Summary
我们描述了一种方法来构建设备的三维培养和实验与细胞和多细胞有机体。该装置允许分析在具有明确趋化因子梯度的三维微环境中对可溶性信号的细胞反应。在检测弱噪声输入时, 有机体优于单个细胞。
Abstract
2D 细胞培养系统的各种局限性引发了人们对三维细胞培养和分析平台的兴趣, 这些平台将更好地模拟活组织的空间和化学复杂性, 并模拟体内组织功能。最近在微细加工技术的发展促进了三维在体外环境中的发展, 在这种环境中, 细胞可以被整合到一个明确的细胞外基质 (ECM) 和一组定义的可溶性或基质相关的生物分子。然而, 技术障碍限制了其在研究实验室的广泛使用。在这里, 我们描述了一种方法, 以构建简单的设备, 用于三维培养和实验的细胞和多细胞有机体在三维微环境中具有明确的趋化因子梯度。我们说明了使用这个平台来分析上皮细胞和有机体对生长因子梯度的反应, 如表皮生长因子 (EGF)。EGF 梯度在设备中稳定了几天, 导致乳腺有机体中的定向分支形成。这一分析使我们能够得出结论, 细胞组的集体梯度检测对单个细胞更为敏感。我们还描述了制造方法, 它不需要光刻设施, 也不需要先进的软光刻技术。该方法将有助于研究三维细胞行为的背景下, 分析发展和病理状态, 包括癌症。
Introduction
在生理环境中, 细胞被嵌入细胞外基质 (ECM) 中, 并暴露在大量的生物分子中。细胞与周围微环境之间的相互作用调节控制多种表型的细胞内过程, 包括迁移、生长、分化和存活1,2。在传统的2D 细胞培养中, 人们已经对细胞行为有了很多了解。然而, 随着血管内成像和3D 水凝胶中嵌入细胞实验的出现, 在简化的二维体外培养物与三维组织样环境中已经认识到细胞行为的重要差异。当细胞与 ECM 纤维相互作用并在三维矩阵中感知其机械性能时, 凝胶的材料刚度在2D 体外系统中并不是一个完全独立的变量。尺寸改变了焦点粘附的形成, 导致细胞形态和行为不同。此外, 与在3D 中打开向所有方向开放的细胞相比, 2D 表面上的细胞接触到的信号线索更少。
这些限制增加了对代表活组织的空间和化学复杂性的三维系统的兴趣, 并更好地预测体内组织功能。它们以多种形式发育, 从自组装细胞微结构到随机穿插在 ecm3,4中的细胞。最近在微细加工技术方面的进展促进了各种类型的3d 培养系统5、6、7、8、9的出现 , 用于研究表型变化和细胞对可溶性信号的反应;然而, 技术障碍限制了研究实验室的广泛使用。在许多情况下, 制造过程需要光刻技术和软光刻的背景知识。此外, 必须控制各种因素, 才能成功构建设备, 并在很长一段时间内实现设备的最佳功能。
我们的方法描述了如何构建一个 3D PDMS 设备, 将细胞和多细胞有机体整合到具有明确趋化因子梯度的三维微环境中, 然后分析上皮对 EGF10的反应。我们的数据表明, 有机生物对浅 EGF 梯度的反应能力来自于通过缝隙连接的细胞间化学耦合。这表明有机生物在更精确地检测弱和嘈杂的空间梯度输入方面具有潜力。制造过程不需要洁净室设施, 也不需要光刻技术。然而, 3D PDMS 设备包含了3D 生理环境的必要因素。该方法将有助于研究三维细胞行为, 具有较大的研究潜力, 不同的细胞类型, 趋化因子和 ECM 组合。
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Protocol
所有动物工作都是根据约翰·霍普金斯大学医学院动物护理和使用机构委员会审查和批准的协议进行的。
1. 中流体装置的制造
- 利用三维 CAD 软件设计 PDMS 设备模具的掩模。
- 使用带有耐热性树脂的立体平版印刷设备打印模具。
注: 此处描述的过程是由商业3D 打印机构执行的。 - 以10:1 的比例将 PDMS 单体溶液与固化剂彻底混合。制造该装置需要3毫升的 PDMS 混合物。总体积取决于要制造的模具的数量。
- 通过在真空干燥器中使用内部实验室真空或真空泵对混合物进行1小时的真空处理。
