Summary
פרוטוקול זה מתאר את הדור של החולה הנגזר הנושא מודלים מבע על ידי פנים-ומבחינה משפטית הקניית תאים קרצינומה של תא ברמה גבוהה urothelial או פנים-rectally הזרקת תאים סרטניים המעי הגס לתוך סוכרת שמנים/חמור משולב כשל חיסוני (הנהון/SCID) עכברים לגידול הגידול הראשוני גרורות מתחת להשפעה של תאים סטרומה בצומת הלימפה, אשר מחקה את ההתקדמות של מחלות גרורתית האדם.
Abstract
חולי סרטן יש התחזיות העניים כאשר הלימפה (LN) מעורבות נוכחת בשני בדרגה גבוהה קרצינומה של תאים (HG-UCC) של שלפוחית השתן ואת סרטן המעי הגס (CRC). יותר מ 50% של חולים עם שרירים פולשנית UCC, למרות טיפול מרפא עבור מחלות קליניות מקומי, יפתחו גרורות ולמות בתוך 5 שנים, ו-CRC גרורתי הוא הגורם המוביל של מקרי מוות הקשורים לסרטן בארה ב. Xenograft מודלים בעקביות לחקות UCC ו-CRC גרורות לראות בחולים נחוצים. מחקר זה נועד לייצר המטופל נגזר הנושא מבע (pdox) מודלים של ucc ו CRC עבור גידול הגידול הראשוני גרורות ספונטנית תחת השפעת תאים סטרומה בתוך מחקה את ההתקדמות של האדם מחלות גרורתית להקרנה התרופה. טרי UCC ו-CRC גידולים שהתקבלו מחולים שעברו כריתה עבור HG-UCC ו אדנוקרצינומה המעי הגס, בהתאמה. שיתוף מחוסן עם התא סטרומה ב-LN (LNSC) תאי HK, לוציפראז-מתויג בתאי UCC היו פנים-ומבחינה משפטית (ליברות) שהוחדרו לתוך החולה החיסוני הנשי/חמור משולב בשילוב הכשל (הנהון/SCID), ותאי CRC היו פנים-rectally IR) הזריקו זכר הנוד/עכבר SCID. צמיחת הגידול גרורות היו במעקב שבועי באמצעות הדמיה biלומינסנציה (בלי). עם ההקרבה, גידולים ראשוניים ואיברי העכבר נקצרו, שקלו, ו formalin-קבוע עבור המטאוקסילין ו אאוזין ו אימונוהיסטוכימיה כתמים. במודלים הייחודיים שלנו pdox, גידולים מבע דומה גידולים טרום השרשה החולה. בנוכחות של תאים HK, שני הדגמים יש גבוהה השתלת שיעורי הגידול נמדד על ידי משקולות הגידול, 83.3% עבור UCC ו 96.9% עבור CRC, ו גבוהה גרורות איברים רחוקים (33.3% הכבד או גרורות בריאות עבור UCC ו 53.1% עבור CRC). בנוסף, לשני הדגמים יש אפס תמותה מההליך. הקמנו מודלים ייחודיים, מיומנסנים עבור כספית אנוש ו CRC, אשר מאפשרים היווצרות הגידול, צמיחה, גרורות לימודים. עם דגמים אלה, בדיקות של תרופות טיפוליות ניתן לבצע ביעילות ובאופן קליני-מבחינה קלינית.
Introduction
הוכח כי הלימפה (בתוך) גרורות הוא אינדיקטור התחזיות הגרוע בהרבה ממאירות איברים מוצק, כולל קרצינומה של תאים ברמה גבוהה urothelial (ucc) של שלפוחית השתן סרטן המעי הגס (CRC)1,2. מעל למחצית החולים עם שרירים פולשנית UCC (MIUCC), למרות טיפול מרפא למחלות קליניות מקומי, יפתחו גרורות ולמות בתוך 5 שנים. CRC גרורתי הוא הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן בארה ב.
מוערך 81,190 חולים חדשים 17,240 סרטן מקרי מוות ספציפיים צפויים להתרחש 2018 בארצות הברית בשל ucc של שלפוחית השתן3,4. בעוד המטופלים יהיה בעיקר (70%) נוכח מחלה פולשנית שאינה שריר, 30% יהיה MIUCC5. למרות הטיפול המרפא (כריתת cystectomy קיצונית [RC] עם או בלי כימותרפיה מערכתית) עבור מחלה מקומית קלינית, חצי מהחולים עם MIUCC של שלפוחית השתן עדיין לפתח גרורות ולמות בתוך 5 שנים3. צומת לימפה מעורבות נמצא כ 20% על 25% של המטופלים עברו RC6,7,8. שיעור ההישרדות של חמש שנים ב-LN חולים חיוביים הוא פחות מ 35% אפילו לאחר RC, מציע במעורבות כנבא שלילי מכריע על הפרוגנוזה בחולים UCC.
