Summary
Denne protokol beskriver genereringen af patient afledte ortotopiske xenograft-modeller ved intra-vesielt at indgyde højkvalitets urotheliale celle karcinom celler eller intra-rektalt injektion af kolorektal cancerceller i ikke-overvægtige diabetiske/svære kombinerede immundefekt (NOD/SCID) mus til primær tumorvækst og spontane metastaser under påvirkning af lymfeknude stromale celler, som efterligner progression af humane metastatiske sygdomme.
Abstract
Cancer patienter har dårlige prognoser, når lymfeknude (LN) involvering er til stede i både høj-grade urotheliale celle karcinom (HG-UCC) af blæren og kolorektal cancer (CRC). Mere end 50% af patienter med muskel-invasiv UCC, trods helbredende terapi for klinisk lokaliseret sygdom, vil udvikle metastaser og dø inden for 5 år, og metastatisk CRC er en førende årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA. Xenograft-modeller, der konsekvent efterligner UCC og CRC metastase set hos patienter, er nødvendige. Denne undersøgelse har til formål at generere patient-afledte ortotopisk xenograft (pdox) modeller af UCC og CRC for primær tumorvækst og spontane metastaser under påvirkning af LN stromale celler efterligne progression af humane metastatiske sygdomme for Drug screening. Frisk UCC og CRC tumorer blev opnået fra samtykkede patienter, der gennemgår resektion for HG-UCC og kolorektal adenocarcinoma, hhv. Co-inokuleret med LN stromale celle (lnsc) analoge HK celler, luciferase-Tagged UCC-celler var intra-vesically (Ib) indpodet i kvindelige ikke-overvægtige diabetisk/svær kombineret immundefekt (NOD/scid) mus, og CRC-celler var intra-rectally (IR) injiceres i mandlige NOD/SCID mus. Tumor vækst og metastase blev overvåget ugentligt ved hjælp af bioluminescens Imaging (BLI). Ved offer, primære tumorer og mus organer blev høstet, vejet, og formalin-fastgjort for Hematoxylin og eosin og immun histokemi farvning. I vores unikke PDOX-modeller ligner xenograft-tumorer patientens præ-implantations tumorer. I nærværelse af HK celler har begge modeller høj tumor implantation satser målt ved BLI og tumor vægte, 83,3% for UCC og 96,9% for CRC, og høj Fjern organ metastaser satser (33,3% opdaget lever eller lungemetastaser for UCC og 53,1% for CRC). Desuden har begge modeller nul dødelighed fra proceduren. Vi har etableret unikke, reproducerbare PDOX modeller for human HG-UCC og CRC, som giver mulighed for tumordannelse, vækst, og metastase undersøgelser. Med disse modeller kan testning af nye terapeutiske lægemidler udføres effektivt og på en klinisk mimetisk måde.
Introduction
Det har vist sig, at lymfeknuder (LN) metastase er en dårlig prognose indikator i mange solide orgel maligniteter, herunder høj-grade urotheliale celle karcinom (UCC) af blæren og kolorektal cancer (CRC)1,2. Over halvdelen af patienterne med muskel-invasiv UCC (MIUCC), trods helbredende terapi for klinisk lokaliseret sygdom, vil udvikle metastaser og dø inden for 5 år. Metastatisk CRC er en af de førende årsager til kræft relateret død i USA.
En anslået 81.190 nye patienter og 17.240 kræftspecifikke dødsfald forventes at forekomme i 2018 i USA på grund af UCC af blæren3,4. Patienterne vil overvejende (70%) nuværende med ikke-muskel invasiv sygdom, 30% vil have MIUCC5. På trods af kurativ terapi (radikal cystektomi [RC] med eller uden systemisk kemoterapi) for klinisk lokaliseret sygdom, halvdelen af patienter med MIUCC af blæren vil stadig udvikle metastaser og dø inden for 5 år3. Involvering af lymfeknuder findes hos ca. 20% − 25% af de patienter, der har gennemgået RC6,7,8. Femårig overlevelsesrate i LN positive patienter er mindre end 35% selv efter RC, hvilket tyder på LN involvering som en afgørende negativ prædiktor for prognosen i UCC patienter.
