Summary
Detta protokoll beskriver generering av patient-härledda ortotopiska xenograft-modeller genom intravesikalt ingjuta av höggradig urotelial cells cancerceller eller intrarektalt injicering av kolorektalcancerceller i icke-feta diabetiska/svåra kombinerade immunbrist (NOD/SCID) möss för primär tumörtillväxt och spontana metastaser under påverkan av lymfkörtel stromaceller, som härmar utvecklingen av mänskliga metastatiska sjukdomar.
Abstract
Cancer patienter har dåliga prognoser när lymfkörtel (LN) engagemang förekommer i både höggradig urotelial cellkarcinom (HG-UCC) i urinblåsan och kolorektal cancer (CRC). Mer än 50% av patienter med muskelinvasiv UCC, trots kurativ terapi för kliniskt lokaliserad sjukdom, kommer att utveckla metastaser och dö inom 5 år, och metastaserad CRC är en ledande orsak till cancerrelaterade dödsfall i USA. Xenograft-modeller som konsekvent imiterar UCC och CRC-metastaser som ses hos patienter behövs. Denna studie syftar till att generera patient-derived ortotopiska xenograft (PDOX) modeller av UCC och CRC för primär tumörtillväxt och spontana metastaser under påverkan av LN stromacellstumörer celler imitera utvecklingen av mänskliga metastaserande sjukdomar för Drug screening. Färska UCC och CRC tumörer erhölls från samtyckt patienter som genomgår resektion för HG-UCC och kolorektal adenocarcinom, respektive. Co-inokuleras med LN stromacellstumörer cell (LNSC) analoga HK celler, luciferase-märkta UCC celler var intra-vesically (IB) ingjutit till kvinnliga icke-feta diabetiker/svår kombinerad immunbrist (NOD/SCID) möss, och CRC-celler var intra-rectally (IR) injiceras i manliga nickar/SCID möss. Tumörtillväxt och metastaser övervakades varje vecka med hjälp av Mareld Imaging (bli). Vid offer, primära tumörer och mus organ skördades, vägdes, och formalin-fast för hematoxylin och eosin och immunohistokemi färgning. I våra unika PDOX-modeller liknar xenograftumörer patientens pre-implantations tumörer. I närvaro av HK celler, båda modellerna har höga tumör implantation priser mätt med BLI och tumör vikter, 83,3% för UCC och 96,9% för CRC, och hög avlägsen organmetastaser (33,3% upptäckt lever-eller lungmetastaser för UCC och 53,1% för CRC). Dessutom, båda modellerna har noll dödlighet från förfarandet. Vi har etablerat unika, reproducerbara PDOX modeller för Human HG-UCC och CRC, som möjliggör tumör bildning, tillväxt, och metastaser studier. Med dessa modeller, testning av nya terapeutiska läkemedel kan utföras effektivt och på ett kliniskt-mimetic sätt.
Introduction
Det har visats att lymfkörtel (ln) metastaser är en dålig prognostisk indikator i många solida organ maligniteter, inklusive höggradig urotelial cell carcinoma (UCC) i urinblåsan och kolorektal cancer (CRC)1,2. Över hälften av patienterna med muskelinvasiv UCC (MIUCC), trots kurativ terapi för kliniskt lokaliserad sjukdom, kommer att utveckla metastaser och dö inom 5 år. Metastaserad CRC är en ledande orsak till cancerrelaterad död i USA.
Uppskattningsvis 81 190 nya patienter och 17 240 cancerspecifika dödsfall väntas inträffa i 2018 i USA på grund av UCC av urinblåsan3,4. Patienter kommer huvudsakligen (70%) närvarande med icke-muskelinvasiv sjukdom, 30% kommer att ha MIUCC5. Trots botande terapi (radikal cystektomi [RC] med eller utan systemisk kemoterapi) för kliniskt lokaliserad sjukdom, hälften av patienterna med MIUCC av urinblåsan kommer fortfarande att utveckla metastaser och dö inom 5 år3. Lymfkörteln engagemang finns i cirka 20% − 25% av patienter som genomgått RC6,7,8. Femårig överlevnad i LN positiva patienter är mindre än 35% även efter RC, vilket tyder LN engagemang som en avgörande negativ prediktor för prognosen i UCC patienter.
