo celular pocillos. El filtro está recubierto con células hCMEC/D3, una línea de células endoteliales del cerebro humano que ha demostrado ser altamente confiable para prueba25,26,27, para formar el BBB de la droga BBB. Minibrain, que es una cultura Co diferenciada de las neuronas humanas y astrocitos derivados de la NTera/Cl2.D1 de la célula línea28,29 mezclan junto con la línea de células microgliales humano CHME/Cl530 en proporción correspondiente a la microglia vs relaciones neurona-astrocitos del cerebro31, se cultiva en la parte inferior de la placa del bien.
Además de estudiar el pasaje de drogas a través de la BBB y su destino en el parénquima, el interfaz de sangre-cerebro en cellulo modelo podría ser una poderosa herramienta para abordar la entrada de patógenos en el cerebro (neuroinvasiveness), la dispersión en el cerebro (neurotropismo) y la toxicidad (neurovirulencia) puede ejercer sobre las células del parénquima cerebral. Neurovirulencia y neuroinvasiveness estudios benefician el desarrollo de un eficiente modelo de cellulo y ventajosa para reemplazar a los modelos animales. Usando el kit de BBB-Minibrain32, demostró el fenotipo neuroinvasive de raros mutantes virales que acumula en la cepa del virus neurotrópico francés del Virus de la fiebre amarilla (es decir, FNV-YFV33,34) para preparar un suspender la vacuna viva de YFV y el paso de una biomolécula neuroprotectivos y neuroprotectoras llamado Neurovita (referido como NV en adelante en el manuscrito)35. Porque NV ni naturalmente cruza la membrana celular ni el BBB, NV fue fundido con la parte variable (VHH) de anticuerpos de cadena única llama que atraviesa las membranas biológicas incluyendo la BBB y funciona como una célula penetrando molécula (CPM)36. La propiedad CPM de VHH parece depender del punto isoeléctrico y la longitud de los VHH37.
En prueba de cellulo debe hacerlo posible ordenar las moléculas que potencialmente podrían cruzar el BBB antes de realizar farmacocinética y farmacodinámica análisis en animales e idealmente en el mismo tiempo ser capaz de predecir su comportamiento nervioso parénquima. Este sistema es biológicamente relevante y fácil de configurar y manejar por profesionales bien formados en la célula cultura26,29,30,38. El interés de tales pruebas de cellulo sería doble: reducir los costos de ensayos preclínicos en la una mano y reducir el uso de pruebas en animales por otra parte.
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Protocol
1. la célula de trabajo de la cultura de Ntera/CL2. D1 para preparar un cocultivo de hNeurons poste-mitotic y hAstrocytes (NT2-no disponible)
Nota: Este es el componente de Minibrain (figura 1).
- Cultivo de la Ntera/Cl2.D1
- Retire un frasco de las células del tanque de nitrógeno líquido. Mantener en hielo.
- Descongelar las células rápidamente en un baño de agua de 37 ° C.
- Transferencia de las células en un tubo de 15 mL que contiene 10 mL de medio completo DMEM F12 (medio de Eagle modificado de Dulbecco: medio de mezcla de nutrientes F-12) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 2 mM glutamina, 100 UI de penicilina y 100 μg estreptomicina (es decir, completa Medio de F12 DMEM).
- Centrifugue a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Disociar el sedimento en 2 mL de medio completo DMEM F12.
- Transferir en un matraz de cultivo de tejidos T75 en poliestireno con tratamiento específico para células adherentes sensibles (T75Cell+) que contiene 13 mL de medio completo DMEM F12.
- Las células en una incubadora que mantiene a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad hasta 90% de confluencia de la cultura (es decir, alrededor de 5 días). Cambiar el medio cada 2-3 días.
- Subcultivo de la Ntera/Cl2.D1 y la amplificación
- Retire el medio del frasco.
- Lavar la monocapa de células con 10 mL de solución salina buffer fosfato (PBS) suplementada con Ca2 + y Mg2 +.
- Lavar la monocapa de células con 10 mL de solución de EDTA (mantenida a temperatura ambiente).
- Añadir 3 mL de solución de tripsina-EDTA (0.05% tripsina EDTA 0,02%) e incubar 2 minutos a TA.
- Agitar el frasco y asegúrese de que las células son separadas de la superficie de plástico.
- Añadir 10 mL de medio completo DMEM F12 para inactivar la tripsina, la transferencia en un tubo de 15 mL y centrifugar durante 5 min a 200 x g a TA.
- Disocian el sedimento con 10 mL de medio completo y use hasta 1 mL para inocular cada nuevo matraz que contiene 14 mL de medio completo DMEM F12.
Nota: Treinta frascos T75 celular+ son necesarios para la diferenciación de cada uno. - Incube los frascos a 37 º C, 5% CO2 y 95% de humedad hasta 90% de confluencia.
- Diferenciación de NTera/Cl2.D1 en la cultura Co humano neurona-astrositos
Nota: Este es el principal componente de la Minibrain.- En el día 0, disociar las células con tripsina-EDTA como se describe en el paso 1.2 y disociar el sedimento celular de cada frasco con 2 mL de medio completo DMEM F12.
