Summary
Este protocolo descreve a geração de modelos transplantação orthotopic do paciente-derivados do xenograft por intra-vesically incutir pilhas urotelial de primeira qualidade da carcinoma da pilha ou de injetar intra-rectal pilhas de cancro colorretal em não-obeso diabético/severo combinado ratos da imunodeficiência (NOD/SCID) para o crescimento preliminar do tumor e metástases espontâneas a influência de pilhas stromal do nó de linfa, que imita a progressão de doenças metastáticas humanas.
Abstract
Os pacientes com câncer têm prognósticos pobres quando o envolvimento do linfonodo (ln) está presente no carcinoma de células urotelial de alto grau (Hg-UCC) da bexiga e câncer colorretal (CRC). Mais de 50% dos pacientes com UCC músculo-invasor, apesar da terapia curativa para a doença clìnica-localizada, desenvolverão metástases e morrem dentro de 5 anos, e o CRC metastático é uma causa principal de mortes Cancer-relacionadas nos E.U. Os modelos de xenograft que imitam consistentemente a metástase de UCC e de CRC vistos nos pacientes são necessários. Este estudo visa gerar modelos de Xenoenxerto ortotópico derivado do paciente (PDOX) de UCC e CRC para o crescimento primário do tumor e metástases espontâneas a influência de células estromais do LN, imitando a progressão de doenças metastáticas humanas para triagem de fármacos. Os tumores frescos de UCC e de CRC foram obtidos dos pacientes consentiu que submetem-se ao Resection para HG-UCC e adenocarcinoma colorretal, respectivamente. Co-inoculated com as pilhas análogas da HK da pilha do stromal do ln (lnsc), as pilhas luciferase-etiquetadas de UCC eram intra-vesically (IB) instilado em ratos não-obesos fêmeas do diabético/imunodeficiência combinada severa (nod/scid), e as pilhas de CRC eram intra-rectal (ir) injetada camundongos NOD/SCID masculinos. O crescimento e a metástase do tumor foram monitorados semanalmente usando a imagem latente do bioluminescência (bli). Em cima do sacrifício, os tumores preliminares e os órgãos do rato foram colhidos, pesados, e formalin-fixados para a coloração do hematoxylin e do Eosin e do immunohistochemistry. Em nossos modelos originais de PDOX, os tumores do xenograft assemelham-se aos tumores pacientes do pre-implante. Na presença de células de HK, ambos os modelos apresentam altas taxas de implante tumoral mensuradas por BLI e pesos tumorais, 83,3% para a UCC e 96,9% para CRC, e altas taxas de metástase de órgãos distantes (33,3% detectaram metástase hepática ou pulmonar para a UCC e 53,1% para CRC). Além disso, ambos os modelos têm mortalidade zero a partir do procedimento. Nós estabelecemos modelos originais, reprodutíveis de PDOX para o HG-UCC e o CRC humanos, que permitem a formação do tumor, o crescimento, e os estudos da metástase. Com estes modelos, o teste de drogas terapêuticas novas pode ser executado eficientemente e em uma maneira clìnica-mimmetic.
Introduction
Demonstrou-se que a metástase do nó de linfa (ln) é um indicador prognóstico pobre em muitas malignidades sólidas do órgão, incluindo o carcinoma urotelial de primeira qualidade da pilha (UCC) da bexiga e do cancro colorretal (CRC)1,2. Sobre a metade dos pacientes com o UCC músculo-invasor (MIUCC), apesar da terapia curativa para a doença clìnica-localizada, desenvolverá metástases e morre dentro de 5 anos. A CRC metastática é uma das principais causas de morte relacionada ao câncer nos EUA.
Estima-se que 81.190 novos pacientes e 17.240 mortes específicas de câncer ocorram em 2018 nos Estados Unidos devido ao UCC da bexiga3,4. Enquanto os pacientes serão predominantemente (70%) presente com doença invasiva não-muscular, 30% terão MIUCC5. Apesar da terapia curativa (Cistectomia Radical [RC] com ou sem quimioterapia sistemática) para a doença clìnica localizada, a metade dos pacientes com miucc da bexiga ainda desenvolverá metástases e morre dentro de 5 anos3. O acometimento linfonodal é encontrado em aproximadamente 20% − 25% dos pacientes submetidos a RC6,7,8. A taxa de sobrevida de cinco anos em pacientes positivos de LN é inferior a 35% mesmo após RC, sugerindo envolvimento do LN como preditor negativo crucial para o prognóstico em pacientes com UCC.
