Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन रोगी व्युत्पन्न ऑर्थोटोपिक एक्सोग्रैफ्ट मॉडल द्वारा इंट्रा-वेसिअल रूप से उच्च ग्रेड यूरोथेलियल सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं या अंतर-rectally इंजेक्शन कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं में गैर-बेबी मधुमेह / इम्यूनोडेफिशियेंसी (एनओडी/एससीआईडी) चूहों प्राथमिक ट्यूमर के विकास और लिम्फ नोड स्ट्रॉमल कोशिकाओं के प्रभाव में सहज मेटास्टेसिस, जो मानव मेटास्टैटिक रोगों की प्रगति की नकल करता है।
Abstract
कैंसर रोगियों को गरीब prognoses है जब लिम्फ नोड (LN) भागीदारी मूत्राशय और कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) के दोनों उच्च ग्रेड urothelial सेल कार्सिनोमा (एचजी-यूसीसी) में मौजूद है। मांसपेशी इनवेसिव यूसीसी के साथ रोगियों के 50% से अधिक, चिकित्सकीय-स्थानीयकृत रोग के लिए उपचारात्मक चिकित्सा के बावजूद, मेटास्टेसिस का विकास होगा और 5 साल के भीतर मर जाएगा, और मेटास्टैटिक सीआरसी अमेरिका में कैंसर से संबंधित मौतों का एक प्रमुख कारण है। रोगियों में देखा लगातार यूसीसी और सीआरसी मेटास्टेसिस की नकल करने वाले Xenograft मॉडल की आवश्यकता है। इस अध्ययन का उद्देश्य प्राथमिक ट्यूमर विकास और एलएन स्ट्रॉमल कोशिकाओं के प्रभाव में सहज मेटास्टेसिस के लिए यूसीसी और सीआरसी के रोगी व्युत्पन्न ऑर्थोटोपिक एक्सोग्रैफ्ट (पीडीओएक्स) मॉडल को दवा स्क्रीनिंग के लिए मानव मेटास्टैटिक रोगों की प्रगति की नकल करना है। ताजा यूसीसी और सीआरसी ट्यूमर क्रमशः एचजी-यूसीसी और कोलोरेक्टल एडेनोकार्सीनोमा के लिए लकीर के दौर से गुजर रहे सहमति वाले रोगियों से प्राप्त किए गए थे। LN stromal सेल (LNSC) एनालॉग एचके कोशिकाओं के साथ सह-inoculated, luciferase-टैग्ड यूसीसी कोशिकाओं इंट्रा-वेसically थे (आईबी) महिला गैर-बेबी मधुमेह में पैदा / नर NOD/ ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस को बायोल्युमिनेंस इमेजिंग (बीआईएल) का उपयोग करके साप्ताहिक निगरानी की गई थी। बलिदान पर, प्राथमिक ट्यूमर और माउस अंगों काटा गया, तौला, और formalin Hematoxylin और Eosin और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला के लिए तय. हमारे अद्वितीय PDOX मॉडल में, xenograft ट्यूमर रोगी पूर्व प्रत्यारोपण ट्यूमर के समान. एच के कोशिकाओं की उपस्थिति में, दोनों मॉडल उच्च ट्यूमर प्रत्यारोपण दर BLI और ट्यूमर वजन द्वारा मापा, यूसीसी के लिए 83.3% और सीआरसी के लिए 96.9%, और उच्च दूर अंग मेटास्टेसिस दर (33.3% का पता चला जिगर या यूसीसी के लिए फेफड़ों मेटास्टेसिस और सीआरसी के लिए 53.1%). इसके अलावा, दोनों मॉडल प्रक्रिया से शून्य मृत्यु दर है. हम मानव HG-UCC और सीआरसी, जो ट्यूमर गठन, विकास, और मेटास्टेसिस अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए अद्वितीय, reproduible PDOX मॉडल की स्थापना की है। इन मॉडलों के साथ, उपन्यास चिकित्सीय दवाओं का परीक्षण कुशलतापूर्वक और एक नैदानिक-मिमेटिक तरीके से किया जा सकता है।
Introduction
यह दिखाया गया है कि लिम्फ नोड (LN) मेटास्टेसिस मूत्राशय और कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी)1,2के उच्च ग्रेड यूरोथैलियल सेल कार्सिनोमा (यूसीसी) सहित कई ठोस अंग द्रोह में एक गरीब पूर्वानुमान सूचक है। मांसपेशियों में इनवेसिव यूसीसी (एमआईयूसीसी) के साथ रोगियों के आधे से अधिक, नैदानिक-स्थानीयकृत रोग के लिए उपचारात्मक चिकित्सा के बावजूद, मेटास्टेसिस विकसित होगा और 5 साल के भीतर मर जाएगा। मेटास्टैटिक सीआरसी अमेरिका में कैंसर से संबंधित मौत का एक प्रमुख कारण है।
एक अनुमान के अनुसार 81,190 नए रोगियों और 17,240 कैंसर विशिष्ट मौतों के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका में होने की संभावना है3,4मूत्राशय के यूसीसी के कारण . जबकि रोगियों को मुख्य रूप से होगा (70%) गैर-मांसपेशी इनवेसिव रोग के साथ मौजूद, 30% MIUCC5होगा . चिकित्सकीय स्थानीयकृत रोग के लिए उपचारात्मक चिकित्सा (मूल सिस्टेक्टॉमी [आरसी] के साथ या बिना प्रणालीगत रसायन चिकित्सा के बावजूद, मूत्राशय के एमआईयूसीसी वाले आधे रोगी अभी भी मेटास्टेसिस विकसित करेंगे और 5 साल के भीतर मर जाएंगे3. लिम्फ नोड भागीदारी लगभग 20% में पाया जाता है -25% रोगियों में आर सी6,7,8से गुजरना है . एलएन सकारात्मक रोगियों में पांच साल जीवित रहने की दर आर सी के बाद भी 35% से कम है, यूसीसी रोगियों में पूर्वानुमान के लिए एक महत्वपूर्ण नकारात्मक भविष्यवक्ता के रूप में एलएन भागीदारी का सुझाव।
कोलोरेक्टल कैंसर तीसरे सबसे आम संयुक्त राज्य अमेरिका में दोनों पुरुषों और महिलाओं में निदान कैंसर है. रोगी परिणाम काफी हद तक ट्यूमर विशेषताओं और ट्यूमर microenvironment पर निर्भर करते हैं, इस तरह के आक्रमण की गहराई के रूप में, LN भागीदारी, और दूर अंग metastases. हालांकि सीआरसी में मृत्यु दर स्क्रीनिंग और प्रभावी सर्जरी के कारण पिछले दशक में कमी आई है, यह अनुमान है कि सीआरसी रोगियों के लगभग 50% मेटास्टेसिस या आवर्तक रोग9का विकास होगा .
