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Neuroscience

Gesichtsnervenchirurgie im Rattenmodell zur Untersuchung der axonalen Hemmung und Regeneration

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/59224

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen reproduzierbaren Ansatz zur Gesichtsnervenchirurgie im Rattenmodell, einschließlich Beschreibungen verschiedener induzierbarer Verletzungsmuster.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt konsistente und reproduzierbare Methoden zur Untersuchung der axonalen Regeneration und Hemmung in einem Modell für Die Nervenverletzungen der Ratte. Der Gesichtsnerv kann über seine gesamte Länge, vom intrakraniellen Segment bis zu seinem extratemporalen Verlauf, manipuliert werden. Es gibt drei primäre Arten von Nervenverletzungen, die für die experimentelle Untersuchung von regenerativen Eigenschaften verwendet werden: Nervenzerkleinerung, Transektion und Nervenspalt. Die Bandbreite der möglichen Interventionen ist riesig, einschließlich chirurgischer Manipulation des Nervs, Lieferung von neuroaktiven Reagenzien oder Zellen, und entweder zentrale oder Endorgan-Manipulationen. Zu den Vorteilen dieses Modells für die Untersuchung der Nervenregeneration gehören Einfachheit, Reproduzierbarkeit, Konsistenz zwischen Denspezies, zuverlässige Überlebensraten der Ratte und eine erhöhte anatomische Größe im Vergleich zu murinen Modellen. Seine Einschränkungen beinhalten eine begrenztere genetische Manipulation im Vergleich zum Mausmodell und die regenerationsliche Fähigkeit der Ratte, so dass der Gesichtsnervenforscher die Zeitpunkte für die Genesung sorgfältig bewerten muss und ob Ergebnisse in höhere Tiere und Studien am Menschen übersetzt werden sollen. Das Rattenmodell für Gesichtsnervenverletzungen ermöglicht funktionelle, elektrophysiologische und histomorphometrische Parameter für die Interpretation und den Vergleich der Nervenregeneration. Damit bietet es ein enormes Potenzial, das Verständnis und die Behandlung der verheerenden Folgen von Gesichtsnervenverletzungen bei menschlichen Patienten zu fördern.

Introduction

Cranial-Nervenverletzungen im Kopf- und Nackenbereich können sekundär zu angeborenen, infektiösen, idiopathischen, iatrogenen, traumatischen, neurologischen, onkologischen oder systemischen Ätiologien1sein. Der Hirnnerv VII, oder der Gesichtsnerv, ist häufig betroffen. Die Inzidenz von Gesichtsnerven dysfunktion kann signifikant sein, da es betrifft 20 bis 30 pro 100.000 Menschen jedes Jahr2. Die wichtigsten motorischen Zweige des Gesichtsnervs sind die zeitlichen, zygomatischen, bukkalen, marginalen Unterkiefer- und Zervixzweige; Je nach beteiligtem Zweig können die Folgen orale Inkompetenz oder Trunkenheit, Hornhauttrockenheit, Gesichtsfeldverstopfung sekundär zu Ptosis, Dysarthrie oder Gesichtsasymmetrie2,,3. Langfristige Morbidität umfasst das Phänomen der Synkinese, oder unfreiwillige Bewegung einer Gesichtsmuskelgruppe, mit versuchter freiwilliger Kontraktion einer ausgeprägten Gesichtsmuskelgruppe. Okulare-orale Synkinese ist die häufigste der aberranten Regeneration als Fortsetzung der Gesichtsnervenverletzung und verursacht funktionelle Beeinträchtigung, Peinlichkeit, vermindertes Selbstwertgefühl und schlechte Lebensqualität3. Die Verletzung einzelner Zweige bestimmt die Funktionen, die selektiv kompromittiert werden.