- Añadir 1 mL de la suspensión celular (correspondiente a 5 x 106 células) en cajas Petri de plástico 60 de 85 mm de diámetro que contiene 11 mL de medio completo DMEM F12.
Nota: Las células no se adherirá al plástico y se agregan de forma pseudo neuroesferas (ver fotografía en la parte inferior de la figura 1). Incubar las cajas 60 Petri a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad para un día. - En el día 1, agregar 1 mL de medio completo DMEM F12 suplementado con 130 μm de all-Trans retinoico (ATRA) por caja de Petri (concentración final ATRA 10 μm) y devolver las placas a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad durante 24 horas.
- En el día 2, transferir cuidadosamente el medio con esferas de células de cada Petri Dish en un tubo de 50 mL y centrifugar durante 10 min a x 50 g y RT Desvínculo cuidadosamente el sedimento suelto con 13 mL de medio completo DMEM F12 suplementado con 10 μm ATRA y añadir th e 13 mL en una nuevo 85 mm de diámetro placa de Petri.
Nota: Sobre los diferentes pasos, es muy importante mantener la densidad de las esferas tan alta como la densidad obtenida en el día 2 (es decir, alrededor de una densidad de 70%). Por lo tanto, si la densidad de la esfera es bajar, reducir el número total de platos de Petri según el número de células. - Repita el procedimiento anterior (paso 1.3.4) a los días 4, 6 y 8.
- En 10 días, repita el procedimiento anterior pero agregar las esferas a los matraces T75 celular+ en lugar de platos de Petri. Añadir las células de una placa de Petri en un matraz de T75 celular+ .
- Días 11, 13, 15 y 17, cambiar el medio usado con 14 mL de completa F12 de DMEM suplementado con 10 μm ATRA.
- En el día 19, cambio medio con 14 mL de medio DMEM F12 completo sin ATRA por frasco.
- En el día 20, disociar suavemente las células con tripsina/EDTA como sigue.
- Cada matraz T75 celular+ , de lavar las células con 10 mL de PBS suplementado con Ca2 + y Mg2 +; Incubar las células con 4 mL de EDTA por 5 min a TA.
- Retire con cuidado el EDTA y 2 mL de tripsina-EDTA e incubar 7 min en RT. Agitar suavemente el matraz y añadir cuidadosamente 8 mL de medio completo DMEM F12.
- Centrifugar 10 min a 160 x g y RT. disociar el precipitado de células en 13 mL de medio completo DMEM F12 y transferencia en un matraz T75 celular+ .
Nota: La disociación muy suave con tripsina-EDTA permitirá recuperar el ATRA distingue las células de las células originales de teratocarcinoma, que se unen fuertemente a la vajilla de plástico.
- Al día 21, quite el medio y las células muertas. Añadir 14 mL de medio completo DMEM F12 suplementado con 5% FBS, glutamina 2 mM, 100 UI penicilina, 100 μg estreptomicina y 0.5 μm de AraC (citosina β-D-arabinofuranoside) (completa 5% FBS DMEM F12-AraC).
- A los días 23, 25 y 28, reemplazar utiliza medio con 14 mL de 5% FBS DMEM F12-AraC.
- A 29 días hasta 49 (cada dos días), reemplazar utiliza medio con 14 mL de medio completo DMEM F12 suplementado con 5% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 UI de penicilina, 100 μg estreptomicina, 5 μm de FudR (5-fluoro-2' deoxiuridina) y 10 μm Urd (uridina) (completado 5% FBS DMEM F12-FudR-Urd).
- En el día 50, reemplazar utilizada medio con 14 mL de medio completo DMEM F12 suplementado con 5% SFB, 2 mM glutamina, 100 UI de penicilina, 100 μg estreptomicina y 10 μm Urd (completa 5% FBS DMEM F12-Urd).
- En 51 días hasta 95 (dos veces por semana), reemplazar utiliza medio con 14 mL de completa 5% FBS DMEM F12-Urd.
Nota: Las células pueden ser utilizado para experimentos de día 51 pero no más tarde de día 95. El uso de seriales tratamientos con inhibidores de la mitosis permite recuperar población pura de la cultura de hNeuron poste-mitotic y hAstrocytes (NT2-no disponible). - Para las células de la semilla, proceder a tripsinización suave como se describe para el día 20.
2. célula cultura trabajo de microglial humano células CHME/Cl5
Nota: Este es el componente de la microglía de la Minibrain (Figura 1).
- Cultivo la microglía humano células CHME/Cl5
- Retire un frasco de las células desde el tanque de nitrógeno líquido. Mantener en hielo.
- Descongelar rápidamente en un baño de agua de 37 ° C.
- La transferencia de las células en un tubo de 15 mL que contiene 10 mL de medio completo DMEM F12 suplementado con 5% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 UI de penicilina y 100 μg estreptomicina (es decir, medio completo DMEM F12 de FBS 5%).
- Centrifugue a 200 x g durante 5 min a TA. Desvínculo el sedimento con 2 mL de medio completo de FBS DMEM F12 de 5%.
- Transferir en un matraz T75 celular+ 13 ml de medio completo de FBS DMEM F12 de 5%.
