Summary
Bu protokol, yüksek dereceli ürosityal Hücre Karsinomu hücrelerinin intra-vesically instilling veya intra-rektal enjekte kolorektal kanser hücreleri olmayan obez diyabetik/şiddetli kombine tarafından hasta türeyen ortootopik xenograft modellerinin oluşturulması açıklanmaktadır immüneksikliği (NOD/SCıD) primer tümör büyümesi için fareler ve lenf nodu stromal hücrelerin etkisi altında spontan metastaz, hangi insan metastatik hastalıkların ilerlemesini taklit.
Abstract
Kanser hastaları, mesane ve kolorektal kanseri (CRC) hem yüksek dereceli ürosityal Hücre Karsinomu (HG-UCC) içinde lenf nodu (LN) tutulumu olduğunda kötü prognostiklere sahiptir. Kas-invaziv UCC olan hastaların% 50 ' den fazla, klinik lokalize hastalık için küratif tedaviye rağmen, metastaz geliştirmek ve 5 yıl içinde ölmek, ve metastatik CRC ABD 'de kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir. Hastalarında sürekli olarak UCC ve CRC metasrik taklit eden xenograft modelleri gereklidir. Bu çalışmada primer tümör büyümesi için UCC ve CRC 'nin hasta türevi ortootopik xenograft (PDOX) modelleri ve LN stromal hücrelerinin etkisi altında spontan metastaz modeli, insan metastatik hastalıklarının ilaç taraması için ilerlemesini taklit etmeyi amaçlamaktadır. HG-UCC ve kolorektal adenokarsinoma için rezeksiyon yapılarak, sırasıyla taze UCC ve CRC tümörleri elde edildi. LN stromal Cell (LNSC) Analog HK hücreleri ile ortak inoküle, luciferase-etiketli UCC hücreleri intra-vesically vardı (ıB) kadın olmayan obez diyabetik/şiddetli kombine immünyetmezlik (NOD/SCıD) fareler, ve CRC hücreleri intra-rektik edildi (IR) içine enjekte Erkek NOD/SCıD fareler. Tümör büyümesi ve metassel, Bioluminesans görüntüleme (BLı) kullanılarak haftalık olarak izleniyor. Kurban üzerine, primer tümörler ve fare organları hasat edildi, tartıldı, ve formalin-hematoxylin ve eozin ve immünhistokimya boyama için sabit. Benzersiz PDOX modellerinde, xenograft tümörleri hasta ön implantasyon tümörlerine benzerdir. HK hücrelerinin varlığında, her iki model de BLı ve tümör ağırlıkları ile ölçülen yüksek tümör implantasyon oranları, 83,3% UCC ve% 96,9 CRC için, ve yüksek uzak organ metastaz oranları (% 33,3 tespit karaciğer veya akciğer metastaz için UCC ve% 53,1 CRC için). Buna ek olarak, her iki model yordamdan sıfır mortalite vardır. İnsan HG-UCC ve CRC için benzersiz, tekrarlanabilir PDOX modelleri kurduk, bu da tümör oluşumuna, büyümesini ve metasük çalışmalarına izin verir. Bu modellerde, yeni terapötik ilaçların test edilmesi verimli ve klinik olarak mimetic bir şekilde yapılabilir.
Introduction
Lenf nodu (LN) metastazının, mesane ve kolorektal kanser (CRC)1,2' nin yüksek dereceli ürogariyal Hücre Karsinomu (UCC) dahil olmak üzere birçok katı organ malignitesinde kötü prognostik bir gösterge olduğunu göstermiştir. Kas-invaziv UCC (MıUCC) olan hastaların yarısından fazlası, klinikte lokalize hastalık için küratif tedaviye rağmen, 5 yıl içinde metastanca gelişecek ve ölür. Metastatik CRC ABD 'de kanser ile ilgili ölüm önde gelen nedenidir.
Tahmini 81.190 yeni hastalar ve 17.240 kanser spesifik ölümlerin, ABD 'de, mesane3,4UCC nedeniyle 2018 yılında gerçekleşmesi bekleniyor. Hastalar ağırlıklı olarak (% 70) Kas invazif olmayan hastalık ile mevcut,% 30 MıUCC5olacaktır. Klinikte lokalize hastalık için küratif tedaviye (radikal cystektomi [RC] veya sistemik kemoterapi olmadan) rağmen, mesane MIUCC olan hastaların yarısı hala metasürler geliştirecek ve 5 yıl içinde ölmek3. RC6,7,8' deki hastaların yaklaşık% 20 −% 25 ' inde lenf nodu tutulumu bulunmuştur. LN pozitif hastalarda beş yıllık hayatta kalma oranı, RC 'den sonra bile% 35 ' den az, UCC hastalarında prognoz için önemli bir negatif öngörü olarak LN tutulumu öneriyor.