Die klinische Behandlung von Gesichtsnervenverletzungen ist nicht gut standardisiert und bedarf weiterer Forschung, um die Ergebnisse zu verbessern. Steroide können akute Schwellung des Gesichtsnervs lindern, während Botox für die befristeung synkinetischer Bewegungen nützlich ist; aber, die primären rekonstruktiven Optionen in der Bewaffnung des Praktikers beinhalten chirurgische Intervention durch Nervenreparatur, Substitution oder Reanimation3,4,5,6. Je nach Art der erlittenen Gesichtsnervenverletzung kann der Gesichtsnervenchirurg eine Reihe von Optionen nutzen. Für eine einfache Transektion ist Nervenreanastomose nützlich, während die Reparatur von Kabeltransplantaten besser für einen Nervendefekt geeignet ist; für eine Wiederherstellung der Funktion kann der Chirurg entweder statische oder dynamische Gesichtsreanimationsverfahren wählen. In vielen Fällen von Gesichtsnervenverletzungen und anschließender Reparatur, auch in den Händen erfahrener Gesichtsnervenchirurgen, führt das beste Ergebnis immer noch zu anhaltender Gesichtsasymmetrie und funktionellem Kompromiss7.

Diese suboptimalen Ergebnisse haben umfangreiche Forschung über die Regeneration der Gesichtsnerven angespornt. Zu den allgemeinen Themen von Interesse gehören die Perfektionierung und Innovierung von Nervenreparaturtechniken, die Bestimmung der Wirkung verschiedener Nervenregenerationsfaktoren und die Bewertung des Potenzials spezifischer neuronaler Inhibitoren zur Bekämpfung des langfristigen Ergebnisses der Synkinese8,9,10,11. Während In-vitro-Modelle verwendet werden können, um einige Merkmale von Wachstums- oder Hemmfaktoren zu bewerten, lässt sich eine echte translationale Forschung zu diesem Thema am besten über übersetzbare Tiermodelle ablesen.

Die Entscheidung, welches Tiermodell verwendet werden soll, kann eine Herausforderung sein, da Forscher sowohl große Tiere wie Schafe als auch Kleintiermodelle wie Mäuse12,13verwendet haben. Während große Tiermodelle eine ideale anatomische Visualisierung bieten, erfordert ihre Verwendung spezielle Ausrüstung und Personal, das nicht leicht oder leicht verfügbar ist. Darüber hinaus könnte die Durchführung einer Studie zum Nachweis der Wirkung sehr kostenprohibitiv sein und möglicherweise nicht im Durchführbarkeitsbereich vieler wissenschaftlicher Zentren liegen. So wird das Kleintiermodell am häufigsten genutzt. Das Mausmodell kann für die Bewertung einer Reihe von Ergebnissen im Zusammenhang mit Gesichtsnervenchirurgie verwendet werden; Die begrenzte Länge des Nervs kann jedoch die Fähigkeit des Wissenschaftlers einschränken, bestimmte Muster zu modellieren, wie z. B. eine Verletzung mit großen Lücken14.

So hat sich der Ratte murin Prototyp als Arbeitspferd-Modell, durch das der Wissenschaftler innovative chirurgische Verfahren durchführen oder hemmende oder wachstumsfördernde Faktoren nutzen und die Wirkung über eine breite Palette von Ergebnisparametern bewerten kann. Die Anatomie der Ratte im Gesichtsnerv wird vorhersehbar und leicht reproduzierbar angegangen. Seine größere Skala, im Vergleich zum Mausmodell, ermöglicht die Modellierung einer breiten Palette von chirurgischen Defekten, von einfachen Transektion bis 5 mm Lücken15,16. Dies ermöglicht ferner die Anwendung komplexer Eingriffe an der Defektstelle, einschließlich der topischen Platzierung von Faktor, intraneuralen Injektionen des Faktors und der Platzierung von Isograften oder Brücken17,18,19,20,21,22,23.

Die gefügige Natur der Ratte, ihre zuverlässige Anatomie und ihre Neigung zur effektiven Nervenregeneration ermöglicht die Sammlung vieler Ergebnismaßnahmen als Reaktion auf die oben genannten chirurgischen Muster der Verletzung24. Über das Rattenmodell ist der Gesichtsnervenforscher in der Lage, elektrophysiologische Reaktionen auf Verletzungen, Nerven- und Muskelhistologische Ergebnisse über Immunhistochemie, funktionelle Ergebnisse über die Verfolgung des Vibrissalpads und die Beurteilung des Augenverschlusses sowie mikro- und makroskopische Veränderungen mittels fluoreszierender oder konfokaler Mikroskopie, unter anderem11,22,23,25,26,27,28,29, zu bewerten. So wird das folgende Protokoll einen chirurgischen Ansatz für den Gesichtsnerv der Ratte und die Verletzungsmuster skizzieren, die induziert werden können.