- Células en cultivo a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad hasta 90% de confluencia. Cambiar el medio cada 2-3 días.
- Subcultivo de las células microgliales humano CHME/Cl5
- Retire el medio del frasco.
- Lavar la monocapa de células con 10 mL de PBS suplementado con Ca2 + y Mg2 +.
- Lavar la monocapa de células con 10 mL de solución de EDTA (mantenida a temperatura ambiente).
- Añadir 3 mL de solución de tripsina-EDTA e incubar 2 minutos a TA.
- Agitar el frasco y asegúrese de que las células son separadas de la superficie de plástico.
- Añadir 10 mL de medio completo de FBS DMEM F12 5% para inactivar la tripsina, la transferencia en un tubo de 15 mL y centrifugar durante 5 min a 200 x g y RT.
- Disocian el sedimento con 10 mL de medio completo y use hasta 1 mL para inocular cada nuevo matraz que contiene 14 mL de medio completo de FBS DMEM F12 de 5%.
- Incube los frascos a 37 º C, 5% CO2 y 95% de humedad hasta 90% de confluencia.
3. la cultura de trabajo con la hCMEC/D3 capa porosas insertos y preparar BBB
- Cultivo de las células endoteliales humanas hCMEC/D3 (figura 2)
- Diluir el tipo de colágeno la rata a la 1:30 con agua pura estéril (grado de cultura de célula).
- Transferir 10 mL a un matraz T75 celular+ e incubar 2 h a 37 ° C, 5% CO2 y 95% humedad incubadora.
- Retirar la solución de colágeno y reemplazarlo con 15 mL de medio de célula endotelial suplementado con 10 mM de HEPES (referido como medio completo celular endotelial).
- Retire un frasco de cryo de células desde el tanque de nitrógeno líquido. Mantener en hielo.
Nota: Las células fueron cultivadas, y un lote de semilla se realizó según lo descrito por el fabricante. La línea celular está cubierta por un acuerdo de transferencia de material biológico. Las células se obtienen en el número 25 de paso y no se deben utilizar más el paso 35. - Descongelar rápidamente en un baño de agua de 37 ° C.
- Transferencia de las células en el matraz T75 celular+ y devolver el frasco a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad para 2 a 4 h.
- Retire con cuidado el medio sin perder o eliminar células. Enjuague las celdas una vez con 10 mL de medio completo celular endotelial.
- Añadir 15 mL de medio completo celular endotelial.
- Células en cultivo a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad hasta el 100% de confluencia (no menos de 4 días) sin cambiar el medio.
- Subcultivo del hCMEC/D3 para preparar el relleno de la BBB
- Cubrir un nuevo matraz T75 celular+ o insertos con el tipo I colágeno de rata como se describió anteriormente (paso 3.1).
- Retire el medio del frasco. Lavar la monocapa de células con 10 mL de PBS suplementado con Ca2 + y Mg2 +.
- Añadir 2 mL de solución de tripsina-EDTA e incubar 5 min a 37 ° C.
- Agitar el frasco y asegúrese de que las células son completamente separadas de la superficie de plástico.
- Añadir 4 mL de medio de célula endotelial completa inactivación de la tripsina.
- Con una pipeta de plástico de 5 mL, disocian mecánicamente las células por aspiración y lavado a la suspensión de células mientras que mantener la pipeta de 5 mL en el fondo del matraz por lo menos 5 veces.
- Uso de 5 x 104 células/insertar para una cultura de membrana poliéster bien 12 insertos inserto y 2 x 106 células para un matraz T75 celular+ y contar las células. Preparar también tres filtros sin células para los experimentos de PELy (es decir, permeabilidad de las células endoteliales a véase Lucifer amarillo abajo del párrafo 4.2) con las inserciones de cultura de membrana de poliéster.
- Incube los frascos o insertos a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad hasta el 100% de confluencia.
- No cambie el medio para matraz T75 celular+ hasta un nuevo paso. Por el contrario de BBB en la cultura de membrana poliéster inserta: cambio medio en los días 2 y 4, utilizar el BBB para los experimentos en el día 6.
4. construcción y control de calidad de la BBB-Minibrain (Figura 2)
- Configurar un poliéster de BBB-Minibrain cultura membrana Inserte dispositivo (figura 2B)
- Crecen las células hCMEC/D3 12 bien poliester cultura membrana insertar filtros para 6 días en medio de la célula endotelial antes de usar para el experimento.
- Cubrir una placa bien 12 con poly-D-lisina (1 mL/pozo, 10 μg/mL, 4 h a temperatura ambiente) y, a continuación, laminina (1 mL/pocillo, 1 μg/mL, durante la noche a temperatura ambiente).
- Retirar laminina y añadir 1 mL de células endoteliales medio suplementado con 5% FBS (media de 5% de células endoteliales).
- Incubar durante 1 h a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
- Trypsinize el NT2-N/A (como se describe en el paso 1.3.9) y CHME/Cl5 (como se describe en el paso 2.2) y disociar los pellets de células con medio completo celular endotelial.
