Summary
Wir beschreiben eine Methode, um Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multikellulären Organoiden zu experimentieren. Dieses Gerät ermöglicht die Analyse von zellulären Reaktionen auf lösliche Signale in 3D-Mikroumgebungen mit definierten Chemoattractged-Steigungen. Organoide sind besser als einzelne Zellen, wenn es um die Erkennung schwacher lauter Eingänge geht.
Abstract
Verschiedene Begrenzungen von 2D-Zellkultursystemen haben Interesse an 3D-Zellkulturen und-analyseplattformen geweckt, die die räumliche und chemische Komplexität lebender Gewebe besser nachahmen und in vivo-Gewebefunktionen nachahmen würden. Die jüngsten Fortschritte in der Mikrofabrikationstechnologie haben die Entwicklung von 3D-Umgebungen in vitro-Umgebungen erleichtert, in denen Zellen in eine klar definierte extrazelluläre Matrix (ECM) und eine definierte Reihe löslicher oder matrix assoziierter Biomoleküle integriert werden können. Die technologischen Barrieren haben jedoch ihren weit verbreiteten Einsatz in Forschungslabors eingeschränkt. Hier beschreiben wir eine Methode, um einfache Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multizellulären Organoiden in 3D-Mikroumgebungen mit einem definierten Chemoattractant Farbverlauf zu experimentieren. Wir veranschaulichen die Nutzung dieser Plattform zur Analyse der Reaktion von Epithelzellen und Organoiden auf die Abstufungen von Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF). EGF-Steigungen waren in den Geräten für mehrere Tage stabil, was zu einer gerichteten Zweigbildung bei Brustorganoiden führte. Diese Analyse ließ zu dem Schluss kommen, dass die kollektive Gradientenwahrung durch Zellgruppen empfindlicher gegenüber einzelnen Zellen ist. Wir beschreiben auch die Herstellungsmethode, die weder Photolithografieanlagen noch fortgeschrittene Soft-Lithografie-Techniken erfordert. Diese Methode wird hilfreich sein, um 3D-zelluläre Verhaltensweisen im Zusammenhang mit der Analyse von Entwicklung und pathologischen Zuständen, einschließlich Krebs, zu untersuchen.
Introduction
In physiologischer Umgebung sind Zellen in eine extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet und einer Fülle von Biomolekülen ausgesetzt. Wechselwirkungen zwischen Zellen und der umgebenden Mikroumgebung regulieren intrazelluläre Prozesse, die verschiedene Phenotypen steuern, darunter Migration, Wachstum, Differenzierung und Überleben1, 2. In einer herkömmlichen 2D-Zellkultur wurde viel über zelluläre Verhaltensweisen gelernt. Mit dem Aufkommen von intravitalen Bildgebungen und Experimenten mit Zellen, die in 3D-Hydrogelen eingebettet sind, wurden jedoch wichtige Unterschiede in den Zellverhalten in den vereinfachten 2D-In-vitro-Kulturen vs. 3D-Gewebehung-ähnlichen Umgebungen erkannt. Während die Zellen mit ECM-Fasern interagieren und ihre mechanischen Eigenschaften innerhalb der 3D-Matrix spüren, ist die Materialsteifigkeit des Gels keine vollständig unabhängige Variable in einem 2D-In-vitro-System. Die Dimensionalität verändert die fokale Haftbildung, was zu einer unterschiedlichen Zellmorphologie und zum Verhalten führt. Darüber hinaus sind Zellen auf einer 2D-Oberfläche weniger Signalkassen ausgesetzt als Zellen, die in 3D für alle Richtungen offen sind.
