Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

Published: May 24, 2019 doi: 10.3791/59226
Automatic Translation
1, 2, 1, 2,3, 1
1Department of Biomedical Engineering and Yale Systems Biology Institute, Yale University, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, 3Center for Cell Dynamics and Department of Cell Biology, Johns Hopkins University

Summary

אנו מתארים שיטה לבניית התקנים לתרבות תלת-ממדית ולניסויים בתאים ובאורגנואידים רב-תאיים. התקן זה מאפשר ניתוח של תגובות הסלולר אותות מסיסים בסביבות תלת-ממד עם מעברי צבע כימותסטנט מוגדרים. אורגנואידים הם טובים יותר מאשר תאים בודדים בזיהוי של כניסות רעש חלש.

Abstract

מגבלות שונות של 2D מערכות תרבות תא יש התעניינות בתרבות תא תלת-ממד ופלטפורמות ניתוח, אשר יהיה טוב יותר לחקות את המורכבות המרחבית והכימית של רקמות החיים ולחקות בפונקציות רקמה vivo. ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיות microfabrication הקלו את ההתפתחות של 3D בסביבות מבחנה שבהם תאים ניתן לשלב לתוך מטריצה החילוץ מוגדר היטב (ECM) וערכה מוגדרת של מסיסים או מטריצה הקשורים. עם זאת, מחסומים טכנולוגיים הוגבלה שימוש נרחב במעבדות מחקר. כאן, אנו מתארים שיטה לבנות מכשירים פשוטים לתרבות תלת-ממדית וניסויים עם תאים ואורגנואידים רב-תאיים בסביבות תלת-ממד עם מעבר צבע כימוסטנט מוגדר. אנו ממחישים את השימוש בפלטפורמה זו לניתוח התגובה של תאים אפיתל ואורגנואידים למעברי צבע של גורמי גדילה, כגון גורם גידול באפידרמיס (EGF). מעברי הצבע EGF היו יציבים במכשירים במשך מספר ימים המובילים להקמת ענף בבימוי אורגנואידים השד. ניתוח זה איפשר לנו להסיק שמעבר הצבע הקולקטיבי הרגיש לפי קבוצות תאים רגיש יותר לעומת תאים בודדים. כמו כן, אנו מתארים את שיטת הייצור, אשר אינה דורשת מתקני פוטוגרפיה ולא טכניקות ליתוגרפיה רכות מתקדמות. שיטה זו תהיה מועילה לחקר התנהגויות סלולריות תלת-ממדית בהקשר של ניתוח התפתחות ומצבים פתולוגיים, כולל סרטן.

Introduction

בסביבה הפיסיולוגית, התאים מוטבעים במטריצה מועלת (ECM) ונחשפת למגוון רחב של biomolecules. אינטראקציות בין תאים לבין מיקרואקולוגיה סביב ויסות תהליכים תאיים השליטה בפנוטיפים מגוונים, כולל הגירה, צמיחה, בידול והישרדות1,2. הרבה למדו על התנהגויות סלולריות בתרבות התא 2D קונבנציונאלי. עם זאת, עם הופעתו של הדמיה וניסויים עם תאים המוטבעים בתוך 3D הידרוג'לים, הבדלים חשובים התנהגויות תא זוהו ב-2D פשוטה בתרבויות מבחנה לעומת 3D רקמות כמו בסביבות. בעוד תאים אינטראקציה עם סיבי ECM ולחוש תכונות מכניות שלהם בתוך מטריצה תלת-ממדית, קשיחות החומר של ג'ל אינו משתנה בלתי תלוי לחלוטין ב-2D במערכת מבחנה. הממד משנה מערך הדבקה מוקד, וכתוצאה מכך מורפולוגיה והתנהגות של תאים שונים. יתר על כן, תאים על פני שטח דו-ממדי חשופים ליותר אותות איתות מאשר תאים הפתוחים לכל הכיוונים ב-3D.