Kolorektal kanser, Amerika Birleşik Devletleri 'nde hem erkek hem de kadınlarda teşhis edilen üçüncü en yaygın kanserdir. Hastanın sonuçları büyük ölçüde invazyonu, LN tutulumu ve uzak organ metastaz derinliği gibi tümör özelliklerine ve tümör mikroortamına bağlıdır. Tarama ve etkili ameliyatlar nedeniyle son on yılda CRC 'deki mortalite oranı azalsa da, CRC hastalarının yaklaşık% 50 ' si metasrat veya tekrarlayan hastalık9' da gelişecektir.
Küçük hayvan modelleri, tümör progresyonu ve farklı metastatik desenleri incelemek için hızlandırılabilen, tekrarlanabilir ve değiştirilebilir bir platform sağlar. Şu anda, hastalarda görülen CRC ve UCC metasrik olarak taklit edilen xenograft modelleri tanımlanmıştır. Kanser uzak metastaz primer rota lenfatik Spread yoluyla. Yeni araştırma LNs benzersiz bir mikroçevre ile tümörlerin sağlamak ve sadece sadece sabit hedefler nerede kanser hücrelerinin geçmeli geçiş olduğunu göstermektedir, aynı zamanda metastatik süreçte kanser hücreleri ile etkileşim tarafından ayrılmaz bir rol oynar. Gerçekten de, çalışmalarımız, tümör progresyonu ve metastacıları eğitmek ve teşvik etmek yanı sıra, ın stromal mikroçevre da CRC10,11ilaç direnci sorumlu olduğunu keşfetti. Laboratuvarımız son zamanlarda, in stromal hücrelerinin (lnscs) CRC ve uccs üzerinde hasta tarafından türetilen ortootopik xenograft (PDOX) fare modellerini kullanarak tümör etkilerini doğruladı12,13.
PDOX modellerini geliştirmek translasyonel kanser araştırması için önemli bir platform sağlar14,15. PDOX modelleri, donör tümörlerinin temel histolojik ve genetik özelliklerini koruyarak, pasajlar arasında kararlı kalır ve translasyonel kanser araştırması için iyi platformlar yapar12,15. PDOX modelleri preklinik ilaç değerlendirmesi, biyomarker tanımlaması ve klinik sonuçların öngörülerine izin veren kişiselleştirilmiş tıp stratejilerinin preklinik değerlendirilmesi için kullanılmaktadır. Şu anda, LN tutulumunun önemini dikkate alan ve CRC ve UCC 'de primer tümör ve uzak organ metastaz sürekli olarak yeniden üretebilmiyor, açıklanan xenograft modelleri yoktur. Bu çalışmada, ıNSC tutulumu ile metastatik CRC ve UCC hastalıklarının çoğaltılması ile NOD/SCıD farelerinde PDOX modellerinin gelişimini tarif ediyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu hayvan çalışmalarında açıklanan tüm yöntemler, Ochsner sağlık sistemi kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi onaylı yönergeler altında ve hayvan araştırma kurallarına uygun olarak yapılmıştır. Bu çalışmanın tüm hasta tümörleri, Ochsner Health System araştırma Inceleme kurulu ve ınsan üzerindeki kurumsal komite 'nin etik standartlarına uygun olarak kanser rezeksiyon ameliyatı geçiren hastalarından toplanmıştır. Deneme. Ochsner Health System 'de kurulu sertifikalı patologlar, tümör hücrelerinin mikroskobik özelliklerine, histolojik tipine ve sınıf düzeyine dayalı olarak hasta örneklerinin patolojik tanılarını belirledi.
Not: aşağıdaki protokol iki ayrı xenograft modelleri için adımları açıklar, bir UCC modeli bir CRC modelinde çalışma için UCC hücreleri ve CRC hücrelerinin İntrarektal enjeksiyon aşılamak için mesane duvarının electrocoterization üzerinden. Denemeler için hazırlık ve izleme tüm adımlar her iki model için aynıdır, Bölüm 7 ve 8 özellikle UCC instilasyon ve CRC enjeksiyonu için yordamı tarif ederken, sırasıyla.
1. kültür hücresi hatları
- Komple rpmi-1640 orta HK hücreleri Grow 10% fetal sığır serumu ile tamamlayıcı, 2 Nm glutamin, 100 U/ml penisilin G, ve 100 mg/ml streptomisin içinde 37 °c içinde 5% Co2 nemlendirici kuluçk.