छोटे पशु मॉडल ट्यूमर प्रगति और विभिन्न metastatic पैटर्न का अध्ययन करने के लिए एक त्वरित, reproduible, और संशोधित मंच प्रदान करते हैं। वर्तमान में कोई वर्णित xenograft मॉडल है कि लगातार सीआरसी और यूसीसी मेटास्टेसिस रोगियों में देखा नकल कर रहे हैं. कैंसर दूर मेटास्टेसिस का प्राथमिक मार्ग लसीका प्रसार के माध्यम से है। नए शोध से पता चलता है कि LNs एक अद्वितीय microenvironment के साथ ट्यूमर प्रदान करते हैं, और न केवल स्थिर लक्ष्य जहां कैंसर कोशिकाओं क्षणिक पास हैं, लेकिन यह भी metastatic प्रक्रिया में कैंसर की कोशिकाओं के साथ बातचीत से एक अभिन्न भूमिका निभाते हैं. दरअसल, हमारे अध्ययनों से पता चला है कि, शिक्षित करने और ट्यूमर प्रगति और मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने के अलावा, LN stromal microenvironment भी सीआरसी10,11में दवा प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार है. हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में सीआरसी और यूसीसी पर एलएन स्ट्रॉमल कोशिकाओं (एलएनएससी) के ट्यूमरीजेनिक प्रभाव की पुष्टि की है जिसमें रोगी व्युत्पन्न ऑर्थोटोपिक एक्सोग्रैफ्ट (पीडीओएक्स) माउस मॉडल12,13का उपयोग किया गया है।
पीडीओएक्स मॉडल का विकास अनुवाद कैंसर अनुसंधान14,15के लिए एक महत्वपूर्ण मंच प्रदान करता है . उनके दाता ट्यूमर के प्रमुख हिस्टोलॉजिक और आनुवंशिक विशेषताओं को बनाए रखने के द्वारा , पीडीओएक्स मॉडल मार्ग भर में स्थिर रहते हैं और अनुवाद कैंसर अनुसंधान12,15के लिए अच्छा मंच बनाते हैं . PDOX मॉडल पूर्व नैदानिक दवा मूल्यांकन, biomarker पहचान, और नैदानिक परिणामों की भविष्यवाणी के लिए अनुमति व्यक्तिगत चिकित्सा रणनीतियों के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. वर्तमान में, वहाँ कोई वर्णन xenograft मॉडल है कि LN भागीदारी के महत्व पर विचार कर रहे हैं और लगातार प्राथमिक ट्यूमर और सीआरसी और यूसीसी में दूर अंग मेटास्टेसिस प्रजनन करने में सक्षम हैं. इस अध्ययन में, हम एनएनएससी भागीदारी के साथ मेटास्टैटिक सीआरसी और यूसीसी रोगों के प्रजनन के साथ NOD/SCID चूहों में PDOX मॉडल के विकास का वर्णन करते हैं।
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Protocol
इन पशु अध्ययनों में वर्णित सभी तरीके Ochsner स्वास्थ्य प्रणाली की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदित दिशा निर्देशों के तहत और पशु अनुसंधान दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे। इस अध्ययन के लिए सभी रोगी ट्यूमर Ochsner स्वास्थ्य प्रणाली जांच समीक्षा बोर्ड और मानव पर संस्थागत समिति के नैतिक मानकों के अनुसार कैंसर लकीर सर्जरी के दौर से गुजर सहमति रोगियों से एकत्र किए गए थे प्रयोग. Ochsner स्वास्थ्य प्रणाली में बोर्ड प्रमाणित पैथोलॉजिस्ट ट्यूमर कोशिकाओं की सूक्ष्म सुविधाओं के आधार पर रोगी नमूनों के रोग निदान निर्धारित, उनके हिस्टोलॉजिकल प्रकार, और ग्रेड स्तर.
नोट: निम्न प्रोटोकॉल दो अलग-अलग xenograft मॉडल के लिए चरणों का वर्णन करता है, एक यूसीसी मॉडल में अध्ययन के लिए मूत्राशय की दीवार के electrocauterization के माध्यम से एक UCC मॉडल और एक सीआरसी मॉडल में अध्ययन के लिए सीआरसी कोशिकाओं के एक intrarectal इंजेक्शन. सभी चरणों के लिए तैयारी और प्रयोगों की निगरानी दोनों मॉडलों के लिए समान हैं, जबकि वर्गों 7 और 8 विशेष रूप से यूसीसी instillation और सीआरसी इंजेक्शन के लिए प्रक्रिया का वर्णन, क्रमशः.
1. सेल लाइनों को कूलिंग
- पूर्ण RPMI-1640 मध्यम में HK कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 एनएम glutamine, 100 U/mL पेनिसिलिन जी, और 100 mg/mL streptomycin में 37 डिग्री सेल्सियस में एक 5% सीओ2 आर्द्र इनक्यूबेटर के साथ पूरक हो जाओ.