O cancro colorectal é o terceiro cancro o mais comum diagnosticado em homens e em mulheres nos Estados Unidos. Os resultados pacientes dependem pela maior parte das características do tumor e do microambiente do tumor, tais como a profundidade da invasão, o envolvimento de LN, e metástases distantes do órgão. Embora a taxa de mortalidade na CRC tenha diminuído na última década devido à triagem e cirurgias efetivas, estima-se que quase 50% dos pacientes com CRC desenvolvam metástases ou doença recorrente9.
Os modelos animais pequenos fornecem uma plataforma expedita, reprodutível, e modificável para estudar a progressão do tumor e testes padrões metastáticos diferentes. Não há atualmente nenhum modelo descrito do xenograft que imitam consistentemente a metástase de CRC e de UCC considerada nos pacientes. A rota preliminar da metástase distante do cancro é através da propagação linfática. A pesquisa nova sugere que os LNs forneçam tumores com um microambiente original, e são não somente alvos estacionários simplesmente onde as pilhas cancerosas passam transientemente, mas igualmente jogam um papel integral interagindo com as pilhas de cancro no processo metastático. De fato, nossos estudos descobriram que, além de educar e promover a progressão e metástases tumorais, o microambiente do LN stromal também é responsável pela resistência a fármacos em CRC10,11. Nosso laboratório confirmou recentemente os efeitos tumorigênico de ln pilhas stromal (lnscs) em CRC e em UCCs usando os modelos transplantação orthotopic do paciente-derivados do rato do xenograft (pdox)12,13.
O desenvolvimento de modelos pdox fornece uma importante plataforma para a pesquisa translacional do câncer14,15. Mantendo as principais características histológicas e genéticas de seu tumor doador, os modelos pdox permanecem estáveis em passagens e fazem boas plataformas para a pesquisa translacional do câncer12,13. Os modelos PDOX estão sendo usados para avaliação de medicamentos pré-clínicos, identificação de biomarcadores e avaliação pré-clínica de estratégias de medicina personalizada, permitindo a predição de desfechos clínicos. Atualmente, não há modelos de xenoenxertos descritos que considerem a importância do envolvimento do LN e sejam capazes de reproduzir consistentemente o tumor primário e a metástase de órgãos distantes na CRC e na UCC. Neste estudo, nós descrevemos o desenvolvimento de modelos de PDOX em ratos de NOD/SCID com reprodução de doenças metastáticas de CRC e de UCC com participação de LNSC.
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Protocol
Todos os métodos descritos nestes estudos em animais foram conduzidos as diretrizes aprovadas do Comitê institucional de cuidados e uso de animais do sistema de saúde OCHSNER e de acordo com as diretrizes de pesquisa em animais. Todos os tumores do paciente para este estudo foram coletados de pacientes consentiram submetidos a cirurgias de ressecção oncológica de acordo com o Conselho de revisão investigativa do sistema de saúde OCHSNER e os padrões éticos do Comitê institucional de Experimentação. Os patologistas Conselho-certificados no sistema de saúde de OCHSNER determinaram os diagnósticos patológicos de espécimes pacientes baseados nas características microscópicas de pilhas do tumor, de seu tipo histológico, e de nível da classe.
Nota: o seguinte protocolo descreve as etapas para dois modelos separados do xenograft, um modelo de UCC através do eletrocauterização da parede da bexiga para incuficar pilhas de UCC e uma injeção recto de pilhas de CRC para o estudo em um modelo de CRC. Todas as etapas que preparam e monitoram os experimentos são idênticas para ambos os modelos, enquanto as seções 7 e 8 descrevem especificamente o procedimento para instilação de UCC e injeção de CRC, respectivamente.