Not: HK hücreleri normal insan foliküler dendritik hücreler ve yetiştirilen ve ≤ 15 pasajlar in vitro16için genişletilebilir. - Bir deney hazırlamak için, hücreleri tripsinize.
- Medya kaldırın ve Hank 'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hücrelere 2 mL 1% tripsin ekleyin. 4 dakika boyunca 37 °C ' de% 5 CO2 nemlendirici kuluçte hücreleri geri yerleştirin.
- 10 mL serolojik pipet bağlı bir el pipet yardım kullanarak 15 mL tüp içine çanak hücreleri toplayın. Tam RPMI-1640 orta 8 mL ekleyin.
- 40 μL hücre ve 40 μL tripan mavi bir tek iyi bir 96 kuyu plaka birleştirin. Hemokytometreye 10 μL karışım ekleyin ve canlı hücreleri Sayın. 1.000.000 hücre ekleme 25 mL tam RPMI-1640 orta bir 150 mm Steril doku kültürü-tedavi çanak hücreleri büyümeye devam etmek.
Not: Bu adımda hazırlanan HK hücre süspansiyon enjeksiyon için tümör hücreleri ile karıştırmak için bir saat içinde kullanılmalıdır.
2. hasta numune toplama
- Rezeksiyon ameliyatında 15 (BlCaPt15, pT3b N1 M0) ve 37 (BlCaPt37, pT3b pN0 M0) hastadan UCC tümörlerinin toplanması.
- Rezeksiyon ameliyatında (CoCaPt155, T1 N0 M0) ve 302 (CoCaPt302, T1 N0 M0) tarafından onaylı hasta 155 CRC tümörlerinin toplanması.
3. hasta tümörünün genişlemesi
- Penikilin G (500 U/mL) ve streptomisin (500 mg/mL) içeren soğuk steril McCoy 'un ortamında cerrahide tümör toplayın.
- Implant tümörleri 6 − 8 haftalık kadın NOD/SCıD farelerinin sol ve sağ kanadına doğrudan girer.
- Küçük cerrahi makas kullanarak küçük parçalar halinde mekanik olarak kıyma dokular (~ 1 mm3).
- 13 G kemik iliği aspirasyon biyopsi iğneleri kullanarak sol ve sağ kanatta subkutan Implant dokusu.
Not: 8 mm3 toplam hacmi, kanat her iki tarafına eşit bölünmüştür.
4. etiketleme ve Lusiferaz etiketli tümörlerin zenginleştirme
- Ölçüm tümör büyüme iki haftalık bir dijital Kaliper kullanarak.
- Çapı 1 cm, tümör transduce. Doğrudan tek doz Luc/kırmızı floresan protein (RFP)-Lentivirus (50 μL/tümör, 1:30 seyreltme konsantre yüksek titresi Lentivirus stokta) ile tümör içine enjekte 1 cc şırınga ile 27 G iğne.
Not: hasta tümörü genellikle 1 − 2 ayda 1 cm çapına ulaşır. Ancak, büyüme oranı son derece değişken ve tümör derecesi ve türü dahil olmak üzere bir dizi faktörlere dayanmaktadır. - Canlı hayvanlarda Bioluminesans görüntüleme (BLı) ile haftalık tümör izleyin.
- Fareleri tartın. 150 mg/kg lusiferin intraperitoneal ile bilinçli fare enjekte ve fare vücudunda dolaşmak için substrat için 5 dakika bekleyin.
- % 100 oksijen, 1 L/min bir indüksiyon odasında 2,5% izofluran ile fareyi anestezize.
- Isoflurane akan ve görüntü ile BLı görüntüleme makinesinde mide üzerine fare yerleştirin. Luc/RFP pozitif tümör bölgelerinin (sahte renk biyo-Işıksaçan görüntü) varlığını onaylamak için sıralı görüntüler alın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra kafes geri fare.
5. enzimatik sindirim için tümör uygun bölümünü seçin
- UCC veya CRC prosedürün gününde, Lusiferaz etiketli tümör ile görüntü faresi 4.3.1 − 4.3.3 adımlarla.
Not: subkutan tümör büyümeye zaman uzunluğu tümör büyüme hızına ve deney enjekte edilecek hayvanların planlanan sayısı bağlıdır. - Fare kanadı ve görüntüden hasat tümörü.
- Görüntüleme sonrası CO2 inhalasyon tarafından euthanize fare. CO2 odasına fare yerleştirin, solunum tutuklamaya kadar 1,4 L/dak gaz açın ve 3 dakika boyunca bırakın. Servikal dislocation Ile bu izleyin.