Kolorektal cancer er den tredje mest almindelige kræft diagnosticeret i både mænd og kvinder i USA. Patientens resultater afhænger i høj grad af tumorkarakteristika og tumor mikromiljø, såsom dybden af invasion, LN involvering, og fjerntliggende organ metastaser. Selv om dødeligheden i CRC faldt i det sidste årti på grund af screening og effektive operationer, anslås det, at næsten 50% af CRC-patienter vil udvikle metastaser eller recidiverende sygdom9.
Små dyremodeller giver en hurtig, reproducerbar og modificerbare platform til at studere tumorprogression og forskellige metastatiske mønstre. Der er i øjeblikket ingen beskrevne xenograft-modeller, der konsekvent efterligner CRC og UCC metastase set hos patienter. Den primære vej af kræft fjerne metastase er via lymfatisk spredning. Ny forskning tyder på, at LNs giver tumorer med et unikt mikromiljø, og er ikke kun blot stationære mål, hvor kræftceller forbigående passere, men også spille en integreret rolle ved at interagere med kræftceller i den metastatiske proces. Faktisk, vores undersøgelser opdagede, at ud over at uddanne og fremme tumorprogression og metastaser, LN stromale mikromiljø er også ansvarlig for lægemiddelresistens i CRC10,11. Vores laboratorium har for nylig bekræftet de tumorigent effekter af LN stromale celler (lnscs) på CRC og uccs ved hjælp af patient-afledte ortotopisk xenograft (pdox) musemodeller12,13.
Udvikling af pdox-modeller udgør en vigtig platform for Translationel kræftforskning14,15. Ved at opretholde de vigtigste histologiske og genetiske karakteristika for deres donor tumor forbliver pdox-modellerne stabile på tværs af passager og gør gode platforme for Translationel kræftforskning12,15. PDOX-modeller anvendes til præklinisk Lægemiddelvurdering, identifikation af biomarkør og præklinisk evaluering af personaliserede medicin strategier, der gør det muligt at forudsige kliniske resultater. I øjeblikket er der ingen beskrevne xenograft modeller, der overvejer betydningen af LN involvering og er i stand til konsekvent at gengive primær tumor og fjern orgel metastase i CRC og UCC. I denne undersøgelse beskriver vi udviklingen af PDOX-modeller i NOD/SCID-mus med reproduktion af metastatiske CRC-og UCC-sygdomme med involvering af LNSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet i disse dyreforsøg, blev udført i henhold til de godkendte retningslinjer for den institutionelle dyrepleje-og anvendelses Komité for Ochsner-sundhedssystemet og i overensstemmelse med retningslinjerne for dyreforskning. Alle patient tumorer for denne undersøgelse blev indsamlet fra samtykkede patienter, der gennemgår kræft resektion kirurgi i overensstemmelse med Ochsner Health System undersøgende revision bestyrelsen og de etiske standarder i den institutionelle Komité for menneskelige Eksperimenter. Board-certificerede patologer på Ochsner Health System fastlagt de patologiske diagnoser af patientprøver baseret på de mikroskopiske egenskaber af tumorceller, deres histologiske type, og grade niveau.
Bemærk: følgende protokol beskriver trinene for to separate xenograft-modeller, en UCC-model via elektro cauterization af blære væggen til indgyde UCC-celler og en intrarectal injektion af CRC-celler til undersøgelse i en CRC-model. Alle trin, der forbereder og overvåger forsøgene, er identiske for begge modeller, mens afsnit 7 og 8 specifikt beskriver proceduren for henholdsvis UCC-instillation og CRC-injektion.
1. dyrkning af cellelinjer
- Grow HK celler i komplet RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtal kvægserum, 2 nM glutamin, 100 U/mL penicillin G, og 100 mg/mL streptomycin ved 37 °C i en 5% CO2 befuret inkubator.