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Protocol

Alle Interventionen wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) durchgeführt. Das experimentelle Protokoll wurde vor der Umsetzung vom Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC) der University of Michigan genehmigt. Zehn Wochen alte erwachsene weibliche Sprague-Dawley Ratten wurden verwendet.

1. Vor dem operativen Tag

  1. Stellen Sie vor dem Operationstag einen angemessenen Vorrat an sterilisierten chirurgischen Instrumenten, schmerzstillenden Medikamenten, Anästhesiemedikamenten und Sauerstoff sicher. Eine vollständige Liste finden Sie in der Tabelle der Materialien.

2. Präoperative Einrichtung

  1. Sorgen Sie für einen angemessenen Arbeitsbereich, einschließlich Platz für mindestens zwei Personen (Chirurg und Assistent).
    HINWEIS: Es wird ein spezieller Operationstisch, Platz für den Aufbau der Anästhesiemaschine und ausreichend Stauraum für sterilisierte und Backup-Vorräte benötigt.
  2. Kalibrieren Sie ein Operationsmikroskop für den Einsatz während der Verfahren. Stellen Sie sicher, dass der Chirurg die Griffe des Mikroskops und die Zoom/Fokus-Tasten einstellen kann, indem Sie eine sterilisierte Abdeckung über die Griffe/Tasten legen.
    HINWEIS: Wir verwendeten sterilisierte Aluminiumfolie über den Griffen/Knöpfen.

3. Anästhesie und Zubereitung

  1. Legen Sie das Tier in die Anästhesiekammer und induzieren Sie die Vollnarkose über 1,8% Isofluran und 0,9 l/min Sauerstoff.
    1. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesieebene durch eine Beurteilung der spontanen Atmung und eine Beurteilung des Bewusstseins, indem Sie die Grimasse des Tieres auf eine Zehenklemme bewerten.
  2. Tragen Sie Augenschmierstoff bilateral auf, um vor Hornhautreizungen oder Trockenheit zu schützen.
  3. Rasieren Sie die operative Site(n) mit einem Rasiermesser oder einem automatischen Clipper.
    1. Legen Sie zu diesem Zeitpunkt eine Methode zur Rattenidentifikation fest, entweder über ein Ohrschild oder eine Schwanzkennzeichnung/-markierung.
  4. Verabreichen Sie eine subkutane Injektion von 0,05 mg/kg Buprenorphin auf dem Rücken des Tieres zur Prophylaxe gegen postoperative Schmerzen.