- 70% etanol ile temiz cilt. Doğrudan tümör üzerinde çadır cilt. Cerrahi makas ile cilt küçük bir kesi yapmak. Deri tümörün makası ile ayrı.
- Tümör ve yer steril Petri-çanak çıkarın. Bir görüntüleme makinesinde tüm çanak görüntü.
- Tümör ve yeniden görüntü Lusiferaz pozitif bölümlerde Lusiferaz-negatif bölümler ayırmak için steril makas veya neşter kullanın.
- Sadece en yüksek pozitif tümör parçaları kalana kadar tekrarlayın.
6. tümör enzimatik sindirim
- Laminar akış kaput altında, kıyma Lusiferaz pozitif tümör parçaları (adım 5,4) Steril Cerrahi makas kullanarak olası en küçük parçalara içine ve steril 50 ml konik tüp içine koydu.
Not: en küçük olası parçalara tümör Mincing daha fazla bireysel hücreler verecektir. - 10 ml kolajenaz IV (1,5 mg/ml), 80 μL hyalüronidaz (20 mg/ml) ve 160 μL ile deoksiribonükleaz ı (0,1 mg/ml) için 40 ml HBSS ekleyerek Digest çözümünü hazırlayın. Ters çevirme ile mix çözüm.
- Kıyılmış tümör için 35 − 40 ml Özet çözeltisi ekleyin. 2 saat boyunca sürekli rotasyona sahip 37 °C ' de Inküye.
Not: güçlü bir şekilde inkübasyon boyunca periyodik olarak boru sıkışması tümör doku önlemek için. - Steril 100 μm hücre süzgeci ile tüm sindirimi filtreleyerek enkaz kaldırmak için bir 40 μm hücre süzgeci takip eder. Akışını kaydedin ve enkaz atın.
- 5 dk için 329 x g 'de 20 ml HBSS ve Santrifüjü ekleyerek ücretsiz hücreleri yıkayın 30 ml HBSS 'de süpernatant ve pelletini Pelet aspirate.
- 10 μL hücre çözümünü ve 96 iyi bir plakanın tek bir kuyunda tripan Mavi 90 μL 'i birleştirin. Bir hemacytometer kullanarak canlı hücreleri saymak.
- Transfer 1 x 104 için 1 x 106 tümör hücreleri her fare Için steril bir 15 ml konik tüp. Ekle 3 x 105 HK hücreleri adım 1.2.3 fare başına, tümör hücreleri ile aynı tüp.
Not: toplam hacim 15 mL 'yi aşarsa, steril 50 mL konik tüp kullanın. Her zaman şırınga kullanımı sırasında sıvı kaybı için hesaba çalışma grubu başına ek hayvanlar için daha fazla doz hesaplayın. Örneğin, bir grup 5 fare içeriyorsa, 6 veya 7 fare için yeterli hücre yapın. - 329 x g 'de santrifüjün 5 dakika boyunca santrifüj edilmesi ya da pipetleme ile süpernatant atmak.
- Tam RPMI medyadaki CRC modeli için UCC modeli veya fare başına 10 μL için 50 μL cinsinden hücreleri resuspend. Hücre süspansiyonunu kullanıma hazır olana kadar buzda tutun.
7. UCC fare modeli
- Prosedür için fareler hazırlanması
- Altı-sekiz hafta eski kadın NOD/SCıD fare elde. Saç temizleme kremi kullanarak fareyi alt sırt tıraş. Isoflurane ile bir indüksiyon odasında fare anestezize (% 2,5% 100 oksijen, 1 L/dak).
- Bir kez yatıştırıcı, bir izofluran burun koni ve çıplak arka sıkıca bir Dispersif Elektrot üzerinde topraklı onun burnu ile fitil pozisyonda fare yer.
Not: fare tamamen sakinleştirici Eğer ayak çimdik yanıt vermeyen.
- Adım 6,9, anjeoateter (Şekil 1Aa, AB) kullanarak mesane için hazırlanmış UCC hücreleri.
- Monopolar elektrokoter makine kurmak ve 4 W. bir güç ayarlamak, yağlama jöle ile 24 G steril angiokateter yağlayın ve dişi fare üretra yoluyla yerleştirin.
Not: hafif direnç hissedilebilir. Yavaşça ileri itin veya anjokateter kaldırın ve tekrarlayın. Zorlamayın. Kateter giriş üzerinde bükümler, stabilite sağlamak için kateter içine steril bir kılavuz tel (bkz 7.2.2) yerleştirin. - Tam olarak 0,025 "sabit çekirdek düz kılavuz tel 1 mm angiokateter sonundan geçmiş yerleştirin.