Diese Einschränkungen haben die Interessen für 3D-Systeme erhöht, die die räumliche und chemische Komplexität lebender Gewebe repräsentieren und besser in vivo-Gewebefunktionen vorhersagen. Sie wurden in vielen Formen entwickelt, von Organoiden als sich selbst zusammenstellende zelluläre Mikrostrukturen bis hin zu Zellen, die zufällig in ECM3,4durchsetzt sind. Die jüngsten Fortschritte in der Mikrofabrikationstechnologie haben das Aufkommen verschiedener Arten von 3D-Kultursystemen5,6,7, 8, 9 fürdie Untersuchung phänotypischer Veränderungen und Mobilartige Reaktionen auf lösliche Signale; Technische Barrieren schränken jedoch den weit verbreiteten Einsatz in Forschungslabors ein. In vielen Fällen erfordern die Herstellungsprozesse Photolithografietechniken und Hintergrundwissen für weiche Lithografie. Darüber hinaus müssen verschiedene Faktoren kontrolliert werden, um ein Gerät erfolgreich zu bauen und über einen langen Zeitraum eine optimale Funktion des Gerätes zu erreichen.
Unsere Methode beschreibt, wie man ein 3D-PDMS-Gerät konstruiert, um Zellen und multizelluläre Organoide in eine 3D-Mikroumgebung mit definierten Chemoattracten-Farbverläufen zu integrieren und dann epitheliale Reaktionen auf EGF10zu analysieren. Unsere Daten zeigen, dass die Fähigkeit von Organoiden, auf flache EGF-Steigungen zu reagieren, aus der interzellulären chemischen Kopplung durch Spaltknoten entsteht. Es schlägt das Potenzial von Organoiden für eine präzisere Erkennung von schwachen und lauten räumlich gestaffelten Eingängen vor. Der Herstellungsprozess erfordert weder eine Reinraumanlage noch Photolithografietechniken. Das 3D-PDMS-Gerät enthält jedoch notwendige Faktoren der 3D-physiologischen Umgebung. Diese Methode wird hilfreich sein, um 3D-zelluläre Verhaltensweisen zu studieren und es hat ein großes Forschungspotenzial mit verschiedenen Zelltypen, Chemoattractants und ECM-Kombinationen.
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Protocol
Alle Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee, Johns Hopkins University, School of Medicine, geprüft und genehmigt wurden.
1. Herstellung des mesofluidischen Geräts
- Entwerfen Sie die Maske der Form für PDMS-Gerät mit einer 3D-CAD-Software.
- Drucken Sie die Form mit Stereolithografiegeräten mit einem wärmebeständigen Harz.
Hinweis: Die hier beschriebenen Verfahren wurden von einem kommerziellen 3D-Druckdienst durchgeführt. - Mischen Sie eine PDMS-Monomerlösung mit dem Härtemittel in einem 10:1-Verhältnis gründlich. 3 mL PDM-Mischung wurde für die Herstellung des Gerätes benötigt. Das Gesamtvolumen hängt von der Anzahl der zu fertiger Formen ab.
- Das Gemisch durch den Einsatz eines eigenen Laborvakuums oder einer Vakuumpumpe in einem Vakuumtrockner 1 Stunde abstaubar.
- Die Oberfläche der Form mit einem Klebeband ablöschen, um Staub zu entfernen, und dann die PDMS-Mischung in die Form gießen. Wenn Blasen in den Prozess eingeführt werden, wiederholen Sie die Entgasung im Vakuumtrockner. Blasen, die zwischen den Säulen der Form gefangen sind, können entfernt werden, indem man sie mit einer scharfen Nadel versenkt.
Achtung: Der Entgasungsprozess bei Raumtemperatur sollte innerhalb von 1 Stunde oder weniger durchgeführt werden. - Sichern Sie den PDMS, indem Sie bei 80 ° C für 2 Stunden heizen. Lassen Sie die Form bei Raumtemperatur abkühlen.
- Schneiden Sie die Grenze zwischen Schimmel und PDMS mit einer Klinge und schälen Sie dann PDMS von der Form vorsichtig ab.
