Summary
我々は、細胞および多細胞オルガノイドを用いて3D 培養および実験のためのデバイスを構築する方法について述べる。この装置は定義された化学誘引物質の勾配の3D 微小環境の可溶性信号への細胞応答の分析を可能にする。オルガノイドは、弱いノイズの入力の検出で単一のセルよりも優れています。
Abstract
2D 細胞培養システムの様々な制限は、3D 細胞培養および分析プラットフォームに対する関心を呼び起こし、生体組織の空間的および化学的複雑性を模倣し、インビボ組織機能を模倣する。微細加工技術の最近の進歩は、細胞が十分に定義された細胞外マトリックス (ECM) および可溶性またはマトリックス関連の生体分子の定義されたセットに統合することができるインビトロ環境における3D の開発を促進した。しかし、技術の壁は、研究室での普及を制限している。ここでは、化学誘引物質勾配を定義した3D 微小環境において、細胞や多細胞オルガノイドを用いて3D 培養や実験のための簡単な装置を構築する方法について述べる。我々は、上皮細胞の応答の分析のためのこのプラットフォームの使用を説明し、上皮増殖因子 (EGF) などの成長因子の勾配にオルガノイドします。EGF の勾配は、乳房オルガノイドにおける分岐形成を誘導する数日間の装置において安定であった。この分析により、セルのグループによる集合的な勾配検出は、単一のセルよりも敏感であると結論づけることができました。また、リソグラフィー設備や高度なソフトリソグラフィ技術を必要としない製造方法についても述べる。この方法は、癌を含む開発と病理学的状態の分析の文脈で3D 細胞の挙動を研究するのに役立ちます。
Introduction
生理的環境においては、細胞はセル外マトリックス (ECM) に埋め込まれ、大量の生体分子に曝露される。細胞と周囲の微小環境との相互作用は、遊走、成長、分化および生存を含む多様な表現型を制御する細胞内プロセスを調節する1,2.従来の2D 細胞培養において細胞の挙動について多くのことが学ばれてきた。しかしながら、3D ヒドロゲルに埋め込まれた細胞を用いた生体画像化および実験の出現により、細胞挙動における重要な相違は、3D 組織様環境と比較して単純化された 2D in vitro 培養で認められるようになった。細胞は ECM 繊維と相互作用し、3D マトリックス内でその機械的特性を感知しますが、ゲルの材料剛性は、2D in vitro システムでは完全に独立した変数ではありません。次元は焦点の付着の形成を変え、異なった細胞形態および行動をもたらす。さらに、2D サーフェス上のセルは、3D のすべての方向に開いているセルよりも少ないシグナリングキューにさらされます。
これらの制限は、生体組織の空間的および化学的複雑性を表す3D システムの関心を高め、インビボ組織機能をよりよく予測する。彼らは、ECM3,4にランダムに散在する細胞への自己組織化細胞微細構造として、オルガノイドから多くの形で開発されています。微細加工技術の最近の進歩は、表現型の変化を研究するための様々なタイプの3d 培養システム5、6、7、8、9の出現を促進し、可溶性信号への細胞応答;しかし、技術的な障壁は、研究室での普及を制限します。多くの場合、製造プロセスは、軟リソグラフィのためのフォトリソグラフィー技術と背景知識を必要とします。さらに、デバイスを正常に構築し、デバイスの最適な機能を長期間にわたって実現するには、さまざまな要因を制御する必要があります。
我々の方法は、定義された化学誘引物質勾配を有する3D 微小環境に細胞および多細胞オルガノイドを組み込み、その後、EGF10に対する上皮応答を分析するための 3d PDMS 装置を構築する方法を記述する。我々のデータは、浅い EGF 勾配に応答するオルガノイドの能力が、ギャップ結合を介した細胞間化学的カップリングから生じることを明らかにしている。それは弱く、騒々しい空間的に等級付けられた入力のより精密な検出のためのオルガノイドの潜在性を示す。製造工程はクリーンルーム設備やフォトリソグラフィー技術を必要としません。しかし、3D PDMS デバイスには、3D 生理学的環境の必要な要素が含まれています。この方法は、3D 細胞の挙動を研究するのに役立ち、異なる細胞タイプ、chemoattractants、および ECM の組み合わせによる優れた研究の可能性を秘めています。
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Protocol