1. cultivando linhas celulares
- Cresça as pilhas da HK no meio completo de RPMI-1640 suplementado com o soro bovino fetal de 10%, a glutamina de 2 nanômetro, a penicilina G de 100 U/mL, e a estreptomicina de 100 mg/mL em 37 ° c em uma incubadora humidificada de 5% CO2 .
Nota: as células de HK são células dendríticas foliculares humanas normais e podem ser cultivadas e expandidas para ≤ 15 passagens in vitro16. - Para se preparar para uma experiência, Trypsinize as células.
- Remova a mídia e adicione 2 mL de 1% de tripsina na solução de sal balanceada de Hank (HBSS) para as células. Coloque as células de volta na incubadora de 5% CO2 humidificada a 37 ° c durante 4 min.
- Colete as pilhas do prato em um tubo de 15 ml usando um auxílio handheld do Pipet com um Pipet sorológicos de 10 ml Unido. Adicionar 8 mL de completo RPMI-1640 médio.
- Combine 40 μl das pilhas e 40 μl do azul do Tripan em um único poço de uma placa de 96 poços. Adicione 10 μL de mistura a um hemociômetro e conte células ao vivo. Adicionar 1 milhão células em 25 mL completo RPMI-1640 médio para um 150 mm estéril tecido cultura-Tratado prato para continuar a crescer as células.
Nota: a suspensão da pilha da HK preparada nesta etapa deve ser usada dentro de uma hora para misturar-se com as pilhas do tumor para a injeção.
2. coleção paciente do espécime
- Colete os tumores de UCC do paciente consentido 15 (BlCaPt15, pT3b N1 M0) e 37 (BlCaPt37, pT3b pN0 M0) na cirurgia do Resection.
- Colete tumores de CRC do paciente consentido 155 (CoCaPt155, T1 N0 M0) e 302 (CoCaPt302, T1 N0 M0) na cirurgia do Resection.
3. expansão do tumor do paciente
- Colete tumores na cirurgia no meio estéril frio de McCoy que contem a penicilina G (500 U/mL) e a estreptomicina (500 mg/mL).
- Implante tumores diretamente no flanco esquerdo e direito da fêmea idosa de 6 − 8 semanas NOD/SCID ratos.
- Mecanicamente triturar os tecidos em pedaços pequenos (~ 1 mm3) usando pequenas tesouras cirúrgicas.
- Implante o tecido por via subcutânea ao flanco esquerdo e direito usando agulhas da biópsia da aspiração da medula de 13 G.
Nota: implante um volume total de 8 mm3 dividido uniformemente para ambos os lados do flanco.
4. marcação e enriquecimento de tumores de luciferase rotulados
- Meça o crescimento do tumor bi-semanal usando um compasso de calibre digital.
- A 1 cm de diâmetro, transduce tumor. Injete diretamente no tumor com dose única de Luc/proteína vermelha fluorescente (RFP)-Lentivirus (50 μL/tumor, 1:30 diluição do estoque concentrado de Lentivirus de alto Titer) usando uma seringa de 1 cc com uma agulha de 27 G.
Nota: o tumor do paciente tipicamente atinge 1 cm de diâmetro em 1 − 2 meses. No entanto, a taxa de crescimento é extremamente variável e com base em um número de fatores, incluindo grau tumoral e tipo. - Monitore o tumor semanalmente pela imagem bioluminescente (BLI) em animais vivos.
- Pese os ratos. Injete o rato consciente com 150 mg/kg de luciferina via intraperitoneal e aguarde 5 min para que o substrato circule no corpo do rato.
- Anestesie o rato com 2,5% de isoflurano em 100% de oxigénio, 1 L/min numa câmara de indução.
- Coloc o rato no estômago em uma máquina da imagem latente de bli com fluxo e imagem do isoflurano. Faça exame de imagens sequenciais para confirmar a presença de regiões positivas do tumor de Luc/RFP (imagem bio-luminescente da falso-cor). Retorne o rato à gaiola depois que a imagem latente é completa.
5. Selecione a porção apropriada de tumor para digestão enzimática
- No dia do procedimento de UCC ou de CRC, o rato da imagem com luciferase marcou o tumor como nas etapas 4.3.1 − 4.3.3.