- 用胶带将模具表面压入, 去除灰尘, 然后将 PDMS 混合物倒入模具。如果在此过程中引入气泡, 请在真空干燥器中重复脱气。被困在模具支柱之间的泡泡可以通过用锋利的针头戳它们来去除。
注: 室温下的脱气过程应在1小时内或更短内完成。 - 在80°c 加热 2小时, 以治疗 PDMS。让模具在室温下冷却。
- 用刀片切割模具和 PDMS 之间的边界, 然后小心地从模具上剥离 PDMS。
- 修剪 PDMS 部件以适应22毫米 x 22 毫米的盖板, 并在入口打一个洞。
注: 协议可以在此处暂停。 - 用低皮棉组织和70% 乙醇擦拭表面, 清洁 PDMS 部件和 22 mm x 22 mm 覆盖物。然后用胶带轻拍去除大的灰尘颗粒。
- 通过高压灭菌 (121°c 湿 8分钟, 干燥 15分钟) 或暴露在紫外线下 1小时, 对 PDMS 部件和盖板进行消毒。
- 在组织培养罩中, 用电晕放电枪处理 PDMS 部件的底部表面和盖滑移 5分钟, 然后将它们粘合在一起。
注意: 在此过程中, 将任何非导电材料 (如聚苯乙烯泡沫) 放置在底部, 并去除所有导电材料。在治疗后5分钟内立即将胶原蛋白注入设备, 以增加胶原蛋白凝胶与玻璃覆盖物之间的粘合。
2. 细胞制备: 原发性乳腺有机体分离
注: 乳腺有机体隔离的细节可在以前的工作11中找到。任何一种单细胞或有机体都可以根据它们自己的分离/分离协议来制备。
- 用手术刀将小鼠的乳腺组织弄碎, 直到组织放松, 并在 DEMEE/F12 中的胶原蛋白溶液 (每只小鼠10毫升) 中, 在37°c 时将其摇匀 30分钟, 再加上0.1 克胰蛋白酶, 0.1 克胶原酶FBS 为5毫升, 155μl 为 1μgml, 50μml 为庆大霉素。
- 以 1, 250 x 克离心胶原酶溶液 10分钟, 通过抽吸去除上清液。在 DMEM/F12 的10毫升中分散细胞, 在 1, 250 x g下离心机10分钟。在抽吸去除 DMMM\ f12 后, 在 DMEM/F12 的4毫升中重新悬浮细胞, 辅以40Μl 的 DNase (2 unitsμl)。
- 用手晃动 DNase 溶液 2-5, 然后以 1, 250 x 克离心 10分钟.
- 通过四个差动离心分离单个细胞的有机体 (脉冲到 1 250 x g,并在离心机达到预期速度后停止 3-4秒)。在每个脉冲之间, 吸气上清液, 并在 dmmml f12 中重新悬浮颗粒。
- 用1% 的青霉素和1% 的胰岛素-转铁硒-x 重新悬浮在 DMM/F12 所需的生长介质中的最后一个颗粒, 用于胶原蛋白的制备。
3. 胶原蛋白制剂和注射
注: 其他类型的 ECM 凝胶可以根据自己的凝胶协议进行制备。
- 制备胶原蛋白 I 型溶液 (3.78 mg/mL), 10倍 DMEM, 1 N NaOH 溶液, 冰上正常生长介质。
注: 保持冰, 直到该过程完成。 - 在预冷的微离心管中加入6μl 的 1 n NaOH 溶液、200μl 的生长介质和50μl 的 10x DMEM, 然后将溶液充分混合。
- 将425微克利用胶原蛋白加入预混合溶液中, 通过移液彻底混合。
- 将胶原蛋白混合物短暂离心 (少于 5秒), 从混合物中分离和去除气泡。
- 将中和胶原蛋白溶液保存在冰上 1小时, 以诱导纤维形成。
- 将50Μl 细胞悬浮液加入胶原蛋白混合物中, 彻底混合。
注: 最后胶原蛋白浓度为 2 mg/mL。 - 使用200μl 管道通过 PDMS 设备的入口注入溶液, 直到整个腔内被填充。如果胶原蛋白混合物溢出通过支柱的缝隙, 切断多余的胶原蛋白凝胶与尖锐的手术刀片后凝胶化。
- 将设备保持在37°c 的孵化器中, 用5% 的 CO2保持 1小时, 以诱导凝胶化。
- 用培养基填充两侧的储层, 并将设备保存在37°c 的孵化器中, 并使用5% 的 CO2, 直到进行共聚焦成像。
4. 3D 成像和定量