Kolorektal cancer är den tredje vanligaste cancer diagnosen hos både män och kvinnor i USA. Patientens resultat beror till stor del på tumör egenskaper och tumör mikromiljö, såsom djup invasion, LN engagemang, och avlägsna organ metastaser. Även om dödligheten i CRC minskade under det senaste decenniet på grund av screening och effektiva operationer, det uppskattas att nästan 50% av CRC-patienter kommer att utveckla metastaser eller återkommande sjukdom9.
Små djurmodeller ger en snabb, reproducerbar och modifierbar plattform för att studera tumörprogression och olika metastatiska mönster. Det finns för närvarande inga beskrivna xenograft modeller som konsekvent imiterar CRC och UCC metastaser ses hos patienter. Den primära vägen för cancer avlägsen metastaser är via lymfatiska spridningen. Ny forskning tyder på att LNs ger tumörer med en unik mikromiljö, och är inte bara bara stationära mål där cancerceller transitivt passera, men också spela en viktig roll genom att interagera med cancerceller i metastaserande processen. Faktum är att våra studier upptäckte att, förutom att utbilda och främja tumör progression och metastaser, LN stromacellstumörer mikromiljö är också ansvarig för läkemedelsresistens i CRC10,11. Vårt labb bekräftade nyligen de tumorigena effekterna av LN stromacellstumörer celler (lnscs) på CRC och uccs med patient-härledda ortotopiska xenograft (pdox) musmodeller12,13.
Att utveckla pdox-modellerna utgör en viktig plattform för Translationell Cancerforskning14,15. Genom att bibehålla de viktigaste histologiska och genetiska egenskaperna hos deras givare tumör, pdox modellerna förbli stabila övergångarna och göra bra plattformar för Translationell Cancerforskning12,15. PDOX-modellerna används för preklinisk läkemedels utvärdering, biomarkör identifiering och preklinisk utvärdering av individanpassade medicinska strategier som möjliggör förutsägelse av kliniska utfall. För närvarande finns det inga beskrivna xenograft modeller som anser vikten av LN engagemang och kan konsekvent reproducera primär tumör och avlägsen organmetastaser i CRC och UCC. I denna studie beskriver vi utvecklingen av PDOX modeller i NOD/SCID möss med reproduktion av metastaserad CRC och UCC sjukdomar med LNSC engagemang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs i dessa djurstudier utfördes enligt de godkända riktlinjerna från den institutionella djuromsorg och användning kommittén för Ochsner Health system och i enlighet med djur forsknings riktlinjer. Alla patient tumörer för denna studie samlades in från samtyckt patienter som genomgick cancer resektion operationer i enlighet med Ochsner Health system utrednings nämnden och de etiska standarderna för den institutionella kommittén för mänskliga Experiment. Board-certifierade patologer vid Ochsner Health system fastställt patologiska diagnoser av patientprover baserat på mikroskopiska funktioner i tumörceller, deras histologiska typ, och grad nivå.
Anmärkning: följande protokoll beskriver stegen för två separata xenograft modeller, en UCC modell via elektrocauterization av urinblåsan väggen att ingjuta UCC celler och en intrarectal injektion av CRC celler för studier i en CRC-modell. Alla steg för att förbereda och övervaka experimenten är identiska för båda modellerna, medan avsnitten 7 och 8 specifikt beskriver förfarandet för UCC instillation och CRC injektion, respektive.
1. odling av cellinjer
- Grow HK celler i komplett RPMI-1640 medium kompletteras med 10% foster bovint serum, 2 nM glutamin, 100 U/mL Penicillin G, och 100 mg/mL streptomycin vid 37 ° c i en 5% CO2 befuktade inkubator.