Not: Tel, 1 mm durdurma noktasını belirtmek ve tutarlılık sağlamak için prosedürden önce bantla işaretlenir. - 1 s mesane mukoza elektrik tahrişi için izin için kılavuz tel Monopolar pin tutun.
- 1 cc Luer-Lok şırıngaya taze steril angiokateter takın ve 6,9 adımda toplanan hücrelerin 200 μL 'yi çizin.
Not: en az 100 μL anjeoateter 'dan şırıngaya kaybolur. Gerekli hücre süspansiyonunun hacmini hesaplarken kayıp hacmini telafi etme. - Kılavuz tel ve anjokateter fare üretradan çıkarın. Üretra bağlı hücrelerin şırınga ile anjeoateter ekleyin.
Not: Ilerleme daha önce daha kolay olmalıdır. - 50 μL hücreleri fare mesane için instill. Hücrelerin mesane duvara uymasını sağlamak için angiocatheter çıkarmadan önce birkaç saniye bekleyin.
Not: hücreler mesane içinde kalır ve primer bir tümör içine gelişir.
- Monopolar elektrokoter makine kurmak ve 4 W. bir güç ayarlamak, yağlama jöle ile 24 G steril angiokateter yağlayın ve dişi fare üretra yoluyla yerleştirin.
- Isoflurane burun koni ve topraklama pad fare çıkarın. 1 saat aşağıdaki prosedür için fareyi gözlemleyin. Sıkıntılar, yani, geri hunched, nefes, vb stres belirtileri arayın.
8. CRC fare modeli
- Isoflurane ile altı-sekiz haftalık erkek NOD/SCID fare anestezize (2,5% 100 oksijen, 1 L/dak) indüksiyon odasında. Bir ayak tutam ile sedasyon onaylayın.
- Bir izofluran burun konisi için onların burnu güvenli ve istikrar için teyp ile ön ekstremite güvenliğini sağlamak için emin olmak, bir diseksiyon mikroskop altında sırtüstü pozisyonda anestezize fare yerleştirin.
Not: Diseksiyon mikroskobu yerine Loupes kullanılabilir. Küçük bir nesne, kuyruk tabanına yerleştirildiğinde, anüs yükseltmek görünürlük ve açı geliştirmek için kullanılabilir. Tipik olarak, gazlı bez küçük bölümler 1 inç çapı bir silindir şekli içine haddelenmiş. - Distal anal ve rektal mukoza ortaya çıkarmak için kavisli yağlanmış künt uçlu forseps ile anal kanal dilate. Dışkı çıkarın.
- 50 μL cam şırıngada steril 30 G çıkarılabilir iğne kullanarak 10 μL tümör ve HK hücrelerinin (adım 6,9) distal posterior rektal submukoza 1 ile 2 mm arasında anal kanalın üzerine enjekte edilmesi gerekir. İğne eğim mukoza ile kaplanmıştır. Pelvik boşluğa geçmemeye dikkat edin.
- Isoflurane burun koni fare çıkarın. 1 saat aşağıdaki prosedür için fareyi gözlemleyin. Sıkıntılar, yani, geri hunched, nefes, vb stres belirtileri arayın.
9. Bioluminesans görüntüleme
- Lusiferaz aktivitesi için bir Bioluminesans görüntüleme sistemi kullanarak primer tümör, karaciğer ve akciğer metastatik yükünü haftalık olarak izleyin.
- UCC veya CRC deneyinden bir fare alın ve tartın. Enjekte 150 mg/kg lusiferin intraperitoneal ve fare vücudunda dolaşmak için substrat için 5 dakika bekleyin.
- Anestezize fare ile 2,5% Isoflurane içinde 100% oksijen, 1 L/min indüksiyon odasında.
- Nosecone sabit burun ile BLı görüntüleme makinesinde fare yerleştirin. Görüntü için açığa çıktığında, ilgi alanı kamera karşı karşıya olduğundan emin olun. UCC ve CRC enjeksiyon için, ventral tarafı her görüntü için kamera karşı karşıya olmalıdır. Görüntü fareyi sırtüstü pozisyonda.
10. organ ve tümör toplama
- Primer tümör Luminesans parlaklık ulaştığında 1 x 1011 fotonlar ya da fareler sıkıntı belirtileri Sergi (yani, kilo kaybı, geri hunched, sert/ağır nefes, vb), Co tarafından ötenize fareler2 inhalasyon (olarak adım 5.2.1) sonra lusiferin Enjeksiyon ve tüm vücut görüntüleme.
