Summary
Här presenterar vi ett protokoll som beskriver inställningen av en i cellulo BBB (blod-hjärnbarriären)-Minibrain polyester porösa membran kultur infoga system för att utvärdera transport av biomolekyler eller smittämnen över en mänsklig BBB och deras fysiologisk påverkan på närliggande hjärnceller.
Abstract
Tidig screening av nervsystemet läkemedel på ett relevant och tillförlitligt i cellulo BBB modell för deras penetration och deras interaktion med barriären och hjärnparenkymet är fortfarande ett ouppfyllt behov. För att fylla denna lucka, utformade vi en 2D i cellulo-modellen, den BBB-Minibrain, genom att kombinera en polyester porösa membran kultur infoga human BBB modell med en Minibrain bildas av en tri-kultur av mänskliga hjärnceller (neuroner, astrocyter och mikrogliaceller). Den BBB-Minibrain tillät oss att testa transport av en nervskyddande läkemedelskandidat (t.ex. Neurovita), via BBB, att fastställa specifika inriktningen av denna molekyl till nervceller och visa att egenskapen nervskyddande av drogen var bevarad efter drogen hade korsat BBB. Vi har också visat att BBB-Minibrain utgör en intressant modell att upptäcka passage av viruspartiklar över endotelceller barriären och övervaka infektion av Minibrain av neuroinvasive viruspartiklar. Den BBB-Minibrain är ett tillförlitligt system, lätt att hantera för forskare utbildad i cell kultur teknik och förutsägande av hjärnans celler fenotyper efter behandling eller förolämpning. Intresse av sådana cellulo testning skulle vara dubbel: att införa derisking steg tidigt i läkemedelsutvecklingen å ena och minska användningen av djurförsök å andra.
Introduction
Hjärnan är separerad från den systemiska cirkulationen av en icke-genomsläpplig struktur som begränsar utbyte mellan hjärnparenkymet och blod, kallas den blood - brain barriären (BBB). Mestadels består av cerebral endotelceller, interagerar BBB dynamiskt med astrocyter, perivaskulär mikroglia och nervceller i angränsande hjärnparenkymet. De tre viktigaste funktionerna i BBB är skapande och underhåll av Joniska homeostas för neuronala funktioner, leverans av hjärnan med näringsämnen, och skydd från toxiska skador eller inmatning av patogener1,2, som bidrar till underhåll av hjärnan homeostas och dess funktioner3. Denna barriär är så effektiv att bara några droger kan passera BBB4,5. För närvarande består tillgängliga metoder att förutsäga huruvida en molekyl kommer att passera BBB och diffunderar in hjärnan av ex vivo-studier på obduktionen material, bild spårning i hjärnan hos frivilliga försökspersoner med MRI (magnetisk resonansen tänkbar) eller PET (ståndpunkt utsläpp tomografi) eller farmakodynamiska och farmakokinetiska prekliniska studier i djur6,7,8. Dessa tekniker och modeller har vissa begränsningar, såsom begränsad upplösning av PET och MRI6,8, det är svårighet att kvantifiera molekyler (dvs antikropp baserat molekyler till exempel) så dåligt låg känslighet penetrera hjärnan7, och för den prekliniska studier sina höga kostnader och resort för djurförsök.
Den sista punkten är viktig eftersom, enligt 3R's regler, (ersättning, begränsning och förfining av djurförsök) de föreskrivande myndigheterna har bett att forskarna snarast utveckla vetenskapligt korrekt alternativ till djur experiment9,10,11,12,13,14,15.
Under de senaste årtiondena, flera in vitro-modeller av BBB som har föreslagits16,17,18 genom att odla på filter membran infogar endotelceller från olika arter som mus, råtta, nötkreatur och gris. Vad beträffar den mänskliga arten är, uppmanas knappa och svåra tillgängligheten av primära celler forskarna att utveckla mänskliga modeller baserat på förevigade hjärnan endotelceller eller härledda mänskliga stamceller19,20, 21. Dessa hinder är korrekt in vitro-ersättningar av BBB förutsatt att de uttrycker endotelceller markörer, åtsittande föreningspunkt markörer, effluxtransportörer, koncentrationsgradient bärare, receptorer, och bemöta de endothelial stimuli 20. Några BBB modeller använder filtret membran skär belagd med endotelceller och andra celltyper (dvs, astrocyter, nervceller eller pericyter22,23,24) analyserades. Målet med dessa samtidig kulturer var att öka BBB fysiska egenskaper genom att utnyttja utsöndringen av lösliga faktorer av astrocyter/nervceller eller pericyter.
Dock inkluderar ingen av dessa modeller hjärnparenkymet för att studera och förutse ödet av en läkemedelskandidat när det har passerat barriären. Vårt mål var därför att bygga en i cellulo blod/hjärnan gränssnitt, det BBB-Minibrain, genom att kombinera en BBB-modell och en kultur av blandade hjärnceller i ett enda kit. Den BBB-Minibrain använder en kultur system bestående av en porös filtret sitter i en brunn rundbottnade cell kultur platta. Filtret är belagd med hCMEC/D3 celler, en mänsklig hjärna endotelceller linje som har visat sig mycket tillförlitlig för BBB drogtester25,26,27, för att bilda BBB. Minibrain, som är en samtidig differentierade kultur av mänskliga nervceller och astrocyter som härrör från den NTera/Cl2.D1 cell linje28,29 blandas med den mänskliga mikrogliala cellinje CHME/Cl530 i baserat på motsvarande den mikroglia vs. neuron-astrocyter nyckeltal av hjärnan31, odlas i botten av plattan väl.