नोट: HK कोशिकाओं सामान्य मानव कूपिक डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं रहे हैं और विकसित किया जा सकता है और के लिए विस्तार $ 15 इन विट्रो16मार्ग . - एक प्रयोग के लिए तैयार करने के लिए, कोशिकाओं trypsinize.
- मीडिया निकालें और कोशिकाओं को हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) में 1% trypsin के 2 एमएल जोड़ें. कोशिकाओं को 5% सीओ2 नम इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए वापस रखें।
- एक 10 एमएल सीरोलॉजिकल पाइप संलग्न के साथ एक हाथ में पाइप ्ट सहायता का उपयोग कर एक 15 एमएल ट्यूब में पकवान से कोशिकाओं को ले लीजिए। पूरा RPMI-1640 माध्यम के 8 एमएल जोड़ें.
- कोशिकाओं के 40 डिग्री सेल्सियस और एक 96 अच्छी तरह से थाली के एक ही कुएं में trypan नीले रंग के 40 डिग्री सेल्सियस का मिश्रण. एक हीमोसाइटोमीटर के लिए मिश्रण के 10 डिग्री एल जोड़ें और लाइव कोशिकाओं की गिनती. कोशिकाओं को बढ़ रही जारी रखने के लिए एक 150 मिमी बाँझ ऊतक संस्कृति का इलाज पकवान करने के लिए 25 एमएल पूरा RPMI-1640 मध्यम में 1 लाख कोशिकाओं जोड़ें।
नोट: HK सेल निलंबन इस चरण में तैयार इंजेक्शन के लिए ट्यूमर कोशिकाओं के साथ मिश्रण करने के लिए एक घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
2. रोगी नमूना संग्रह
- सहमति रोगी से यूसीसी ट्यूमर ले लीजिए 15 (BlCaPt15, pT3b N1 M0) और 37 (BlCaPt37, pt3b pN0 M0) लकीर सर्जरी में.
- सहमति रोगी से सीआरसी ट्यूमर ले लीजिए 155 (CoCaPt155, T1 N0 M0) और 302 (CoCaPt302, T1 N0 M0) लकीर सर्जरी में.
3. रोगी ट्यूमर का विस्तार
- कोल्ड बाँझ McCoy के माध्यम में सर्जरी में ट्यूमर ले लीजिए पेनिसिलिन जी (500 U/mL) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (500 mg/
- 6 "8 सप्ताह पुरानी महिला NOD/
- यांत्रिक रूप से छोटे शल् यसन कैंची का उपयोग करते हुए छोटे टुकड़ों में कीमा ऊतकों को 1 मिमी3) का उपयोग करना।
- 13 जी अस्थि मज्जा आकांक्षा बायोप्सी सुइयों का उपयोग कर छोड़ दिया और सही पार्श्व करने के लिए प्रत्यारोपण ऊतक subcutaneously.
नोट: की कुल मात्रा प्रत्यारोपण 8 मिमी3 flank के दोनों पक्षों के लिए समान रूप से विभाजित.
4. टैगिंग और luciferase लेबल ट्यूमर के संवर्धन
- एक डिजिटल कैलिपर का उपयोग कर ट्यूमर विकास द्वि-साप्ताहिक उपाय।
- व्यास में 1 सेमी पर, ट्यूमर ट्रांसड्यूस। ल्यूक/लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) की एकल खुराक के साथ ट्यूमर में सीधे इंजेक्ट करें-lentivirus (50 डिग्री सेल्सियस/ट्यूमर, 1:30 केंद्रित उच्च टिटर lentivirus स्टॉक से कमजोर पड़ने) एक 27 जी सुई के साथ एक 1 सीरिंज का उपयोग कर।
नोट: रोगी ट्यूमर आम तौर पर 1 डिग्री 2 महीने में व्यास में 1 सेमी तक पहुँचता है। हालांकि, विकास दर अत्यंत चर और ट्यूमर ग्रेड और प्रकार सहित कारकों की एक संख्या पर आधारित है. - लाइव जानवरों में bioluminescent इमेजिंग (BLI) द्वारा साप्ताहिक ट्यूमर की निगरानी करें।
- चूहों का वजन करें। 150 mg/kg luciferin intraperitoneally के साथ चेतन माउस इंजेक्शन और माउस के शरीर में प्रसारित करने के लिए सब्सट्रेट के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
- माउस को 100% ऑक्सीजन में 2.5% isoflurane के साथ एनेस्थेटाइज करें, एक प्रेरण कक्ष में 1 L/
- एक BLI इमेजिंग मशीन में पेट पर माउस जगह isoflurane बह रही है और छवि के साथ. Luc/RFP सकारात्मक ट्यूमर क्षेत्रों (झूठे रंग जैव-दीप्ति छवि) की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए अनुक्रमिक छवियों को लें। इमेजिंग पूरा होने के बाद पिंजरे में माउस को लौटाएँ.
5. एंजाइमी पाचन के लिए ट्यूमर के उपयुक्त भाग का चयन करें
- यूसीसी या सीआरसी प्रक्रिया के दिन, luciferase के साथ छवि माउस चरण 4.3.1 में के रूप में ट्यूमर टैग 4.3.1 $4.3.
नोट: subcutaneous ट्यूमर विकसित करने के लिए समय की लंबाई ट्यूमर के विकास की गति और प्रयोग में इंजेक्ट किया जा करने के लिए जानवरों की योजना बनाई संख्या पर निर्भर करता है। - माउस पार्श्व और छवि से हार्वेस्ट ट्यूमर.