- Cuenta las celdas, mezcla 3.6 x 105 NT2-N/A y 0,4 x 105 células/pozo CHME/Cl5 y placa bien semillas el 12.
- En T = 24 h (24 h después de la siembra): cambiar el medio usado con medio completo fresco de la célula endotelial (Minibrain células y células endoteliales) y transferir el filtro hCMEC/D3 poliester membrana cultura inserto en la parte superior de las células Minibrain. Incubar el BBB Minibrain a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
Nota: La BBB-Minibrain entonces consistirá en una capa de células endoteliales humanas hCMEC/D3 en filtro aísla el compartimiento luminal (o compartimiento de la "sangre") y de una cultura mixta de células humanas hNT2-N/A y hCHME/Cl5 (Minibrain) en la parte inferior del bien definición el compartimiento abluminal (o compartimiento del "cerebro") (figura 2B).
- Validación de la permeabilidad endotelial de la BBB-Minibrain (Control de calidad) (figura 2)
- Preparar el tampón de transporte (TB), que es tampón HBSS (solución salina balanceada con Hanks) con Ca2 + y Mg2 + con piruvato de sodio HEPES y 1 mM de 10 mM.
- Preparar platos bien 12 con 1,5 mL de tampón de transporte por pozo.
- En T = 0, hacer fresco tampón de transporte complementado con 50 μm Lucifer amarillo (LY-TB).
- Invierta cada filtro para quitar cuidadosamente el medio sin afectar la barrera endotelial de la célula.
- Colocar el filtro en el plato bien 12 relleno y agregar 0,5 mL de LY-TB.
- Incubar las placas en una incubadora a 37° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
- En la transferencia de T = 10 min los filtros nuevos TB llena 12 placas bien y mantienen el compartimiento abluminal de la primera placa para la lectura de OD.
- En T = 25 min, repetir en 4.2.7.
- En T = 45 min, pare el transporte mediante la eliminación de los filtros de las placas. Mantenga abluminal y luminales compartimentos medidas OD.
- Transferencia en un oscuro 96 bien las placas de las muestras: 10 μl con 190 μl TB la LY-TB y los compartimientos del luminales 200 μL de la muestra para los compartimientos abluminal.
- Medir la fluorescencia de la LY-TB presente en las diferentes muestras a λ428 nm λ535 nm (longitud de excitación y de emisión de ondas respectivamente).
- Calcular la permeabilidad endotelial (Pe) hacia LY-TB (PeLY) según Siflinger-Birnboim, A et al (1987)39 y Da Costa, A et al (2018)34 mediante la fórmula:
1/PSe = (1/PSt) – (1/PSf) y PeLY= PSe/S.
Nota: PSf es la permeabilidad del filtro sin las células, PSt es la permeabilidad del filtro con las células de PSe es la permeabilidad de la época de la monocapa endotelial la superficie de la capa monomolecular, S es la superficie de la monocapa (un filtro bien 12 = 1,12 cm2 ), PeLY se expresa en cm/min. Para hCMEC/D3 PeLY debe estar entre 0,7 y 1,2 x 10-3 cm/min dependiendo principalmente de los equipos utilizado en los experimentos. Importante: un PeLY superior 1.2 significa que el BBB no es lo suficientemente apretado y se observan algunas fugas. Eliminar estas barreras.
5. uso de BBB-Minibrain a destacar la presencia de partículas virales neuro invasivo en una muestra de vacuna de Virus de fiebre amarilla, el virus neurotrópico francés YFV-FNV 34 (Figura 3)
- Cruce de BBB y la multiplicación de virus de fiebre amarilla en el Minibrain
- Utilizar el BBB-Minibrain preparado como se describe en el paso 4.1.7 24 h antes de la adición del virus; sustituir el medio por medio de celular endotelial de FBS 2%.
Nota: Es extremadamente importante evitar cambiar el medio justo antes de añadir el virus. Cambiar el medio puede activar las células endoteliales humanas y transitoriamente abrir la barrera que permite el paso del virus. Aquí el medio se cambia 24 h antes de comenzar el experimento. - En T = 0, añadir 3500 placa formando unidades (PFU) de YFV-FNV diluido en 50 μl de 2% medio de célula endotelial FBS muy cuidadosamente en la parte superior el compartimiento luminal. El control Minibrain BBB se inocula con 50 μl de medio de células endoteliales de FBS 2% sin virus. Determinar bien PeLY de compañera.
- Incubar el BBB Minibrain en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
- Después de 24 h, retire el dispositivo de filtro de membrana de poliéster cultura insertos y PeLY, muestra 1 mL del compartimiento abluminal de determinar y valorar el virus descrito por A. da Costa et al (2018)34. Reemplace el medio por medio fresco de células endoteliales de la FBS del 2%.
- Incubar el BBB Minibrain a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
- Después de 72 h, el medio del compartimiento abluminal de la muestra y valorar el virus, o extraer el ARN de las células Minibrain para análisis de expresión génica como es descrito por A. da Costa et al (2018)34.
- Utilizar el BBB-Minibrain preparado como se describe en el paso 4.1.7 24 h antes de la adición del virus; sustituir el medio por medio de celular endotelial de FBS 2%.