- Das PDMS-Teil auf die 22 mm x 22 mm Coverslip montieren und ein Loch am Eingang schlagen.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Reinigen Sie das PDMS-Keil und 22 mm x 22 mm Koverslip, indem Sie die Oberflächen mit Lowlint-Gewebe und 70% Ethanol abwischen. Dann große Staubpartikel entfernen, indem sie mit einem Klebeband abnehmen.
- Sterilisieren Sie das PDMS-Teil und kupfen Sie entweder durch Autoklaven (121 ° C für 8 Minuten nass, 15 Minuten trocken) oder durch UV-Licht für 1 Stunde.
- Die Unterseite des PDMS-Teils behandeln und mit einer Korona-Auslasspistole 5 min in der Gewebekultur abdecken und dann miteinander verbinden.
CAUTION: Legen Sie alle nicht leitenden Materialien wie Polystyrol-Schaum auf den Boden und entfernen Sie dabei alle leitenden Materialien. Sammeln innerhalb von 5 Minuten nach der Behandlung in das Gerät einspritzen, um die Bindung zwischen Kollagengel und Glaskappenlippe zu erhöhen.
2. Zellvorbereitung: Primäres Säugetierorganoid-Isolierung
Hinweis: Die Details der Säugetierung der Organoiden finden Sie in einem früheren Werk 11. Jede Art von Einzelzelle oder Organoid kann nach eigenen Isolation-/Ablösungsprotokollen hergestellt werden.
- Das Brustdrüsengewebe der Mäuse mit einem Skalpell würfeln, bis sich das Gewebe entspannt und 30 min bei 37 ° C in 50 mL Collagenase-/Trypsin-Lösung (10 mL pro Maus) in DEME/F12 mit 0,1 g Trypsin, 0,1 g Kollagenase, schütteln , 5 mL FBS, 250 μL von 1 μg/mL Insulin und 50 μL von 50 μg/mL gentamicin.
- Zentrifuge die Collagenase/trypsin Lösung mit 1.250 x g für 10 min. Entfernen Sie den Supernatant durch Aspiration. Die Zellen in 10 mL von DMEM/F12 und die Zentrifuge mit 1.250 x g für 10 min zerlegen. Nach dem Entfernen von DMEM/F12 durch Aspiration, wieder Suspendierung von Zellen in 4 ml DMEM/F12 mit 40 μL DNase (2 units/μL) ergänzt.
- Schütteln Sie die DNase-Lösung von Hand für 2-5 min und dann Zentrifuge mit 1.250 x g für 10 min.
- Trennen Sie Organoide von einzelnen Zellen durch vier Differentialzentrifugationen (pulsieren Sie auf 1.250 x g und stoppen Sie die Zentrifuge 3-4 s, nachdem sie die beabsichtigte Geschwindigkeit erreicht hat). Zwischen jedem Puls, saugen Sie den Supernatant und erneuern Sie das Pellet in 10 mL DMEM/F12.
- Das abschließende Pellet in der gewünschten Menge an Wachstumsmedium von DMEM/F12 mit 1% Penicillin/Streptomycin und 1% Insulin-Transferrin-selenium-X für die Kollagenvorbereitung neu aussetzen.
3. Kollagenvorbereitung und Injektion
Hinweis: Andere ECM-Gele können nach eigenen Gelengeprotokollen hergestellt werden.
- Bereiten Sie Collagen-Typ I-Lösung (3,78 mg/mL), 10x DMEM, 1 N NaOH-Lösung, normales Wachstumsmedium auf Eis.
Achtung: Halten Sie Eis auf, bis das Verfahren abgeschlossen ist. - 6 μL von 1 N NaOH-Lösung, 200 μL Wachstumsmedium und 50 μL von 10x DMEM in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr geben und die Lösung gründlich vermischen.
- 425 μL Kollagen in die vorgemischte Lösung geben und durch Pipettieren gründlich mischen.