すべての動物の仕事は、機関の動物のケアと使用委員会、ジョンズ・ホプキンス大学、医学部によって見直され、承認議定書に従って実施しました。
1. mesofluidic 装置の製作
- 3D CAD ソフトウェアを使用して PDMS デバイス用の金型のマスクを設計します。
- 耐熱樹脂の立体造形装置を使用して金型を印刷します。
注: ここで説明する手順は、市販の3D 印刷サービスによって実行されました。 - 10:1 の比率で硬化剤と PDMS モノマー溶液を徹底的に混合します。3 mL の PDMS 混合物は、装置の製造のために必要とされた。総容積は製造されるべき型の数によって決まる。
- 社内の実験室の真空または真空ポンプを真空デシケーターで1時間使用して真空をかけることで、混合物を脱気する。
- 粘着テープでモールドの表面を軽くし、ほこりを取り除き、PDMS 混合物を鋳型に注ぎます。プロセス中に気泡が導入された場合、真空デシケーター内で脱気を繰り返す。金型の柱の間に閉じ込められた気泡は、鋭い針でそれらを刺すことによって除去することができます。
注: 室温での脱気プロセスは、1時間以内に行う必要があります。 - 2時間80° c で加熱して PDMS を硬化させる。金型を室温で冷却できるようにします。
- 刃で金型と PDMS の境界を切り、型から PDMS を注意深く剥がします。
- 22 mm x 22 mm のカバースリップにフィットし、インレットに穴を開けるように PDMS 部品をトリムします。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。 - カバースリップの低い組織と 70% のエタノールで表面を拭くことにより、PDMS 部品と 22 mm x 22 mm のクリーニングを行います。その後、粘着テープで dabbing して大きなダスト粒子を除去します。
- カバースリップを滅菌し、オートクレーブ (121 ° c、濡れた8分間、15分間乾燥) または1時間の UV 光への曝露によって、PDMS 部品を殺菌します。
- PDMS 部品の底面とカバースリップをコロナ放電ガンで、ティッシュカルチャーフードで5分間処理し、それらを一緒に結合します。
注意: 底にポリスチレンフォームなどの非導電材を置き、このプロセス中にすべての導電材を除去します。コラーゲンを、5分以内に、コラーゲンゲルとガラスカバースリップ間の結合を増加させる処置の後、すぐに装置に注入してください。
2. 細胞の準備: 第一次乳腺オルガノイドの分離
注: 乳腺オルガノイド分離の詳細は、前の作業11で見つけることができます。任意の種類の単一の細胞またはオルガノイドは、独自の分離/剥離プロトコルに従って調製することができます。
- マウスの乳腺組織をメスでミンチさせると、組織が弛緩して、37° c で30分、50 mL のコラゲナーゼ/トリプシン溶液 (マウスあたり 10ml) にデメ/F12 で 0.1 g のトリプシンを添加し、0.1 g のコラゲナーゼ、5 mL の FBS、250μ l の1μ g/mL インスリン、50μ l の50μ g/mL ゲンタマイシンを投与します。
- コラゲナーゼ/トリプシン溶液を10分間 1250 x gで遠心分離する。吸引によって上澄みを取り除く。10 mL の DMEM/F12 に細胞を分散させ、10分間 1250 x gで遠心分離する。吸引によって DMEM/F12 を除去した後、4 mL の DMEM/F12 で細胞を再懸濁し、40μ l の DNase (2 単位/μ l) を補充した。
- 2-5 分の手で DNase 溶液を振り、その後10分間 1250 x gで遠心分離します。
- 1つの細胞から4つの差動 centrifugations (1250 x gにパルスし、それが意図された速度に達した後に遠心分離機 3-4 s を停止する) を通してオルガノイドを分離します。各パルス間で、上清を吸引し、10ml の DMEM/F12 でペレットを再懸濁する。
- 1% のペニシリン/ストレプトマイシン、およびコラーゲン調製のための 1% インスリン-トランスフェリン-セレン-X を用いて、所望の量の DMEM/F12 の成長培地中で最終ペレットを再懸濁させる。
3. コラーゲンの調製と注入
注: 他のタイプの ECM ゲルは、独自のゲル化プロトコルに従って調製することができます。