Obs: HK celler är normala mänskliga follikulära dendritiska celler och kan odlas och utvidgas för ≤ 15 passager in vitro-16. - För att förbereda för ett experiment, trypsinize cellerna.
- Ta bort media och tillsätt 2 mL 1% trypsin i Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS) till celler. Placera cellerna tillbaka i 5% CO2 befuktade inkubator vid 37 ° c i 4 min.
- Samla celler från skålen till en 15 mL tub med hjälp av en handhållen Pipettera stöd med en 10 mL serologiska Pipettera bifogas. Tillsätt 8 mL komplett RPMI-1640 medium.
- Kombinera 40 μL av celler och 40 μL trypan blå i en enda brunn på en 96 väl tallrik. Tillsätt 10 μL av blandningen till en hemocytometern och räkna levande celler. Tillsätt 1 000 000 celler i 25 mL komplett RPMI-1640 medium till en 150 mm steril vävnadskultur-behandlad maträtt att fortsätta växa cellerna.
Obs: HK cellsuspension beredd i detta steg måste användas inom en timme för att blanda med tumörceller för injektion.
2. insamling av patient preparat
- Samla in UCC-tumörerna från samtyckt patient 15 (BlCaPt15, pT3b N1 M0) och 37 (BlCaPt37, pT3b pN0 M0) vid resektion kirurgi.
- Samla CRC tumörer från samtyckt patienten 155 (CoCaPt155, T1 N0 M0) och 302 (CoCaPt302, T1 N0 M0) vid resektion kirurgi.
3. utbyggnad av patient tumör
- Samla tumörer vid kirurgi i kallt sterilt McCoy ' s medium innehållande Penicillin G (500 U/mL) och streptomycin (500 mg/mL).
- Implantat tumörer direkt i den vänstra och högra flanken av 6 − 8 veckor gamla kvinnliga nicka/SCID möss.
- Mekaniskt finhacka vävnader i små bitar (~ 1 mm3) med hjälp av små kirurgiska saxar.
- Implantat vävnad subkutant till vänster och höger flank med 13 G benmärgs aspiration biopsinålar.
Anmärkning: implantat en total volym på 8 mm3 fördelas jämnt på båda sidorna av flanken.
4. märkning och berikning av luciferas märkta tumörer
- Mät tumörtillväxt varannan vecka med hjälp av en digital bromsbroms.
- Vid 1 cm i diameter, transduce tumör. Injicera direkt i tumören med enkeldos av Luc/Red fluorescerande protein (RFP)-lentivirus (50 μL/tumör, 1:30 utspädning från koncentrerad hög titer lentivirus lager) med en 1 cc spruta med en 27 G nål.
Anmärkning: patientens tumör vanligtvis når 1 cm i diameter i 1 − 2 månader. Emellertid, tillväxttakten är extremt varierande och baseras på ett antal faktorer, inklusive tumör klass och typ. - Monitor tumör varje vecka med bioluminescerande Imaging (bli) i levande djur.
- Väg upp mössen. Injicera medveten mus med 150 mg/kg Luciferin intraperitonealt och vänta 5 min för underlaget att cirkulera i musens kropp.
- Anesthetize musen med 2,5% isofluran i 100% syre, 1 L/min i en induktions kammare.
- Placera musen på magen i en bli Imaging maskin med isofluran flyter och bild. Ta sekventiella bilder för att bekräfta närvaron av Luc/RFP positiva tumör regioner (falsk-färg bio-Luminescent bild). Återgå musen till buren efter avbildning är klar.
5. Välj lämplig del av tumören för enzymatisk nedbrytning
- På dagen för UCC eller CRC förfarande, bildmus med luciferas taggade tumör som i steg 4.3.1 − 4.3.3.
Notera: längden på tiden för den subkutana tumören att växa beror på hastigheten på tumörtillväxt och det planerade antalet djur som ska injiceras i experimentet. - Harvest tumör från mus flank och bild.