- इमेजिंग के बाद सीओ2 इनहेलेशन द्वारा माउस को यूथेनाइज करें। सीओ2 कक्ष में माउस रखें, 1.4 L/min पर गैस पर बारी जब तक श्वसन गिरफ्तारी और 3 मिनट के लिए छोड़ दें. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ इस का पालन करें.
- 70% इथेनॉल के साथ स्वच्छ त्वचा. ट्यूमर के ऊपर सीधे तम्बू त्वचा. शल्य कैंची के साथ त्वचा में एक छोटा सा चीरा बनाते हैं. कैंची के साथ ट्यूमर से अलग त्वचा.
- ट्यूमर निकालें और एक बाँझ पेट्री-डिश में जगह है। एक इमेजिंग मशीन में छवि पूरे पकवान.
- ट्यूमर और फिर से छवि में luciferase सकारात्मक वर्गों से luciferase-नकारात्मक वर्गों को अलग करने के लिए बाँझ कैंची या स्केलपेल का प्रयोग करें।
- दोहराएँ जब तक केवल सबसे अत्यधिक सकारात्मक ट्यूमर टुकड़े रहते हैं.
6. ट्यूमर का एंजाइमी पाचन
- स्तरीय प्रवाह हुड के तहत, कीमा luciferase सकारात्मक ट्यूमर टुकड़े (कदम 5.4) बाँझ शल्य कैंची का उपयोग कर छोटी संभव टुकड़े में और उन्हें एक बाँझ 50 एमएल शंकु ट्यूब में डाल दिया।
नोट: छोटी संभव टुकड़े में ट्यूमर mincing अधिक व्यक्तिगत कोशिकाओं उपज होगी. - कोलैडेनेज IV (1.5 मिलीग्राम/एमएल), 80 डिग्री सेल्सियस हायलुरोनिडेज (20 मिलीग्राम/एमएल) और 160 एमएल डीऑक्सीराइबोनकुलेज I (0.1 मिलीग्राम/एमएल) को एचबीएस एस के 40 एमएल में जोड़कर डाइजेस्ट समाधान तैयार करें। उलटा करके समाधान मिलाएं.
- कीमा बनाया ट्यूमर के लिए डाइजेस्ट समाधान के 35 -40 एमएल जोड़ें। 2 ज के लिए निरंतर रोटेशन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
नोट: ट्यूमर ऊतक को clumping से रोकने के लिए पूरे ऊष्मायन भर में समय-समय पर जोरदार रूप से हिला ट्यूब। - मलबे को हटाने के लिए एक 40 डिग्री सेल छलनी के बाद बाँझ 100 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से पूरे पाचन फ़िल्टर। प्रवाह के माध्यम से बचाने के लिए और मलबे को त्यागदें।
- 5 मिनट के लिए 329 x ग्राम पर एचबीएसएस और सेंट्रीफ्यूज के 20 एमएल जोड़कर मुक्त कोशिकाओं को धोएं और एचबीएस के 30 एमएल में गोली को फिर से शुरू करें।
- कोशिका विलयन के 10 डिग्री सेल्सियस तथा 96 कूप प्लेट के एक कुएं में 90 डिग्री सेल्सियस का मिश्रण किया जाता है। हेमीस्टोमीटर का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं की गणना करें।
- स्थानांतरण 1 x 104 करने के लिए 1 x 106 ट्यूमर कोशिकाओं माउस प्रति एक बाँझ 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए. 3 x 105 HK कोशिकाओं कदम से जोड़ें 1.2.3 माउस प्रति, ट्यूमर कोशिकाओं के साथ एक ही ट्यूब के लिए.
नोट: बाँझ 50 एमएल शंकु ट्यूब का प्रयोग करें यदि कुल मात्रा 15 एमएल से अधिक है। सिरिंज उपयोग के दौरान तरल पदार्थ की हानि के लिए खाते में प्रति अध्ययन समूह के लिए हमेशा अधिक खुराक की गणना. उदाहरण के लिए, यदि किसी समूह में 5 चूहे हैं, तो 6 या 7 चूहों के लिए पर्याप्त कक्ष बनाएं. - 5 मिनट के लिए 329 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज. या तो aspirating या पाइपिंग द्वारा supernatant छोड़ें।
- यूसीसी मॉडल के लिए 50 $L प्रति माउस में कक्षों को पुन: निलंबित करें या पूर्ण RPMI मीडिया में CRC मॉडल के लिए प्रति माउस 10 $L. बर्फ पर सेल निलंबन रखें जब तक उपयोग के लिए तैयार है.
7. यूसीसी माउस मॉडल
- प्रक्रिया के लिए चूहों की तैयारी
- छह से आठ सप्ताह पुरानी महिला NOD/ हेयर रिमूवल क्रीम का उपयोग करके माउस की पीठ के निचले हिस्से को दाढ़ी करें। isoflurane के साथ एक प्रेरण कक्ष में माउस Anesthetize (2.5% में 100% ऑक्सीजन, 1 L/
- एक बार बेहोश हो जाने के बाद, माउस को एक सिसोलुरेन नाक शंकु में अपने स्नाउट के साथ सुपाच्य स्थिति में रखें और एक dispersive इलेक्ट्रोड पर मजबूती से जमीन पर वापस नंगे।
नोट: माउस पूरी तरह से sedated है अगर प्रति अंगुली चुटकी करने के लिए अप्रतिसादी.