- Zentrifugen Sie die Kollagenmischung kurz (weniger als 5 Sekunden), um Blasen aus der Mischung zu trennen und zu entfernen.
- Halten Sie die neutralisierte Kollagenlösung 1 Stunde lang auf Eis, um die Faserbildung zu induzieren.
- 50 μL Zellaufhängung in das Kollagen-Gemisch geben und gründlich mischen.
Hinweis: Die endgültige Kollagenkonzentration beträgt 2 mg/mL. - Die Lösung mit 200 μL Pipet über den Eingang des PDMS-Geräts eingeben, bis die ganze Kammer ausgefüllt ist. Wenn das Kollagengemisch durch die Lücken der Säulen überfließt, schneiden Sie das überschüssige Kollagengel mit scharfem OP-Klinge nach Gelation aus.
- Halten Sie das Gerät im Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO2 für 1 Stunde, um Gelation zu induzieren.
- Füllen Sie die Behälter beidseitig mit Wachstumsmedium aus und halten Sie das Gerät bei 37 ° C mit 5% CO2 im Inkubator, bis eine konfokale Bildgebung durchgeführt wird.
4.3D-Bildgebung und Quantifizierung
- Installieren Sie eine Live-Zell-Bildationskammer in ein konfokales Mikroskop und stellen Sie die Temperatur und CO 2 auf 37 ° C bzw. 5% vor. Um Feuchtigkeit zu erhöhen, Wasser in den Behälter der Kammer geben und bei Bedarf nasse Tücher in die Kammer legen.
- Legen Sie das PDMS-Gerät in die Kammer und fügen Sie EGF zu einem der Reservoirs als "Quelle" des EGF in der Gradientenbildung hinzu. Das andere Reservoir wird einem "Spülbecken" dienen, das für die Entwicklung der räumlich gestaffelten EGF-Verteilung benötigt wird. 2,5 nM EGF wurde in der Spüle für die Herstellung der Steigung von 0,5 nM/mm in dieser Studie hinzugefügt.
- Stellen Sie die Palette des Z-Stapels ein, der das Volumen der organoiden von Interesse abdeckt, und starten Sie die Bildgebung.
CAUTION: Um die Phototoxizität zu vermeiden, versuchen Sie eine geringere Laserintensität in der konfokalen Bildgebung oder verwenden Sie Multi-Photon-Bildgebungstechniken. - Rekonstruieren Sie ein 3D-Bild aus 2D-Bildstapel mit kommerzieller Software oder einem maßgeschneiderten Programm. Messen Sie die Länge und den Winkel der Zweige, die sich von den Organoiden oder der Migration einzelner Zellen erstrecken. Führen Sie hier die Quantifizierung durch, indem Sie mit ImageJ eine freie Umrisslinie um den organoiden Körper ziehen.
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Representative Results
EGF ist ein wesentlicher Regulator für die Verzweigung der Morphogenese in Brustdrüsen und ein kritischer Chemoattractant, der die Migration von Brusepithelzellen bei invasivem Krebswachstum leitet. Wir haben die oben beschriebenen mesoskopischen fluidischen Geräte verwendet, um die Reaktion der Zellen auf definierte EGF-Fardienten zu untersuchen (Abbildung 1A, B) 10. Das Gerät ergibt einen 5 mm breiten, 10 mm langen und 1 mm großen Kulturbereich. Die Seiten des Kulturraums sind durch sechseckige Säulen von offenen Brunnen getrennt, mit denen die flüssige ECM und die Zellmischung durch Oberflächenspannung in den Zellkulturbereich eingeklemmt werden. Wir stellen fest, dass es angesichts der Größe dieser 3D-Kultur sehr schwierig, teuer und zeitaufwendig wäre, eine entsprechend große Form durch Photolithographie 10 zu konstruieren. Durch die Verwendung einer neuartigen Anwendung einer Standardtechnik, der Stereolithographie, haben wir die Form schnell und kostengünstig hergestellt. Darüber hinaus kann durch die Änderung des Designs ein exponentieller Farbverlauf(Abbildung 1C, i) oder mehrere lineare Farbverläufe in einem Chip (Abbildung 1C, ii) sowie ein stabiler Farbverlauf mit kontinuierlichem Durchfluss induziert werden (Abbildung 1C, iii).