4. Chirurgische Annäherung und Verletzungsmuster

  1. Übertragen Sie das Tier auf den Operationstisch und setzen Sie den Gasstrom über einen Nosecone fort. Stellen Sie sicher, dass ein Wärmepolster unter dem Tier und dem sterilen Feld positioniert ist, um seine Körpertemperatur zu halten.
  2. Setzen Sie sterilisierte Gaze (aufgerollt und mit Klebeband befestigt), um als Halsrolle für die Ratte zu verwenden; dies wird eine verbesserte Exposition des chirurgischen Feldes bieten. Beachten Sie, dass die angemessene Positionierung des Tieres für eine effiziente Nervenidentifikation und -sektion von größter Bedeutung ist.
  3. Bereiten Sie die Gesichtshaut des Tieres für den Eingriff vor. Verwenden Sie Chlorhexidin oder eine Jodlösung, um die chirurgische Stelle 3x, abwechselnd mit 70% Ethanol, zu schrubben, um eine Desinfektion zu gewährleisten.
  4. Planen und markieren Sie den chirurgischen Schnitt auf Wunsch. Manipulieren Sie das ipsilaterale Ohr in vorder-posteriorer Richtung, um die natürliche Faltung der postauricularen Haut zu bestimmen.
  5. Mode einen 4-5 mm Schnitt in der postauricularen Falte mit scharfen Irisschere oder einer Nummer 15 Klinge. Dies kann später im Verfahren bei Bedarf erweitert werden.
  6. Sezieren Sie stumpf durch die sofortige subkutane Faszien und platzieren Sie einen Mikro-Weitlaner-Retraktor, um die Exposition zu verbessern. Beachten Sie, dass es in diesem Bereich kleinkalibrige Blutgefäße geben kann; diese werden am besten vermieden, indem man sich über den Weitlaner Retraktor überlegen oder minderwertig zurückzieht.
  7. Identifizieren Sie den vorderen Gturastric Muskel, während er sich in einer schlechteren bis überlegenen Richtung in Richtung seiner Einfügung entlang der Schädelbasis bewegt.
    1. Verteilen Sie sanft durch den Muskelbauch entlang seiner Einfügemarke, um die Sehne des vorderen Digastric Bauch zu offenbaren. Beachten Sie, dass die Sehne als filmy weißer Prozess erscheint, der vom Muskel mit einer festen Einfügung auf die Schädelbasis ausgeht.
  8. Nach der Identifizierung des vorderen Digastric Muskels und seiner Sehne, passen Sie den Weitlaner Retraktor an, um den Muskelbauch weiter zurückzuziehen. Beachten Sie, dass der anschließend exponierte Bereich der dreidimensionale Raum ist, in dem der Hauptstamm des Gesichtsnervs liegt.
    HINWEIS: Dieser Bereich wird überlegen und medial durch die Schädelbasis begrenzt, seitlich durch den vorderen Digastric Muskel, posteromedial durch den Gehörgang und minderwertig durch die Strukturen des Halses, einschließlich der oberflächlichen temporalen Arterie.
  9. Nach ausreichender Exposition, identifizieren Sie den Hauptstamm des Gesichtsnervs, wie es sich minderwertig unter der Sehne des Gortes muskel bewegt, wo es das Stylomastoid Foramen von der Schädelbasis verlässt. Beachten Sie, dass der Nerv als perlweiße Schnur erscheint, eingehüllt in die parotis-masseterische Faszie des Tieres. Üben Sie Vorsicht, wenn Sie den Nerv weiter aussetzen, aus den folgenden Gründen.
    1. Vermeiden Sie aggressive Sezieren, oder senkrechte Ausbreitungen, um vor Stretch-vermittelten Neuropraxie Verletzungen zu schützen.
    2. Vermeiden Sie eine aggressive hintere und medial gerichtete Sezierung, um sich vor einer Verletzung der dünnen Gewebe, die den Gehörgang überlagern, zu schützen, da dies die Mittelohrflora in den chirurgischen Bereich einführen könnte.
    3. Vermeiden Sie es, die oberflächliche zeitliche Arterie durch eine breite mediale und minderwertig eitel ierte Zerlegung zu beschädigen. Beachten Sie, dass eine Verletzung durch lebhafte, pulsatile Blutungen identifiziert wird.
      1. Wenn die Arterie verletzt ist, üben Sie prompten Druck mit einem Baumwoll-Applikator oder sterilen Gaze über Zange. Hämostatische Mittel oder flüssiges Fibrin-Dichtmittel können in unmittelbarer Nähe platziert werden. Beachten Sie, dass das Tier eine subkutane Injektion von 0,9% steriler Saline zur Flüssigkeitsstabilisierung benötigen kann.
  10. Verfolgen Sie den Hauptstamm disistally, indem Sie entlang des Nervs in eine unterlegene Richtung, distally vom Ausgang des Stylomastoid Foramen.
    1. Erweitern Sie den ursprünglichen Schnitt, um eine vollständige Exposition des Nervs und seiner Zweige zu ermöglichen. Achten Sie darauf, eine Störung der Ohrspeicheldrüse zu vermeiden, da dies zu postoperativer Sialocele führen könnte.
  11. Induzieren Sie die gewünschten Verletzungsmuster wie folgt.
    1. Für eine Quetschverletzung verwenden Sie glatte Oberfläche Juwelier Zange, um den Nerv fest zu greifen und komprimieren Sie es9. Tragen Sie einen konstanten und reproduzierbaren Druck auf den Nerv für einen Zeitraum von 30 s auf, um eine angemessene Zerkleinerungsverletzung zu gewährleisten.
    2. Für eine einfache Transektion, greifen Sie die Faszie über den Nerv, oder das unmittelbare Epineurium, mit feinverzahnten Zangen, und verwenden Scharfe Mikroschere, um den Nerv an der gewünschten Stelle mit einem einzigen Schnitt sauber zu transsektieren. Achten Sie darauf, übermäßige Traktion auf den Nerv mit der Zange zu vermeiden.
    3. Erstellen Sie für ein Nervenspaltmodell den gewünschten Nervenspalt mit einer ähnlichen Methode wie die einfache Transektionsverletzung. Verwenden Sie den sterilisierten Schaft eines baumwollgekippten Applikators, der auf den gewünschten Nervenspalt längenintraoperativ geschnitten wird, um eine Ähnlichkeit des Verletzungsmusters zwischen Tieren zu gewährleisten.