סרטן המעי הגס הוא הסרטן השלישי השכיח ביותר שאובחנו בגברים ונשים הן בארצות הברית. התוצאות המטופל תלוי במידה רבה על מאפייני הגידול ומיקרוסביבה הגידול, כגון עומק של פלישה, במעורבות, וגרורות איברים מרוחקים. למרות שיעור התמותה ב CRC ירד בעשור האחרון עקב ההקרנה ניתוחים יעילים, מעריכים כי כמעט 50% של חולי CRC יפתחו גרורות או מחלה חוזרת9.
מודלים של חיות קטנות לספק מהיר, הניתנות לכימות, ולאפשר פלטפורמת ללמוד התקדמות הגידול דפוסי גרורתי שונים. יש כרגע לא תיאר מבע מודלים בעקביות לחקות CRC ו ucc גרורות לראות בחולים. הנתיב העיקרי של גרורות סרטן רחוקה היא באמצעות התפשטות הלימפה. מחקר חדש עולה כי LNs לספק גידולים עם מיקרוסביבה ייחודית, והם לא רק רק מטרות נייח שבו תאים סרטניים לעבור בעקשנות, אבל גם לשחק תפקיד אינטגרלי על ידי אינטראקציה עם תאים סרטניים בתהליך גרורתי. אכן, המחקרים שלנו גילו כי, בנוסף לחינוך וקידום התקדמות הגידול גרורות, מיקרוהסביבה בסטרומה גם אחראי על עמידות לסמים ב CRC10,11. המעבדה שלנו אישרה לאחרונה את ההשפעות הטומגניים של בתאי סטרומה (LNSCs) ב CRC ו uccs באמצעות מטופל הנגזר המטופל הנושא מבע (pdox) עכבר מודלים12,13.
פיתוח מודלים של חמצון מספק פלטפורמה חשובה לחקר הסרטן הטרנסלבותית14,15. על ידי שמירה על היסטולוגית העיקריים ואת המאפיינים הגנטיים של גידול התורם שלהם, מודלים pdox להישאר יציבים על פני מעברים ולעשות פלטפורמות טובות לחקר הסרטן translational12,15. מודלים PDOX נמצאים בשימוש עבור הערכת תרופות טרום קלינית, זיהוי בסמנים, והערכה טרום קלינית של אסטרטגיות רפואה אישית המאפשר חיזוי של תוצאות קליניות. כיום, אין מתוארים מודלים מבע כי לשקול את החשיבות של מעורבות LN ומסוגלים בעקביות לשחזר את הגידול העיקרי גרורות איברים רחוקים ב CRC ו ucc. במחקר זה, אנו מתארים את ההתפתחות של מודלים PDOX ב בהנהון/SCID עכברים עם שעתוק של מחלות CRC גרורתית ו UCC עם מעורבות LNSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות במחקרים אלה בעלי חיים נערכו במסגרת ההנחיות המאושרות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ובוועדת השימוש של מערכת הבריאות של אוחסנר ובהתאם להנחיות מחקר בעלי חיים. כל המטופלים גידולים עבור מחקר זה נאספו מחולים שעברו ניתוחי הניתוח סרטן בהתאם ללוח בריאות של מערכת הבריאות של נוסנר והסטנדרטים האתיים של הוועדה המוסדית על האדם ניסויים. פתקולוגים מוסמכים במערכת הבריאות של נוסנר קבע את האבחנות הפתולוגיים של דגימות החולה המבוססות על תכונות מיקרוסקופיים של תאים סרטניים, סוג היסטולוגית שלהם, ורמת כיתה.
הערה: הפרוטוקול הבא מתאר את השלבים עבור שני דגמים נפרדים של מבע, מודל ucc באמצעות אלקטרומזציה של קיר שלפוחית השתן כדי להחדיר תאים ucc והזרקה intrarectal של תאי CRC למחקר במודל CRC. כל השלבים ההכנה והניטור של הניסויים זהים לשני הדגמים, בעוד סעיפים 7 ו-8 מתארים באופן ספציפי את ההליך לגבי מעקב והזרקת CRC של UCC, בהתאמה.
1. שורות תא מקולף
- לגדול תאים HK בRPMI השלם-1640 בינוני שיושלם עם 10% סרום העובר, 2 גלוטמין ננומטר, 100 U/mL פניצילין G, ו 100 mg/mL סטרפטומיצין ב 37 ° c ב 5% CO2 מחולל חממה.