Bemærk: HK celler er normale humane follikulære dendritiske celler og kan dyrkes og udvides til ≤ 15 passager in vitro16. - For at forberede et eksperiment, trypsinize cellerne.
- Fjern mediet, og tilsæt 2 mL 1% trypsin i Hank's balance saltopløsning (HBSS) til cellerne. Placer cellerne tilbage i 5% CO2 befuret inkubator ved 37 °c i 4 min.
- Saml celler fra parabol i et 15 mL rør ved hjælp af en håndholdt pipet støtte med en 10 mL serologisk pipet vedhæftet. Tilsæt 8 mL komplet RPMI-1640 medium.
- Kombiner 40 μL celler og 40 μL trypan og et blå i en enkelt brønd af en 96 brønd plade. Tilsæt 10 μL blanding til et hemocytometer og Tæl levende celler. Tilsæt 1.000.000 celler i 25 mL komplet RPMI-1640 medium til en 150 mm steril vævskultur-behandlet skål for at fortsætte med at dyrke cellerne.
Bemærk: HK cellesuspension forberedt i dette trin skal anvendes inden for en time til at blande med tumorceller til injektion.
2. indsamling af patient prøver
- Indsamle EUTK-tumorer fra godkendt patient 15 (BlCaPt15, pT3b N1 m0) og 37 (BlCaPt37, pT3b pN0 m0) ved resektion kirurgi.
- Indsaml CRC-tumorer fra godkendt patient 155 (CoCaPt155, T1 N0 m0) og 302 (CoCaPt302, T1 N0 m0) ved resektion kirurgi.
3. udvidelse af patientens tumor
- Indsaml tumorer ved kirurgi i kold steril McCoy medium indeholdende penicillin G (500 U/mL) og streptomycin (500 mg/mL).
- Implantat tumorer direkte i venstre og højre flanke af 6 − 8 uger gamle kvindelige NOD/SCID mus.
- Mekanisk hakket væv i små stykker (~ 1 mm3) ved hjælp af små kirurgiske saks.
- Implantat vævet subkutant til venstre og højre flanke ved hjælp af 13 G knoglemarv Aspirations biopsi nåle.
Bemærk: implantatet har en samlet volumen på 8 mm3 fordelt jævnt på begge sider af flanken.
4. mærkning og berigelse af der mærket tumorer
- Mål tumorvækst bi-ugentligt ved hjælp af en digital caliper.
- Ved 1 cm i diameter, transduce tumor. Direkte indsprøjtes i tumor med enkelt dosis af Luc/rødt fluorescerende protein (RFP)-lentivirus (50 μL/tumor, 1:30 fortynding fra koncentreret højtiter lentivirus lager) ved hjælp af en 1 CC sprøjte med en 27 G nål.
Bemærk: patientens tumor typisk når 1 cm i diameter i 1 − 2 måneder. Men, vækstraten er ekstremt variabel og baseret på en række faktorer, herunder tumor kvalitet og type. - Overvåg tumor ugentligt ved bioluminescerende billeddannelse (BLI) i levende dyr.
- Veje musene. Injicer bevidst mus med 150 mg/kg luciferin intraperitonealt og vent 5 min for substratet at cirkulere i musens krop.
- Anæstetize musen med 2,5% isofluran i 100% ilt, 1 L/min i en induktions kammer.
- Placer musen på maven i en BLI Imaging maskine med isofluran flyder og billede. Tag sekventielle billeder for at bekræfte tilstedeværelsen af Luc/RFP positive tumor regioner (falsk-farve bio-Luminescent billede). Returner musen til bur efter billeddannelse er færdig.
5. Vælg passende portion tumor til enzymatisk fordøjelse
- På dagen for UCC eller CRC procedure, billede mus med der Tagged tumor som i trin 4.3.1 − 4.3.3.
Bemærk: længden af tid for den subkutane tumor til at vokse afhænger af hastigheden af tumorvækst og det planlagte antal dyr, der skal injiceres i forsøget. - Høst tumor fra mus flanke og billede.