- コラーゲンタイプ I 溶液 (3.78 mg/mL)、10倍 DMEM、1 N NaOH 溶液、氷上の正常成長培地を調製する。
注: 手順が完了するまで氷の上に保管してください。 - 6μ l の 1 N NaOH 溶液、200μ l の成長培地および50μ l の 2, マイクロ遠心をあらかじめ冷却されたチューブに加え、溶液を完全に混合する。
- 425μ l のコラーゲンをあらかじめ混合した溶液に添加し、ピペットでよく混ぜる。
- コラーゲン混合物を短時間 (5 秒未満) 遠心分離し、混合物から気泡を除去します。
- 中和したコラーゲン溶液を氷上で1時間保持し、繊維形成を誘導します。
- コラーゲン混合物に50μ l の細胞懸濁液を加え、よく混ぜる。
注: 最終的なコラーゲン濃度は 2mg/mL です。 - 全体のチャンバが充填されるまで、PDMS 装置の入口を介して200μ l pipet を使用して溶液を注入する。コラーゲンの混合物が柱の隙間をオーバーフローした場合、過剰なコラーゲンゲルをゲル化後に鋭い外科用ブレードで切り出します。
- 5% の CO2 で37° c のインキュベーター内のデバイスを1時間、ゲル化を誘発させます。
- 成長培地で両側の貯水池を満たし、共焦点イメージングが実行されるまで、5% の CO2 で37° c のインキュベーター内のデバイスを維持します。
4. 3D イメージングと定量化
- 生細胞イメージング培養室を共焦点顕微鏡に設置し、温度と CO2 をそれぞれ37° c、5% に事前設定します。湿度を上げるには、チャンバの貯留部に水を加え、必要に応じて濡れたワイプをチャンバ内に置きます。
- PDMS 装置をチャンバ内に置き、グラジエント形成中の EGF の「ソース」として EGF を1つのリザーバに加える。もう1つのリザーバは、空間的にグレーディングされた EGF 分布の開発に必要な「シンク」を提供します。この研究では 0.5 nM/mm の勾配を作るために、シンクに 2.5 nM の EGF を添加しました。
- 目的のオルガノイドのボリュームをカバーする Z スタックの範囲を設定し、イメージングを開始します。
注意: 光毒性を避けるために、共焦点イメージングではより低いレーザー強度を試すか、マルチフォトンイメージング技術を使用してください。 - 商用ソフトウェアまたはカスタムメイドのプログラムを使用して、2D イメージスタックから3D イメージを再構築します。オルガノイドから伸びる枝の長さと角度、および個々の細胞の移動を測定します。ここでは、ImageJ を使ってオルガノイドボディの周りにフリーハンドで輪郭を描くことで定量化を行います。
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Representative Results
EGF は、乳腺の形態形成を分岐させ、浸潤性の癌増殖における乳房上皮細胞の遊走を誘導する重要な化学誘引物質である。我々は、上述したメゾスコピック流体デバイスを用いて、EGF の勾配を定義した細胞の応答を研究した (図 1a、B)10。このデバイスは、幅 5 mm、長さ 10 mm、高さ 1 mm の培養エリアを生成します。培養領域の側面は、表面張力を介して細胞培養領域内の液体 ECM および細胞混合物を捕捉するために使用される六角形の柱によって開井戸から分離される。我々は、この3D 培養のサイズを考えると、非常に困難であり、高価であり、フォトリソグラフィー10によって適切なサイズの金型を構築するのに時間がかかることに留意する。標準的な技術の新しい適用を使用することによって、光造形、我々は迅速かつ安価に金型を生産します。さらに、設計を修正することによって、指数の勾配 (図1c、i) または複数の線形勾配をチップで (図1c、ii) と同様に、連続的な流れを有する安定した勾配を誘導することができる (図 1c、iii)。
インシリコにおいて (図2a、B、C) および In vitro (図 2d、E、F) 試験は、約2日間持続した細胞培養領域全体にわたって安定な線状 EGF の勾配を形成することを実証したソースとシンクの貯水池。タンパク質の時間依存性拡散を、商品化されたマルチフィジックス・ソフトウェアを用いてシミュレートした。部屋の構成の3D 幾何学はソフトウェアで作り直され、部屋の容積内の平均の集中は定められ、プロットした。これらの結果は、EGF (6.4 kDa タンパク質) が、比較的短時間に上述したように調製したコラーゲンゲル内で安定した拡散ベースの勾配を形成し得ることを示唆した。また、この方法を使用して、1、10、および 150 kDa のタンパク質の類似プロファイルを形成できることも確認しました。