- Amplificación de variantes neurotrópica de YFV-FNV en células Minibrain por pasajes seriales
- Uso Minibrain células habían cubierto 12 placas bien (es decir, pasos 4.1.6 y 4.1.7).
- Al tiempo 0 h, el punto agregar 3.500 placa formando unidades de YFV-FNV diluido en 50 μl de medio de células endoteliales de FBS 2% muy cuidadosamente la parte superior de las células (compartimiento luminal).
- Después de 1 h, quitarlo del medio con el inóculo de virus y reemplazar con medio fresco de células endoteliales de la FBS del 2%.
- Después de 48 h, 500 μl de medio de cultivo de la muestra e infectar células Minibrain
- Después de 120 h, 500 μl de medio de cultivo de la muestra e infectar células Minibrain.
- Después de 192 h, excepto el medio de cultivo (= acción de virus enriquecida) y extraer el ARN de las células Minibrain para análisis de expresión génica como es descrito por A. da Costa et al (2018)34.
6. uso de BBB-Minibrain cruce de BBB y cerebro de la célula objetivo de una biomolécula
- Transporte a través de la BBB de una neurona a biomoléculas
- Utilice el BBB Minibrain preparado como paso descrito 4.1.7.
- En el momento 0 h, añadir las biomoléculas (en el ejemplo proporcionado en la sección de resultados, 58.75 ng, BBB de las moléculas de NeuroTag-NV florescente de célula fueron agregados por BBB Minibrain insertar.
- Incubar el BBB Minibrain a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
- Después de 24 h, retire el dispositivo de filtro de membrana de poliéster cultura insertos y determinar PeLY, mancha las células Minibrain para hNeurons neurofilament Nf200 y detectar la presencia de las biomoléculas en el Minibrain (en el ejemplo incluido en el resultado sección, NeuroTag-NV fue detectada utilizando un anticuerpo dirigido contra el Strep-Tag contiene35,40).
- Transporte a través de la BBB de una biomolécula neuroprotectivos y neuroprotector posteriores análisis en el Minibrain después la biomolécula ha cruzado el BBB
- Utilice el BBB Minibrain preparado como se describe en el paso 4.1.7.
Nota: Para las moléculas dirigidas a las neuronas solamente, células Minibrain pueden ser sustituidas por la única de las neuronas células (NT2-N)38. - En el momento 0 h, añadir 58.75 ng/BBB-Minibrain bien el Florescente NV de moléculas de célula (forma activa CPM-NeuroTag-NV, inactivo forma CPM-NeuroTag-NVΔ) descrito por C. Prehaud et al (2014)35.
- Incubar el BBB Minibrain en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
- Después de 4 h, hacer heridas individuales con una aguja de inyección (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, Bélgica) en las células Minibrain. Hacer rayones por lo menos 10 en cada bien. Determinar bien PeLY en el compañero.
- Incubar el BBB Minibrain en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
- Después de 8 h, sustituir el medio en el compartimiento abluminal por medio completo fresco de la célula endotelial.
Nota: Es importante cambiar el medio en este paso ya que las heridas sufridas por las células Minibrain pueden conducir a muerte celular y la liberación de compuestos citotóxicos. - Incubar el BBB Minibrain en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.
- Después de 48 h, tinción las células para la regeneración del axon de hNeurons descrito por C. Prehaud et al (2013)40.
- Utilice el BBB Minibrain preparado como se describe en el paso 4.1.7.
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Representative Results
El BBB-Minibrain es un cellulo en experimental modelo de interfaz de sangre del cerebro.
El BBB-Minibrain está configurado en el sistema de inserción de cultura membrana poliéster para imitar un compartimiento de la sangre en el nivel superior y un compartimiento del cerebro en el nivel inferior de la interfaz de sangre-cerebro (figura 2AB). Consiste en un compartimiento luminal con las células endoteliales hCMEC/D3 en el filtro formando el BBB y un compartimiento abluminal, que contiene la Minibrain tri-cultura humana de las células cerebrales (neuronas, astrocitos y células de la microglía). Las células Minibrain exhiben una tri-cultura clásica mezclada de fenotipo de la población (figura 1, panel inferior derecho) y marcadores express específicos de cada tipo de célula, como se muestra por da Costa A. et al., 201834.
El uso de capa hCMEC/D3 en el BBB-Minibrain permite obtener una fuerte barrera con un Pe mediaLY de 0.95e-03 cm/min y una media Trans endotelial eléctrica resistencia (TEER) 51.89 Ω/cm2. Estos valores están en el rango de los valores mejor descrito por una línea de células endoteliales humanas27,41 nunca en tal un membrana poliester insertar sistema de cultivo (figura 2). Estas células expresan marcadores de proteínas de Unión estrecha ZO-1 y cadherina como se esperaba por la cuantificación de la permeabilidad (datos no mostrados). También expresan todos los subconjuntos de los receptores, la emanación de transportadoras o transportadores [receptores: LDLR, receptor de lipoproteína de baja densidad; LRP1, receptor de lipoproteína de baja densidad relacionada con proteína 1; INSR, receptor de la insulina; LEPR, receptor de la leptina; LU, molécula de adhesión de células basales; TFRC, antígeno CD71; AGER, advanced glycosylation receptor de producto final. Transportadores de eflujo: ABCB1 (P-gp); ABCG2 (BCRP); ABCC1 (MRP1); ABCC2 (MRP2); ABCC4, ABCC4 proteína; ABCC5, proteína de ABCC5. Transportadores: STRA6, estimulada por la proteína del gene ácido 6 de retinoico; SLC2A1, transportador de glucosa tipo 1; SLC7A5, transportador neutral grande del aminoácido 1; SLC1A1, proteína de solute carrier family 1; SLC38A5, transportador de solutos familia 38 miembro 5 la proteína; SLC16A1, monocarboxylate transporte proteína 1], que son proteínas clave relevantes para sus funciones biológicas (Figura 2D)21.