- Euthanize mus ved CO2 indånding efter billeddannelse. Placer musen i CO2 kammer, tænde gas på 1,4 L/min indtil respiratorisk anholdelse og lad det i 3 min. Følg dette med livmoderhals dislokation.
- Rengør huden med 70% ethanol. Telt hud direkte over tumor. Med kirurgisk saks lave et lille snit i huden. Separat hud fra tumor med saks.
- Fjern tumor og sted i en steril Petri-skål. Billede hele skålen i en billed maskine.
- Brug steril saks eller skalpel til at adskille der-negative sektioner fra der positive sektioner i tumoren og re-image.
- Gentag indtil kun de fleste meget positive tumor stykker forbliver.
6. enzymatisk fordøjelse af tumor
- Under laminar flow Hood, hakkekød der positive tumor stykker (trin 5,4) i de mindste mulige stykker ved hjælp af steril kirurgisk saks og sætte dem i en steril 50 ml konisk rør.
Bemærk: hakning af tumoren i de mindste mulige stykker vil give flere individuelle celler. - En samlet opløsning forberedes ved tilsætning af 10 mL kollagenase IV (1,5 mg/mL), 80 μL hyaluronidase (20 mg/mL) og 160 μL deoxyribonuclease I (0,1 mg/ml) til 40 mL HBSS. Bland opløsningen ved at invertere.
- Tilsæt 35 − 40 mL af den fordøje løse opløsning til hakket tumor. Inkuber ved 37 °C med kontinuerlig rotation i 2 timer.
Bemærk: kraftigt ryste røret regelmæssigt i hele inkubationen for at forhindre tumor væv fra clumping. - Filtrer hele fordøjelsen gennem steril 100 μm cellefilter efterfulgt af en 40 μm celle-si for at fjerne snavs. Gem strømmen gennem og kassér snavs.
- Vask frie celler ved at tilsætte 20 mL HBSS og centrifugeres ved 329 x g i 5 min. Aspirér supernatanten, og resuspender pellet i 30 ml hbss.
- Kombiner 10 μL celle opløsning og 90 μL trypan og et blå i en enkelt brønd af en 96 brønd plade. Tæl levende celler ved hjælp af en hemacytometer.
- Overfør 1 x 104 til 1 x 106 tumorceller pr. mus til et sterilt 15 ml konisk rør. Tilsæt 3 x 105 HK celler fra trin 1.2.3 per mus, til det samme rør med tumorceller.
Bemærk: Brug steril 50 mL konisk slange, hvis den totale mængde overstiger 15 mL. Beregn altid flere doser for yderligere dyr pr. studiegruppe for at tage højde for tab af væske under brug af sprøjten. For eksempel, hvis en gruppe indeholder 5 mus, lave nok celler til 6 eller 7 mus. - Centrifugeres ved 329 x g i 5 min. kassér supernatanten enten ved aspirering eller pipettering.
- Resuspendering af celler i 50 μL pr. mus for UCC-model eller 10 μL pr. mus for CRC-model i komplette RPMI-medier. Hold cellesuspensionen på isen, indtil den er klar til brug.
7. UCC-musemodel
- Klargøring af mus til procedure
- Få seks-til otte-ugers gammel kvindelig NOD/SCID-mus. Barberer den nedre ryg af musen ved hjælp af hårfjerning creme. Bedøve musen i en induktions kammer med isofluran (2,5% i 100% ilt, 1 L/min).
- Når bedøvede, Placer musen i liggende position med sin snude i en isofluran næse kegle og bare tilbage solidt jordet på en dispersiv elektrode.
Bemærk: musen er helt bedøvede, hvis ikke reagerer på tåen knivspids.
- Instill UCC celler udarbejdet i trin 6,9 til blære ved hjælp af en angiocatheter (figur 1Aa, AB).
- Oprette en monopolære elektro kautery maskine og sat til en effekt på 4 W. smør en 24 G steril angiocatheter med smøre gelé og Indsæt gennem urinrøret af den kvindelige mus.