- Karaciğer ve akciğer çıkarın, bir petri tabak ve görüntü herhangi bir metasatik belirlemek için yer. Tümör, tartım ve görüntü çıkarın. Ortam sıcaklığında 48 h için% 10 nötr tamponlu formalin içinde organ ve tümör düzeltin.
Not: doku transferini önlemek için her organ arasında makas ve forseps temizleyin/silin.
11. histolojik değerlendirme
- Parafin içinde formalin sabit dokulara katıştırın ve hematoksinlin ve eozin (H & E) ve immünhistokimyasal (ıHC) boyama için bir mikrotome 5 μm kalınlıkta dokularda dilim.
Not: parafin slaytlarının tüm H & E boyama Ochsner sağlık sistemi patoloji laboratuarında yapıldı, ve bu yazıda tüm ıHC boyama, Ki67 kullanarak yüksek sıcaklık antijen alımı sonra Ochsner sağlık sistemi araştırma laboratuarında yapıldı ve Sit, 20 antikorlar, biyotinlenmiş ikincil antikor izledi, ve avidin-biotin-peroksidaz kompleksleri üretici talimatlarına göre13,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
UCC PDOX modelinde, UCC hastaları ' BlCaPt15 veya BlCaPt37 hücreleri intra-vesically (ıB), HK hücrelerinin varlığını kadın NOD/SCıD fare mesane (Şekil 1a) içine aşıldı. Yirmi beş dışarı otuz (83,3%) hayvanlar primer tümörlerin oluşturduğu ve haftalık BLI (Şekil 1B, C ve Tablo 1) dayalı zaman bağımlı primer tümör büyümesi gösterilir. Benzer şekilde, CRC PDOX modelinde, 32 ' den 31 ' i (% 96,9) Fareler intra-reksal (IR) hastalar ' CoCaPt155 veya CoCaPt302 hücreleri artı HK hücreleri (Şekil 1D-F ve Tablo 1) enjekte ederken primer tümör büyüdü. Hasta tümörüne bağlı olarak, fare tümörü büyümesini farklı bir gecikme süresi vardı, hangi hastanın klinik özellikleri farkı yansıtan (Şekil 1C, F).
Hem ıB hem de IR modellerinde tümör hücre enjeksiyonu sadece ortootopik primer tümörlerin (Şekil 2a, B, mavi oklar) üretilmesine karşın, birçok fare test edilmiş, karaciğer ve/veya akciğer metastaz da geliştirdi. 30 ' dan 10 ' a (% 33,3) ve 17 dışarı-in 32 (53,1%) farele UCC hücreleri ve HK hücreleriyle birlikte CRC hücreleri ile aşılmış, sırasıyla ex vivo BLı üzerinden uzak organ metastaz tespit (Şekil 2a,B ve Tablo 1).
Benzer doku morfolojisi onaylamak için, H & E ve IHC boyama ksenogreft ve primer hasta tümörlerinin karşılaştırılması yapıldı. Hasta mesane karsinomunun histopatolojisi BlCaPt15 ve BlCaPt37 (Şekil 3A) ' dan ksenogreft 'de sürdürülmüştür. Sonuçlar, hastaların primer tümörlerinin kas invazif büyüme desenine karşılık gelen xenograft tümörü gösterir. IHC 'de insan hücresi proliferasyon işaretleyicisine özgü antikor Ki67 kullanılmıştır. Ki67 pozitif nükleer boyama, yüksek proliferatif, hızlı büyüyen insan tümörü hücrelerini gösterir. Xenograflar 'ın boyama sonuçları Orijinal cerrahi biyopsilerin benzeridir. Benzer şekilde, IR modelinde H & E boyama, ksenogreft ve CoCaPt155 ve CoCaPt302 hasta tümörlerinin arasındaki mimarinin benzerliğini gösterir. PDOX modellerine karşı antikor kullanan ıHC 20 de benzer tümör büyüme deseni gösterdi (Şekil 3B). Bu nedenle, PDOX modelimiz UCC ve CRC hasta klinik ilerlemesini geri aldı.