5. Wundverschluss

  1. Die Wunde mit steriler Herzwäsche bewässern und mit steriler Gaze trocknen.
  2. Nähern Sie die Hautränder in einer einfachen, subcuticular Art und Weise mit resorbierbaren Nähten, oder verwenden Sie Hautkleber oder Wundclips, die auch für Wundverschluss akzeptabel sind. Legen Sie einen vergrabenen Stich, indem Sie einen tiefen bis oberflächlichen Biss von einer Hautkante und dann einen anschließenden oberflächlichen bis tiefen Biss der gegenüberliegenden Hautkante.

6. Postoperative Erholung

  1. Verabreichen Sie eine subkutane Injektion von nichtsteroidalen entzündungshemmenden Analgetika (wie 0,05 mg/kg Buprenorphin und 0,5 mg/kg Carprofen) zur postoperativen Schmerzkontrolle. Legen Sie die Injektion entlang des Rückens des Tieres.
  2. Beenden Sie die Verabreichung des Anästhetikums und lassen Sie das Tier Sauerstoff für weitere 1 min einatmen.
  3. Legen Sie das Tier in eine erwärmte (über eine Wärmelampe), aseptischen Käfig ohne Einstreumaterial, um versehentliche Einnahme zu vermeiden. Beachten Sie, dass das Tier in der Regel Anzeichen einer Erholung innerhalb von 1-2 min zeigt und orientierungslos erscheinen kann, mit einer verzögerten Wiederherstellung der Hinterbeinfunktion.
  4. Bringen Sie die Tiere in ihre Käfige in der entsprechenden Wohneinheit zurück und verabreichen Sie postoperative Schmerzmittel am postoperativen Tag #1, um eine kontinuierliche Prophylaxe gegen Schmerzen zu gewährleisten.
  5. Überwachen Sie die Tiere 2x pro Tag, um Anzeichen von Unterernährung, Hornhautreizungen oder chirurgischen Infektionen an der Stelle zu bewerten und geeignete chirurgische Protokolle aufrechtzuerhalten.
    1. Verabreichen Sie 0,9% sterile Saline in subkutaner Weise, wenn es signifikante Gewichtsverlust.
    2. Schmieren dein Auge Salbe täglich auftragen, bis der Blinkreflex des Tieres wieder hergestellt ist.