הערה: תאים HK הם נורמליים בתאי הזקיקים האנושיים וניתן לגדל ולהרחיב עבור ≤ 15 מעברים בתוך מבחנה16. - , כדי להתכונן לניסוי. מטריסיזציה של התאים
- הסר מדיה והוסף 2 מ ל של 1% טריפסין בתמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS) לתאים. למקם תאים בחזרה 5% CO2 מחולל חממה ב 37 ° c עבור 4 דקות.
- לאסוף את התאים ממנה לתוך שפופרת 15 מ ל באמצעות מכשיר כף יד בסיוע לחיות מחמד עם מצורף 10 מ"ל. הוסף 8 מ ל של RPMI-1640 בינוני מלא.
- שילוב 40 μL של תאים ו-40 μL של טרי, כחול בבאר אחת של מספר 96 היטב. הוסף 10 μL של תערובת ל הומוציטוטומטר ולספור תאים חיים. הוסף 1,000,000 תאים ב -25 מ ל להשלים RPMI-1640 בינונית לתוך 150 מילימטר רקמה סטרילית הטיפול המטופל כדי להמשיך לגדל את התאים.
הערה: השעיית תא HK מוכן בשלב זה יש להשתמש בתוך שעה כדי לערבב עם תאים סרטניים להזרקה.
2. אוסף החולה הדגימה
- לאסוף את הגידולים UCC מן המטופל הסכים 15 (BlCaPt15, pT3b N1 M0) ו 37 (BlCaPt37, pT3b pN0 M0) בניתוח כריתה.
- לאסוף גידולים CRC מפני החולה הסכימו 155 (CoCaPt155, T1 N0 M0) ו 302 (CoCaPt302, T1 N0 M0) בניתוח כריתה.
3. התפשטות הגידול בחולה
- לאסוף גידולים בניתוח בינוני סטרילי קר מקוי של מק המכילים פניצילין G (500 U/mL) ו סטרפטומיצין (500 mg/mL).
- השתל גידולים ישירות לתוך האגף השמאלי והימני של 6 שבוע הנקבה הזקנה הנהון/SCID עכברים.
- מכנית המממנת רקמות לחתיכות קטנות (~ 1 מ"מ3) באמצעות מספריים כירורגי קטן.
- רקמת השתל תת-עורי האגף השמאלי והימני באמצעות 13 גרם מח עצם השאיפה מחטים ביופסיה.
הערה: השתל נפח כולל של 8 מ"מ3 מחולק באופן שווה לשני צידי האגף.
4. תיוג והעשרה של לוציפראאז התווית גידולים
- למדוד צמיחה הגידול bi-שבועי באמצעות caliper דיגיטלי.
- . בקוטר של 1 ס מ, גידול מיותר ישירות להזריק לתוך הגידול עם מנה אחת של לוק/חלבון פלורסנט אדום (rfp)-הנגיף (50 μl/גידול, 1:30 דילול מרוכזת גבוהה סיכוייו מרוכז וירוס) באמצעות מזרק 1 cc עם מחט 27 גרם.
הערה: גידול החולה מגיע בדרך כלל 1 ס מ בקוטר 1 עד 2 חודשים. עם זאת, שיעור הצמיחה הוא משתנה מאוד מבוסס על מספר גורמים כולל כיתה הגידול וסוג. - מוניטור הגידול שבועי על ידי הדמיה ביולומימטיות (בלי) בחיות חיים.
- . שוקלים את העכברים הכנס עכבר מודע עם 150 mg/kg לוספרין intraperitoneally ולחכות 5 דקות עבור מצע להסתובב בגוף של העכבר.
- מורדם העכבר עם 2.5% isofלוריאן ב 100% חמצן, 1 L/דקות בחדר אינדוקציה.
- מניחים את העכבר על הבטן במכונת דימות בלי הדמיה עם הזרמת ותדמית. לקחת תמונות סדרתית כדי לאשר את הנוכחות של לוק/RFP באזורים סרטניים חיוביים (תמונה כוזבת צבע ביולוגי). החזרת העכבר לכלוב לאחר השלמת ההדמיה.
5. בחירת החלק המתאים של הגידול לעיכול אנזימטי
- ביום של הליך ucc או CRC, עכבר התמונה עם מתויג ללוציפראז הגידול כמו בשלבים 4.3.1-4.3.3.
הערה: משך הזמן של הגידול התת עורי לצמוח תלוי במהירות של צמיחת הגידול ומספר מתוכנן של בעלי חיים להיות מוזרק בניסוי. - הגידול הקציר מאגף העכבר והתמונה.
- המתת חסד עכבר על ידי CO2 אינהלציה לאחר הדמיה. מקום העכבר בחדר CO2 , להדליק גז ב 1.4 L/min עד הנשימה לעצור ולהשאיר על 3 דקות. עקוב אחר זה עם פריקה צוואר הרחם.
- עור נקי עם 70% אתנול. . עור אוהל ישירות מעל הגידול עם מספריים כירורגיים לעשות חתך קטן בעור. עור נפרד מגידול עם מספריים.