乳腺オルガノイドは、空間的に均一な 2.5 nM EGF の存在下で複数の分岐を形成し、分岐形成は3日間にわたって方向バイアスを示さなかった (図 3a、D)。しかし、0.5 nM/mm の線状勾配の形で EGF を添加した場合、分岐形成は有意な指向性バイアスを表示した (図 3b, E)。しかし、同じ勾配の単一細胞に対してはそのようなバイアスを検出しませんでした。多細胞通信が勾配応答に必要であるかどうかを判断するために、様々な阻害剤による細胞間ギャップ結合をブロックすることで分枝形成の偏りを防ぐことができるかどうかを検討した。ギャップ接合阻害剤は、実際には、勾配に応答するオルガノイドの能力を抑制した (図 3c、F)。この方法10を記述した元の研究でさらに広範囲に検討されているように、この結果は、乳腺オルガノイド10における EGF 勾配応答のためにギャップジャンクションを介した通信が必要であるという仮説を支持する。
図 1.EGF グラデーションを定義した Mesofluidic デバイス。(A) PDMS チップの3d ビュー: (i) 上面図および (ii) 金型の正面図 (単位: mm) (iii) には、pdms (透明) で満たされた金型 (赤) の配列 (iv) pdms チャンバー型 (v) 組立装置 (vi) の概略図 pilled 装置充填の実際の画像コラーゲンゲルと培養培地を使用した ed。(B)コラーゲンゲルおよび高 (赤色) および低 (赤色) egf 濃度の mesofluidic に埋め込まれたオルガノイドを有するチャンバの概略図であり、egf の勾配をもたらす (この図は、10から修飾している)。(C)指数勾配 (i) を誘導するための潜在的な設計、チップ内の4つの異なる線形勾配 (ii)、および連続流動を伴う安定した勾配 (iii)。赤色の領域は、培地および灰色の領域で満たされたソースまたはシンクが、ゲル/細胞混合物で充満したチャンバを示す。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.チップを横切るリガンドの勾配の評価。(A)勾配プロファイルを示すチップ上のリガンド濃度のシミュレーション。(B) 1 kDa タンパク質および(C) 70 kDa タンパク質の模擬勾配プロファイル(D) 10 KDa デキストランブルーの線状勾配を有するデバイスの画像を、EGF の拡散を可視化するために用いた。六角形の点線は、ゲル領域の側面の柱を示します。チップを横切って 1, 10 および 150 kDa デキストランの実験的な勾配プロファイル (この図は、エリソン et al. 201610) (E)から8時間後および(F) 48 時間後に変更された。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.EGF グラジエントに対する細胞応答。(A)均一な 2.5 NM EGF を有するコラーゲン中のオルガノイドの非指向性分岐。(B)オルガノイドの指向性分岐が 0.5 nM/MM の EGF の線状勾配を持つコラーゲン(C)ギャップ接合ブロッカーを有する EGF の 0.5 nM/mm の線状勾配にオルガノイドの非指向性分岐。(D-F)オルガノイドの角ヒストグラムは、それぞれ (A)-(C) に対応する分岐方向をそれぞれ示している。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
PDMS 金型の製作は、市販の3D プリンティングサービスを使用して行われましたが、自社内のハイエンド3D プリンタでも実現できます。様々な3D 加工方法の中で、高解像度のモールド生成には立体造形が推奨されます。PDMS 硬化は、高温 (80 ° c) で発生するため、材料は、印刷が外部委託されている場合は、明示的に指定する必要があり、十分に熱耐性でなければなりません。サーマルポストキュアは、印刷サービス会社と話し合い、部品の熱抵抗を高めることができます。印刷サービスおよび材料の詳細は、資料の表に記載されています。