El BBB-Minibrain permite selección, amplificación y caracterización de variantes virales neuroinvasive rara de una preparación de vacuna de virus vivo.
El dispositivo de cultura Minibrain BBB fue utilizado como un cellulo en prueba permitiendo aislamiento y amplificación de variantes raras de neuroinvasive/neurovirulent potencialmente presentes en el virus de la fiebre amarilla (YFV) vacunas vivas virales42. YFV es un virus viscerotrópica contra el hígado que no cruza eficientemente el BBB. El virus neurotrópico francés, FNV, fue utilizado como una vacuna viva de YFV hasta la década de 198033,43. FNV fue encontrado para causar énesis post vacunal en niños (0,3 a 0,4% entre personas vacunadas) y así fue continuado en 198233,43. Utilizamos FNV aquí como un prototipo de virus YF que puede contener una alta proporción de variantes neuroinvasive/neurovirulent42,44. Una preparación de virus FNV (es decir, 3500 UFP/ml) fue añadido en el compartimiento luminal de un BBB-Minibrain, el control era un Minibrain BBB que fue infectado de mofa. Presencia de las partículas de virus en el compartimiento luminal no altera la permeabilidad de la barrera como medida 24h más tarde ya que el PeLY en los pozos virales no fue diferente del PeLy de pocillos de control (0.80 ± 0.09 x 10-3 cm/min. y 0,86 ± 0.09 x 10-3 cm/min para PeLY en el control y YFV-FNV pozos respectivamente). El contenido del compartimiento abluminal se evaluó la presencia de virus por ensayo de placa, en el post infección de 24 h. Las células Minibrain eran incubadas dos días más para evaluar la amplificación de neuroinvasive variantes en las células cerebrales y monitorizar la expresión génica como se describe en la viñeta que se muestra en la Figura 3A.
Hemos detectado algunos virus YFV-FNV, que pueden cruzar el BBB en 24 h (media 43 PFU/mL). Los virus fueron amplificados para los próximos dos días por la multiplicación del virus dentro de las células del cerebro (significa título de 4.69 x 104 PFU/mL), (figura 3B). De nota, una preparación de la cepa de vacuna que no hace post vacunal énesis no eficientemente cruzaría el BBB en este sistema como ha sido demostrado por da Costa A. et al (2018)34. Se identificaron dos biomarcadores de la multiplicación del virus: el interferón estimula Gene 15 (ISG15) y el interferón regulador Factor 7 (IRF7). Las expresiones de estos dos biomarcadores fueron estimuladas cuando esta población de neuroinvasiva viral fue pasada en serie en las células Minibrain (figura 3). Estrictamente, estas upregulations por Q-RT-PCR se correlacionaron con la carga viral (Pearson p valor 0.0016 ISG15 y 0.0260 para IRF7).
BBB-Minibrain permite ambos análisis de la capacidad de una biomolécula a pasar la barrera y en el mismo tiempo comprobar si la función de biomoléculas se conservó después de la travesía BBB.
NV es una biomolécula derivada de virus de la rabia que posee sorprendentes propiedades de neuroprotección y Neurorregeneración40. Este polipéptido pequeño que naturalmente no cruza la membrana celular ni el BBB fue fundido con un CPM a las neuronas de destino. Nuestra opción era utilizar la parte variable (VHH) de anticuerpos de cadena única llama que atraviesa las membranas biológicas como la BBB36,45 y una NeuroTag dirigida específicamente a las neuronas. NV fue vinculado el VHH y un NeuroTag, para construir una CPM-NeuroTag-NV (Figura 4A) y el VHH sólo para construir un CPM-NeuroTagΔ-NV falta la NeuroTag específica que permite la focalización de las neuronas (Figura 4B). Después se agrega en el compartimiento luminal, CPM-NeuroTag-NV (puntos verdes) cruza el BBB y fue capaz de atacar las neuronas humanas (en rojo) (figura 4, D). CPM-NeuroTagΔ-NV cruza la barrera de la célula endotelial (puntos verdes) pero menos eficientemente dirige las neuronas humanas (la mayoría de los puntos verdes se encuentran fuera de las neuronas) (figura 4).