- 将活细胞成像培养室安装在共聚焦显微镜上, 并分别预先设定温度和二氧化碳至37°c 和5%。为了提高湿度, 在室内的储罐中加水, 如有必要, 在室内放置湿巾。
- 将 PDMS 装置放置在腔内, 并将 EGF 添加到其中一个储层中, 作为梯度地层中 EGF 的 "源"。另一个水库将服务于发展空间分级 EGF 分布所需的 "汇"。本研究在水槽中加入了 2.5 nM egf, 使梯度达到 0.5 nmmm。
- 设置 z 堆栈的范围, 覆盖感兴趣的有机体的体积, 并开始成像。
注意: 为避免光毒性, 请尝试在共聚焦成像中降低激光强度, 或使用多光子成像技术。 - 使用商业软件或定制程序从2D 图像堆栈重建3D 图像。测量从有机细胞延伸的分枝的长度和角度或单个细胞的迁移。在这里, 使用 ImageJ 在有机体周围绘制手绘轮廓来执行量化。
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Representative Results
EGF 是乳腺分枝形态发生的重要调节剂, 也是指导浸润性癌症生长中乳腺上皮细胞迁移的关键趋化剂。我们使用上述介观流体器件来研究细胞对定义的 EGF 梯度的反应 (图 1a, b)10。该装置产生5毫米宽、10毫米长、1毫米高的养区。培养区的两侧由六角形柱从开井中分离, 这些柱通过表面张力将液体 ECM 和细胞混合物捕获在细胞培养区内。我们注意到, 考虑到这种3D 文化的大小, 通过光刻10构建合适尺寸的模具将非常困难、昂贵且耗时.通过采用标准技术--立体平版印刷的新应用, 我们快速、廉价地生产了这种模具。此外, 通过修改设计, 可以诱导芯片中的指数梯度 (图 1c, i) 或多个线性梯度 (图 1c, ii) 以及具有连续流动的稳定梯度 (图 1c, iii)。
在硅胶 (图 2a、b、c)和体外 (图 2A、e、f)测试中, 都显示了在整个细胞培养区形成稳定的线性 egf 梯度的情况, 这种梯度持续了大约两天, 但没有补充源 "和" 接收 "水库。利用商业化的多物理场软件模拟了蛋白质的时间依赖性扩散。在软件上重新创建了腔体结构的三维几何形状, 并确定并绘制了腔体体积内的平均浓度图。这些结果表明, EGF, 6.4 KDA 蛋白, 可以在上述在相对较短的时间内制备的胶原蛋白凝胶中形成稳定的基于扩散的梯度。我们还确定, 使用这种方法可以形成类似的1、10和 150 kDa 蛋白质分布。
乳腺有机体在空间均匀 2.5 nM EGF 的存在下形成多个分支, 分枝形成在3天内无方向偏差 (图 3a, d)。但是, 如果以 0.5 nmmm 的线性梯度形式添加 egf, 则分支形成显示出明显的方向偏差 (图 3B, e)。然而, 我们没有检测到同一梯度中的单个细胞有这样的偏差。为了确定是否有必要进行多细胞通信的梯度响应, 我们探讨了是否阻止细胞间间隙连接与各种抑制剂将防止有偏倚的分支的形成。缝隙结抑制剂确实抑制了有机体对梯度的反应能力 (图 3C, f)。正如在描述这种方法的原始研究10中更广泛地探讨的那样, 这一结果支持了这样的假设, 即通过缝隙连接点的通信对于乳腺有机体 10中 egf 梯度响应是必要的。
图1。具有定义 EGF 梯度的中氟化装置。(A) PDMS 芯片的3d 视图: (i) 模具的顶部视图和 (ii) 模具的前视图 (单位: mm) (iii) 从模具中填充 PDMS (透明) (iv) 从模具上填充的一系列模具 (红色) (v) 组装设备的示意图 (vi) 设备的真实图像填充与胶原蛋白凝胶和培养基。(B)中流体室的示意图, 其中含有嵌入胶原蛋白凝胶凝胶的有机体, 以及导致 egf 梯度的高 (红色) 和低 (红色) egf 浓度的储层 (这一数字已从10)修改。(C)诱导指数梯度 (i)、芯片中四种不同线性梯度 (ii) 和连续流动的稳定梯度 (三) 的潜在设计。红色区域表示充满培养基和灰色区域的源或汇表示充满凝胶细胞混合物的腔。请点击这里查看此图的较大版本.