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Representative Results

Nach dem ersten chirurgischen Eingriff gibt es zwei Haupttypen von Ergebnismessungen: serielle Messungen im lebenden Tier und Messungen, die ein Opfer des Tieres erfordern. Beispiele für serielle Messungen sind elektrophysiologische Assays, wie eine zusammengesetzte Muskelwirkungspotentialmessung30, Bewertungen der Gesichtsmuskelbewegung mittels laserunterstützter oder Videografie bedeutet9, oder sogar repetitive Live-Bildgebung des Nachwachsens des Gesichtsnervs bei fluoreszierenden transgenen Tieren31,32. Abbildung 1 zeigt die Live-Bildgebung des Hauptrumpfs des Gesichtsnervs bei einer erwachsenen transgenen Thy1-GFP-Ratte. Am marginalen Unterkieferzweig wurde eine Quetschverletzung durchgeführt, die etwa 2-3 mm bis zum Astpunkt der ersten Pes distal ist. Mit Hilfe der MetaMorph-Bildgebungssoftware konnten wir die fluoreszierende Intensität an jedem Punkt entlang des Gesichtsnervs quantifizieren. Insbesondere ist es möglich, fluoreszenzproximal und distal an einer Verletzungsstelle zu quantifizieren und dabei die Rückkehr der Fluoreszenz als Marker für die Nervenregeneration seriell zu bewerten. Abbildung 2 zeigt die allmähliche Rückkehr der Fluoreszenz (gemessen als Verhältnis von distaler Fluoreszenz zu proximaler Fluoreszenz über eine einfache Transektionsstelle) an den 1, 2, 3 und 4 Wochen Zeitpunkten in der Thy1-GFP-Ratte.

Die histomorphometrische Analyse des eigentlichen Nervs oder des Muskels erfordert, dass das Tier nach einer vorgegebenen Zeitzeit geopfert wird, um die gewünschte Wirkung über Gruppen hinweg zu demonstrieren. Abbildung 3 zeigt Querschnittsbilder der marginalen Unterkieferteilung. Diese Technik erfordert eine sorgfältige Gewebehandhabung, Lagerung, Vorbereitung, Schnittung und Färbung, um eine histomorphometrische Analyse über verschiedene Gruppen hinweg zu ermöglichen. Bei angemessener Anwendung ermöglicht diese Technik die Quantifizierung des Axondurchmessers, der Menge an Schmutz, der Nervenfaser, des Nervenanteils und der Dichtemessungen.

Figure 1
Abbildung 1:Anatomie der Gesichtsnerven in der Thy1-GFP-Ratte 1 Woche nach einer Quetschverletzung am marginalen Unterkiefernerv nachgewiesen. Die Stelle der Zerkleinerungsverletzung wird durch den weißen Pfeil demonstriert. Die Abschnitte des Nervs werden als MT(Main Trunk), B (buccal) und MM (marginal manandibular) Zweige bezeichnet. Die Maßstabsleiste steht für 1,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Quantifizierung der Rückführung der Fluoreszenz als Verhältnis der fluoreszierenden Intensität der Stelle, die sich sofort distal mit der Transektionsverletzung über die Intensität der Stelle proximal zur Transektionsverletzung unterscheidet. Vier Tiere wurden untersucht, und eine Quetschverletzung wurde modelliert. Das Diagramm wird als mittlerer Anteil dargestellt, Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Axialer Querschnitt des marginalen Unterkieferzweigs des Gesichtsnervs der Ratte nach Färbung mit Toluidinblau. Die Maßstabsleiste steht für 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das Modell der Gesichtsnervenverletzung der Ratte hat sich aufgrund seiner chirurgischen Zugänglichkeit, seines Verzweigungsmusters und seiner physiologischen Bedeutung27,29,33,34,35,36als das vielseitigste System für die Bewertung neurotropher Faktoren herauskristallisiert. Die Kombination von Videodemonstration und Anwendung transgener Tierdaten eröffnet neue Möglichkeiten für die wissenschaftliche Erforschung von nervenregenerierenden Phänomenen. Dieses Modell ermöglicht die systematische und detaillierte Charakterisierung der neuronalen Reaktion auf Traumata, neurotrophe Einflüsse, immunmodulatorische Einflüsse und andere Aspekte der Mikroumgebung. Obwohl das primäre Ziel der klinischen Gesichtsnervenstudie die Wiederherstellung der Motoneuron-Funktion betrifft, kann das Modell auch verwendet werden, um Ereignisse an der neuromuskulären Kreuzung, Nuancen des axonalen Transports und das Zusammenspiel von axonal-gliaalen Einflüssen27,36,37,38,39,40,41,42,43,44. Mechanistische Studie mit Gesichtsnerv hat paradoxerweise zu wichtigen Erkenntnissen in Bezug auf zentrale Entzündungen und neurodegenerative Erkrankungen, wie Alzheimer und Parkinson-Krankheit45,46,47geführt. Dort haben die medizinischen Implikationen der Arbeit in diesem Modell bemerkenswerte Auswirkungen auf ein besseres Verständnis und schließlich die Verbesserung der klinischen Versorgung von Patienten, die sowohl mit Erkrankungen des peripheren als auch des zentralen Nervensystems betroffen sind, die sowohl unterstützende Zellen als auch neuronale Gewebe betreffen.