- एक एंजियोकैथेटर का उपयोग करके मूत्राशय के लिए चरण 6.9 में तैयार यूसीसी कोशिकाओं को स्थापित करें (चित्र 1Aa,Ab)।
- एक मोनोपोलर इलेक्ट्रोकाउटरी मशीन सेट करें और 4 डब्ल्यू लुब्रिकेट एक 24 जी बाँझ एंजियोकैथेटर की शक्ति के लिए सेट करें जिसमें लुब्रिकाटिंग जेली के साथ और मादा माउस के मूत्रमार्ग के माध्यम से डालें।
नोट: थोड़ा प्रतिरोध महसूस किया जा सकता है. धीरे से आगे धक्का या angiocatheter और दोहराने को हटा दें। बल न करें। कैथेटर प्रविष्टि पर झुकता है, तो स्थिरता प्रदान करने के लिए कैथेटर में आधे रास्ते (देखें 7.2.2) एक बाँझ गाइड तार डालें। - पूरी तरह से डालने 0.025" निश्चित कोर सीधे गाइड तार 1 मिमी एंजियोकैथेटर के अंत पिछले.
नोट: तार 1 मिमी रोक बिंदु इंगित करने के लिए प्रक्रिया से पहले टेप के साथ चिह्नित किया गया है और स्थिरता का बीमा. - मूत्राशय mucosa के बिजली की जलन के लिए अनुमति 1 s के लिए गाइड तार करने के लिए monopolar पिन पकड़ो.
- 1 सीसी लूर-लोक सिरिंज के लिए एक ताजा बाँझ एंजियोकैथेटर संलग्न करें और चरण 6.9 से एकत्र कोशिकाओं के 200 डिग्री एल को आकर्षित करें।
नोट: कम से कम 100 डिग्री सेल्सियस एंजियोकैथेटर से सिरिंज को खो दिया है। आवश्यक सेल निलंबन की मात्रा की गणना करते समय हानि मात्रा के लिए क्षतिपूर्ति करें। - माउस मूत्रमार्ग से गाइड तार और एंजियोकैथेटर निकालें। मूत्रमार्ग में संलग्न कोशिकाओं के सिरिंज के साथ एंजियोकैथेटर डालें।
नोट: उन्नति पहले की तुलना में आसान होना चाहिए। - माउस मूत्राशय के लिए कोशिकाओं के 50 डिग्री सेल्सियस को उत्तेजित करें। कोशिकाओं को मूत्राशय की दीवार का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए एंजियोकैथेटर को हटाने से पहले कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें।
नोट: कोशिकाओं मूत्राशय में रहते हैं और एक प्राथमिक ट्यूमर में विकसित.
- एक मोनोपोलर इलेक्ट्रोकाउटरी मशीन सेट करें और 4 डब्ल्यू लुब्रिकेट एक 24 जी बाँझ एंजियोकैथेटर की शक्ति के लिए सेट करें जिसमें लुब्रिकाटिंग जेली के साथ और मादा माउस के मूत्रमार्ग के माध्यम से डालें।
- isoflurane नाक शंकु और ग्राउंडिंग पैड से माउस निकालें। 1 ज निम्नलिखित प्रक्रिया के लिए माउस का निरीक्षण करें। संकट के लक्षण के लिए देखो, यानी, वापस hunched, परिश्रम साँस लेने, आदि.
8. सीआरसी माउस मॉडल
- प्रेरण कक्ष में आइसोलुरेन (2.5% में 100% ऑक्सीजन, 1 एल/ एक अंगुली चुटकी के साथ sedation की पुष्टि करें.
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत सुपाच्य स्थिति में एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें, एक isoflurane नाक को सुरक्षित करने के लिए और स्थिरता के लिए टेप के साथ उनके सामने अंगों को सुरक्षित करने के लिए सुनिश्चित करें।
नोट: Loupes एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है. एक छोटी सी वस्तु दृश्यता और कोण में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब पूंछ के आधार के नीचे रखा, गुदा को ऊपर उठाने. आमतौर पर, धुंध के छोटे वर्गों 1-इंच व्यास के सिलेंडर आकार में लुढ़काए जाते हैं। - दूरस्थ गुदा और गुदा श्लेष्म को बेनकाब करने के लिए घुमावदार चिकनाई युक्त कुंद-टिप ्ड बलप्स के साथ गुदा नहर को अलग करें। मल निकालें।
- एक बाँझ 30 जी हटाने योग्य सुई पर एक 50 डिग्री एल ग्लास सिरिंज का उपयोग करने के लिए ट्यूमर के 10 $L और HK कोशिकाओं (चरण 6.9 से) गुदा नहर के ऊपर distal पीछे गुदा submucosa 1 से 2 मिमी में इंजेक्ट करने के लिए. सुई के बेवेल को श्लेष्म द्वारा कवर किया जाना चाहिए। श्रोणि गुहा में पारित करने के लिए नहीं सावधान रहें।
- इस्फ्लुरेन नाक शंकु से माउस निकालें। 1 ज निम्नलिखित प्रक्रिया के लिए माउस का निरीक्षण करें। संकट के लक्षण के लिए देखो, यानी, वापस hunched, परिश्रम साँस लेने, आदि.
9. बायोलुमिनसेंट इमेजिंग
- प्राथमिक ट्यूमर, जिगर, और फेफड़ों metastatic बोझ साप्ताहिक luciferase गतिविधि के लिए एक bioluminescent इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर मॉनिटर.
- यूसीसी या सीआरसी प्रयोग से एक माउस प्राप्त करें और वजन. इंजेक्शन 150 मिलीग्राम/किलोग्राम luciferin इंट्राperitoneally और माउस के शरीर में प्रसारित करने के लिए सब्सट्रेट के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
- 100% ऑक्सीजन में 2.5% isoflurane के साथ एनेस्थेटाइज माउस, प्रेरण कक्ष में 1 L/
- नाक के साथ BLI इमेजिंग मशीन में माउस प्लेस nosecone में तय. जब छवि के लिए उजागर, सुनिश्चित करें कि ब्याज के क्षेत्र कैमरे का सामना करना पड़ रहा है. यूसीसी और सीआरसी इंजेक्शन के लिए, अधर पक्ष प्रत्येक छवि के लिए कैमरे का सामना करना चाहिए. सुपाच्य स्थिति में छवि माउस.