Bemærk: svag modstand kan mærkes. Skub forsigtigt fremad eller fjern angiocatheter og Gentag. Må ikke tvinge. Hvis kateteret bøjer ved indtrækning, indsættes en steril guide ledning (Se 7.2.2) halvt ned i kateteret for at give stabilitet. - Sæt 0,025 "Fixed Core lige guidewire 1 mm forbi enden af angiocatheter fuldt ud.
Bemærk: ledningen er mærket med tape før proceduren for at indikere 1 mm stoppunkt og sikre konsistens. - Hold den monopolære stift til guide ledningen til 1 s, hvilket giver mulighed for elektrisk irritation af blære slimhinden.
- Fastgør et frisk, sterilt angiocatheter til 1 CC luer-Lok-sprøjte, og træk 200 μL indsamlede celler fra trin 6,9.
Bemærk: mindst 100 μL går tabt fra angiocatheter til sprøjten. Kompensere for tab volumen ved beregning volumen af cellesuspension nødvendig. - Fjern guidewire og angiocatheter fra mus urethra. Indsæt angiocatheter med sprøjte af celler fastgjort i urinrøret.
Bemærk: avancement bør være lettere end før. - Instill 50 μL af celler til muse blære. Vent et par sekunder, før du fjerner angiocatheter at give mulighed for celler til at overholde blæren væggen.
Bemærk: cellerne forbliver i blæren og udvikler sig til en primær tumor.
- Oprette en monopolære elektro kautery maskine og sat til en effekt på 4 W. smør en 24 G steril angiocatheter med smøre gelé og Indsæt gennem urinrøret af den kvindelige mus.
- Fjern musen fra isofluran næse kegle og jording pad. Overhold musen i 1 h følgende procedure. Se efter tegn på angst, dvs, jagtet ryg, besværet vejrtrækning, osv.
8. CRC-musemodel
- Anesthetize seks-til-otte-ugers gamle mandlige NOD/SCID mus med isofluran (2,5% i 100% ilt, 1 L/min) i induktions kammeret. Bekræft sedation med en tå knivspids.
- Placer bedøvet mus i liggende position under en dissekere mikroskop, og sørg for at sikre deres snude til en isofluran til og for at sikre deres forreste lemmer med tape for stabilitet.
Bemærk: der kan anvendes loupes i stedet for et dissekterende mikroskop. Et lille objekt kan bruges til at forbedre synlighed og vinkel, når de placeres under bunden af halen, opløgende anus. Typisk er små sektioner af gaze rullet ind i en cylinder form af 1-tommer diameter. - Dilate analkanalen med buede smurt stumpede pincet for at udsætte den distale anal og rektal slimhinde. Fjern afføring.
- Brug en steril 30 G aftagelig nål på en 50 μL glassprøjte til at injicere 10 μL tumor og HK celler (fra trin 6,9) ind i den distale posterior rektal submucosa 1 til 2 mm over analkanalen. Nålens facet skal dækkes af slimhinden. Pas på ikke at passere ind i bækken hulen.
- Fjern musen fra isofluran næse kegle. Overhold musen i 1 h følgende procedure. Se efter tegn på angst, dvs, jagtet ryg, besværet vejrtrækning, osv.
9. bioluminescerende billeddannelse
- Overvåg den primære tumor-, lever-og lunge metastaserende byrde ugentligt ved hjælp af et bioluminescerende billedbehandlingssystem til luciferaseaktivitet.
- Få en mus fra UCC eller CRC eksperiment og vejer. Injicer 150 mg/kg luciferin intraperitonealt og vent 5 min for substratet at cirkulere i musens krop.
- Anæstetize mus med 2,5% isofluran i 100% ilt, 1 L/min i induktions kammeret.
- Placer musen i BLI Imaging Machine med næse fikseret i nosecone. Når du udsætter for billedet, skal du sørge for, at det område af interesse vender kameraet. For UCC og CRC injektion, den ventrale side skal vende kameraet for hvert billede. Billede mus i liggende position.