Förutom att studera passage av läkemedel över BBB och deras öde i parenkymet, kunde blod-hjärn gränssnittet i cellulo modell vara ett kraftfullt verktyg att ta inträde av patogener i hjärnan (neuroinvasiveness), spridning i hjärnan (neurotropism) och toxicitet (neurovirulence) de kan utöva på parenkymet hjärnceller. Neurovirulence och neuroinvasiveness studier skulle gynnas utvecklingen av en effektiv i cellulo modell och vara fördelaktigt att ersätta djurmodeller. Med hjälp av BBB-Minibrain kit32, vi visat neuroinvasive fenotypen av sällsynta viral mutanter som ackumulerats i den franska neurotrop stam av gula febern-Virus (dvs. FNV-YFV33,34) används för att förbereda en slutat levande YFV vaccin och passagen av en neuroregenerative och nervskyddande biomolecule kallas Neurovita (som kallas NV hädanefter i manuskriptet)35. Eftersom NV varken naturligt passerar cellmembranet eller den BBB, NV var smält med den rörliga delen (VHH) av en enda kedja antikropp av lamadjur som korsar de biologiska membran inklusive BBB och fungerar som en cell genomträngande molekyl (CPM)36. Egenskapen CPM för VHH tycks bero på den isoelektriska punkten och längden på VHH37.
Detta i cellulo test bör göra det möjligt att sortera de molekyler som potentiellt kunde passera BBB innan utför farmakokinetisk och farmakodynamisk analys i djur och helst samtidigt för att kunna förutsäga deras beteende i nervsystemet parenkymet. Detta system är biologiskt relevant och lätt att ställa in och hantera av proffs väl utbildade i cell kultur26,29,30,38. Intresse av sådana cellulo testning skulle vara dubbel: att minska kostnaderna för prekliniska tester å ena och minska användningen av djurförsök å andra sidan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell kulturarbete Ntera/CL2. D1 att förbereda en samtidig kultur efter mitotiska hNeurons och hAstrocytes (NT2-N/A)
Obs: Detta är del av Minibrain (figur 1).
- Odling i Ntera/Cl2.D1
- Ta bort en flaska med frusna celler från flytande kväve tank. Hålla på is.
- Tina cellerna snabbt i 37 ° C vattenbad.
- Överföra cellerna i en 15 mL tub innehållande 10 mL komplett DMEM F12 medium (Dulbeccos modifierade Eagle Medium: näringsämne blandning F-12 medium) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin, 100 IE penicillin och 100 µg streptomycin (dvs komplett DMEM F12 medium).
- Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter i rumstemperatur (RT). Separera pelleten i 2 mL komplett DMEM F12 medium.
- Överföring i en T75 vävnadsodling kolv i polystyren med specifik behandling av känsliga vidhäftande celler (T75Cell+) som innehåller 13 mL komplett DMEM F12 medium.
- Kultur celler i en inkubator som hålls vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet tills 90% sammanflödet (dvs. ca: 5 arbetsdagar). Ändra medium varje 2-3 dagar.
- Subculturing de Ntera/Cl2.D1 och förstärkning
- Ta bort mediet från kolven.
- Skölj den cell enskiktslager med 10 mL fosfat buffert saltlösning (PBS) kompletteras med Ca2 + och Mg2 +.
- Skölj den cell enskiktslager med 10 mL EDTA-lösning (som hålls på RT).
- Tillsätt 3 mL trypsin-EDTA-lösning (0,05% trypsin, 0,02% EDTA) och inkubera 2 min på RT.
- Skaka kolven och kontrollera cellerna är fristående från plastytan.
- Tillsätt 10 mL av komplett DMEM F12 medium att inaktivera trypsin, överföra i en 15 mL rör och Centrifugera under 5 minuter vid 200 x g på RT.
- Separera pelleten med 10 mL komplett medium och Använd 1 mL för att Inokulera varje ny kolv som innehåller 14 mL komplett DMEM F12 medium.
Obs: Trettio T75 Cell+ kolvar krävs för varje differentiering. - Inkubera kolvar vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet tills 90% sammanflödet.
- Differentiering av NTera/Cl2.D1 i mänskliga neuron-astrocyten samtidig kultur
Obs: Detta är den viktigaste komponenten i Minibrain.- På dag 0, separera celler med trypsin-EDTA som beskrivs i steg 1.2 och separera cellpelleten av varje kolv med 2 mL av komplett DMEM F12 medium.
- Tillsätt 1 mL cellsuspension (motsvarande 5 x 106 celler) i 60 petriskålar av plast med 85 mm diameter som innehåller 11 mL komplett DMEM F12 medium.
Obs: Cellerna fäster inte plasten och kommer aggregera till formuläret pseudo neurospheres (se foto i den undre panelen i diagram 1). Inkubera i 60 petriskålar vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet i en dag. - Dag 1, tillsätt 1 mL av komplett DMEM F12 medium kompletteras med 130 µM av all-Trans retinoinsyra (ATRA) per petriskål (slutlig koncentration ATRA 10 µM) och returnera rätterna vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet för 24 h.
- På dag 2, överför mycket noga det medium som innehåller cell sfärer av varje Petri Dish i en 50 mL tub och Centrifugera i 10 min vid 50 x g och RT. dissociera noggrant lös pelleten med 13 mL komplett DMEM F12 medium kompletteras med 10 µM ATRA och tillsätt th e 13 mL i en ny 85 mm diameter petriskål.
Obs: Över de olika passagerna, det är mycket viktigt att bibehålla de sfärer densitet så hög som det densitet som erhålls vid dag 2 (dvs runt en täthet av 70%). Därför, om sfär tätheten sänka, minska det totala antalet petriskålar enligt antalet celler. - Upprepa proceduren ovan (steg 1.3.4) på dag 4, 6 och 8.