10. कटाई अंगों और ट्यूमर
- जब प्राथमिक ट्यूमर संदीपन चमक 1 x 1011 फोटॉनों तक पहुँचता है या यदि चूहे संकट के लक्षण प्रदर्शित करते हैं (यानी, वजन घटाने, वापस hunched, कठोर / इंजेक्शन और पूरे शरीर इमेजिंग.
- जिगर और फेफड़ों को निकालें, एक पेट्री डिश और छवि में जगह किसी भी metastases की पहचान करने के लिए. ट्यूमर निकालें, वजन और छवि. परिवेश के तापमान पर 48 एच के लिए 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन में अंगों और ट्यूमर को ठीक करें।
नोट: ऊतक के स्थानांतरण से बचने के लिए प्रत्येक अंग के बीच कैंची और संदंश साफ करें।
11. हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन
- पैराफिन में फिक्स्ड टिश्यू को एम्बेड करें और हेमैटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) धुंधला करने के लिए माइक्रोटोम पर 5 डिग्री मीटर मोटाई पर ऊतकों को टुकड़ा करें।
नोट: पैराफिन स्लाइड के सभी एच एंड ई धुंधला Ochsner स्वास्थ्य प्रणाली की पैथोलॉजी प्रयोगशाला में किया गया था, और इस कागज में सभी IHC धुंधला उच्च तापमान प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के बाद Ochsner स्वास्थ्य प्रणाली के एक अनुसंधान प्रयोगशाला में किया गया था Ki67 का उपयोग कर और cytokeratin 20 एंटीबॉडी, biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी के बाद, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार avidin-बायोटिन-peroxidase परिसरों13,17.
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Representative Results
यूसीसी पीडीओएक्स मॉडल में, यूसीसी रोगियों के BlCaPt15 या BlCaPt37 कोशिकाओं को इंट्रा-वेसिकली (आईबी) महिलाNOD/ तीस में से पच्चीस (83.3%) जानवरों प्राथमिक ट्यूमर उत्पन्न और साप्ताहिक BLI के आधार पर समय निर्भर प्राथमिक ट्यूमर विकास प्रदर्शित (चित्र 1B, सी और तालिका 1)। इसी तरह, सीआरसी पीडीओएक्स मॉडल में, 32 में से 31 (96.9%) चूहों प्राथमिक ट्यूमर वृद्धि हुई जब इंट्रा-rectally (IR) रोगियों के साथ इंजेक्शन ' CoCaPt155 या CoCaPt302 कोशिकाओं प्लस HK कोशिकाओं (चित्र 1D-F और तालिका 1). रोगी ट्यूमर पर निर्भर करता है, माउस ट्यूमर विकास एक अलग विलंबता अवधि थी, जो रोगी के नैदानिक विशेषताओं में अंतर को दर्शाता है (चित्र 1C, एफ)।
आईबी और आईआर दोनों मॉडलों में, ट्यूमर सेल इंजेक्शन न केवल ऑर्थोटोपिक प्राथमिक ट्यूमर उत्पन्न (चित्र2ए,बी,नीले तीर), लेकिन कई चूहों का परीक्षण भी जिगर और / 30 में से 10 में (33.3%) और 32 में से 17 (53.1%) यूसीसी कोशिकाओं और एचके कोशिकाओं के साथ सीआरसी कोशिकाओं के साथ पैदा चूहों, क्रमशः, हम पूर्व विवो BLI के माध्यम से दूर अंग मेटास्टेसिस का पता लगाया (चित्र 2A,बी और तालिका 1)।
इसी तरह के ऊतक आकारिकी की पुष्टि करने के लिए, एच एंड ई और आईएचसी धुंधला xenografts और प्राथमिक रोगी ट्यूमर की तुलना प्रदर्शन किया गया. रोगी मूत्राशय कार्सिनोमा की हिस्टोपैथोलॉजी BlCaPt15 और BlCaPt37 से exografts में बनाए रखा गया था (चित्र 3A) . परिणाम रोगियों के प्राथमिक ट्यूमर की मांसपेशियों इनवेसिव विकास पैटर्न के लिए इसी xenograft ट्यूमर दिखा. मानव सेल प्रसार मार्कर Ki67 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी IHC में इस्तेमाल किया गया था. Ki67 सकारात्मक परमाणु धुंधला अत्यधिक proliferative इंगित करता है, तेजी से बढ़ रही मानव ट्यूमर कोशिकाओं. xenografts से धुंधला परिणाम मूल शल्य बायोप्सी के उन लोगों के समान थे. इसी तरह, आईआर मॉडल में, एच एंड ई धुंधला दोनों CoCaPt155 और CoCaPt302 के xenografts और रोगी ट्यूमर के बीच वास्तुकला की समानता इंगित करता है. आईएचसी साइटोकेराटिन 20 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए भी दोनों पीडीओएक्स मॉडल में समान ट्यूमर विकास पैटर्न दिखाया गया है (चित्र 3 बी) । इस प्रकार, हमारे PDOX मॉडल यूसीसी और सीआरसी रोगी नैदानिक प्रगति recapitulated.