- Euthanize mus genom CO2 inandning efter avbildning. Placera musen i CO2 kammaren, slå på gasen på 1,4 L/min tills andningsstillestånd och låt verka i 3 min. Följ detta med cervikal dislokation.
- Ren hud med 70% etanol. Tält huden direkt ovanför tumören. Med kirurgisk sax göra ett litet snitt i huden. Separera huden från tumör med sax.
- Ta bort tumören och placera i en steril petriskål. Bild hela skålen i en bild maskin.
- Använd steril sax eller skalpell att separera luciferas-negativa sektioner från luciferas positiva sektioner i tumören och re-image.
- Upprepa tills endast de flesta mycket positiva tumör bitar kvar.
6. enzymatisk nedbrytning av tumör
- Under laminärt flöde Hood, finhacka luciferas positiva tumör bitar (steg 5,4) i minsta möjliga bitar med steril kirurgisk sax och Lägg dem i en steril 50 ml koniskt rör.
Notera: Mincing tumören i minsta möjliga bitar kommer att ge fler enskilda celler. - Bered sammanfattad lösning genom att tillsätta 10 mL kollagenase IV (1,5 mg/mL), 80 μL av hyaluronidas (20 mg/mL) och 160 μL av deoxyribonuclease I (0,1 mg/mL) till 40 mL HBSS. Blanda lösningen genom att invertera.
- Tillsätt 35 − 40 mL av den smälta lösningen till malet tumör. Inkubera vid 37 ° c med kontinuerlig rotation för 2 h.
Obs: kraftigt skaka röret regelbundet under inkubering för att förhindra tumör vävnad från klumpar. - Filtrera hela matsmältningen genom steril 100 μm cell SIL följt av en 40 μm cell sil för att ta bort skräp. Spara flödet genom och kassera skräp.
- Tvätta fria celler genom att tillsätta 20 mL HBSS och centrifugera vid 329 x g i 5 min. Aspirera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 30 ml Hbss.
- Kombinera 10 μL cell lösning och 90 μL trypan Blue i en enda brunn på en 96-platta. Räkna levande celler med en hemacytometer.
- Överför 1 x 104 till 1 x 106 tumörceller per mus till ett sterilt 15 ml koniskt rör. Tillsätt 3 x 105 hk celler från steg 1.2.3 per mus, till samma rör med tumörceller.
Anmärkning: Använd sterilt 50 mL koniskt rör om den totala volymen överskrider 15 mL. Beräkna alltid fler doser för ytterligare djur per studiegrupp för att ta hänsyn till vätskeförlust vid användning av sprutan. Om en grupp till exempel innehåller 5 möss kan du göra tillräckligt med celler för 6 eller 7 möss. - Centrifugera vid 329 x g i 5 min. Kassera supernatanten antingen med aspirerande eller pipettering.
- Omsuspendera celler i 50 μL per mus för UCC-modell eller 10 μL per mus för CRC-modell i komplett RPMI-media. Håll cellsuspensionen på isen tills den är klar för användning.
7. UCC musmodell
- Beredning av möss för ingrepp
- Få sex till åtta veckors gammal kvinnlig NOD/SCID mus. Raka den nedre ryggen på musen med hårborttagningskräm. Anesthetize musen i en induktions kammare med isofluran (2,5% i 100% syre, 1 L/min).
- En gång Sedated, Placera musen i liggande läge med sin nos i en isofluran näsa kon och nakna tillbaka stadigt jordad på en dispersiv elektrod.
Obs: musen är helt sederad om inte svarar på tå nypa.
- Ingjuta UCC-celler som bereds i steg 6,9 till urinblåsan med en angiocatheter (figur 1Aa, AB).
- Ställ in en monopolär elektrocautery maskin och inställd på en effekt av 4 W. Smörj en 24 G steril angiocatheter med smörj gelé och skär genom urinröret av den kvinnliga musen.