- להסיר את הגידול והמקום בצלחת פטרי סטרילית. תמונה כל צלחת במכונת דימות.
- השתמש מספריים סטרילי או אזמל כדי להפריד לוציפראז חלקים שליליים מקטעים חיוביים לוציפראז בגידול ותמונה מחדש.
- חזרו על הפעולה עד שיישארו רק החלקים החיוביים ביותר של הגידול.
6. העיכול האנזימטי של הגידול
- תחת מכסה זרם למינארי, הגון חתיכות גידול חיוביות ללוציפראז (שלב 5.4) לתוך החלקים הקטנים ביותר האפשריים באמצעות מספריים כירורגית סטרילי ולשים אותם לתוך צינור הצינורית של ה50 mL סטרילי.
הערה: הגידול בחלקים הקטנים ביותר האפשריים תניב תאים בודדים נוספים. - להכין פתרון תקציר על ידי הוספת 10 מ ל של הקולגן הרביעי (1.5 mg/mL), 80 μL של hyaluronidase (20 מ"ג/mL), ו 160 μL של deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) כדי 40 mL של HBSS. מערבבים פתרון על ידי היפוך.
- הוסף 35 ל-40 מ ל של פתרון התקציר לגידול טחון. מודטה ב 37 ° c עם סיבוב רציף 2 h.
הערה: שפופרת לנער נמרצות מדי פעם במהלך הדגירה כדי למנוע רקמת הגידול מפני הסדר. - מסנן את כל העיכול באמצעות מסננת תא 100 יקרומטר סטרילי ואחריו מסננת תא 40 יקרומטר כדי להסיר פסולת. שמור את הזרימה דרך ולהשליך פסולת.
- לשטוף את התאים הפנויים על ידי הוספת 20 מ ל של HBSS ו צנטריפוגה ב 329 x g עבור 5 דקות. מלבין את הסופרנטאנט ולהשעות את הגלולה ב 30 מ ל של HBSS.
- לשלב 10 μL של פתרון התא ו-90 μL של טריבן כחול בבאר אחת של 96 צלחת הבאר. ספירת תאים חיים באמצעות המיקלטומטר.
- העברה 1 x 104 כדי 1 x 106 תאים סרטניים לכל עכבר לצינור מעוקר של 15 מ"ל. הוסף 3 x 105 תאים HK משלב 1.2.3 לכל עכבר, על צינור אותו עם תאים סרטניים.
הערה: השתמש בצינורית חרוט 50 mL סטרילית אם הנפח הכולל חורג מ-15 mL. תמיד לחשב מינונים נוספים עבור בעלי חיים נוספים לקבוצת לימוד לחשבון אובדן של נוזלים במהלך שימוש במזרק. לדוגמה, אם קבוצה מכילה 5 עכברים, הפוך מספיק תאים עבור 6 או 7 עכברים. - צנטריפוגה ב 329 x g עבור 5 דקות. להיפטר supernatant על ידי מלטף או ליטוף.
- השהה את התאים מחדש ב-50 μL לכל עכבר עבור מודל UCC או 10 μL לכל עכבר עבור מודל CRC במדיית RPMI מלאה. לשמור על השעיה התא על הקרח עד מוכן לשימוש.
7. מודל העכבר UCC
- הכנת עכברים לפרוצדורה
- השיגו שישה עד שמונה בשבוע נקבה הנהון העכבר SCID. לגלח את הגב התחתון של העכבר באמצעות קרם להסרת שיער. מייבשים את העכבר בתא אינדוקציה עם isofלוריאן (2.5% ב 100% חמצן, 1 L/דקות).
- פעם הרגעה, מקום העכבר במיקום פרקדן עם חוטם שלה בחרוט האף isofלוריאן ובחזרה חשופים בחוזקה מקורקע על האלקטרודה מפזרים.
הערה: העכבר הוא מסומם לחלוטין אם לא מגיב הבוהן צביטה.
- הלהחדיר תאים UCC שהוכנו בשלב 6.9 כדי שלפוחית השתן באמצעות אנגיוצנתר (איור 1Aa, Ab).
- הגדר מכונת מונוקאובית אלקטרוקובלטרי ולהגדיר כוח של 4 W. לשמן את הצנתר 24 G מעוקרים עם ריבת שימון ולהכניס דרך השופכה של העכבר הנשי.
הערה: התנגדות קלה עלולה להיות מורגשת. בעדינות לדחוף קדימה או להסיר אנגיוצנתר ולחזור. . אל תכפה אם קטטר מתכופף על כניסה, להוסיף חוט מדריך סטרילי (לראות 7.2.2) במחצית לתוך קטטר כדי לספק יציבות. - במלואו להוסיף את 0.025 "קבוע ליבה מדריך ישר חוט 1 מ"מ מעבר לקצה של הקטטר אנגיו.