Nota: o período de tempo para que o tumor subcutâneo cresça depende da velocidade do crescimento tumoral e do número planejado de animais a serem injetados no experimento. - Tumor da colheita do flanco e da imagem do rato.
- Euthanize o rato pelo CO2 inalação após a imagem latente. Coloque o mouse na câmara CO2 , ligue o gás em 1,4 L/min até a parada respiratória e deixe por 3 min. Siga isto com luxação cervical.
- Limpe a pele com 70% de etanol. Tenda pele diretamente acima do tumor. Com tesouras cirúrgicas fazer uma pequena incisão na pele. Separe a pele do tumor com tesouras.
- Remova o tumor e coloc em um petri-prato estéril. Prato inteiro da imagem em uma máquina da imagem latente.
- Use tesouras estéreis ou bisturi para separar as seções luciferase-negativas das seções positivas do luciferase no tumor e na re-imagem.
- Repita até que somente as partes mais altamente positivas do tumor permaneçam.
6. digestão enzimática do tumor
- a capa laminar do fluxo, as partes positivas do tumor do luciferase do mince (etapa 5,4) nas partes possíveis as menores que usam tesouras cirúrgicas estéreis e põr as em um tubo cônico estéril de 50 mL.
Nota: mincing o tumor nas partes possíveis as menores renderá umas pilhas mais individuais. - Prepare a solução de digestão adicionando 10 mL de colagenase IV (1,5 mg/mL), 80 μL de hialuronidase (20 mg/mL) e 160 μL de desoxirribonuclease I (0,1 mg/mL) a 40 mL de HBSS. Misture a solução invertendo.
- Adicione 35 − 40 mL da solução de digestão ao tumor picado. Incubar a 37 ° c com rotação contínua por 2 h.
Nota: agitar vigorosamente o tubo periodicamente durante toda a incubação para prevenir o tecido tumoral de aglutina. - Filtre a digestão inteira através do filtro estéril da pilha de 100 μm seguido por um filtro da pilha de 40 μm para remover restos. Salve o fluxo e descarte os detritos.
- Lave as células livres adicionando 20 mL de HBSS e centrifugue a 329 x g durante 5 min. aspirar o sobrenadante e resuspender a pelota em 30 ml de HBSS.
- Combine 10 μL da solução da pilha e 90 μl do azul do Tripan em um único poço de uma placa do poço 96. Contagem de células ao vivo usando um hemacytometer.
- Transfira 1 x 104 para 1 x 106 células tumorais por rato para um tubo cônico estéril de 15 ml. Adicionar 3 x 105 células de HK da etapa 1.2.3 por mouse, para o mesmo tubo com células tumorais.
Nota: Utilize um tubo cônico estéril de 50 mL se o volume total exceder 15 mL. Calcule sempre mais doses para animais adicionais por grupo de estudo para dar conta da perda de fluido durante o uso da seringa. Por exemplo, se um grupo contiver 5 ratos, faça células suficientes para 6 ou 7 ratos. - Centrifugador em 329 x g por 5 min. descarte o sobrenadante quer aspirando ou pipetando.
- Reressuscite células em 50 μL por mouse para modelo UCC ou 10 μL por mouse para modelo CRC em mídia RPMI completa. Mantenha a suspensão celular no gelo até estar pronto para uso.
7. modelo do rato de UCC
- Preparação de camundongos para o procedimento
- Obtenha seis a oito semanas de idade fêmea NOD/SCID mouse. Raspar as costas do mouse usando creme de depilação. Anestesie o camundongo em uma câmara de indução com isoflurano (2,5% em 100% de oxigênio, 1 L/min).
- Uma vez sedado, coloque o mouse em posição supina com seu focinho em um cone de nariz isoflurano e Bare back firmemente fundamentada em um eletrodo dispersivo.
Nota: o rato está completamente sedado se não responder à pinça do dedo.
- Instill pilhas de UCC preparadas na etapa 6,9 à bexiga usando um angiocatheter (Figura 1Aa, AB).
- Configurar uma máquina monopolar do eletrocautério e ajustar-se a uma potência de 4 W. lubrific um angiocatheter estéril de 24 G com geléia de lubrificação e a inserção através da uretra do rato fêmea.