Es gibt eine erste Lernkurve mit der Durchführung von Gesichtsnervenoperationen im Rattenmodell. Während es für den Wissenschaftler nicht notwendig ist, chirurgisch ausgebildet zu werden, sollten sie bequem unter einem Operationsmikroskop arbeiten und binokulares Sehen nutzen. Der Wissenschaftler sollte sich weiterhin mit seiner nicht dominanten Hand wohl fühlen, da die Einstellung des Rückzugs mit dem Weitlaner Retraktor in der kontralateralen Hand die Visualisierung erheblich verbessern kann. Dies gilt insbesondere für die Identifizierung des Hauptrumpfs des Gesichtsnervs, da es dem unerfahrenen Chirurgen möglich ist, Sehenswürdigkeiten zu verlieren und im dreidimensionalen Raum, in dem der Nerv die Schädelbasis verlässt, desorientiert zu werden. Sobald jedoch Erfahrungen gesammelt wurden und der Chirurg konsequent in der Lage ist, die Sehne des Gortmuskels zu identifizieren, dann sind die Eingriffe recht geradlinig. Wo das Verfahren - ein einfacher Transektion des Nervs - so lange wie 30 min dauern könnte, wenn der Wissenschaftler zunächst lernt, in den Händen eines erfahrenen Chirurgen, kann es so zweckdienlich wie 5 min vom Schnitt bis zum Wundverschluss sein. Mit einem erfahrenen Assistenten, der die Vorbereitung und Anästhesie der Tiere leitet - sowie nach Bedarf nach Bedarf - ist es möglich, mehrere Tiere in einer Einzigen Sitzung zu bearbeiten. Wenn komplexe intraoperative Manöver durchgeführt werden, wie z. B. eine stereotaxic intraneurale Injektion, erhöht sich die benötigte Zeit.

Diese Gruppe hat Erfahrung in der Arbeit mit den erwachsenen Lewis- und Sprague-Dawley-Ratten und der erwachsenen Thy1-GFP-Ratte. Diese Modelle haben eine beeindruckende Widerstandsfähigkeit gezeigt, sowohl intraoperativ als auch postoperativ. Es wäre klug, Zeit für die Akklimatisierung des Tieres (in der Regel 1 Woche) einzuplanen, wenn es von einer separaten Einrichtung gemäß dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren bestellt wird, da ein zu baldes Arbeiten nach einer Übertragung zu übermäßigem Stress und schlechter postoperativer Gesundheit führen könnte. Bei einseitigen Gesichtsnervenverletzungen zeigt die Ratte postoperativ keine unerwünschten Anzeichen von Unterernährung oder Hornhautreizung. Darüber hinaus vertragen sie sich wiederholende Perioden der Anästhesie recht gut48, da frühere Protokolle serielle elektrophysiologische Analysen der Rückkehr der Schnurrhaare bis zum eventuellen Opfer gefordert haben. Obwohl die Betreiber versuchen sollten, die intraoperative Sterilität nach besten Kräften aufrechtzuerhalten, haben wir bei keinem der operierten Tiere postoperative Infektionen festgestellt. Gelegentlich wird das Tier versuchen, an seinem Einschnittplatz zu kratzen; jedoch, Es kehrt in der Regel zum Ausgangszustand mit Nachwachsen der Haare innerhalb von 1-2 Wochen postoperativ. Wenn die Ohrspeicheldrüse verletzt oder versehentlich entfernt wird, dann wird sialocele entstehen, was eine Wiederholungderasthesie zur Drainage erforderlich machen kann.