Como se describió anteriormente, NV estaba ligado a un VHH y una NeuroTag para construir una CPM-NeuroTag-NV. Hicimos lo mismo para NVΔ una forma inactiva de NV que carece de la parte activa de NV (CPM-NeuroTag-NVΔ) (figura 5A). Después se agrega en el compartimiento Luminal, CPM-NeuroTag-NV cruza el BBB y fue capaz de regenerar los axones de las neuronas humanas después de la herida (figura 5B, panel derecho), por el contrario a CPM-NeuroTag-NV Δ la forma inactiva de NV (figura 5B, izquierda panel)40. Estas propiedades se evaluaron en dos tipos de protocolos; ya sea en una pre – exposición (figura 5) o en un protocolo de exposición del mensaje (figura 5). Cuando aplicado antes del axon de rayar (4 h, H4), CPM-NeuroTag-NV desencadena la neuroprotección de las neuronas del herido y la regeneración axonal al contrario de la mofa de tratados las células (es decir, control) o las células tratan con CPM-NeuroTag-NVΔ (media regeneración 91% y 12% - 10% respectivamente, figura 5). Cuando las biomoléculas se aplicación después de las lesiones axonales (1 hora, H1, figura 5) con el fin de imitar un protocolo terapéutico posterior a la exposición, el NV-NeuroTag-CPM es todavía capaz de regenerar axones por el contrario de la forma de movilidad de CPM-NeuroTag-NV Δ,) significa regeneración 85% y 5.1% respectivamente) (figura 5).
Figura 1: modelo de la Minibrain. Tabla de tiempo de las culturas NT2-N/A y CHME/Cl5 (panel superior). Fotografías (paneles inferiores) de la línea celular original (Ntera/cl2. D1) en el panel de la izquierda las neuroesferas pseudo obtienen después del tratamiento de ATRA en el panel superior central, el CHME/Cl5, en la parte media inferior y el Minibrain triculture (violeta Cristal tinción), en el panel derecho, resultante de la mezcla de NT2-N/A y CHME / Culturas de CL5. Escala de la barra 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: el modelo BBB Minibrain. A. horario de las culturas de hCMEC/D3 y fotografía del dispositivo Minibrain BBB: un poliéster cultura insertos-filtro de membrana con la barrera endotelial hCMEC/D3 se sostiene con una pinza antes de insertarse en un pozo de 12 pozos celular placa de cultivo. B. historieta que describe el dispositivo con el compartimiento luminal de (sangre) que contiene la barrera endotelial de la célula y el compartimiento de abluminal (cerebro) que contiene las células Minibrain (humanas neuronas, astrocitos y células de la microglía). C. medidas representativas de la permeabililty BBB-Minibrain por TEER (es decir, resistencia eléctrica TransEndothelial) en tres dispositivos o permeabilidad a LY (es decir, PeLY) en cinco filtros. D. Análisis de la expresión de q-RT-PCR de los receptores, transportadores de eflujo y transportadores en las células endoteliales hCMEC/D3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: modelo de la BBB-Minibrain permite la identificación de variantes neuroinvasive entre preparación de vacuna YFV vivo. A. horario del experimento. B. cuantificación de los virus que han cruzado la BBB por la placa formando la titulación de la unidad (PFU) de virus vivo (cada punto representa una membrana poliester cultura insertos experimento). C. diagrama de la expresión génica ISG15 y IRF7 medido por q-RT-PCR en función del número de partículas virales en la carga viral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: la BBB-Minibrain permite realizar pruebas de propiedades de biomoléculas neuroprotectivos: targeting específica de neuronas cuando NV está fusionada a NeuroTag. A. historieta del CPM basado en NV (es decir, CPM-NeuroTag-NV) que contiene un NeuroTag específico para neurona específicamente. B. historieta del CPM basado en NV eliminado de la NeuroTag (es decir, CPM-NeuroTagΔ-NV). C. fotografías representativas de la inmunofluorescencia de las neuronas humanas. Escala de 50 μm. 200 NF en rojo, CPM-NeuroTag-NV/CPM-NeuroTagΔ-NV en núcleos verdes, en azul de la barra. D. moléculas de CPM-NeuroTag-NV pueden cruzar el BBB y destino de las neuronas humanas más eficientemente que CPM-NeuroTagΔ-NV. Las neuronas infectadas y una población total de neuronas se contaron en diapositivas por triplicado después de inmunomarcación. Total neuronas corresponden a las células positivas NF200 (en rojo). Cualquier célula roja asociada a uno o más punto verde (CPM-NV) se cuenta como una neurona positiva. Prueba t de student no pareado dos cola ***p = 0.0002. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: la BBB-Minibrain permite realizar pruebas de propiedades de biomoléculas neuroprotectivos: cruce de BBB no altera las propiedades neuroprotectivos de NV. A. historieta del CPM basado en NV (es decir, CPM-NV) y su homólogo de movilidad (es decir, CPM-NVΔ). B. regeneración del axón CPM-NV en un en cellulo ensayo rasguño (panel derecho). CPM-NVΔ no puede activar la regeneración del axón (panel izquierdo), escala bar 100 μm. C. CPM-NV puede atravesar la célula endotelial y regenerar axones en las neuronas de la BBB-Minibrain cuando se aplica 4 h antes de la lesión: esquema (panel superior) del experimento; (panel inferior) la cuantificación de la regeneración. D. CPM-NV también es activo en un protocolo terapéutico cuando se aplica 1 h después de la herida: esquema (panel superior) del experimento; (panel inferior) la cuantificación de la regeneración. Prueba t de student no pareado dos cola ***p < 0.0001. Regeneración fue calculada a partir de experimentos por triplicado (> 800 neuronas contadas) después de la tinción de las células neuronales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este artículo hemos demostrado cómo construir una cellulo en interfaz de sangre, cerebro, BBB-Minibrain, combinando un modelo BBB y la cultura de mezcla cerebro células cerebrales (Minibrain) en un solo equipo. Este sistema es biológicamente relevante, fácil de configurar y manejar para experimentadores bien ensen $ ados en cultivo celular.