- Dag 10, upprepa proceduren ovan men lägga till sfärernas T75 Cell+ kolvar i stället för petriskålar. Lägga till celler från en petriskål till en T75 Cell+ kolv.
- Dagar 11 ändra 13, 15 och 17, används medlet med 14 mL komplett DMEM F12 kompletteras med 10 µM ATRA.
- Dag 19, ändra medium med 14 mL komplett DMEM F12 medium utan ATRA per kolv.
- Dag 20, sära försiktigt cellerna med trypsin/EDTA som följer.
- För varje T75 Cell+ kolv, skölj cellerna med 10 mL PBS kompletteras med Ca2 + och Mg2 +; Inkubera cellerna med 4 mL av EDTA för 5 min på RT.
- Avlägsna försiktigt EDTA och tillsätt 2 mL av trypsin-EDTA och inkubera 7 min på RT. skaka mycket försiktigt kolven och tillsätt försiktigt 8 mL komplett DMEM F12 medium.
- Centrifugera 10 i min vid 160 x g och RT. dissociera cellpelleten i 13 mL komplett DMEM F12 medium och överföring i en T75 Cell+ kolv.
Obs: Mycket mild dissociation med trypsin-EDTA kan återvinna ATRA differentierade celler från de ursprungliga teratocarcinoma celler, som är starkt kopplade till plastartiklar.
- Ta bort mediet och döda celler på dag 21. Lägg till 14 mL komplett DMEM F12 medium kompletteras med 5% FBS, 2 mM glutamin, 100 IE penicillin, 100 µg streptomycin och 0,5 µM av AraC (cytosin β-D-arabinofuranoside) (fullständig 5% FBS DMEM F12-AraC).
- På dagar 23, 25 och 28, Ersätt används medium med 14 mL 5% FBS DMEM F12-AraC.
- Dagar 29 upp till 49 (varannan dag), Ersätt används medium med 14 mL komplett DMEM F12 medium kompletteras med 5% fetalt bovint serum, 2 mM glutamin, 100 IE penicillin, 100 µg streptomycin, 5 µM av FudR (5-fluoro-2' deoxiuridin) och 10 µM Urd (uridin) (komplett 5% FBS DMEM F12-FudR-Urd).
- Dag 50, Ersätt används medium med 14 mL komplett DMEM F12 medium kompletteras med 5% FBS, 2 mM glutamin, 100 IE penicillin, 100 µg streptomycin och 10 µM Urd (komplett 5% FBS DMEM F12-Urd).
- På dagar 51 upp till 95 (två gånger i veckan), Ersätt används medium med 14 mL komplett 5% FBS DMEM F12-Urd.
Obs: Cellerna kan vara används för experiment från dag 51 men inte senare än dagen 95. Användningen av seriell behandlingar med Mitos-hämmare kan återvinna ren befolkningen av samtidig kultur efter mitotiska hNeuron och hAstrocytes (NT2-N/A). - För att seeda cellerna, Fortsätt med mild trypsinization som beskrivs för dag 20.
2. cellen kulturarbete av mänskliga mikrogliala celler CHME/Cl5
Obs: Detta är den mikrogliala delen av Minibrain (figur 1).
- Odla den mänskliga mikrogliala celler CHME/Cl5
- Ta bort en flaska med frusna celler från flytande kväve tanken. Hålla på is.
- Tina snabbt i 37 ° C vattenbad.
- Överföra cellerna i en 15 mL tub innehållande 10 mL komplett DMEM F12 medium kompletteras med 5% fetalt bovint serum, 2 mM glutamin, 100 IE penicillin och 100 µg streptomycin (dvs komplett 5% FBS DMEM F12 medium).
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min på RT. dissociera pelleten med 2 mL av komplett 5% FBS DMEM F12 medium.
- Överföring i en T75 Cell+ kolv som innehåller 13 mL komplett 5% FBS DMEM F12 medium.
- Kultur celler vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet tills 90% sammanflödet. Ändra medium varje 2-3 dagar.
- Subculturing de mänskliga mikrogliaceller CHME/Cl5
- Ta bort mediet från kolven.
- Skölj den cell enskiktslager med 10 mL PBS kompletteras med Ca2 + och Mg2 +.
- Skölj den cell enskiktslager med 10 mL EDTA-lösning (som hålls på RT).
- Tillsätt 3 mL trypsin-EDTA-lösning och inkubera 2 min på RT.
- Skaka kolven och kontrollera cellerna är fristående från plastytan.
- Tillsätt 10 mL av komplett 5% FBS DMEM F12 medium att inaktivera trypsin, överföra i en 15 mL rör och Centrifugera under 5 minuter vid 200 x g och RT.
- Separera pelleten med 10 mL komplett medium och Använd 1 mL för att Inokulera varje ny kolv som innehåller 14 mL komplett 5% FBS DMEM F12 medium.
- Inkubera kolvar vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet tills 90% sammanflödet.
3. kultur arbete med hCMEC/D3 att bestryka porösa skär och förbereda BBB
- Odla mänskliga endothelial celler hCMEC/D3 (figur 2)
- Späd den typ jag råtta kollagen till 1:30 med ren sterilt vatten (cell kultur grad).
- Överför 10 mL till en T75 Cell+ kolv och inkubera 2 h 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet inkubator.
- Ta bort kollagen lösningen och ersätta det med 15 mL av endotelceller medium kompletteras med 10 mM HEPES (som kallas komplett endotelceller medium).
- Ta bort en cryo injektionsflaska av celler från flytande kväve tanken. Hålla på is.
Obs: Cellerna odlades, och ett fröparti gjordes som beskrivs av tillverkaren. Cellinje täcks av ett avtal om biologiska materialöverföring. Cellerna som framställs vid passage nummer 25 och bör inte användas längre än passage 35. - Tina snabbt i 37 ° C vattenbad.