Sowohl in silico (Abbildung 2A, B,C) als auch in vitro (Abbildung 2D, E, F)zeigten die Bildung eines stabilen linearen EGF-Gefälles im gesamten Zellkulturbereich, der etwa zwei Tage dauerte, ohne die ' Quelle "und" Spüle "Reservoirs. Die zeitabhängige Diffusion der Proteine wurde mit einer kommerzialisierten Multiphysik-Software simuliert. Die 3D-Geometrie der Kammerkonfiguration wurde auf der Software nachgebildet und die durchschnittliche Konzentration innerhalb des Kammervolumens ermittelt und gezeichnet. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass EGF, ein 6,4 kNach-Protein, innerhalb des Kollagengels, wie oben beschrieben, über einen relativ kurzen Zeitraum einen stabilen diffusionsbasierten Farbverlauf bilden kann. Wir haben auch festgestellt, dass mit dieser Methode ähnliche Proteinprofile von 1, 10 und 150 kDa gebildet werden können.
Mammuma-Organoide bildeten mehrere Äste in Anwesenheit von räumlich gleichmäßigem 2,5 nM EGF und die Filialbildung zeigte keine Richtungsneigung über 3 Tage (Abbildung 3A, D). Wenn EGF jedoch in Form eines linearen Gradienten von 0,5 nM/mm hinzugefügt wurde, zeigte die Filialbildung eine signifikante Richtungsneigung (Abbildung 3B, E). Allerdings haben wir keine solche Voreingenommenheit für einzelne Zellen im gleichen Farbverlauf festgestellt. Um festzustellen, ob eine multizelluläre Kommunikation für die Gradientenreaktion notwendig war, wurde untersucht, ob die Blockierung von interzellulären Spaltknotenpunkten mit verschiedenen Inhibitoren die voreingenommene Filialbildung verhindern würde. Die Spaltknotenhemmer unterdrückten in der Tat die Fähigkeit der Organoide, auf den Gefälle zu reagieren (Abbildung 3C, F). Wie in der ursprünglichen Studie, die diese Methode10beschreibt, ausführlicher untersucht wird, unterstützt dieses Ergebnis die Hypothese, dass die Kommunikation durch Spaltknoten für die EGF-Gradientenreaktion bei Säugetierorganoiden 10 notwendig ist.
Bild 1. Mesofluidic-Gerät mit definiertem EGF-Gefälle. (A) 3D-Ansicht des PDMS-Chips: (i) obere Ansicht und (ii) Frontansicht einer Form (Einheit: mm) (iii) ein Array von Formen (rot) gefüllt mit PDMS (transparent) (iv) PDMS-Kammern, die von der Form (v) abgeflickt werden, ein schematisches Diagramm eines zusammengesetzten Gerätes (vi) ein echtes Bild der Gerätefüllung Mit Kollagen-Gel und Kulturmedium. (B) Ein schematisches Diagramm der mesofluidischen Kammer mit Organoiden, die in ein Kollagengel eingebettet sind, und Behältern von hoher (rot) und niedriger (rot) EGF-Konzentration, die zu EGF-Feigungen führt (Diese Zahl wurde ab 10 geändert). (C) Mögliche Konstruktionen zur induzierten eines exponentiellen Gefälles (i), vier verschiedene lineare Farbverläufe in einem Chip (ii) und ein stabiler Farbverlauf mit kontinuierlichem Fluss (iii). Rote Regionen zeigen Quellen oder Spülbecken, die mit Kulturmittelleitern gefüllt sind, und graue Regionen zeigen Kammern, die mit Gel/Zell-Mischungen gefüllt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 2. Auswertung von Ligand-Steigungen auf dem Chip. (A) Simulation der Ligakonkonzentration über den Chip, der Gradientenprofile zeigt. Simulierte Gradientenprofile von (B) 1 kDa und (C) 