Nota: ligeira resistência pode ser sentida. Empurre delicadamente para a frente ou remova o angiocatheter e repita-o. Não force. Se o cateter se dobrar na entrada, insira um fio-guia estéril (ver 7.2.2) no meio do cateter para proporcionar estabilidade. - Introduza totalmente o 0, 25 "fio de guia reto do núcleo fixo 1 milímetro após a extremidade do angiocatheter.
Nota: o fio é marcado com fita adesiva antes do procedimento para indicar o ponto de parada de 1 mm e garantir a consistência. - Segure o pino monopolar para o fio guia para 1 s permitindo a irritação elétrica da mucosa da bexiga.
- Fixe um angiocatheter estéril fresco à seringa do Luer-Lok de 1 centímetro cúbico e elabore 200 μL de pilhas coletadas da etapa 6,9.
Nota: pelo menos 100 μL é perdido do angiocatheter à seringa. Compensar o volume de perda ao calcular o volume de suspensão celular necessária. - Remova o fio guia e o angiocatheter da uretra do rato. Introduza o angiocatheter com a seringa das pilhas anexadas na uretra.
Nota: avanço deve ser mais fácil do que antes. - Instill 50 μL das pilhas à bexiga do rato. Aguarde alguns segundos antes de remover o angiocatheter para permitir que as células aderem à parede da bexiga.
Nota: as células permanecem na bexiga e se desenvolvem em um tumor primário.
- Configurar uma máquina monopolar do eletrocautério e ajustar-se a uma potência de 4 W. lubrific um angiocatheter estéril de 24 G com geléia de lubrificação e a inserção através da uretra do rato fêmea.
- Remova o rato do cone do nariz do isoflurano e da almofada de aterramento. Observe o mouse para 1 h após o procedimento. Procure sinais da aflição, isto é, para trás curvado, respiração trabalhada, etc.
8. modelo de mouse CRC
- Anestesiar o aceno masculino de seis a oito semanas de idade/camundongo com isoflurano (2,5% em 100% de oxigênio, 1 L/min) na câmara de indução. Confirme a sedação com uma pitada de dedo.
- Coloc o rato anestesiado na posição supina um microscópio de dissecação, certificando-se fixar seu focinho a um cone de nariz do isoflurano e fixar seus membros dianteiros com a fita para a estabilidade.
Nota: as lupas podem ser utilizadas em vez de um microscópio de dissecação. Um objeto pequeno pode ser usado para melhorar a visibilidade e o ângulo quando coloc a base da cauda, elevando o ânus. Tipicamente, as seções pequenas da gaze são roladas em uma forma do cilindro do diâmetro de 1 polegada. - Dilatar o canal anal com curvo fórceps com ponta romba lubrificada para expor a mucosa anal e retal distal. Retire as fezes.
- Use uma agulha removível estéril de 30 G em uma seringa de vidro de 50 μL para injetar 10 μL de pilhas do tumor e da HK (da etapa 6,9) na submucosa rectal do posterior longe do ponto de origem 1 a 2 milímetros acima do canal anal. O chanfro da agulha deve ser coberto por mucosa. Tenha cuidado para não passar para a cavidade pélvica.
- Remova o rato do cone do nariz do isoflurano. Observe o mouse para 1 h após o procedimento. Procure sinais da aflição, isto é, para trás curvado, respiração trabalhada, etc.
9. imagem bioluminescente
- Monitore o tumor preliminar, o fígado, e a carga metastática do pulmão semanalmente usando um sistema bioluminescente da imagem latente para a atividade do luciferase.
- Obter um mouse de experimento UCC ou CRC e pesar. Injete 150 mg/kg de luciferina intraperitonealmente e aguarde 5 min para que o substrato circule no corpo do rato.
- Anestesie o rato com 2,5% de isoflurano em 100% de oxigénio, 1 L/min na câmara de indução.
- Coloc o rato na máquina da imagem latente de BLI com o nariz reparado no nosecone. Ao expor para a imagem, certifique-se de que a área de interesse está enfrentando a câmera. Para a injeção de UCC e CRC, o lado ventral deve enfrentar a câmera para cada imagem. Rato da imagem na posição supina.