- Överföra cellerna i T75 Cell+ kolven och tillbaka kolven vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet för 2 till 4 h.
- Ta bort mediet försiktigt utan att förlora eller att ta bort celler. Skölj cellerna en gång med 10 mL komplett endotelceller medium.
- Tillsätt 15 mL av komplett endotelceller medium.
- Kultur celler vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet tills 100% sammanflödet (inte mindre än 4 dagar) utan att ändra mediet.
- Subculturing hCMEC/D3 för att förbereda insatsen av BBB
- Coat en ny T75 Cell+ kolv eller infogar med typ jag råtta kollagen som beskrivs ovan (steg 3.1).
- Ta bort mediet från kolven. Skölj den cell enskiktslager med 10 mL PBS kompletteras med Ca2 + och Mg2 +.
- Tillsätt 2 mL av trypsin-EDTA-lösning och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C.
- Skaka kolven och se till att cellerna är helt fristående från plastytan.
- Tillsätt 4 mL komplett endotelceller medium att inaktivera trypsin.
- Med plast pipett 5 mL mekaniskt separera celler genom att aspirera och spolning cellsuspensionen samtidigt som den 5 mL pipetten till botten av kolven minst 5 gånger.
- Räkna cellerna och användning 5 x 104 celler/insats för en 12 väl polyester membran kultur infogar infoga och 2 x 106 celler för en T75 Cell+ kolv. Förbered också tre filter utan celler för PELy (dvs endotelceller permeabilitet till Lucifer gula se nedan punkt 4.2) experiment med Polyester membran kultur skären.
- Ruva kolvar eller skär vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet tills 100% sammanflödet.
- Ändra inte mediet för T75 Cell+ kolven tills en ny passage. Tvärtom för BBB på polyester membran kultur infogar: ändra medium på dag 2 och 4, använda BBB för experiment på dag 6.
4. Bygg- och kvalitetskontroll av de BBB-Minibrain (figur 2)
- Ställa in en BBB-Minibrain Polyester membran kultur infoga enheten (figur 2B)
- Växa hCMEC/D3 cellerna på 12 väl Polyester membran kultur infoga filter för 6 dagar på endotelceller medium innan du använder dem för experimentet.
- Coat en 12 väl tallrik med poly-D-lysin (1 mL per brunn, 10 µg/mL, 4 h på RT) och sedan laminin (1 mL per brunn, 1 µg/mL, övernattning på RT).
- Ta bort laminin och tillsätt 1 mL av endotelceller medium kompletteras med 5% FBS (5% endotelceller medium).
- Inkubera i 1 timme vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet.
- Försiktigt trypsinize de NT2-N/A (enligt beskrivningen i steg 1.3.9) och CHME/Cl5 (enligt beskrivningen i steg 2.2) och separera cell pellets med komplett endotelceller medium.
- Räkna cellerna, mix 3,6 x 105 NT2-N/A och 0,4 x 105 CHME/Cl5 celler per brunn och utsäde 12 väl plattan.
- Vid T = 24 h (24 h efter sådd): ändra används medlet med färska komplett endotelceller medium (Minibrain celler och endotelceller) och över hCMEC/D3 Polyester kultur infoga membranfiltret ovanpå de Minibrain cellerna. Inkubera i BBB-Minibrain vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet.
Obs: Den BBB-Minibrain sedan kommer att bestå av ett lager av mänskliga endothelial celler hCMEC/D3 på filter isolera den luminala fack (eller ”blod” fack) och en blandad kultur av mänskliga celler hNT2-N/A och hCHME/Cl5 (Minibrain) längst ned på den väl definierande den abluminal fack (eller ”hjärnan” fack) (figur 2B).
- Validering av endotel permeabilitet av den BBB-Minibrain (kvalitetskontroll) (figur 2 c)
- Förbereda transport bufferten (TB), vilket är HBSS (Hanks balanserad saltlösning) buffert med Ca2 + och Mg2 + kompletteras med 10 mM HEPES och 1 mM natrium Pyruvat.
- Förbereda 12 plattor med 1,5 mL transport buffert per brunn.
- Vid T = 0, göra färsk transport buffert kompletteras med 50 µM Lucifer Yellow (LY-TB).
- Återföra varje filter uppochned för att avlägsna försiktigt medium utan att påverka endotelceller barriären.
- Placera filtret på fyllda 12 väl plattan och tillsätt 0,5 mL av LY-TB.
- Inkubera plattorna i en inkubator vid 37° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet.
- Vid T = 10 min överföring filtren på nya TB fyllda 12 plattor och hålla i abluminal facket av första plattan för OD läsning.
- Vid T = 25 min, upprepa 4.2.7.
- Vid T = 45 min, stoppa transporten genom att ta bort filtren från plattorna. Håll abluminal och luminala fack för OD åtgärder.
- Överföring i en mörk 96 väl plattor proverna: 10 µL med 190 µL TB för den LY-TB och de luminala fack, 200 µL prov för delar av abluminal.
- Mäta fluorescensen av den LY-TB närvarande i de olika proverna vid λ428 nm λ535 nm (excitation och utsläpp längd vågor respektive).
- Beräkna endotel permeabilitet (Pe) mot LY-TB (PeLY) enligt Siflinger-Birnboim, A et al. (1987)39 och Da Costa, A et al. (2018)34 med hjälp av formeln:
1 – PSe = (1/PSt) – (1/PSf) och PeLY= PSe/S.