70 kDa Protein. D) Bild des Geräts mit einem linearen Gefälle von 10 kDa Dextran Blue verwendet, um die Verbreitung von EGF zu visualisieren. Sechseckgetierte Linien zeigen Säulen an der Seite des Gel-Bereichs. Experimentelle Gradientenprofile von 1, 10 und 150 kDa dextran auf dem Chip (Diese Zahl wurde von Ellison et al. 201610) (E) nach 8 Stunden und (F ) nach 48 Stunden modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 3. Zelluläre Reaktion auf EGF-Gefälle. (A) nicht-richtungsweisende Verzweigung von Organoiden in Kollagen mit einem einheitlichen 2,5 nM EGF. B) Richtliche Verzweigung von Organoiden in Kollagen mit einem linearen Gefälle von 0,5 nM/mm EGF. C) nicht-direktionale Verzweigung von Organoiden in einem linearen Gefälle von 0,5 nM/mm EGF mit einem Spaltknotenblocker. (D-F) Winkelhistogramme von Organoidverzweigungsrichtungen, die (A)-(C) entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Herstellung von PDMS-Formen erfolgte mit einem kommerziellen 3D-Druckservice, kann aber auch mit einem High-End-3D-Drucker im eigenen Haus durchgeführt werden. Die Stereolithographie wird unter den verschiedenen 3D-Fertigungsmethoden für hochauflösende Formengenerationen empfohlen. Da die PDMS-Härtung bei einer hohen Temperatur (80 ° C) erfolgt, sollten die Materialien ausreichend thermisch beständig sein, was bei Auslagerung des Drucks explizit angegeben werden sollte. Eine thermische Nachkur kann mit dem Druckdienstleister besprochen werden, um die thermische Beständigkeit des Bauteils zu erhöhen. Die Details des Druckdienstes und der Materialien sind in der Materiallisteaufgeführt.
Die mechanische Eigenschaft der gehärteten PDMS hängt von der Aushärtungstemperatur ab. Wird das PDMS-Gemisch vor dem Aushärten im Ofen lange bei Raumtemperatur gehalten, wird es auch nach der vollständigen Aushärtung zu elastisch. Der Entgasungsprozess bei Raumtemperatur sollte daher innerhalb von 1 Stunde oder weniger erfolgen. Degassing bezieht sich auf eine zyklische Anwendung des Vakuums, die helfen kann, alle Mikroblasen innerhalb von PDMS zu entfernen.
Der pH-Wert der Kollagen-Lösung ist nicht nur für die Gelation, sondern auch für die Zelllebensfähigkeit entscheidend. Wird Kollagen vor der Vermischung mit Zellen nicht neutralisiert, ist die Zelllebensfähigkeit gering. Die Menge der 1 N NaOH-Lösung zur Neutralisierung des Kollagengemischs hängt vom pH-Wert der ursprünglichen Kollagenlösung ab und kann theoretisch berechnet werden. Es wird jedoch empfohlen, die NaOH-Lösung schrittweise in die Kollagenlösung einzufügen, die pH-Messwerte des Mediums mit Phenol-roten Indikator oder mit pH-Testbändern zu überprüfen.
Die Entnahme des Gels ist während des gesamten Prozesses wichtig. Wenn sich beim Gelten Blasen bilden, nachdem das Kollagengemisch in das Gerät injiziert wird, können sie auch entfernt werden, indem man das Gerät für 10 Minuten oder mehr auf Eis legt. Durch den Absturz der Temperatur verringert sich die Größe der Blasen und die Hohlräume werden schließlich durch das Gel-Gemisch belegt. Die gleiche Methode kann verwendet werden, wenn Blasen zwischen den Säulen eingeklemmt werden, nachdem man den Stauseen ein Kulturmedium hinzugefügt hat.