चित्र 1: ऑर्थोटोपिक यूसीसी और सीआरसी माउस मॉडल। (ए-सी) अंतर-आशय (आईबी) में यूसीसी कोशिकाओं को माउस मूत्राशय13में डालना। (आ) एक एंजियोकैथेटर एक महिला NOD/SCID माउस के मूत्राशय में डाला गया था और एक इलेक्ट्रोकाउटरी सदमे एक गाइड तार के माध्यम से मूत्राशय की दीवार के लिए लागू किया गया था। (अब) Luciferase टैग UCC ट्यूमर कोशिकाओं, BlCaPt15 (2 x 104 कोशिकाओं), या BlCaPt37 (5 x 105 कोशिकाओं) के अलावा के साथ 3 x 105 LN stromal HK कोशिकाओं, एनओडी / (डी-एफ) माउस मलाशय17के submucosal ऊतक परत में सीआरसी कोशिकाओं के इंट्रा-रेक्टल (आईआर) इंजेक्शन। (डी) गुदा नहर को चिकनाई युक्त कुंद-टिप्ड बलप्स के साथ फैलाया गया था ताकि दूरस्थ गुदा और गुदा श्लेष्म तक पहुंच प्राप्त हो सके और एक 30 जी सुई को गुदा नहर के ऊपर 1 डिग्री 2 मिमी तक गुदा नहर के ऊपर डाला गया था जब तक कि बेवेल को पहले कवर नहीं किया गया था इंजेक्शन जगह लेता है. Luciferase टैग सीआरसी ट्यूमर कोशिकाओं, CoCaPt155 (5 x 105 कोशिकाओं), या CoCaPt302 (1 x 104 कोशिकाओं) के अलावा के साथ 3 x 105 HK कोशिकाओं इंजेक्शन थे. ट्यूमर बोझ पर नजर रखी और bioluminescent इमेजिंग (BLI) के माध्यम से परिमाणित किया गया था; बी और ई) . ल्यूसिफेरेज़ के ट्यूमर विकास को यूसीसी या सीआरसी कोशिकाओं के ट्यूमर के विकास की गतिज रूप से बीआई एलआई के माध्यम से निगरानी की गई थी और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सी और एफ) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: PDOX मॉडल सहज दूर अंग मेटास्टेसिस का उत्पादन. प्रतिनिधि चूहों (शीर्ष पैनलों) चित्र 1में के रूप में एक ही प्रयोगों से, जैसे, luciferase टैग UCC ट्यूमर कोशिकाओं के साथ intra-vesically पैदा, BlCaPt15 या BLCaPt37 कोशिकाओं के साथ HK कोशिकाओं (ए) या अंत में rectally के साथ luciferase टैग सीआरसी ट्यूमर कोशिकाओं, CoCaPt155 या HK कोशिकाओं के साथ CoCaPt302 कोशिकाओं (बी) दिखाए जाते हैं. पीला तीर माउस मूत्राशय (ए) को इंगित करता है। बलिदान के समय ली गई तस्वीरें ऑर्थोटोपिक ट्यूमर गठन (नीले तीर) का संकेत देती हैं। जिगर, फेफड़े, और ट्यूमर (मध्य पैनलों) नेक्रोप्सी और उनके पूर्व विवो BLI (नीचे पैनलों) में एकत्र माउस जिगर और फेफड़ों मेटास्टेसिस के रूप में के रूप में अच्छी तरह से luciferase गतिविधि के साथ ट्यूमर से पता चला. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: Xenograft ट्यूमर रोगी पूर्व प्रत्यारोपण ट्यूमर के समान. रोगी ट्यूमर या चित्र 1 में के रूप में एक ही प्रयोगों में चूहों से एकत्र ट्यूमर से पैराफिन एम्बेडेड ट्यूमर ऊतक एच एंड ई (ए और बी) या मानव Ki67 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ IHC (ए) या साइटोकेराटिन द्वारा दाग थे 20 (CK20; बी) भूरे रंग सकारात्मक धुंधला इंगित करता है. एच एंड ई धुंधला ट्यूमर घोंसले चिकनी मांसपेशियों बंडलों(ए ) में विच्छेदन से पता चलता है. तस्वीरें एक डिजिटल deconvoluting माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया और एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया. स्केल बार: 100 डिग्री मी. सभी छवियों को 200 डिग्री के मूल आवर्धन में लिया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| ट्यूमर प्रत्यारोपण (%) | फेफड़े/लिवर मेटास्टेसिस (%) | मृत्यु दर (%) | |
| यूसीसी, n $ 30 | 83.3 | 33.3 | 0 |
| सीआरसी, n $32 | 96.9 | 53.1 | 0 |
तालिका 1: ट्यूमर गठन, मेटास्टेसिस, और आईबी और आईआर मॉडल में मृत्यु दर का सारांश।
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Discussion
मेटास्टैटिक रोग अधिकांश कैंसर रोगी नश्वरता के लिए जिम्मेदार है। पूर्व नैदानिक चिकित्सीय परीक्षणों में, यह माउस मॉडल है कि सबसे बारीकी से सहज दूर अंग metastases के साथ मानव ट्यूमर के विकास का अनुकरण स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रत्यारोपित रोगी ट्यूमर व्युत्पन्न कैंसर कोशिकाओं (xenografts) के साथ murine मॉडल का उपयोग ट्यूमर जीव विज्ञान और भविष्य कहनेवाला biomarkers के एक बेहतर समझ के लिए अनुमति देता है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परीक्षण और उपन्यास चिकित्सा के antineoplastic प्रभाव की भविष्यवाणी18. कई मॉडलों के लिए इस तरह के फेफड़ों की बीमारी का उत्पादन करने की क्षमता दिखा नसों में पूंछ नस इंजेक्शन के रूप में murine प्रयोगों में यूसीसी और सीआरसी metastases दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया है19 या ट्यूमर कोशिकाओं या ट्यूमर टुकड़े के subcutaneous प्रत्यारोपण के लिए पार्श्व में स्थानीयकृत ट्यूमर विकास20,21| एक प्रयोगशाला ने पहले ही ट्यूमर को सफलतापूर्वक ट्यूमर को बढ़ावादेने के लिए हाइड्रोक्लोरिक एसिड उपचार का उपयोग करके मूत्राशय के कैंसर की यूरीन मॉडल की सूचना दी थी . जबकि इन तरीकों विश्वसनीय स्थानीय विकास का उत्पादन और कुछ metastatic गतिविधियों का प्रदर्शन कर सकते हैं, वे विशेष रूप से मानव में विकसित कैंसर के प्राकृतिक पाठ्यक्रम के समान नहीं है और रोगियों में देखा metastatic तंत्र का उपयोग नहीं करते18, 23. अन्य murine मॉडल ट्यूमर कोशिकाओं को सीधे जिगर या mesentery जैसे अंगों में इंजेक्शन द्वारा ट्यूमर के विकास की नकल करने के लिए सूचित किया गया था, लेकिन वे ट्यूमर सेल रिसाव के जोखिम किया और महत्वपूर्ण metastases का उत्पादन नहीं किया.