Obs: Polyesterstapelfibrer är permeabiliteten i filtret utan celler, PSt är permeabiliteten i filtret med celler, PSe är permeabiliteten av endothelial enskiktslager tiden enskiktslager, S yta är ytan av enskiktslager (för ett 12 väl filter = 1,12 cm2 ), PeLY uttrycks i cm/min. För hCMEC/D3 PeLY bör vara mellan 0,7 och 1,2 x 10 används-3 cm/min beroende främst av FBS i experiment. Viktigt: en PeLY högre än 1.2 innebär att BBB inte är tillräckligt tät och några läckage kan observeras. Kassera dessa hinder.
5. användning av BBB-Minibrain att belysa förekomsten av neuro-invasiv viruspartiklar i ett gula febern-Virus vaccin prov, franska neurotropa virus, YFV-FNV 34 (figur 3)
- BBB korsning och multiplikation av gula febern-virus i Minibrain
- Använd den BBB-Minibrain som beretts enligt anvisningarna i steg 4.1.7 24 h före tillsats av viruset. ersätta mediet med 2% FBS endotelceller medium.
Obs: Det är extremt viktigt att undvika att ändra mediet bara innan du lägger till viruset. Ändra mediet kan aktivera de mänskliga endothelial cellerna och övergående öppna den barriär som gör att passagen av viruset. Här ändras mediet 24 h innan experimentet. - Vid T = 0, tillsätt 3500 plack bildas enheter (PFU) av YFV-FNV utspädd i 50 µL 2% FBS endotelceller medium mycket försiktigt på toppen av luminala facket. Kontrollen BBB-Minibrain inokuleras med 50 µL av 2% FBS endotelceller medium utan virus. Bestäm PeLY följeslagare väl.
- Inkubera i BBB-Minibrain i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet.
- Efter 24 h, ta bort polyester membran kultur skär filter enheten och bestämma PeLY, prov 1 mL från den abluminal facket och titrera viruset som beskrivits av A. da Costa et al. (2018)34. Ersätta mediet med färska 2% FBS endotelceller medium.
- Inkubera i BBB-Minibrain vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet.
- Efter 72 h, prova medlet från abluminal facket och titrera viruset eller extrahera RNA från Minibrain celler för gen uttryck analys som beskrivits av A. da Costa et al. (2018)34.
- Använd den BBB-Minibrain som beretts enligt anvisningarna i steg 4.1.7 24 h före tillsats av viruset. ersätta mediet med 2% FBS endotelceller medium.
- Förstärkning av neurotropa varianter av YFV-FNV på Minibrain celler av seriell passager
- Användning Minibrain celler belagda plattor med 12 (dvs steg 4.1.6 och 4.1.7).
- På gång peka 0 h, lägga till 3.500 plack bildas enheter av YFV-FNV utspädd i 50 µL av 2% FBS endotelceller medium mycket försiktigt på toppen av cellerna (luminala fack).
- Efter 1 h, ta bort medlet med det virus inokulatet och ersätta med färsk 2% FBS endotelceller medium.
- Efter 48 h, prova 500 µL odlingssubstrat och infektera färska Minibrain celler
- Efter 120 h, prova 500 µL odlingssubstrat och infektera färska Minibrain celler.
- Efter 192 h, spara odlingsmedium (= virus lager berikad) och extrahera RNA från Minibrain celler för gen uttryck analys som beskrivits av A. da Costa et al. (2018)34.
6. användning av BBB-Minibrain att studera BBB korsning och hjärnan cell riktat en biomolecule
- Transportera över BBB av en neuron inriktning biomolecule
- Använd Minibrain-BBB beredd som beskrivs steg 4.1.7.
- Vid tidpunkt 0 h, lägga biomolecule (i exemplet förutsatt i avsnittet resultat lades 58.75 ng/BBB av cell diffusionskoefficient NeuroTag-NV molekyler per BBB-Minibrain sätt.
- Inkubera i BBB-Minibrain vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet.
- Efter 24 h, bort polyester membran kultur skär filter enheten och bestämma PeLY, då fläcken Minibrain cellerna för hNeurons neurofilament Nf200 och upptäcka förekomsten av biomolecule i Minibrain (i det exempel som ges i resultatet avsnitt, NeuroTag-NV upptäcktes använder en antikropp riktad mot Strep-taggen innehåller35,40).
- Transportera över BBB neuroregenerative biomolecule och efterföljande nervskyddande analys i Minibrain efter biomolecule har korsat BBB
- Använd Minibrain-BBB bereds enligt anvisningarna i steg 4.1.7.
Obs: För molekyler inriktning nervceller endast, Minibrain celler kan ersättas av de nervceller celler (NT2-N) bara38. - Lägg till 58.75 ng/BBB-Minibrain väl av cell diffusionskoefficient NV molekylerna (aktiv form CPM-NeuroTag-NV, icke-aktiv form CPM-NeuroTag-NVΔ) beskrivs av C. Prehaud et al. (2014)35vid tidpunkt 0 h.
- Inkubera i BBB-Minibrain i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet.
- Efter 4 h, göra individuella sår med en injektionsnål (26GX1/2 ”, 12-4,5, Terumo, Belgien) på Minibrain cellerna. Göra minst 10 repor på varje individ också. Bestäm PeLY följeslagare väl.
- Inkubera i BBB-Minibrain i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet.
- Efter 8 h, ersätta mediet i abluminal facket med färska komplett endotelceller medium.
Obs: Det är viktigt att ersätta mediet vid detta steg eftersom den skadade av Minibrain celler kan leda till celldöd och sedan utgivningen av cytotoxiska substanser. - Inkubera i BBB-Minibrain i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet.
- Efter 48 h, färgas cellerna för axon regenerering av hNeurons som beskrivs av C. Prehaud et al. (2013)40.