10. colheita de órgãos e tumores
- Quando o Radiance primário da luminescência do tumor alcança 1 x 1011 fótons ou se os ratos exibem sinais da aflição (isto é, perda de peso, parte traseira curvado, respiração áspera/trabalhada, etc.), eutaniza ratos pela inalação do co2 (como na etapa 5.2.1) após o luciferina injeção e imagem de corpo inteiro.
- Remova o fígado e o pulmão, coloc em uma placa de Petri e na imagem para identificar todas as metástases. Remova o tumor, pesar e imagem. Fixar órgãos e tumores em formalina tamponada neutra de 10% para 48 h à temperatura ambiente.
Nota: Limpe/limpe tesouras e fórceps entre cada órgão para evitar a transferência do tecido.
11. avaliação histológica
- Incorporar os tecidos fixos de formalina em parafina e fatiar os tecidos a 5 μm de espessura em um micrótomo para coloração de hematoxilina e eosina (H & e) e imunoistoquímica (IHC).
Nota: toda a coloração de H & E de lâminas de parafina foi feita no laboratório de patologia do sistema de saúde de OCHSNER, e todas as manchas de IHC neste papel foram executadas em um laboratório de pesquisa do sistema de saúde de OCHSNER após a recuperação do antígeno de alta temperatura usando o 67 e os anticorpos Cytokeratin 20, seguidos pelo anticorpo secundário biotinylated, e os complexos da avidina-biotina-peroxidase de acordo com instruções do fabricante13,14.
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Representative Results
No modelo PDOX da UCC, as células BlCaPt15 ou BlCaPt37 do UCC foram intravesicamente (IB) instiladas na presença de células de HK na bexiga de rato NOD/SCID feminina (Figura 1a). Vinte e cinco em trinta (83,3%) os animais geraram tumores primários e apresentavam crescimento do tumor primário dependente do tempo com base na bli semanal (Figura 1b, C e tabela 1). Da mesma forma, no modelo CRC PDOX, 31 de 32 (96,9%) os ratos cresceram o tumor preliminar quando intra-rectally (IR) injetado com as pilhas do CoCaPt155 ou do CoCaPt302 dos pacientes mais as pilhas da HK (Figura 1D-F e tabela 1). Dependendo do tumor do paciente, o crescimento tumoral do camundongo teve um período de latência diferente, o que reflete a diferença nas características clínicas do paciente (Figura 1C, F).
Em ambos os modelos IB e IR, a injeção de células tumorais não só gerou tumores primários ortotópicas (Figura 2a, B, setas azuis), mas muitos camundongos testados também desenvolveram metástases hepáticas e/ou pulmonares. Em 10 de 30 (33,3%) e 17 em 32 (53,1%) camundongos instilados com células UCC e células CRC com células de HK, respectivamente, detectamos metástase de órgãos distantes via ex vivo BLI (Figura 2a,B e tabela 1).
Para confirmar a morfologia similar do tecido, a coloração de H & e e de IHC foi executada comparando xenoenxertos e tumores pacientes preliminares. A histopatologia da carcinoma da bexiga paciente foi mantida nos xenoenxertos de BlCaPt15 e de BlCaPt37 (Figura 3a). Os resultados mostram o tumor do xenograft que corresponde ao teste padrão de crescimento invasor do músculo dos pacientes ' tumores preliminares. O anticorpo específico ao marcador humano da proliferação de pilha 67 foi usado em IHC. A mancha nuclear positiva de 67 indica as pilhas humanas altamente proliferativas, rápido-crescentes do tumor. Os resultados de coloração de xenoenxertos foram semelhantes aos das biópsias cirúrgicas originais. Da mesma forma, no modelo IR, a coloração de H & e indica a similaridade da arquitetura entre os xenoenxertos e os tumores de pacientes de ambos CoCaPt155 e CoCaPt302. O IHC que usa o anticorpo de encontro ao Cytokeratin 20 igualmente mostrou o teste padrão similar do crescimento do tumor em ambos os modelos de PDOX (Figura 3B). Assim, nosso modelo de PDOX recapitulou a progressão clínica paciente de UCC e de CRC.