Wir nutzten diese Technologie, um mesofluidische Geräte zu schaffen, die es erlauben, große multizelluläre Konstrukte in eine physiologisch relevante extrazelluläre Matrixumgebung einzubetten und sie mit definierten Farbverläufen von Wachstumsfaktoren und anderen löslichen Bioaktive Moleküle. Die hochauflösende Stereolithographie ermöglichte es uns, hochwertige, kostengünstige Formen herzustellen. Der Herstellungsprozess erfordert weder Reinraumeinrichtungen noch Photolithografietechniken und ermöglicht so eine einfache, aber effektive Erzeugung einer 3D-Umgebung für Zellkultur und Experimente, die mehrere Vorteile gegenüber dem traditionellen 2D hat. experimentieren. Das hier abgebildete Gerät wurde so konzipiert, dass es einen Kulturraum von 5 mm breit, 10 mm lang und 1 mm groß hat. Das relativ große Kulturgebiet mit dickerer Höhe ermöglicht das Wachstum von mesoskopisch großen Organoiden oder Spheroiden, die von zehn bis zu Hunderten Mikrometern reichen. Es ermöglicht auch die Analyse der verzweigten epithelialen Morphogenese und die Analyse der kollektiven und einzelnen Zellmigration innerhalb der 3D-Umgebung. Die Seiten des Geräts sind offene Brunnen, die den Einsatz von Standard-Pipetten ermöglichen, Medien zu ändern oder Medikamente hinzuzufügen, ohne dass eine komplizierte Verkleidung mit den Flüssigkeitskontrollgeräten, die in der Regel für Mainstream-mikrofluidische Geräte verwendet werden. Darüber hinaus ist die einfache Konfiguration einer PDMs-Kammer und eines Abdeckglases am Boden universell kompatibel mit verschiedenen mikroskopischen Systemen. Der Einsatz der Geräte zeigte die voreingenommene Verzweigung der Morphogenese im normalen Brustgewebe als Reaktion auf den aufgezwungenen EGF-Gefälle als repräsentatives Beispiel für die Verwendung des Geräts. Diese Verwendung kann aber auch auf verschiedene Gewebe, Zellquellen, Chemoattractants und Medikamente zur Analyse von Zellgewebeverhalten in 3D ausgeweitet werden. Der Einsatz kann auch erweitert werden, um eine realistischere Gewebe-Modellierung, die Gefäßnetzbildung aus einzelnen Zellen innerhalb des Gels zusammen mit der Einbeziehung von anderen Zelltypen, einschließlich mesenchymale Strom und Immunkomponenten, unterbringen würde Und verschiedene Epithelzelltypen.
Obwohl die Stereolithographie die feinste Auflösung unter den 3D-Drucktechniken bietet, ist die minimale Größe der Eigenschaften immer noch auf mehrere Dutzend Mikrometer begrenzt. Daher reicht dieses Protokoll nicht aus, um die Photolithographie bei der Herstellung von Formen im Maßstab von mehreren Mikrometern zu ersetzen. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist die relativ geringe Tiefe der hochwertigen Bildgebung in der z-Richtung im Vergleich zur x-y-Richtung, die ein inhärentes Problem der bildgebenden Gewebekonstrukte mit konventioneller Mikroskopie ist. Doch auch bei diesen Einschränkungen kann die beschriebene Methode eine leistungsfähige und flexible Analyseplattform bieten, die einfach zu fabrizieren und zu verwenden ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien an AJE (NSF PD-11-7246, Breast Cancer Research Foundation (BCRF-17-048) und NCI U54 CA210173) und AL (U54CA209992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
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