הערה: התיל מסומן בקלטת לפני ההליך כדי לציין את נקודת העצירה 1 מ"מ ולהבטיח עקביות. - להחזיק את הסיכה מונוסולאר לחוט מדריך עבור 1 s המאפשר גירוי חשמלי של רירית שלפוחית השתן.
- לצרף את חדש אנגיוקטטר סטרילי ל 1 cc luer-lok מזרק לצייר את 200 μL של התאים שנאספו משלב 6.9.
הערה: לפחות 100 μL אובד מהקטטר למזרק. מפצה על עוצמת הפסד בעת חישוב נפח של ההשעיה של התא הדרוש. - הסר חוט מנחה ו אנגיוצנתר מתוך השופכה של העכבר. הכנס את אנגיוקטטר עם מזרק של תאים המחוברים לשופכה.
הערה: ההתקדמות צריכה להיות קלה מבעבר. - להחדיר 50 μL של תאים לשלפוחית השתן של העכבר. המתן כמה שניות לפני הסרת הקטטר אנגיו, כדי לאפשר לתאים לדבוק בקיר שלפוחית השתן.
הערה: תאים נשארים בשלפוחית השתן ומתפתחים לגידול ראשוני.
- הגדר מכונת מונוקאובית אלקטרוקובלטרי ולהגדיר כוח של 4 W. לשמן את הצנתר 24 G מעוקרים עם ריבת שימון ולהכניס דרך השופכה של העכבר הנשי.
- הסירו את העכבר מקונוס. האף ומשטח ההארקה שים לב לעכבר על 1 h ההליך הבא. חפשו סימני מצוקה, כלומר, גב כושל, נשימה מאומצת וכו '.
8. מודל העכבר CRC
- שישה-עד שמונה שבוע הנהון הגבר/עכבר SCID עם מיקוד (2.5% ב 100% חמצן, 1 L/דקות) בחדר אינדוקציה. לאשר הרגעה עם צביטה בבוהן.
- המקום עכבר מורדם במצב פרקדן תחת מיקרוסקופ מבתר, והקפד לאבטח את החוטם שלהם לתוך isofלוריאן nosecone ולאבטח את הגפיים הקדמיים עם קלטת ליציבות.
הערה: ניתן להשתמש בלופס במקום במיקרוסקופ מבתר. אובייקט קטן יכול לשמש כדי לשפר את הניראות ואת הזווית כאשר מניחים תחת בסיס הזנב, מרוממת את פי הטבעת. בדרך כלל, חלקים קטנים של גזה מגולגלים לצורת גליל של קוטר 1 אינץ '. - להתרחב תעלת אנאלי עם סיכה מעוקל מלקחיים בוטה כדי לחשוף את רירית האנאלי ואת הקרום הרקטלי. להסיר צואה.
- השתמש במחט נשלפת 30 גרם נשלף על 50 μL זכוכית מזרק להזריק 10 μL של הגידול תאים HK (משלב 6.9) לתוך submucosa רקטלית האחורי 1 כדי 2 מ"מ מעל תעלת אנאלי. השיקוע של המחט צריך להיות מכוסה על ידי רירית. היזהרו לא לעבור אל חלל האגן.
- . להסיר את העכבר מקונוס האף שים לב לעכבר על 1 h ההליך הבא. חפשו סימני מצוקה, כלומר, גב כושל, נשימה מאומצת וכו '.
9. הדמיה של ביולומיבי,
- ניטור הגידול העיקרי, כבד, ואת הנטל גרורתי הריאות שבועי באמצעות מערכת הדמיה ביולומינט עבור פעילות לוציפראז.
- השיגו עכבר מניסוי UCC או CRC ושוקלים. להזריק 150 מ"ג/ק"ג לוספרין intraperitoneally ולחכות 5 דקות המצע להסתובב בגוף של העכבר.
- העכבר מורדם עם 2.5% isofלוריאן ב 100% חמצן, 1 L/מינימום בחדר אינדוקציה.
- העכבר במקום מכונת בלי הדמיה עם האף קבוע ב nosecone. בחשיפת התמונה, ודאו שאזור העניין פונה למצלמה. עבור הזרקת UCC ו-CRC, הצד הגחוני צריך להתמודד עם המצלמה עבור כל תמונה. עכבר התמונה במצב פרקדן.
10. קצירת איברים וגידולים
- כאשר זוהר הגידול העיקרי האור מגיע 1 x 1011 פוטונים או אם העכברים מוצגים סימנים של מצוקה (כלומר, ירידה במשקל, לאחור, נוקשה/מאומצת נשימה, וכו '), המתת החסד על ידי CO2 שאיפת (כמו בשלב 5.2.1) לאחר לוספרין הזרקה והדמיה של כל הגוף.