Figura 1: modelos de mouse Orthotopic UCC e CRC. (A-C) Instilação intra-vesicle (IB) de pilhas de UCC na bexiga do rato13. (AA) Um angiocatheter foi introduzido na bexiga de um rato fêmea de Nod/scid e um choque do eletrocautério foi aplicado à parede da bexiga através de um fio de guia. (AB) Luciferase marcou pilhas do tumor de UCC, BlCaPt15 (2 x 104 pilhas), ou BlCaPt37 (5 x 105 pilhas) com a adição de 3 x 105 pilhas da HK de stromal do ln, foram INCUTIDOS na bexiga do rato de Nod/scid através do angiocatheter. (D-F) Injeção intra-rectal (IR) de pilhas de CRC na camada submucosal do tecido do recto17do rato. (D) o canal anal foi dilatado com pinça com ponta de corte lubrificada para permitir o acesso à mucosa anal e retal distal e uma agulha de 30 G foi inserida na submucosa retal posterior distal 1 − 2 mm acima do canal anal até que o chanfro fosse coberto antes a injeção ocorra. Luciferase marcou células tumorais CRC, CoCaPt155 (5 x 105 células), ou CoCaPt302 (1 x 104 células) com a adição de 3 x 105 células de HK foram injetadas. A carga tumoral foi monitorada e quantificada via imagem bioluminescente (BLI; B e e). O crescimento tumoral da luciferase marcou células UCC ou CRC foi monitorado kineticamente via BLI e analisado utilizando o software de análise de imagem (C e F). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: os modelos de PDOX produzem metástases distantes espontâneas do órgão. Camundongos representativos (painéis superiores) dos mesmos experimentos que na Figura 1, por exemplo, instilados intra-vesicamente com luciferase etiquetadas células tumorais UCC, células BlCaPt15 ou BlCaPt37 com células de HK (A) ou intra-retal com LUCIFERASE Tagged tumor CRC células, células CoCaPt155 ou CoCaPt302 com células de HK (B) são mostradas. As setas amarelas indicam A bexiga do rato (A). As fotos tiradas no momento do sacrifício indicam a formação ortotópica do tumor (setas azuis). O fígado, o pulmão, e o tumor (painéis médios) coletaram no necropsia e em seu ex vivo bli (os painéis inferiores) mostraram a metástase do fígado e do pulmão do rato assim como o tumor com atividade do luciferase. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: tumores de Xenoenxerto assemelham-se a tumores de pré-implante. O tecido de tumor embebido em parafina do tumor ou dos tumores pacientes coletados dos ratos nos mesmos experimentos que na Figura 1 foram seccionados e corados por H & e (a e B) ou IHC com anticorpos contra o humano 67 (a) ou citoqueratina 20 (CK20; B). a cor marrom indica coloração positiva. A coloração deH & E mostra ninhos tumorais dissecando em feixes musculares lisos (A). As fotografias foram tiradas utilizando-se um microscópio de desvoltinha digital e analisadas com um software de análise de imagem. Barras de escala: 100 μm. Todas as imagens foram tiradas em ampliação original de 200 ×. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Implante tumoral (%) | Metástase pulmonar/hepática (%) | Mortalidade (%) | |
| UCC, n = 30 | 83,3 | 33,3 | 0 |
| CRC, n = 32 | 96,9 | 53,1 | 0 |
Tabela 1: Resumo da formação tumoral, metástase e mortalidade em modelos IB e IR.
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Discussion
A doença metastática é responsável para a maioria de mortalidades pacientes do cancro. Em testes terapêuticos pré-clínicos, é crucial estabelecer modelos do rato que mais pròxima emular o crescimento humano do tumor com metástases distantes espontâneas do órgão. Usando modelos murinos com células cancerosas derivadas do tumor paciente implantado (xenoenxertos) permite uma melhor compreensão da biologia tumoral e biomarcadores preditivos, bem como testes e predição de efeitos antineoplásicos de novas terapias18. Muitos modelos têm sido usados para mostrar metástases de UCC e CRC em experimentos murinos, como injeções intravenosas de veia cauda, mostrando a capacidade de produzir doença pulmonar19 ou implante subcutâneo de células tumorais ou fragmentos tumorais no flanco para crescimento localizado20,21do tumor. Um laboratório relatou previamente um modelo murino do cancro da bexiga usando tratamentos do ácido clorídrico para promover com sucesso a captação do tumor22. Quando estes métodos produzem o crescimento local de confiança e podem demonstrar algumas atividades metastáticas, não se assemelham especificamente ao curso natural do cancro desenvolvido nos seres humanos e não utilizam o mecanismo metastático visto nos pacientes18, a 23. Outros modelos murino foram relatados para imitar o crescimento do tumor injetando pilhas do tumor diretamente em órgãos tais como o fígado ou o mesentery, mas carreg riscos do escapamento da pilha do tumor e não produziu metástases significativas.