10. høst organer og tumor
- Når den primære tumor luminescens udstråling når 1 x 1011 fotoner, eller hvis mus udviser tegn på angst (dvs. vægttab, jagtet ryg, hård/besværet vejrtrækning, osv.), aflive mus ved co2 indånding (som i trin 5.2.1) efter luciferin injektion og helkrops-billeddannelse.
- Fjern leveren og lungerne, Placer i en petriskål og billede for at identificere eventuelle metastaser. Fjern tumor, vejning og billede. Fix organer og tumor i 10% neutral Buffered formalin for 48 h ved omgivende temperatur.
Bemærk: Rengør/tør saks og pincet mellem hvert organ for at undgå overførsel af væv.
11. histologisk evaluering
- Indkapsle formalin faste væv i paraffin og skær vævet ved 5 μm tykkelse på en mikrotomet for hematoxylinlegemer og eosin (H & E) og immunohistokemiske (IHC) farvning.
Bemærk: alle H & E farvning af paraffin slides blev udført i patologi laboratorium af Ochsner sundhedssystem, og alle IHC farvning i dette papir blev udført i et forskningslaboratorium af Ochsner sundhedssystem efter høj temperatur antigen hentning ved hjælp af Ki67 og cytokeratin 20 antistoffer, efterfulgt af biotinyleret sekundært antistof, og Avidin-biotin-peroxidase komplekser i henhold til producentens anvisninger13,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I UCC PDOX-modellen var UCC-patienters BlCaPt15-eller BlCaPt37-celler intra-vesically (IB) indpodet i tilstedeværelsen af HK-celler i kvindelig NOD/SCID-muse blære (figur 1a). Femogtyve ud af tredive (83,3%) dyr genererede primære tumorer og viste tid afhængig primær tumorvækst baseret på ugentlige bli (figur 1b, C og tabel 1). Tilsvarende i CRC-PDOX-modellen var 31 ud af 32 (96,9%) mus voksede primær tumor, når intra-rektalt (IR) injiceres med patienternes CoCaPt155 eller CoCaPt302 celler plus HK celler (figur 1d-F og tabel 1). Afhængig af patientens tumor, mus tumorvækst havde en anden ventetid periode, som afspejler forskellen i patientens kliniske karakteristika (figur 1c, F).
I både IB og IR-modeller, tumor celle injektion ikke kun genereret ortotopiske primære tumorer (figur 2a, B, blå pile), men mange mus testet også udviklet leveren og/eller lungemetastaser. I 10 ud af 30 (33,3%) og 17 ud af 32 (53,1%) mus indpodet med UCC-celler og CRC-celler med henholdsvis HK celler, vi detekterede Fjern organ metastaser via ex vivo BLI (figur 2a,B og tabel 1).
For at bekræfte lignende vævs morfologi blev der udført H & E og IHC-farvning ved sammenligning af xenografter og primære patient tumorer. Histopatologi af patient blære karcinom blev opretholdt i xenografter fra BlCaPt15 og BlCaPt37 (figur 3a). Resultaterne viser xenograft tumor svarende til muskel invasiv vækstmønster af patienternes primære tumorer. Det antistof, der er specifikt for humane celle sprednings markør Ki67, blev anvendt i IHC. Ki67 positiv nuklear farvning indikerer meget proliferative, hurtigt voksende humane tumorceller. Farvnings resultaterne fra xenografter var de samme som de oprindelige kirurgiske biopsier. På samme måde indikerer H & E-farvning i IR-modellen ligheden mellem arkitekturen mellem xenografter og patientens tumorer i både CoCaPt155 og CoCaPt302. IHC ved hjælp af antistof mod cytokeratin 20 viste også lignende tumorvækst mønster i begge PDOX-modeller (figur 3b). Således, vores PDOX model rekapitulerede UCC og CRC patient klinisk progression.