Şekil 1: Ortotopik UCC ve CRC fare modelleri. (A-C) UCC hücrelerinde fare mesane içine vesikül (ıB) instıtasyon13. (AA) Bir dişi NOD/SCıD faresinin mesane içine bir anjeoateter takılmış ve bir kılavuz tel ile mesane duvara bir elektroautery şok uygulandı. (AB) Luciferase etiketli UCC tümör hücreleri, BlCaPt15 (2 x 104 hücreler), veya BlCaPt37 (5 x 105 hücreler) ilavesi ile 3 x 105 LN stromal HK hücreleri, ANJIOKATETER aracılığıyla nod/SCID fare mesane içine eğilerek. (D-F) Submukozal doku katmanına CRC hücrelerinin Intra-rektal (IR) enjeksiyonu, fare rektum17. (D) Anal kanal distal Anal ve rektal mukoza erişim sağlamak için yağlanmış künt uçlu forseps ile genişlemis ve 30 G iğne distal posterior rektal submukoza yerleştirilen 1 − 2 mm anal kanalın üzerinde eğim önce kaplanmıştır kadar Enjeksiyon gerçekleşir. Luciferase etiketli CRC tümör hücreleri, CoCaPt155 (5 x 105 hücreler), veya CoCaPt302 (1 x 104 hücreler) ilavesi ile 3 x 105 HK hücreler enjekte edildi. Tümör yükü izlenen ve Bioluminesans görüntüleme yoluyla nicelik (BLı; B ve E). Lusiferaz tarafından işaretlenmiş UCC veya CRC hücrelerinin tümör büyümesi BLI üzerinden kinetik olarak izleniyor ve görüntü analiz yazılımı (C ve F) kullanılarak incelendi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: PDOX modelleri spontan uzak organ metastazı üretir. Temsilci fareler (üst paneller) aynı deneylerden Şekil 1, örneğin, intra-vesically ile Lusiferaz etiketli UCC tümör hücreleri, BlCaPt15 veya BlCaPt37 hücreleri ile HK hücreleri (A) veya intra-reksal ile Lusiferaz etiketli CRC tümör hücre, CoCaPt155 veya CoCaPt302 hücreleri ile HK hücreleri (B) gösterilir. Sarı oklar fare mesane (A) gösterir. Kurban sırasında çekilen fotoğraflar Ortotopik tümör oluşumu (mavi oklar) gösterir. Karaciğer, akciğer ve tümör (orta paneller) otopsi ve onların ex vivo BLI (alt paneller) toplanan fare karaciğer ve akciğer metastaz yanı sıra Lusiferaz aktivite ile tümör gösterdi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: xenograft tümörleri hastaya implantasyon öncesi tümörlere benzer. Şekil 1 ' de olduğu gibi aynı deneylerde farelerden toplanan hasta tümörü veya tümörlerden parafin gömülü tümör dokusu, insan Ki67 (a) veya sitanatin karşı antikorlar ile H & E (a ve B) veya IFC tarafından kesilmiştir ve lekelenirdi 20 (CK20; B). kahverengi renk pozitif boyama gösterir. H & E boyama, düz kas demetleri (A) içine diseksiyon tümör yuvaları gösterir. Fotoğraf dijital deconvoluting mikroskop kullanılarak çekildi ve bir görüntü analiz yazılımı ile analiz edildi. Ölçek çubukları: 100 μm. Tüm görüntüler 200 Orijinal büyütme alınmıştır ×. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Tümör implantı (%) | Akciğer/karaciğer metasatik (%) | Mortalite (%) | |
| UCC, n = 30 | 83,3 | 33,3 | 0 |
| CRC, n = 32 | 96,9 | 53,1 | 0 |
Tablo 1: ıB ve IR modellerinde tümör oluşumu, metastam ve mortalitenin Özeti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metastatik hastalık çoğu kanser hastası mortaliteleri için sorumludur. Klinik öncesi terapötik testlerde, insan tümörü büyümesini spontan uzak organ metastazı ile en yakından taklit eden fare modelleri kurmak çok önemlidir. İmplante edilen hasta tümörü ile duvar modellerini kullanarak kanser hücreleri türetilmiştir (xenografts) tümör biyoloji ve öngörü biyolojik daha iyi bir anlayış yanı sıra test ve yeni tedaviler Antineoplastik etkileri tahmin sağlar18. Bir çok model, akciğer hastalığı üretmek için yeteneği gösteren intravenöz kuyruk ven enjeksiyonları gibi murine deneylerinde UCC ve CRC metastaşları göstermek için kullanılmıştır19 veya tümör hücrelerinin subkutan implantasyon veya yan içine tümör parçaları lokalize tümör büyümesi20,21. Bir laboratuar daha önce tümör alımı22başarıyla teşvik hidroklorik asit tedavileri kullanarak bir mesane kanseri murine modeli bildirdi. Bu yöntemler güvenilir yerel büyüme üretmek ve bazı metastatik faaliyetler gösterebilir iken, özellikle insanlarda geliştirilen kanserin doğal seyrini benzer değildir ve hastalarda görülen metastatik mekanizma kullanmayın18, 23 yaşında. Diğer duvar modelleri, tümör hücrelerini doğrudan karaciğer veya mezentery gibi organlara enjekte ederek tümör büyümesini taklit etmek için bildirilmiştir, ancak tümör hücresi kaçağı riskleri taşıdılar ve önemli metastaz üretmedi.