Nós temos demonstrado previamente a correlação entre o índice da pilha do cancro no tumor preliminar e o envolvimento24 do ln e o papel da interação do stromal da pilha de cancro/LN no curso da progressão preliminar do tumor à doença metastática10 , 12 anos de , 17. incorporando nosso trabalho anterior sobre a influência do microambiente ESTROMAL do ln na progressão metastática, estabelecemos modelos ortotópicos (especialmente os modelos pdox) que imitam o curso natural de disseminação metastática, são Tecnicamente reprodutível, preservar a heterogeneidade dos tumores do paciente original, e gerar o tumor preliminar consistente e os resultados metastáticos12,13,17. Usar os efeitos de realce do tumor do microambiente stromal de LN é importante porque fornece um microambiente similar do tumor no UCC humano e no CRC, desenvolve todas as etapas na cascata metastática, reduz o número de pilha do cancro exigido no modelo do rato que minimiza o número de passagens do xenograft, e conduz a um modelo de confiança que imita pròxima o crescimento e as metástases do tumor no ser humano.
Nós estabelecemos um método único de electro-estimulação IB usando a coinstilação de células de HK que produz um modelo confiável para o desenvolvimento de MIUCC. Nosso modelo imita o curso natural da progressão do UCC pela implantação do tumor que começa na mucosa, conduzindo no músculo, então se por metástese aos pulmões13.
Nossos resultados também mostram que o modelo de infravermelho é seguro, reprodutível e bem-sucedido. O modelo transplantação orthotopic do do rato de CRC caracteriza o crescimento preliminar do tumor e a metástase distante espontânea12,17. O procedimento de IR é rápido, fácil de aprender, tecnicamente fácil de executar, e não muito estressante sobre os animais. Os grupos IB e IR apresentaram mortalidade zero (tabela 1) no período pós-operatório antes da mensuração final da bli. No entanto, a técnica requer prática. Se a injeção intrarretal for bem-sucedida, deve haver uma "bolha" visível que se forma como o fluido é introduzido na submucosa retal e resultará em crescimento primário do tumor que acabará por se tornar palpável, como mostrado na Figura 1. Se o tumor foi injetado muito profundamente na cavidade pélvica, ele será desanexado ao trato colorretal e cresce muito grande para encher a pélvis, às vezes causando obstrução. Se a injeção é demasiado rasa ou não entra na camada submucosal rectal de todo, vazará para fora tendo por resultado a carga preliminar reduzida ou ausente do tumor.
Estabelecemos modelos PDOX únicos e reprodutíveis para HG-UCC e CRC humanos. Estes modelos permitem estudos da formação e da metástase do tumor. Nós podemos agora usar estes modelos como o método preliminar para continuar a estudar o microambiente stromal de LN e sua interação com os tumores preliminares pacientes. Esses modelos também nos permitirão investigar terapias que interferem com os efeitos pró-tumorigênicos do LNSC no tumor primário. Com estes modelos, o teste de drogas terapêuticas novas pode ser executado eficientemente e em maneiras clìnica-mimmetic.
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Disclosures
Este estudo foi parcialmente apoiado pela iniciativa de pesquisa de medicina translacional OCHSNER Grant 2014. Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller e Shannon McChesney, que ajudaram a iniciar esses estudos por seu excelente suporte técnico. Os autores também agradecem a Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar e Maria Latsis por assistência em pacientes que consentem e que fornecem espécimes tumorais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
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