- Använd Minibrain-BBB bereds enligt anvisningarna i steg 4.1.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den BBB-Minibrain är en i cellulo experimentell modell av blod-hjärn-gränssnittet.
Den BBB-Minibrain ställs in på polyester membran kultur infoga systemet att efterlikna ett blod fack på övre plan och hjärnan fack på den lägre nivån av blod-hjärn-gränssnittet (figur 2AB). Den består av en luminala fack med hCMEC/D3 endotelceller på filtret bildar BBB och ett fack för abluminal, som innehåller Minibrain tri-människakulturen cerebral celler (nervceller, astrocyter och mikrogliaceller). Minibrain cellerna uppvisar en klassisk tri-kultur blandad befolkning fenotyp (figur 1, nedre högra panelen) och snabb specifika markörer för varje typ av cell som visas av da Costa A. et al., 201834.
Användningen av hCMEC/D3 lager i den BBB-Minibrain kan få en stark barriär med en genomsnittlig PeLY av 0.95e-03 cm/min och en genomsnittlig Trans Endothelial elektriska motstånd (TEER) 51.89 Ω/cm2. Dessa värden är i spänna av de bästa värdena någonsin beskrivs för en mänsklig endotelceller linje27,41 i sådant polyester membran kultur infoga system (figur 2 c). Dessa celler uttrycker åtsittande föreningspunkt protein markörer såsom ZO-1 och cadherin som förväntat av permeabilitet kvantifiering (inga data anges). De uttrycker också alla delmängder av receptorer, efflux transportörer eller transportörer [receptorer: Receptorn, låg densitet lipoprotein receptor; LRP1, låg densitet lipoprotein receptor relaterade protein 1; INSR, insulin receptor; LEPR, leptin receptor; LU, basalcellscancer vidhäftning molekyl; TFRC, CD71 antigenet. AGER, advanced glycosylation slutprodukten receptorn. Effluxtransportörer: ABCB1 (P-gp); ABCG2 (BCRP); ABCC1 (MRP1); ABCC2 (MRP2); ABCC4, ABCC4 protein; ABCC5, ABCC5 protein. Transportörer: STRA6, stimuleras av retinoic acid gen 6 protein; SLC2A1, glukostransportör typ 1; SLC7A5, stora neutral aminosyra transportören 1; SLC1A1, koncentrationsgradient carrier familj 1 protein; SLC38A5, koncentrationsgradient carrier familj 38 medlem 5 protein; SLC16A1, monocarboxylate transport protein 1], som är huvudsakliga proteinerna som är relevanta för deras biologiska funktioner (figur 2D)21.
Den BBB-Minibrain tillåter att välja, förstärka och karaktärisera sällsynta neuroinvasive viral varianter från en levande virus vaccin beredning.
BBB-Minibrain kultur enheten användes som en i cellulo testa så att isolering och förstärkning av sällsynta neuroinvasive/neurovirulent varianter som potentiellt finns i gula febern-virus (YFV) viral levande vacciner42. YFV är ett viscerotropic virus inriktning levern som inte effektivt korsar BBB. Det franska neurotropa viruset, FNV, användes som levande YFV vaccin fram till 1980-talet33,43. FNV befanns orsaka efter antikroppars neuropathogenesis hos barn (0,3 till 0,4 procent bland vaccinerade) och därmed lades ned 198233,43. Vi använde FNV här som en prototyp av YF virus som kan innehålla en hög andel av neuroinvasive/neurovirulent varianter42,44. En FNV virus beredning (dvs 3500 PFU/ml) lades i luminala facket av en BBB-Minibrain, kontroll var en BBB-Minibrain som var mock-infekterade. Förekomsten av viruspartiklarna i luminala facket förändrar inte barriär permeabilitet som uppmätta 24h senare eftersom PeLY i viral brunnarna inte skiljde sig från de PeLy av kontrollbrunnar (0,80 ± 0,09 x 10-3 cm/min ”och 0,86 ± 0,09 x 10-3 cm/min för PeLY i kontroll- och YFV-FNV brunnar respektive). Innehållet i abluminal facket utvärderades för förekomsten av virus av plack assay, på 24 h efter infektion. Minibrain cellerna var ruvade två dagar längre för att utvärdera förstärkning av neuroinvasive varianter i hjärnans celler och för att övervaka genuttryck som beskrivs på den tecknade serien som visas på figur 3A.
Vi har upptäckt vissa YFV-FNV virus, som kan passera BBB 24 h (menar 43 PFU/mL). Virusen var förstärkt för de kommande två dagarna av multiplikation av viruset inne i hjärncellerna (menar titer 4,69 x 104 PFU/mL), (figur 3B). Notera skulle en beredning av vaccinet-stam som inte orsakar efter antikroppars neuropathogenesis inte effektivt korsar BBB i detta system som det har visats av da Costa A. o.a. (2018)34. Vi identifierat två biomarkörer för multiplikation av viruset: Interferon stimuleras gen 15 (ISG15) och Interferon reglerande faktor 7 (IRF7). Uttryck av dessa två biomarkörer stimuleras när denna neuroinvasive viral befolkningen var seriellt överförda på Minibrain celler (figur 3 c). Dessa upregulations mätt med Q-RT-PCR var strängt korrelerade till virusbelastningen (Pearson p värde 0.0016 för ISG15 och 0.0260 för IRF7).
BBB-Minibrain tillåter båda testmetoder en biomolecule att passera barriären och på samma tid testning om funktionen biomolecule bevarades efter BBB korsning förmåga.