- להסיר את הכבד והריאות, מקום צלחת פטרי ותמונה כדי לזהות גרורות כלשהן. הסרת הגידול, שקילה ותמונה. תקן איברים וגידול ב 10% מאגור נייטרלי עבור 48 h בטמפרטורת הסביבה.
הערה: ניקוי/ניגוב מספריים ומלקחיים בין כל איבר כדי למנוע העברה של רקמות.
11. הערכה היסטולוגית
- להטביע רקמות קבוע פורמלין ב פרפין ופורסים את הרקמות ב 5 יקרומטר עובי על מיקרוטומה עבור המטאוקסילין ו אאוזין (H & E) ו אימונוהיסטוכימיה (ihc) כתמים.
הערה: כל H & E כתמים של שקופיות פרפין נעשה במעבדה פתולוגיה של מערכת הבריאות של אוחנר, וכל כתמים IHC בנייר זה בוצע במעבדת מחקר של מערכת הבריאות של אוחנר לאחר אחזור אנטיגן בטמפרטורה גבוהה באמצעות Ki67 ו ציטוקרטין 20 נוגדנים, ואחריו נוגדן משני biotinylated, ו avidin-biotin-peroxidase מתחמי על פי הוראות היצרן13,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במודל ה-UCC PDOX, התאים BlCaPt15 או BlCaPt37 החולים של UCC היו פנים (ליברות) החדירו בנוכחות של תאים HK לנקבה נוד/שלפוחית העכבר SCID (איור 1A). עשרים וחמש מתוך שלושים (83.3%) בעלי חיים שנוצר גידולים ראשוניים והציג זמן צמיחה הגידול העיקרי מבוסס על בלי לשבוע (איור 1b, C ושולחן 1). באופן דומה, במודל CRC PDOX 31 מתוך 32 (96.9%) עכברים גדל הגידול העיקרי כאשר פנים-rectally (IR) הוזרק עם החולים ' CoCaPt155 או CoCaPt302 תאים בתוספת תאים HK (איור 1D-F ושולחן 1). בהתאם לגידול החולה, גידול העכבר הצמיחה היתה תקופת השהיה שונה, אשר משקף את ההבדל במאפיינים הקליניים של המטופל (איור 1C, F).
ב-ליברות ו-IR מודלים, הזרקת תא הגידול לא רק שנוצר אורתובנושא גידולים ראשוניים (איור 2A, B, חיצים כחולים), אבל עכברים רבים נבדקו גם מפותח כבד ו/או גרורות בריאות. בתוך 10 מתוך 30 (33.3%) ו -17 מתוך 32 (53.1%) עכברים החדירו עם תאים UCC ותאים CRC עם תאים HK, בהתאמה, גילינו גרורות איברים רחוקים דרך לשעבר vivo בלי (איור 2A,B ושולחן 1).
כדי לאשר מורפולוגיה רקמות דומות, H & E ו-IHC כתמים בוצעו השוואת xenografts וגידולים החולה העיקרי. Histopathology של קרצינומה של שלפוחית השתן החולה נשמרה ב xenografts מ BlCaPt15 ו BlCaPt37 (איור 3A). תוצאות מראה הגידול מבע המתאים לתבנית הצמיחה פולשנית שריר של גידולים ראשוניים של המטופלים. הנוגדן ספציפי הפצת התא האנושי סמן Ki67 שימש ב-IHC. Ki67 מכתים גרעינית חיובית מצביע על מתרבים מאוד, הצמיחה במהירות האדם תאים סרטניים. התוצאות של ההכתמה מהשתלים. דומים לאלו של הביופסיה המקורית באופן דומה, במודל IR, כתמים H & E מציין את הדמיון של האדריכלות בין הגידולים xenografts תלי החולה הן של CoCaPt155 ו CoCaPt302. IHC באמצעות נוגדן נגד ציטוקרטין 20 גם הראה דפוס דומה הצמיחה הגידול הן מודלים PDOX (איור 3B). לפיכך, מודל ה-PDOX שלנו מסכם את ההתקדמות הקלינית של UCC ו-CRC.