硬化 PDMS の機械的性質は、硬化温度に依存します。PDMS 混合物がオーブンで硬化する前に長い時間室温で保たれている場合、それは完全な硬化後にも弾性になります。したがって、室温での脱気プロセスは、1時間以内に行われるべきである。脱気は PDMS 内の任意のマイクロバブルを除去することができます真空の環状アプリケーションを指します。
コラーゲン溶液の pH は、ゲル化だけでなく、細胞の生存率にも重要です。コラーゲンは、細胞と混合する前に中和されていない場合、細胞の生存率は低くなります。コラーゲン混合物を中和するための 1 N NaOH 溶液の量は、元のコラーゲン溶液の pH に依存し、理論的に計算することができる。しかし、コラーゲン溶液に NaOH 溶液を徐々に添加し、フェノールレッドインジケータを使用して培地の pH 測定値を確認するか、pH 試験テープを使用することが推奨される。
ゲルを脱気することは、プロセス全体を通して重要です。コラーゲン混合物が装置に注入された後にゲル化中に気泡が形成される場合、それらは、装置を氷上に10分以上置くことによっても除去することができる。温度を落とすことによって、気泡のサイズは減少し、空隙は最終的にゲル混合物によって占有される。貯水池に培養液を加えた後、柱の間に気泡が閉じ込められている場合にも同じ方法が使用できます。
我々は、この技術を用いて、大規模なマルチセル構造を生理学的に関連する細胞外マトリクス環境に埋め込み、それを定義された成長因子およびその他の可溶性の勾配と統合することを可能にする mesofluidic デバイスを作成した。生物活性分子。高解像度の光造形により、高品質で低コストの金型を製造することができました。製造工程はクリーンルーム設備もフォトリソグラフィー技術を必要とせず、したがって、従来の2D とは複数の利点を有する細胞培養および実験のための3D 環境のシンプルかつ効果的な生成を可能にする。実験。ここで説明するデバイスは、幅 5 mm、長さ 10 mm、高さ1mm のカルチャーエリアを持つように設計されています。高さが厚い比較的大きな培養エリアは、mesoscopically の大きなオルガノイドまたはスフェロイドの成長を許容し、数十から数百マイクロメートルのサイズに及ぶ。また、分枝性上皮の形態形成の分析、および3D 環境内での集合的および単一細胞移動の分析も可能になる。装置の側面は一般に主流のマイクロ流体装置のために使用される液体制御装置との複雑なインターフェイスを必要としないで媒体を変えるか、または薬剤を加えるために標準的なピペットの使用を可能にする開いた井戸である。さらに、PDMS チャンバと下部のカバーガラスのシンプルな構成は、多様な顕微鏡システムと普遍的に互換性があります。デバイスの使用は、正常な乳房組織における形態形成のバイアスされた分岐方向を示し、デバイスの使用の代表的な例として課された EGF 勾配に応答している。しかし、この使用法はまた、3D での細胞/組織挙動の分析のために、異なる組織、細胞源、chemoattractants、および薬物にまで拡張することができる。この使用はまた、間葉間質および免疫成分を含む他の細胞タイプを組み込むとともに、ゲル内の個々の細胞からの血管ネットワーク形成を収容するより現実的な組織モデリングに対応するように拡張することができる。そして多様な上皮細胞タイプ。
光造形は3D プリンティング技術の中でも最も優れた解像度を提供しますが、最小機能サイズは数十マイクロメートルに制限されています。したがって、このプロトコルは、数マイクロメートルのスケールで製造金型にフォトリソグラフィーを交換するのに十分ではありません。このプロトコルのもう一つの制限は、x − y 方向と比較して z 方向における高品質画像化の比較的低い深さであり、これは、従来の顕微鏡検査を使用して、組織スケール構成要素を画像化する固有の問題である。しかし、これらの制限があるとしても、記述された方法は、製造と使用が容易である強力で柔軟な分析プラットフォームを提供することができます。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
この作業は、AJE (NSF PD-11-7246、乳癌研究財団 (BCRF-17-048)、および NCI U54 CA210173) および AL (U54CA209992) への補助金によって支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
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