हम पहले प्राथमिक ट्यूमर और LN भागीदारी में कैंसर सेल सामग्री के बीच संबंध का प्रदर्शन किया है24 और मेटास्टैटिक रोग के लिए प्राथमिक ट्यूमर प्रगति के पाठ्यक्रम में कैंसर सेल की भूमिका / , 12 , 17.मेटास्टैटिक प्रगति में LN stromal microenvironment के प्रभाव पर हमारे पिछले काम को शामिल, हम orthotopic मॉडल (विशेष रूप से PDOX मॉडल) है कि metastatic प्रसार के प्राकृतिक पाठ्यक्रम की नकल की स्थापना की, कर रहे हैं तकनीकी रूप से पुन: उत्पादन ीय, मूल रोगी ट्यूमर की विषमता को बनाए रखने, और लगातार प्राथमिक ट्यूमर और मेटास्टैटिक परिणामउत्पन्न 12,13,17. LN stromal microenvironment के ट्यूमर बढ़ाने के प्रभाव का उपयोग करना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह मानव यूसीसी और सीआरसी में एक समान ट्यूमर microenvironment प्रदान करता है, metastatic झरना में सभी चरणों को विकसित करता है, कैंसर सेल संख्या माउस मॉडल में आवश्यक कम कर देता है जो xenograft मार्ग की संख्या को कम करता है, और एक विश्वसनीय मॉडल है जो बारीकी से ट्यूमर विकास और मानव में metastases नकल में परिणाम.
हम HK कोशिकाओं है कि MIUCC के विकास के लिए एक विश्वसनीय मॉडल का उत्पादन के सह-instillation का उपयोग कर आईबी इलेक्ट्रो-उत्तेजना की एक अनूठी विधि की स्थापना की है। हमारे मॉडल mucosa में शुरू ट्यूमर प्रत्यारोपण द्वारा यूसीसी प्रगति के प्राकृतिक पाठ्यक्रम mimics, मांसपेशियों में अग्रणी, तो फेफड़ों के लिए metastasizing13.
हमारे परिणाम यह भी बताते हैं कि आईआर मॉडल सुरक्षित, पुन: उत्पादन योग्य और सफल है। ऑर्थोटोपिक सीआरसी माउस मॉडल में प्राथमिक ट्यूमर वृद्धि और सहज दूर मेटास्टेसिस12,17है . आईआर प्रक्रिया जल्दी, जानने के लिए आसान है, तकनीकी रूप से प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और जानवरों पर भी तनावपूर्ण नहीं है। आईबी और आईआर समूहों की अंतिम बीआईआई मापन से पहले पश्चात अवधि में शून्य मृत्यु दर (तालिका 1) थी। हालांकि, तकनीक अभ्यास की आवश्यकता है. यदि इंट्रारेक्टल इंजेक्शन सफल होता है, तो एक दृश्य "बबल" होना चाहिए जो तरल पदार्थ के रूप में बनाता है और प्राथमिक ट्यूमर विकास में परिणाम देगा जो अंततः चित्र 1में दिखाए गए के रूप में स्पष्ट हो जाएगा। यदि ट्यूमर को श्रोणि गुहा में बहुत गहरा इंजेक्ट किया गया है, तो यह कोलोरेक्टल पथ से जुड़ा होगा और श्रोणि को भरने के लिए बहुत बड़ा हो जाएगा, कभी-कभी बाधा पैदा करता है। यदि इंजेक्शन बहुत उथले है या गुदा submucosal परत में प्रवेश नहीं करता है, यह कम या अनुपस्थित प्राथमिक ट्यूमर बोझ में जिसके परिणामस्वरूप बाहर रिसाव होगा.
हम मानव HG-UCC और सीआरसी के लिए अद्वितीय, reproduible PDOX मॉडल की स्थापना की है। इन मॉडलों ट्यूमर गठन और मेटास्टेसिस अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं. अब हम प्राथमिक विधि के रूप में इन मॉडलों का उपयोग करने के लिए LN stromal microenvironment और रोगी प्राथमिक ट्यूमर के साथ अपनी बातचीत का अध्ययन जारी रख सकते हैं. इन मॉडलों को भी हमें चिकित्सा है कि प्राथमिक ट्यूमर पर LNSC के समर्थक tumorigenic प्रभाव के साथ हस्तक्षेप की जांच करने की अनुमति देगा. इन मॉडलों के साथ, उपन्यास चिकित्सीय दवाओं का परीक्षण कुशलतापूर्वक और नैदानिक-मिमेटिक शिष्टाचार में किया जा सकता है।
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Disclosures
इस अध्ययन आंशिक रूप से Ochsner अनुवाद चिकित्सा अनुसंधान पहल अनुदान 2014 द्वारा समर्थित किया गया था. लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।
Acknowledgments
लेखक ब्रायन Reuter, डेनिएल Bertoni, पीटर मिलर, और शान्नोन McChesney जो उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए इन अध्ययनों को आरंभ करने में मदद धन्यवाद. लेखकों ने भी हीथ ग्रीन Matrana, मार्गरेट Variano, सुनील तलवार, और मारिया Latsis रोगियों की सहमति और ट्यूमर नमूने प्रदान करने में सहायता के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
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