Daha önce primer tümör ve LN katılımı24 kanser hücresi içeriği arasındaki korelasyon ve metastatik hastalığa primer tümör ilerlemesi sırasında kanser hücresinin/in stromal etkileşiminin rolünü göstermiştir10 , 12 tane , 17. bir önceki ÇALıŞMAYı, LN stromal mikroortamının metastatik progresyonunda etkisi ile birleştiren, metastatik dağılma doğal seyrini taklit eden ortootopik modelleri (özellikle PDOX modelleri) kurduk, Teknik olarak reproducible, orijinal hasta tümörlerinin heterojenliğini koruyun ve tutarlı primer tümör ve metastatik sonuçlar12,13,17oluşturur. LN stromal mikroortamın tümör arttırıcı etkilerinin kullanılması önemlidir, çünkü insan UCC ve CRC 'de benzer bir tümör mikroortamı sağlar, metastatik çağdaki tüm adımları geliştirir, fare modelinde gerekli olan kanser hücre numarasını azaltır xenograft pasajlar sayısını en aza indirir ve insan içinde tümör büyümesini ve metastikleri yakından taklit eden güvenilir bir modele neden olur.
Biz MıUCC geliştirmek için güvenilir bir model üreten HK hücrelerin Co-instilasyon kullanarak ıB elektro-stimülasyon benzersiz bir yöntem kurduk. Modelimiz, mukozada başlayan tümör implantasyonu ile UCC ilerlemesinin doğal seyrini taklit eder, kas içine dönüşür, sonra akciğere metasürleştiriyor13.
Sonuçlarımız Ayrıca IR modelinin güvenli, tekrarlanabilir ve başarılı olduğunu da göstermektedir. Ortootopik CRC Mouse modeli primer tümör büyümesi ve spontan uzak metastaz12,17' ye sahiptir. IR prosedürü hızlı, öğrenmek kolay, teknik olarak gerçekleştirmek için kolay ve çok hayvanlar üzerinde stresli değil. IB ve IR grupları, son BLı ölçümü öncesinde postoperatif dönemde sıfır mortalite (Tablo 1) vardı. Ancak, teknik uygulama gerektirir. İntrarektal enjeksiyonu başarılı olursa, sıvı rektal submukoza içine tanıtılan ve sonunda Şekil 1' de gösterildiği gibi palpe olacak primer tümör büyümesini neden olacak görünür bir "kabarcık" olmalıdır. Tümör pelvik boşluğa çok derin enjekte edilirse, kolorektal yol ile doldurulacaktır ve pelvis doldurmak için çok büyük büyür, bazen tıkanmaya neden olur. Enjeksiyon çok sığ veya rektal submukozal tabaka hiç girmezse, düşük veya eksik primer tümör yükü ile sonuçlanan sızıntı olacaktır.
İnsan HG-UCC ve CRC için benzersiz, tekrarlanabilir PDOX modelleri kurduk. Bu modeller tümör oluşumu ve metastam çalışmaları için izin verir. Şimdi bu modelleri, LN stromal mikroçevre ve hasta primer tümörlerle etkileşimi çalışmaya devam etmek için birincil yöntem olarak kullanabilirsiniz. Bu modeller aynı zamanda primer tümör üzerinde LNSC 'nin yanlısı-tümörorjenik etkilere müdahale eden terapileri araştırmamıza izin verecektir. Bu modeller ile, yeni terapötik ilaçların test verimli ve klinik-mimetic tavırları yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu çalışmada, Ochsner translasyonel Tıp araştırma girişimi Grant 2014 tarafından kısmen desteklenmektedir. Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.
Acknowledgments
Yazarlar Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller, ve Shannon McChesney onların mükemmel teknik destek için bu çalışmaları başlatmak için yardımcı teşekkür ederiz. Yazarlar da Heather yeşil Matrana, Margaret Variano, Sunil taşa, ve Maria Latsis yardım için hasta ve tümör numuneleri sağlamak için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
- Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer--prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
- Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
- National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Bladder Cancer. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/urinb.html (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
- Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
- Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
- Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, discussion 764-755 758-764 (1993).
- Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
- National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2017).
- Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
- Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
- Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
- Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
- Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
- Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
- Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
- Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
- Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
- Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).