Figur 1: Orthotopic UCC og CRC-musemodeller. (A-C) Intra-vesikel (IB) instillation af UCC-celler til muse blære13. (AA) En angiocatheter blev indsat i blæren af en kvindelig NOD/SCID mus og en elektro kautery chok blev anvendt til blære væggen via en guidewire. (AB) Luciferase Tagged UCC tumorceller, BlCaPt15 (2 x 104 celler), eller BlCaPt37 (5 x 105 celler) med tilsætning af 3 x 105 LN stromale HK celler, blev INDPODET i NOD/scid mus blære gennem angiocatheter. (D-F) Intra-rektal (IR) injektion af CRC-celler i det submucosale vævs lag af mus endetarmen17. D) analkanalen blev udvidet med smurte stumpe tang til at give adgang til den distale anal og rektal slimhinde, og en 30 G nål blev indsat i den distale posterior rektal submucosa 1 − 2 mm over analkanalen, indtil facet blev dækket før injektionen finder sted. Luciferase Tagged CRC tumorceller, CoCaPt155 (5 x 105 celler), eller CoCaPt302 (1 x 104 celler) med tilsætning af 3 x 105 HK celler blev injiceret. Tumor byrden blev overvåget og kvantificeret via bioluminescerende billeddannelse (BLI; B og E). Tumor vækst af der Tagged UCC eller CRC celler blev overvåget kinetisk via bli og analyseret ved hjælp af billedanalyse software (C og F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: PDOX-modeller producerer spontane Fjern organ metastaser. Repræsentative mus (øverste paneler) fra de samme eksperimenter som i figur 1, f. eks, indpodet intra-vesically med der Tagged UCC tumorceller, BlCaPt15 eller BlCaPt37 celler med HK celler (A) eller intra-rectally med der Tagged CRC tumor celler, CoCaPt155 eller CoCaPt302 celler med HK celler (B) er vist. Gule pile indikerer muse blære (A). Billeder taget på tidspunktet for offer indikerer ortotopisk tumordannelse (blå pile). Lever, lunge, og tumor (midterste paneler) indsamlet ved nekropsy og deres ex vivo bli (nederste paneler) viste mus lever og lungemetastaser samt tumor med der aktivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: xenograft tumorer ligner patientens præ-implantation tumorer. Paraffin indlejret tumor væv fra patient tumor eller tumorer indsamlet fra mus i de samme eksperimenter som i figur 1 blev sektioneret og plettet af H & E(a og B) eller IHC med antistoffer mod human Ki67 (a) eller cytokeratin 20 (CK20; B). den brune farve indikerer positiv farvning. H & E farvning viser tumor reder dissekere i glatte muskel bundter (A). Fotografier blev taget ved hjælp af en digital devoluting mikroskop og analyseret med en billedanalyse software. Skala stænger: 100 μm. Alle billeder blev taget i den oprindelige forstørrelse på 200 ×. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Tumor implantat (%) | Lunge-/levermetastaser (%) | Dødelighed (%) | |
| UCC, n = 30 | 83,3 | 33,3 | 0 |
| CRC, n = 32 | 96,9 | 53,1 | 0 |
Tabel 1: Resumé af tumordannelse, metastase og dødelighed i IB-og IR-modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metastatisk sygdom er ansvarlig for de fleste kræftpatient dødelighed. I præ-kliniske terapeutiske tests, det er afgørende at etablere musemodeller, der mest tæt emulere menneskelig tumorvækst med spontane fjernt organ metastaser. Ved hjælp af murine modeller med implanteret patient tumor afledte kræftceller (xenografts) giver mulighed for en bedre forståelse af tumor biologi og prædiktiv biomarkører samt afprøvning og forudsigelse af antineoplastiske effekter af Novel behandlingsformer18. Mange modeller er blevet brugt til at vise UCC og CRC metastaser i murine eksperimenter, såsom intravenøs hale vene injektioner viser evnen til at producere lungesygdom19 eller subkutan implantation af tumorceller eller tumor fragmenter i flanke for lokaliseret tumorvækst20,21. Et laboratorium tidligere rapporteret en blærecancer murine model ved hjælp af saltsyre behandlinger til succes fremme tumor optagelse22. Selv om disse metoder frembringer pålidelig lokal vækst og kan påvise nogle metastatiske aktiviteter, ligner de ikke specifikt den naturlige kræftform, der er udviklet hos mennesker, og udnytter ikke den metastatiske mekanisme, som ses hos patienter18, 23. Andre murine modeller blev rapporteret til at efterligne tumorvækst ved at injicere tumorceller direkte i organer såsom leveren eller mesentery, men de har båret risiko for tumor celle lækage og ikke producerer signifikante metastaser.