Änderungen können an der Ortung der Verletzung, der Art der Verletzung oder der durchgeführten Eingriffe vorgenommen werden. Verletzungen können an jedem Punkt entlang des Verlaufs des Gesichtsnervs induziert werden, von intrakraniellen Gesichtsnerventransektion zu Verletzungen des Hauptstamms oder einer seiner peripheren Zweige49. Die breiten Muster der Verletzung gehören Zerkleinerung, einfache Transektion mit oder ohne Reparatur, und Lücken-Defekt mit oder ohne Reparatur oder Brücke11. Die Bandbreite möglicher Interventionen ist erschöpfend. Kurz gesagt, Intervention kann auf der Ebene des Nervs richtig17, an der Stelle der Verletzung23, oder an der muskulösen Endorgan50durchgeführt werden. Die Liste der möglichen Ergebnisparameter ist ebenso langwierig. Zu den histomorphometrischen Parametern des Arbeitspferdes gehören unter anderem die axiale Quantifizierung der Nervenanzahl, der Nervendichte und des Nervenanteils. Weitere Maßnahmen umfassen histologische Analysen von Längsschnitten, um das Ausmaß der Regeneration und neuromuskuläre Knotenquantifizierung zu veranschaulichen, um die Reinnervation der Zielgesichtsmuskulatur zu demonstrieren51. Neue Methoden zur Bewertung der Ergebnisse werden weiterhin entwickelt22. Zum Beispiel haben Hadlock et al. eine komplexe Methode zur Beurteilung der Kontraktur unabhängiger Gesichtszonen durch geruchs- oder puffinduzierte Reaktionen demonstriert; dies hat Potenzial für die Bewertung und eventuelle Behandlung der lästigen synkinetischen Regeneration11.

Wie bei jedem Tiermodell gibt es Einschränkungen bei der Übersetzung der Ergebnisse auf menschliche Patienten. Die Maus- und Rattenmodelle weisen beide das überlegene regenerative Potenzial des Nagetiernervensystems auf; Diese Eigenschaft ermöglicht es dem Nagetier, regenerative Ergebnisse zu demonstrieren, die bei Menschen und höheren Tieren unmöglich erreicht werden konnten24. Daher muss der Gesichtsnervenwissenschaftler sorgfältig geeignete Zeitpunkte für die Bewertung der Nervenregeneration und -regeneration auswählen; Wenn ein längerer Zeitpunkt ausgewählt wird, kann das enge Zeitfenster, in dem versuchsweise Gruppen zuverlässig die Wirkung ihrer einzigartigen Intervention nachweisen können,24übersehen werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

S.A.A. wird von der American Academy of Facial Plastic and Reconstructive Surgery Leslie Bernstein Grants Program finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.8% isoflurane VetOne 13985-030-40
11-0 nylon microsutures AROSuture TK-117038
4-0 monocryl suture VWR 75982-084
Buprenorphine SR ZooPharm MIF 900-006
Carprofen Sigma-Aldrich MFCD00079028
Chlorhexidine VWR IC19135805
Jeweler forceps VWR 21909-458
Micro Weitlaner retractor VWR 82030-146
Micro-scissors VWR 100492-348
Mini tenotomy scissors VWR 89023-522
Number 15 scalpel blade VWR 102097-834
Operating microscope Leica
Petrolatum eye gel Pharmaderm B002LUWBEK
Sterile water VWR 89125-834
Tissue adhesive Vetbond, 3M NC9259532
Water conductor pad Aqua Relief System ARS2000B
Bupivacaine Use as a local analgesic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurowissenschaften Ausgabe 159 Gesichtsnerv Axotomie Neurohemmung Nervenregeneration GFP Rattenmodell Tierchirurgie
Gesichtsnervenchirurgie im Rattenmodell zur Untersuchung der axonalen Hemmung und Regeneration
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Ali, S. A., Stebbins, A. W., Hanks,More

Ali, S. A., Stebbins, A. W., Hanks, J. E., Kupfer, R. A., Hogikyan, N. D., Feldman, E. L., Brenner, M. J. Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration. J. Vis. Exp. (159), e59224, doi:10.3791/59224 (2020).

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