En cuanto a cualquier otro modelo in vitro de BBB, se obtendrían resultados confiables si se aplica el drástico control de la tirantez de la barrera. Rellenos deben ser evaluados cuidadosamente para permeabilidad y cualquier inserto con los valores de permeabilidad insuficiente (es decir, un PeLY superior a 1.2) deben ser desechados.
Equipos deben ser cuidadosamente muestras para identificar un lote que desactivar las características de la BBB. El mismo Consejo se puede hacer en relación con el medio del vehículo en que virus partículas o biomoléculas se diluyen. También se recomienda para mantener tan pequeño como sea posible el volumen de suspensión de biomoléculas o virus, con el fin de no alterar la composición media del compartimiento luminal. Diferenciación de la cultura de neurona/astrocitos humanos co-cultivo de Ntera/CL2. D1 es una tecnología probada. En contraste con las neuronas humanas que son poste-mitotic, astrocitos aún están dividiendo las células. A veces se observa gran proliferación de las células de astrocitos. Si esto sucede, la cultura Minibrain debe desecharse. Las células CHME/Cl5 que utilizamos en nuestro laboratorio fueron fenotipadas para demostrar que eran de origen humano (Homo sapiens CCNT1 phenotyping). Hay un riesgo de que algunos lotes CHME utilizados en algunos laboratorios pueden ser de origen de la rata (norvegicus de Rattus) como por García Mesa Y. et al (2017)46. Por lo tanto, se recomienda para comprobar el origen de la línea celular CHME/Cl5.
El sistema de tri-cultura humana Minibrain incluyendo las neuronas post mitotic (principalmente dopaminérgicas), astrocitos y una línea de células microglial, imita un entorno simplificado cerebral. Este sistema puede mejorarse. Uno puede imaginar agregando oligodendrocitos a la cultura con el objetivo de obtener axones myelinated o células microgliales primaria. El minibrain puede también reemplazarse con un cultivo mixto de células madre procedentes de humanos19,20,21. Sin embargo, la variabilidad entre lotes diferentes de las células debe ser dominado con cuidado. La complejidad de BBB-Minibrain también puede incrementarse mediante la adición del pericitos23. En nuestras manos, esta mejora fue obstaculizada por la dificultad para tener acceso confiable a los pericitos de origen humano.
Hemos demostrado la viabilidad y la utilidad de este kit imitando la interfaz de sangre del cerebro, para i) aislar neuroinvasive raras partículas del virus de una muestra de la vacuna de fiebre amarilla que han evolucionado la propiedad para entrar en el cerebro a través de la BBB, y ii). ampliar estas subpoblaciones neuroinvasive en la tri-cultura Minibrain mímico un parénquima cerebral simplificado. Futuras aplicaciones puede ampliar el control de calidad de otras vacunas vivas como la vacuna de las paperas y promover el BBB-Minibrain como medio para estudiar características de neurovirulencia en vitro.
El segundo estudio piloto fue demostrar que un candidato a fármaco pasa a través de la BBB y alcanza el Minibrain, sin perder sus propiedades neuro-regenerativa. Estamos firmemente convencidos de que el BBB-Minibrain puede permitir avances importantes en la clasificación previa de las moléculas antes de liberarlos a ensayos preclínicos. El uso de la BBB-Minibrain debe facilitar la aplicación de 3R medidas encaminadas a reducir el uso de pruebas para ensayos de reglamentaria e investigación experimental con animales.
En conjunto con el siguiente desarrollo de enfoques en silico (modelo informático), pronto podremos identificar fármacos candidatos con una alta probabilidad de cruzar el BBB, el desarrollo de un modelo 3D en cellulo imitando la sangre del parénquima nervioso interfaz sería de gran ayuda.
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Disclosures
La propiedad intelectual del sistema fue las patentes referidas a 32, 35 y 38.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por becas internas del Instituto Pasteur incluyendo una subvención de Incitative (PTR 435) y por una donación "Contrat de Soutien à la Recherche" de Sanofi Pasteur Institut Pasteur. A. da Costa fue apoyada por la concesión de Sanofi-Pasteur y Florian Bakoa es beneficiario de una beca de doctorado proporcionada por la ANRT (Asociación Nacional de la Recherche et de la Technologie). Estamos agradecidos a Pr Pierre-Olivier Couraud y Dr. Florencia Molinero por discusiones útiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well plates | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
| Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
| Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
| Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
| Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |
References
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