Obs: lätt motstånd kan kännas. Tryck försiktigt framåt eller ta bort angiocatheter och upprepa. Tvinga inte. Om katetern böjer sig vid inträdet, sätt i en steril ledare (se 7.2.2) halvvägs in i katetern för att ge stabilitet. - Sätt in 0,025 "fast kärnans rak ledar tråd 1 mm i slutet av angiocatheter.
Anmärkning: tråden är märkt med tejp före proceduren för att indikera 1 mm stopp punkt och försäkra konsistens. - Håll monopolär stift till ledaren tråden för 1 s möjliggör elektrisk irritation i urinblåsan slemhinnan.
- Fäst en fräsch steril angiocatheter på 1 cc Luer-lok-spruta och dra upp 200 μL av insamlade celler från steg 6,9.
Obs: minst 100 μL förloras från angiocatheter till sprutan. Kompensera för förlust volym vid beräkning av volym av cellsuspension behövs. - Ta bort ledaren och angiocatheter från mus urinröret. Sätt angiocatheter med spruta av celler bifogade i urinröret.
Observera: avancemang bör vara enklare än tidigare. - Ingjuta 50 μL celler till mus blåsan. Vänta några sekunder innan du tar bort angiocatheter att tillåta för celler att ansluta sig till urinblåsan väggen.
Obs: celler kvar i urinblåsan och utvecklas till en primär tumör.
- Ställ in en monopolär elektrocautery maskin och inställd på en effekt av 4 W. Smörj en 24 G steril angiocatheter med smörj gelé och skär genom urinröret av den kvinnliga musen.
- Ta bort musen från isofluran näsa konen och jord pad. Observera musen för 1 h följande procedur. Leta efter tecken på ångest, dvs böjd rygg, ansträngd andning, etc.
8. CRC musmodell
- Anesthetize sex till åtta veckor gamla manliga NOD/SCID mus med isofluran (2,5% i 100% syre, 1 L/min) i induktions kammaren. Bekräfta sedering med en tå nypa.
- Placera sövda musen i liggande läge under en dissekera Mikroskop, se till att säkra deras nos till en isofluran noskon och för att säkra sina frambenen med tejp för stabilitet.
Obs: Loupes kan användas i stället för en dissekera Mikroskop. Ett litet objekt kan användas för att förbättra sikten och vinkeln när den placeras under basen av svansen, Upplyft anus. Typiskt, små delar av gasväv rullas in i en cylinderform av 1-tums diameter. - Vidga analkanalen med böjda smorda trubbiga tippar tång för att exponera den distala anal och rektala slemhinnan. Ta bort avföring.
- Använd en steril 30 G borttagbar nål på en 50 μL glasspruta för att injicera 10 μL av tumör-och HK-celler (från steg 6,9) in i den distala bakre rektala submucosa 1 till 2 mm ovanför analkanalen. Den avfasning av nålen bör täckas av slemhinnan. Var noga med att inte passera in i bäckenhålan.
- Ta bort musen från isofluran näsa konen. Observera musen för 1 h följande procedur. Leta efter tecken på ångest, dvs böjd rygg, ansträngd andning, etc.
9. Bioluminescent avbildning
- Övervaka den primära tumören, levern, och lung metastatisk börda varje vecka med hjälp av en bioluminescerande avbildningssystem för luciferas aktivitet.
- Skaffa en mus från UCC eller CRC experiment och väga. Injicera 150 mg/kg Luciferin intraperitonealt och vänta 5 min för att underlaget ska cirkulera i musens kropp.
- Anesthetize mus med 2,5% isofluran i 100% syre, 1 L/min i induktions kammaren.
- Placera musen i BLI Imaging maskin med näsa fast i Nosecone. När du exponerar för bilden, se till att området av intresse är vänd mot kameran. För UCC och CRC injektion, den ventrala sidan bör möta kameran för varje bild. Bildmus i liggande läge.
10. avverknings organ och tumör
- När den primära tumören luminiscens Radiance når 1 x 1011 fotoner eller om möss uppvisar tecken på ångest (dvs, viktminskning, böjd rygg, hårda/ansträngd andning, etc.), euthanize möss genom Co2 inandning (som i steg 5.2.1) efter Luciferin injektion och helkropps avbildning.