图2。评估整个芯片的配体梯度。(A)模拟整个芯片上的配体浓度, 显示梯度分布。模拟梯度分布 (b) 1 kda 蛋白和(c) 70 kda 蛋白。(D)具有 10 Kda Dextran blue 线性梯度的装置图像, 用于可视化 egf 的扩散。六角形虚线表示凝胶区一侧的柱。芯片上1、10和 150 kDa 右旋糖酐的实验梯度剖面 (这一数字已从 Ellison 等人 2016年10人修改过, 在8小时后修改) (e) , ( f)在48小时后修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图3。细胞对 EGF 梯度的反应。(A)具有均匀 2.5 NM EGF 的胶原蛋白中的有机体的非定向分枝。(B)胶原蛋白中有机体的定向分枝, 线性梯度为 egf 0.5 nM/mm。(C)有机体在 egf 的线性梯度 0.5 nmmm 中的非定向分枝, 并具有缝隙结阻滞剂。(D-F)与 (A)-(C) 相对应的有机体分枝方向的角直方图。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
PDMS 模具的制造是使用商业3D 打印服务进行的, 但也可以通过内部高端3D 打印机来完成。在各种3D 制造方法中, 建议采用立体平版印刷来生成高分辨率模具。由于 PDMS 固化是在高温 (80°c) 下进行的, 因此如果将打印外包, 材料应具有足够的耐热性, 应明确指定。可以与印刷服务公司讨论热后固化问题, 以提高零件的耐热性。印刷服务和材料的细节在材料表中规定。
固化 PDMS 的力学性能取决于固化温度。如果 PDMS 混合物在烤箱中固化前长时间保持在室温下, 即使在完全固化后, 它也会变得过于弹性。因此, 室温下的脱气过程应在1小时或更短的时间内完成。脱气是指真空的循环应用, 可以帮助去除 PDMS 中的任何微气泡。
胶原蛋白溶液的 pH 值不仅对凝胶化至关重要, 而且对细胞活力也至关重要。如果胶原蛋白在与细胞混合前没有中和, 细胞的活力就会很低。用于中和胶原蛋白混合物的 1 n NaOH 溶液的量取决于原胶原蛋白溶液的 pH 值, 可以从理论上计算。但是, 建议将 NaOH 溶液逐渐添加到胶原蛋白溶液中, 使用苯酚红色指示器或使用 pH 测试带检查介质的 pH 读数。
在整个过程中, 凝胶的脱气非常重要。如果在胶原蛋白混合物注入设备后的凝胶过程中形成气泡, 也可以通过将设备放在冰上10分钟或更长时间来去除。通过降低温度, 气泡的大小减小, 并且空洞最终被凝胶混合物占据。当气泡在储层中加入培养基后被困在柱子之间时, 也可以使用同样的方法。
我们利用这一技术创造了中流体器件, 允许将大型多细胞结构嵌入到与生理相关的细胞外基质环境中, 并将其与生长因子和其他可溶性的定义梯度相结合生物活性分子。高分辨率立体平版印刷使我们能够生产高质量、低成本的模具。制作过程不需要洁净室设施, 也不需要光刻技术, 因此可以简单而有效地生成用于细胞培养和实验的3D 环境, 与传统的2D 相比, 具有多重优势实验。这里所说明的设备设计的养殖面积为5毫米宽、10毫米长、1毫米高。相对较大的养殖区域, 高度较厚, 可生长中尺度大的有机生物或球体, 大小从几十微米到数百微米不等。它还允许分析分支上皮形态发生, 并分析集体和单个细胞在三维环境中的迁移。该设备的侧面是开放井, 允许使用标准移液器更换介质或添加药物, 而不需要与液体控制装置进行复杂的接口, 通常用于主流微流体设备。此外, PDMS 室和底部盖板玻璃的简单配置与各种微观系统普遍兼容。这些装置的使用显示了正常乳腺组织形态发生的偏颇分枝方向, 以响应所施加的 EGF 梯度, 作为该装置使用的一个典型例子。然而, 这种用法也可以推广到不同的组织, 细胞来源, 趋化因子, 和药物的细胞组织行为的分析在3D。使用还可以扩展, 以适应更现实的组织建模, 这将容纳血管网络形成从个别细胞在凝胶和纳入其他细胞类型, 包括间充质间质和免疫成分和不同的上皮细胞类型。
尽管立体平版印刷在3D 打印技术中提供了最好的分辨率, 但最小特征大小仍然限制在几十微米。因此, 该协议不足以取代在几个微米范围内制造模具的光刻技术。该协议的另一个局限性是, 与 x-y 方向相比, z 方向上高质量成像的深度相对较低, 这是使用传统显微镜进行成像组织规模结构的一个固有问题。然而, 即使有这些限制, 所描述的方法可以提供一个强大而灵活的分析平台, 易于制造和使用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了向 AJE (NSF PD-11-7246、乳腺癌研究基金会 (BCRF-17-048) 和 NCI U54 CA210173) 和 AL (U54CA209992) 的赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
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