Vi har tidligere påvist sammenhængen mellem kræft cellens indhold i den primære tumor og LN involvering24 og rollen af Cancer CELLEN/LN stromale interaktion i løbet af primær tumorprogression til metastatisk sygdom10 , 12 , 17. ved at indarbejde vores tidligere arbejde om indflydelsen af det LN stromale mikromiljø ved metastatisk progression etablerede vi ortotopiske modeller (især pdox-modellerne), der efterligner den naturlige kurs for metastatisk udbredelse, er teknisk reproducerbar, bevare heterogenitet af oprindelige patientens tumorer, og generere konsekvent primær tumor og metastatiske resultater12,13,17. Ved hjælp af tumor-styrke virkningerne af LN stromale mikromiljø er vigtigt, fordi det giver en lignende tumor mikromiljø i human UCC og CRC, udvikler alle trin i den metastatiske kaskade, reducerer kræft celle nummer kræves i musemodel, som minimerer antallet af xenograft passager, og resulterer i en pålidelig model, der nøje efterligner tumorvækst og metastaser i mennesker.
Vi har etableret en unik metode til IB Electro-stimulation ved hjælp af co-instillation af HK celler, der producerer en pålidelig model for udvikling af MIUCC. Vores model efterligner det naturlige forløb af UCC progression ved tumor implantation begyndende i slimhinden, fører ind i musklen, derefter metastadimensionering til lunger13.
Vores resultater viser også, at den infrarøde model er sikker, reproducerbar og vellykket. Den ortotopisk CRC-musemodel har primær tumorvækst og spontan Fjern metastaser12,17. Den infrarøde procedure er hurtig, let at lære, teknisk let at udføre, og ikke alt for stressende på dyrene. IB-og IR-grupperne havde nuldødelighed (tabel 1) i den postoperative periode før den endelige bli-måling. Men teknikken kræver praksis. Hvis intrarectal injektion er en succes, der bør være en synlig "boble", der danner som væsken indføres i rektal submucosa og vil resultere i primær tumorvækst, der i sidste ende vil blive håndgribelig som vist i figur 1. Hvis tumoren er blevet injiceret for dybt ind i bækken hulen, vil det være ikke fastgjorte til kolorektal tarmkanalen og vokser meget store til at fylde bækkenet, undertiden forårsager obstruktion. Hvis injektionen er for overfladisk eller ikke kommer ind i rektal submucosavævet lag overhovedet, det vil lække ud resulterer i reduceret eller fraværende primære tumorbyrde.
Vi har etableret unikke, reproducerbare PDOX-modeller til human HG-UCC og CRC. Disse modeller giver mulighed for tumordannelse og metastase undersøgelser. Vi kan nu bruge disse modeller som den primære metode til at fortsætte med at studere LN stromale mikromiljø og dets interaktion med patientens primære tumorer. Disse modeller vil også give os mulighed for at undersøge behandlinger, der forstyrrer de Pro-tumorigenic virkninger af LNSC på primær tumor. Med disse modeller kan testning af nye terapeutiske lægemidler udføres effektivt og i klinisk mimetiske manerer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denne undersøgelse blev delvist støttet af Ochsner translationel medicin forsknings initiativet Grant 2014. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller og Shannon McChesney, som hjalp med at iværksætte disse undersøgelser for deres fremragende tekniske støtte. Forfatterne takker også Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar og Maria Latsis for assistance i samtykkende patienter og giver tumorprøver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
- Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer--prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
- Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
- National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Bladder Cancer. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/urinb.html (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
- Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
- Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
- Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, discussion 764-755 758-764 (1993).
- Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
- National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2017).
- Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
- Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
- Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
- Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
- Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
- Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
- Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
- Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
- Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
- Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).