- Ta bort lever och lungor, placera i en petriskål och bild för att identifiera eventuella metastaser. Ta bort tumör, väga och bild. Fix organ och tumör i 10% neutral buffrad formalin för 48 h vid omgivningstemperatur.
Obs: Rengör/torka sax och pinps mellan varje organ för att undvika överföring av vävnad.
11. histologisk utvärdering
- Bädda in formalin fasta vävnader i paraffin och skiva vävnaderna med 5 μm tjocklek på en mikrotom för hematoxylin och eosin (H & E) och immunohistokemisk (IHC) färgning.
Anmärkning: alla H & E färgning av paraffin diabilder gjordes i patologi laboratoriet för Ochsner Health system, och alla IHC färgning i detta papper utfördes i ett forskningslaboratorium av Ochsner Health system efter hög temperatur antigen hämtning med hjälp av Ki67 och cytokeratin 20 antikroppar, följt av en sekundär antikropp, och Avidin-biotin-peroxidas komplex enligt tillverkarens anvisningar13,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I UCC PDOX-modellen var UCC-patienters BlCaPt15-eller BlCaPt37-celler intravesikalt (IB) instillade i närvaro av HK-celler till kvinnlig NOD/SCID-musblåsa (figur 1a). Tjugofem av trettio (83,3%) djur genererade primära tumörer och visade tid beroende primär tumörtillväxt baserat på veckovisa bli (figur 1b, C och tabell 1). På samma sätt, i CRC PDOX-modellen, 31 av 32 (96,9%) möss växte primär tumör när intra-rektalt (IR) injiceras med patientens CoCaPt155 eller CoCaPt302 celler plus HK celler (figur 1d-F och tabell 1). Beroende på patientens tumör, mus tumörtillväxt hade en annan latensperiod, vilket återspeglar skillnaden i patientens kliniska egenskaper (figur 1c, F).
I både IB och IR-modeller, tumör cell injektion inte bara genererade ortotopiska primära tumörer (figur 2A, B, blå pilar), men många möss testas också utvecklat levern och/eller lungmetastaser. I 10 av 30 (33,3%) och 17 av 32 (53,1%) möss instillade med UCC celler och CRC-celler med HK celler, respektive, vi upptäckte avlägsen organmetastaser via ex vivo BLI (figur 2A,B och tabell 1).
För att bekräfta liknande vävnads morfologi, H & E och IHC färgning utfördes jämföra xenograft och primära patienter tumörer. Histopatologi för patienter med blåscancer upprätthölls i xenografter från BlCaPt15 och BlCaPt37 (figur 3a). Resultat visar xenograft tumör motsvarar den muskel invasiva tillväxtmönstret av patienternas primära tumörer. Antikroppen som är specifik för mänsklig cellproliferation markör Ki67 användes i IHC. Ki67 positiva nukleära färgning indikerar mycket proliferativ, snabbt växande mänskliga tumörceller. De infärgning resultaten från xenograft liknade de av de ursprungliga kirurgiska biopsier. På samma sätt i IR-modellen, H & E färgning indikerar likheten mellan xenograft och patienter tumörer i både CoCaPt155 och CoCaPt302. IHC med antikroppar mot cytokeratin 20 visade också liknande tumörtillväxt mönster i båda PDOX-modellerna (figur 3b). Vår PDOX-modell rekapitulerade således UCC-och CRC-patientens kliniska progression.