NV är en biomolecule härrör från rabiesvirus som äger häpnadsväckande boenden neuroprotektion och neuroregeneration40. Denna lilla polypeptid att varken naturligt passerar cellmembranet eller BBB var smält med en CPM kunna rikta nervceller. Vårt val var att använda den rörliga delen (VHH) av en enda kedja antikropp av lamadjur som korsar de biologiska membran inklusive den BBB36,45 och en NeuroTag inriktning nervceller specifikt. NV var knuten till VHH och en NeuroTag, för att konstruera en CPM-NeuroTag-NV (figur 4A) och till VHH bara för att konstruera en CPM-NeuroTagΔ-NV saknar den särskilda NeuroTag som möjliggör inriktningen av nervceller (figur 4B). Efter att den lagts till luminala utrymmet, CPM-NeuroTag-NV (gröna prickar) korsar BBB och kunde rikta mänskliga nervceller (i rött) (figur 4 c, D). CPM-NeuroTagΔ-NV korsar endotelceller barriären (gröna prickar) men mål mindre effektivt de mänskliga nervceller (majoriteten av gröna prickar ligger utanför nervceller) (figur 4 d).
Som beskrivits ovan, var NV kopplad till en VHH och en NeuroTag för att konstruera en CPM-NeuroTag-NV. Vi gjorde samma sak för NVΔ en inaktiv form av NV saknar den aktiva delen av NV (CPM-NeuroTag-NVΔ) (figur 5A). Efter att den lagts till luminala utrymmet, CPM-NeuroTag-NV korsar BBB och kunde regenerera axoner av mänskliga nervceller efter såra (figur 5B, högra panelen), tvärtom att CPM-NeuroTag-NV Δ inaktiv form av NV (figur 5B, vänster panelen)40. Dessa egenskaper analyserades i två typer av protokoll; antingen i en pre-exponering (figur 5 c) eller i ett inlägg exponering protokoll (figur 5 d). När tillämpas innan axon repor (4 h, H4), CPM-NeuroTag-NV utlöser neuroprotektion av skadade nervceller och axonal förnyelse tvärtom av mock behandlade celler (dvs. kontroll) eller celler behandlas med CPM-NeuroTag-NVΔ (medelvärde regenerering 91% och 12% - 10% respektive figur 5 c). När biomolecule tillämpades efter axonal lesioner (1 timme, H1, figur 5 d) för att efterlikna ett terapeutiskt efter exponering protokoll, CPM-NeuroTag-NV är fortfarande kunna regenerera axoner tvärtom av funktionshindrade form av CPM-NeuroTag-NV Δ,) menar förnyelse 85% och 5,1% respektive) (figur 5 d).
Figur 1: The Minibrain model. Tidtabell i NT2-N/A och CHME/Cl5 kulturerna (övre panel). Fotografier (lägre paneler) av den ursprungliga cellinje (Ntera/cl2. D1) i den vänstra panelen, den pseudo neurospheres erhålls efter ATRA behandling i den mellersta övre panelen, den CHME/Cl5, i mellersta nedre panelen och den Minibrain triculture (Cristal Violet färgning), i den högra panelen, följd av blandningen av NT2-N/A och CHME / CL5 kulturer. Skala bar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: BBB-Minibrain modellen. A. tidsplan för hCMEC/D3 kulturer och fotografi av BBB-Minibrain enheten: polyester kultur skär-filtermembran med hCMEC/D3 endotel barriär hålls med en forcep innan kan sättas in i en brunn ett 12 brunnar cell kultur plattan. B. tecknad film som beskriver enheten med luminala (blod) facket som innehåller endotelceller barriären och abluminal (hjärnan) facket som innehåller Minibrain celler (mänskliga nervceller, astrocyter och mikrogliaceller). C. representativa åtgärder av den BBB-Minibrain permeabililty av TEER (dvs. TransEndothelial resistans) på tre enheter eller genomtränglighet LY (dvs PeLY) på fem filter. D. uttryck analys av q-RT-PCR av receptorer, Effluxtransportörer och transportörer på endotelceller hCMEC/D3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: The BBB-Minibrain modell tillåter identifiering av neuroinvasive varianter bland levande YFV vaccin förberedelse. A. schema av experimentet. B. kvantifiering av de virus som har korsat BBB av plackbildande enhet (PFU) titrering av levande virus (varje punkt representerar en polyester membran kultur skär experiment). C. tomt på ISG15 och IRF7 genuttryck mätt q-RT-PCR som en funktion av antal viruspartiklar i virusbelastningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: The BBB-Minibrain tillåter testning av neuroregenerative biomolecule egenskaper: särskild inriktning av nervceller när NV smälts på NeuroTag. A. tecknad av CPM baserat NV (dvs CPM-NeuroTag-NV) som innehåller en specifik NeuroTag för att rikta neuron specifikt. B. tecknad av CPM baserat NV bort av NeuroTag (dvs CPM-NeuroTagΔ-NV). C. representativa immunofluorescens fotografier av de mänskliga nervcellerna. Skala bar 50 µm. NF 200 i rött, CPM-NeuroTag-NV/CPM-NeuroTagΔ-NV i grönt, kärnor i blått. D. CPM-NeuroTag-NV molekyler kan passera BBB och rikta mänskliga nervceller mer effektivt än CPM-NeuroTagΔ-NV. Infekterade nervceller och totala befolkningen av nervceller räknades på tre exemplar bilder efter immunolabeling. Totala nervceller motsvarar NF200 positiva celler (i rött). Alla erytrocyter som är associerad med en eller flera gröna pricken (CPM-NV) räknas som en positiv neuron. Oparat t-test på två tailed ***p = 0,0002. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: The BBB-Minibrain tillåter testning av neuroregenerative biomolecule egenskaper: BBB korsning ändrar inte neuroregenerative egenskaperna för NV. A. tecknad av CPM baserat NV (dvs CPM-NV) och dess funktionshindrade motsvarighet (dvs CPM-NVΔ). B. Axon regenerering av CPM-NV i ett i cellulo scratch test (höger panel). CPM-NVΔ kan inte utlösa axon regenerering (till vänster) skala bar 100 µm. C. CPM-NV kan korsa endothelial cellen och regenerera axoner på nervceller i den BBB-Minibrain när tillämpas 4 h innan lesionen: (övre panel) ordningen av experiment; (nedre panelen) kvantifiering av regenerering. D. CPM-NV är också aktiv i ett terapeutiskt protokoll när det används 1 h efter den såra: (övre panel) ordningen av experiment; (nedre panelen) kvantifiering av regenerering. Oparat t-test på två tailed ***p < 0,0001. Regenerering beräknades från tre exemplar experiment (> 800 nervceller räknas) efter färgning av neuronala celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna artikel vi visat hur man bygger en i cellulo blod/hjärnan gränssnitt, det BBB-Minibrain, genom att kombinera en BBB-modell och en kultur av blandas hjärnan cerebral celler (Minibrain) i ett enda kit. Detta system är biologiskt relevant, lätt att ställa in och hantera för praktiker väl utbildade i cellkultur.