איור 1: אורתובנושא UCC ו-CRC מודלים של עכבר. (א-ג) הסטיציה של תאים UCC לתוך שלפוחית השתן של העכבר13. (Aa) קטטר הוכנס לתוך שלפוחית השתן של נקבה הנד ראש/SCID העכבר ואת הלם אלקטרוקובאטרי הוחל על הקיר שלפוחית השתן דרך חוט מדריך. (אלב) לוציפראז מתויג בתאי הגידול UCC, BlCaPt15 (2 x 104 תאים), או BlCaPt37 (5 x 10 בתאים) עם תוספת של 3 x 105 בתוך סטרומה תאים HK, הוחדרו לתוך שלפוחית השתן/scid העכבר באמצעות הקטטר אנגיונט. (D-F) הזרקת פנים-רקטלית (IR) של תאי CRC לתוך שכבת רקמת המשנה של העכבר פי הטבעת17. (ד) התעלה אנאלי היה מורחבים עם מלקחיים בוטה קהה-משופעת כדי לאפשר גישה לרירית אנאלי ורקטלית ו 30 גרם המחט הוכנס לתוך submucosa רקטלית האחורי 1-2 מ"מ מעל תעלת אנאלי עד שיקוע היה מכוסה לפני ההזרקה מתרחשת. לוציפראז מתויג בתאי הגידול CRC, CoCaPt155 (5 x 105 תאים), או CoCaPt302 (1 x 104 תאים) עם תוספת של 3 x 105 תאים HK הוזרק. נטל הגידול היה תחת פיקוח וכימות באמצעות דימות ביולומינטיות (בלי; B ו- E). צמיחת הגידול של לוציפראז מתויג בתאי UCC או CRC היה מנוטר באמצעות בלי להשתמש וניתח באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (C ו- F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דגמים של PDOX לייצר גרורות איברים רחוקים ספונטנית. עכברים מייצגים (לוחות העליון) מן הניסויים אותם כמו באיור 1, למשל, החדירו פנים-ומבחינה באמצעות לוציפראז מתויג בתאי הגידול Ucc, BlCaPt15 או BlCaPt37 תאים עם תאים HK (A) או פנים-rectally עם לוציפראז הגידול CRC מתויג תאים, CoCaPt155 או CoCaPt302 תאים עם תאים HK (B) מוצגים. חיצים צהובים מציינים שלפוחיתהשתן של העכבר (א). תמונות שצולמו בזמן ההקרבה מצביעים על היווצרות הגידול אורתוטופית (חיצים כחולים). כבד, ריאות, והגידול (לוחות הביניים) שנאסף על נקרופסי ו vivo לשעבר שלהם בלי מעשה (התחתון לוחות) הראה כבד העכבר גרורות ריאות, כמו גם גידול עם פעילות לוציפראז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: גידולים Xenograft דומים החולה טרום ההשתלה גידולים. פרפין רקמת גידול מוטבע מסרטן החולה או גידולים שנאספו מעכברים באותם ניסויים כמו באיור 1 היו מנות ומוכתם על ידי H & E (a ו- B) או ihc עם נוגדנים נגד האדם Ki67 (a) או ציטוקרטין 20 (CK20; ב). צבע חום מצביע על כתמים חיוביים. כתמים H & E מראה קינים הגידול מבתר לתוך חבילות שריר חלק (א). תמונות נלקחו באמצעות מיקרוסקופ לפירוק דיגיטלי ונותחו עם תוכנת ניתוח תמונה. סרגלי קנה מידה: 100 μm. כל התמונות צולמו בהגדלה המקורית של 200 ×. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| השתלת גידול (%) | גרורות ריאות/כבד (%) | תמותה (%) | |
| UCC, n = 30 | 83.3 | 33.3 | 0 |
| CRC, n = 32 | 96.9 | 53.1 | 0 |
טבלה 1: סיכום היווצרות הגידול, גרורות, ותמותה ב-ליברות ו-IR מודלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחלה גרורתית אחראי על רוב החולים מורטליקצבאות החולה. בבדיקות טיפוליות טרום קלינית, זה חיוני כדי ליצור מודלים העכבר הקרוב ביותר לחקות את צמיחת הגידול האנושי עם גרורות איברים מרוחקים ספונטנית. באמצעות מודלים murine עם סרטן החולה מושתל הגידול תאים סרטניים (xenografts) מאפשר הבנה טובה יותר של ביולוגיה של הגידול ביולוגיים חזוי, כמו גם בדיקות וחיזוי של השפעות antineoplastic של טיפולים חדשניים18. דגמים רבים שימשו כדי להראות גרורות UCC ו-CRC בניסויים murine, כגון ורידי זריקות ורידים המראה את היכולת לייצר מחלת ריאות19 או השתלת תת עורית של תאים סרטניים או שברי הגידול לתוך האגף עבור גידול מקומי הגידול20,21. מעבדה אחת דיווחו בעבר סרטן שלפוחית השתן מודל מורטין על ידי שימוש בחומצה הידרוכלורית בהצלחה לקדם ספיגת הגידול22. בעוד שיטות אלה לייצר צמיחה מקומית אמין עשוי להפגין כמה פעילויות גרורתי, הם לא דומים במיוחד את הקורס הטבעי של סרטן שפותחה בבני אדם לא לנצל את מנגנון גרורתי לראות חולים18, . עשריםואחד מודלים murine אחרים דווחו לחקות את צמיחת הגידול על ידי הזרקת תאים סרטניים ישירות לתוך איברים כגון הכבד או מצע המעי, אבל הם נשאו סיכונים של דליפת תא הגידול ולא לייצר גרורות משמעותיות.