Figur 1: Ortoämne UCC och CRC musmodeller. (a-C) Intravesikel (IB) instillation av UCC-celler i mus blåsan13. (AA) En angiocatheter sattes in i urinblåsan av en kvinnlig nod/scid mus och en elektrokauterisation chock tillämpades på urinblåsan väggen via en ledare. (AB) Luciferase taggade UCC tumörceller, BlCaPt15 (2 x 104 celler), eller BlCaPt37 (5 x 105 celler) med tillägg av 3 x 105 LN stromacellstumörer hk celler, ingjutit i nod/scid mus urinblåsan genom angiocatheter. (D-F) Intrarektal (IR) injektion av CRC-celler i submukosala vävnad lagret av mus ändtarmen17. (D) analkanalen var dilaterad med smorda trubbiga tippar tång för att ge tillgång till distala anal och rektal slemhinna och en 30 G nål sattes in i den distala bakre rektal submucosa 1 − 2 mm ovanför analkanalen tills avfasningen täcktes innan injektionen äger rum. Luciferase märkta CRC tumörceller, CoCaPt155 (5 x 105 celler), eller CoCaPt302 (1 x 104 celler) med tillägg av 3 x 105 hk celler injicerades. Tumörbörda övervakades och kvantifierades via bioluminescerande avbildning (bli; B och E). Tumörtillväxt av luciferas taggade UCC eller CRC celler övervakades Kinetically via bli och analyseras med hjälp av bildanalysprogram (C och F). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: PDOX-modeller producerar spontant avlägsna organmetastaser. Representativa möss (topp paneler) från samma experiment som i figur 1, t. ex., ingjutit intravesiskt med luciferas taggade UCC tumörceller, BlCaPt15 eller BlCaPt37 celler med hk celler (A) eller intra-rectally med luciferas märkta CRC tumör celler, CoCaPt155 eller CoCaPt302 celler med HK-celler (B) visas. Gula pilar indikerar mus blåsan (a). Bilder tagna vid tiden för offret indikerar ortotopisk tumör formation (blå pilar). Lever, lungor, och tumör (mellersta paneler) som samlats in vid obduktion och deras ex vivo bli (botten paneler) visade mus lever och lungmetastaser samt tumör med luciferas aktivitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: xenograft tumörer likna patientens pre-implantation tumörer. Paraffin inbäddade tumör vävnad från patientens tumör eller tumörer som samlats in från möss i samma experiment som i figur 1 var sektioneras och färgas av H & E (a och B) eller IHC med antikroppar mot humant Ki67 (a) eller cytokeratin 20 (CK20; B). den bruna färgen indikerar positiv färgning. H & E färgning visar tumör Bon dissekera i glatt muskelbuntar (a). Fotografier togs med hjälp av en digital deconvoluting Mikroskop och analyseras med en bildanalysprogram vara. Skalstreck: 100 μm. Alla bilder togs i ursprunglig förstoring av 200 ×. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tumör implantat (%) | Lung-/levermetastaser (%) | Dödlighet (%) | |
| UCC, n = 30 | 83,3 | 33,3 | 0 |
| CRC, n = 32 | 96,9 | 53,1 | 0 |
Tabell 1: Sammanfattning av tumörbildning, metastaser och dödlighet i IB-och IR-modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metastaserande sjukdom är ansvarig för de flesta cancerpatienter mortalitet. I prekliniska terapeutiska tester är det viktigt att upprätta musmodeller som närmast emulerar människans tumörtillväxt med spontana avlägsna organmetastaser. Använda murina modeller med implanterade patient tumör härledda cancerceller (xenografts) möjliggör en bättre förståelse av tumörbiologi och Prediktiva biomarkörer samt testning och förutsägelse av antineoplastiska effekter av nya terapier18. Många modeller har använts för att Visa UCC och CRC metastaser i murina experiment, såsom intravenös svans ven injektioner visar förmågan att producera lungsjukdom19 eller subkutan implantation av tumörceller eller tumör fragment i flanken för lokaliserad tumörtillväxt20,21. Ett laboratorium tidigare rapporterat en blåscancer murina modell genom att använda saltsyra behandlingar för att framgångsrikt främja tumör upptag22. Även om dessa metoder producerar tillförlitlig lokal tillväxt och kan visa vissa metastatiska aktiviteter, de inte specifikt likna den naturliga förloppet av cancer som utvecklats hos människor och inte utnyttjar den metastaserande mekanismen ses hos patienter18, 23. Andra murina modeller rapporterades att efterlikna tumörtillväxt genom att injicera tumörceller direkt i organ som levern eller mesenteri, men de bar risker för tumör cell läckage och producerade inte betydande metastaser.