När det gäller någon annan in vitro-modell av BBB, skulle tillförlitliga resultat erhållas om drastiska kontroll av täthet av barriären tillämpas. Skär bör testas noggrant för permeabilitet och några skär med otillräcklig permeabilitet värden (dvs. en PeLY högre än 1,2) ska kasseras.
FBS prover ska testas noggrant för att identifiera en batch som inte inaktiverar egenskaperna hos BBB. Samma råd kan göras angående fordon medium i vilket virus partiklar eller biomolekyler är utspädda. Det rekommenderas också att hålla volymen biomolecule eller virus suspension, så liten som möjligt för att inte ändra medium sammansättningen av luminala facket. Differentiering av mänskliga samtidig neuron/astrocyter kultur från den Ntera/CL2. D1 är en beprövad teknik. I motsats till mänskliga nervceller som är efter mitotiska, astrocyter fortfarande delande celler. Hög spridning av astrocyter celler observeras ibland. Om detta händer, har den Minibrain kulturen som skall kasseras. CHME/Cl5 cellerna vi använde i vårt laboratorium var phenotyped att bevisa att de var av mänskligt ursprung (Homo sapiens CCNT1 fenotypning). Det finns en risk att vissa CHME massor används i vissa laboratorier kan vara ursprungslandet råttan (Rattus norvegicus) som hävdade av Garcia-Mesa Y. et al. (2017)46. Därför är det rekommenderat att kontrollera för beskärningen av det CHME/Cl5 cellinje.
Minibrain tri-människakulturen systemet inklusive post mitotiska nervceller (främst dopaminerga), härmar astrocyter och en mikrogliala cell fodrar, en förenklad cerebral miljö. Detta system kan fortfarande förbättras. Man kan tänka sig att lägga oligodendrocyter till kulturen med målet att erhålla myeliniserade axoner eller primära mikrogliaceller. Minibrain kan också ersättas med en blandad kultur människa stamceller19,20,21. Variabiliteten mellan olika massor av celler kommer ändå måste styras noggrant. BBB-Minibrain komplexitet kan också ökas genom att lägga till pericyter23. I våra händer hindrades denna förbättring av svårigheten att få pålitlig tillgång till pericyter av mänskligt ursprung.
Vi har visat möjligheterna och nyttan av detta kit härma blod-hjärn gränssnitt, för att i) isolera sällsynta neuroinvasive viruspartiklar från ett gula febern vaccin prov som har utvecklats egenskapen för att ange hjärnan via BBB, och ii). förstärka dessa neuroinvasive subpopulationer i Minibrain tri-kulturen härma en förenklad hjärnparenkymet. Framtida tillämpningar kan vara att utöka kontrollen av andra levande vacciner såsom påssjuka vaccinet kvalitet och främja den BBB-Minibrain som ett sätt att studera neurovirulence funktioner in vitro.
Andra pilotstudien var att visa att en läkemedelskandidat passerar BBB och når Minibrain, utan att förlora dess neuro-regenerativ egenskaper. Vi är starkt övertygade om att den BBB-Minibrain kan tillåta stora framsteg i försortering av molekyler innan du släpper dem till prekliniska tester. Användningen av den BBB-Minibrain bör underlätta genomförandet av 3R-åtgärder som syftar till att minska användningen av djurförsök för både reglementary analyser och experimentell forskning.
Alldeles med nästa utvecklingen av metoder för i silico (datormodell), kommer vi snart att kunna identifiera läkemedelskandidater med en kickprobability av passerar BBB, utveckling av en 3D-modell i cellulo härma nervös parenkymet blodet gränssnitt skulle vara till stor hjälp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Immateriell egendom som tillhör systemet var de patent som refereras i 32, 35 och 38.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av interna bidrag från Institut Pasteur inklusive en grundval grant (PTR 435) och bidrag ”Contrat de bra à la Recherche” som tillhandahålls av Sanofi Pasteur att Institut Pasteur. A. da Costa stöddes av Sanofi-Pasteur grant och Florian Bakoa är mottagaren av ett PhD stipendium som tillhandahålls av ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Vi står i skuld till Pr Pierre-Olivier Couraud och Dr Florens Miller för bra diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well plates | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
| Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
| Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
| Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
| Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
- Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
- Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
- Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
- Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
- Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
- Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
- Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
- Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
- Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
- Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37 (2017).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
- Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
- Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
- Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671 (2014).
- Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
- da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
- Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Lafaye, P. , EP3191510A1 (2014).
- Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
- Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
- Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
- Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
- High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Wolff, N., Khan, Z., Terrien, E., Sanderine, V. , EP20110306454 (2011).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408 (2018).
- Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
- Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
- Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
- Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).