הדגמנו בעבר את הקורלציה בין תוכן תא הסרטן בגידול העיקרי ו מעורבות24 ואת התפקיד של תא סרטן/באינטראקציה סטרומה במהלך התקדמות הגידול העיקרי למחלה גרורתית10 , מיכל בן 12 , 17. שילוב העבודה הקודמת שלנו על ההשפעה של מיקרו הסביבה סטרומה ב התקדמות גרורתית, הקמנו מודלים אורתודוקס (בעיקר מודלים pdox) המחקים את הקורס הטבעי של הפצת גרורות, הם מבחינה טכנית, לשמר את טרוגניות של גידולים החולה המקורי, וליצור עקבי הגידול העיקרי תוצאות גרורתית12,13,17. באמצעות השפעות שיפור הגידול של הסביבה מיקרוסטרומה ב-LN חשוב משום שהוא מספק מיקרוסביבה דומה של הגידול ב UCC האדם ו CRC, מפתחת את כל השלבים של המפל גרורתי, מפחית את מספר התא של הסרטן הנדרש במודל העכבר אשר ממזער את מספר מעברים מבע, ותוצאות מודל אמין אשר מקרוב מחקה את צמיחת הגידול גרורות בבני אדם.
הקמנו שיטה ייחודית של הגירוי האלקטרו-ליברות באמצעות שיתוף של תאים HK המייצרת מודל אמין לפיתוח MIUCC. המודל שלנו מחקה את הקורס הטבעי של התקדמות UCC על ידי השתלת הגידול החל רירית, המוביל לשריר, ולאחר מכן מתפשט לריאות13.
התוצאות שלנו מראות גם כי מודל IR הוא בטוח, להיות מיוצר, ומוצלח. המודל העכבר אורתוטופית תכונות הצמיחה העיקרית הגידול וגרורות מרחוק ספונטנית12,17. הליך IR הוא מהיר, קל ללמידה, מבחינה טכנית קל לבצע, ולא מלחיץ מדי על החיות. לקבוצות ה-ליברות ו-IR לא היתה תמותת (שולחן 1) בתקופה הפוסט-מבצעית לפני המדידה הסופית של בלי לעשות זאת. עם זאת, הטכניקה דורשת תרגול. אם הזרקת intrarectal הוא מוצלח, צריך להיות גלוי "בועה" שנוצר כמו הנוזל הוא הכניס הרירית הרקטלית ויגרום גידול הגידול העיקרי כי בסופו של דבר להיות מוחשי כפי שמוצג באיור 1. אם הגידול הוזרק עמוק מדי לתוך חלל האגן, זה יהיה בלתי מוצמד למערכת המעי הגס ויגדל גדול מאוד כדי למלא את האגן, לפעמים גורם לשיבוש. אם הזריקה רדודה מדי או לא להזין את שכבת submucosal הרקטלית בכלל, זה יהיה לדלוף החוצה וכתוצאה מכך מופחת או נעדר הגידול העיקרי.
הקמנו מודלים ייחודיים, בעלי מימוש מיוחד של ה-HG-UCC ו-CRC. מודלים אלה מאפשרים היווצרות גידולים לימודי גרורות. עכשיו אנחנו יכולים להשתמש במודלים אלה כשיטה העיקרית כדי להמשיך ללמוד את הסביבה מיקרוסטרומה ב-LN ואת האינטראקציה שלה עם גידולים ראשוניים החולה. מודלים אלה גם יאפשר לנו לחקור טיפולים המפריעים ההשפעות הפרו-מורגניים של ה-LNSC על הגידול הראשוני. עם הדגמים האלה, בדיקות של תרופות טיפוליות הרומן יכול להתבצע ביעילות ובנימוסים קליניות-מיני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
מחקר זה תמך באופן חלקי על ידי יוזמת נוזנר טרנסלtional מחקר הרפואה גרנט 2014. המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים
Acknowledgments
המחברים מודים לבריאן רוטר, דניאל ברטוני, פיטר מילר, ושאנון מקצ שסייעו ליזום מחקרים אלה על התמיכה הטכנית המצוינת שלהם. המחברים גם להודות הת גרין מטרנה, מרגרט Variano, סוניל Talwar, ו מריה Latsis לסיוע בהסכמה בחולים ומספקת דגימות הגידול.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
- Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer--prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
- Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
- National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Bladder Cancer. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/urinb.html (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
- Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
- Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
- Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, discussion 764-755 758-764 (1993).
- Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
- National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2017).
- Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
- Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
- Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
- Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
- Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
- Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
- Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
- Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
- Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
- Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).