Vi har tidigare visat sambandet mellan cancer cellinnehåll i den primära tumören och LN engagemang24 och rollen av cancer cell/LN stromacellstumörer interaktion i samband med primär tumör progression till metastaserande sjukdom10 , 12 , 17. införliva vårt tidigare arbete med påverkan av den LN stromacellstumörer mikromiljön vid metastaserad progression, etablerade vi ortotopiska modeller (särskilt pdox-modellerna) som efterliknar den naturliga spridningen av metastaserande tekniskt reproducerbara, bevara heterogenitet av ursprungliga patient tumörer, och generera konsekvent primär tumör och metastaserande resultat12,13,17. Med hjälp av tumörförbättrande effekter av LN stromacellstumörer mikromiljö är viktigt eftersom det ger en liknande tumör mikromiljö i mänskliga UCC och CRC, utvecklar alla steg i metastaserad kaskad, minskar cancer cell nummer som krävs i musmodell som minimerar antalet xenograft passager, och resulterar i en tillförlitlig modell som nära härmar tumörtillväxt och metastaser i människa.
Vi har etablerat en unik metod för IB Electro-stimulering med hjälp av co-instillation av HK celler som ger en tillförlitlig modell för att utveckla MIUCC. Vår modell härmar den naturliga loppet av UCC progression av tumör implantation början i slemhinnan, leder in i muskeln, sedan och målriktad till lungorna13.
Våra resultat visar också att IR-modellen är säker, reproducerbar och framgångsrik. Den neobladder CRC musmodell funktioner primära tumörtillväxt och spontan avlägsen metastaser12,17. IR-proceduren är snabb, lätt att lära, tekniskt lätt att utföra, och inte alltför stressande på djuren. IB-och IR-grupperna hade noll dödlighet (tabell 1) i den postoperativa perioden före slutlig bli-mätning. Men tekniken kräver övning. Om intrarectal injektion är framgångsrik, det bör finnas en synlig "bubbla" som bildas som vätskan förs in i rektala submucosa och kommer att resultera i primär tumörtillväxt som så småningom kommer att bli påtaglig som visas i figur 1. Om tumören har injicerats för djupt in i bäckenhålan, det kommer att vara ofäst vid kolorektal tarmkanalen och växer mycket stor för att fylla bäckenet, ibland orsakar obstruktion. Om injektionen är för grunt eller inte in i rektal submukosala skikt alls, det kommer att läcka ut vilket resulterar i minskad eller frånvarande primära tumörbörda.
Vi har etablerat unika, reproducerbara PDOX-modeller för Human HG-UCC och CRC. Dessa modeller möjliggör tumör bildning och metastaser studier. Vi kan nu använda dessa modeller som den primära metoden att fortsätta att studera LN stromacellstumörer mikromiljö och dess interaktion med patientens primära tumörer. Dessa modeller kommer också att göra det möjligt för oss att undersöka terapier som stör de Pro-tumorigena effekterna av LNSC på primär tumör. Med dessa modeller, testning av nya terapeutiska läkemedel kan utföras effektivt och i kliniskt-mimetic seder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denna studie stöddes delvis av Ochsner translationell medicin forskningsinitiativet Grant 2014. Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna tackar Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller, och Shannon McChesney som hjälpte till att initiera dessa studier för deras utmärkta tekniska stöd. Författarna tackar också Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar, och Maria Latsis för hjälp i samtyckande patienter och ge tumörprover.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
- Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer--prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
- Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
- National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Bladder Cancer. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/urinb.html (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
- Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
- Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
- Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, discussion 764-755 758-764 (1993).
- Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
- National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2017).
- Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
- Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
- Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
- Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
- Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
- Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
- Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
- Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
- Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
- Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).