מגבלות אלה הגדילו את האינטרסים עבור מערכות 3D המייצגים את המורכבות המרחבית והכימית של רקמות החיים ולנבא טוב יותר בפונקציות vivo רקמה. הם פותחו בצורות רבות של אורגנואידים כמו הרכבה עצמית מיקרו מבנים סלולריים לתאים באופן אקראי ב ecm3,4. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות microfabrication הקלו את הופעתו של סוגים שונים של 3d מערכות תרבות5,6,7,8,9 עבור לימוד שינויים פנוטיפים ו תגובות סלולריות לאותות מסיסים; עם זאת, מחסומים טכנולוגיים מגבילים את השימוש הנרחב במעבדות המחקר. במקרים רבים, תהליכי הייצור דורשים טכניקות ליתוגרפיה ורקע לדפוס רך. יתר על כן, גורמים שונים חייבים להיות נשלט כדי לבנות בהצלחה מכשיר להשיג פונקציה אופטימלית של המכשיר על פני תקופה ארוכה של זמן.

השיטה שלנו מתארת כיצד לבנות התקן 3D PDMS לשילוב תאים ואורגנואידים רב-תאיים לתוך המיקרו מיקרו הסביבה עם מעברי הצבע המוגדרים כימוסטנט ולאחר מכן לנתח את התגובות האפיתל ל-EGF10. הנתונים שלנו חושפים כי הקיבולת של אורגנואידים להגיב על מעברי egf רדוד נובע צימוד כימי התרבות באמצעות צמתים הפער. הוא מציע את הפוטנציאל של אורגנואידים לזיהוי מדויק יותר של קלט מדורגים חלש ורועש מרחב. תהליך הייצור אינו מצריך מתקן חדר נקי ושיטות פוטוגרפיה. עם זאת, המכשיר 3D PDMS כולל את הגורמים הדרושים של הסביבה הפיסיולוגית 3D. שיטה זו תהיה מועילה ללמוד התנהגויות סלולר 3D ויש לו פוטנציאל מחקר גדול עם סוגי תאים שונים, כימומי, ו ECM שילובים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל עבודת החיות נערכה בהתאם לפרוטוקולים שנבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש, אוניברסיטת ג'ונס הופקינס, בית הספר לרפואה.

1. הייצור של המכשיר מסופלודיום

  1. עיצוב המסיכה של התבנית עבור התקן PDMS באמצעות תוכנת CAD 3D.
  2. הדפס את העובש באמצעות ציוד סטריאואוליתוגרפיה עם שרף עמיד תרמית.
    הערה: ההליכים המתוארים כאן בוצעו על-ידי שירות הדפסה תלת-ממדי מסחרי.
  3. מערבבים ביסודיות פתרון מונומר PDMS עם סוכן ריפוי ביחס 10:1. 3 מ ל של תערובת PDMS נדרש עבור הייצור של המכשיר. אמצעי האחסון הכולל תלוי במספר התבניות שיש לזייף.
  4. דגה את התערובת על ידי החלת ואקום עם שימוש בתוך הבית ואקום מעבדה או משאבת ואקום desiccator במשך שעה אחת.
  5. הפוך את המשטח של העובש עם סרט דביק כדי להסיר אבק, ולאחר מכן יוצקים את תערובת PDMS לתבנית. אם בועות מוצגים בתהליך, לחזור על הdesiccator ואקום. בועות לכוד בין עמודי העובש ניתן להסיר על ידי לדקור אותם עם מחט חדה.
    הערה: התהליך החסר בטמפרטורת החדר צריך להתבצע תוך שעה או פחות.
  6. לרפא את PDMS על ידי חימום ב 80 ° c עבור 2 שעות. הניחו לעובש להתקרר בטמפרטורת החדר.
  7. לחתוך את הגבול בין העובש ו-PDMS עם להב ולאחר מכן לקלף PDMS מן העובש בזהירות.
  8. לקצץ את החלק PDMS כדי להתאים את 22 מ"מ x 22 מ"מ coverslip ולחבוט חור על הים.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  9. לנקות את החלק PDMS ו 22 מ"מ x 22 מ"מ coverslip ידי ניגוב משטחים עם ברקמות נמוך-מוך ו 70% אתנול. לאחר מכן להסיר חלקיקי אבק גדולים על ידי באמצעות מדבקה דבק.
  10. לחטא את החלק PDMS ואת שמיכות על ידי אוטוקלינג (121 ° c עבור 8 דקות רטוב, 15 דקות יבש) או חשיפה לאור UV במשך שעה אחת.
  11. לטפל במשטח התחתון של חלק PDMS ולכסות את הכיסוי עם האקדח הכתר פריקה עבור 5 דקות בשכונה תרבות הרקמה ולאחר מכן קשר אותם יחד.
    התראה: הניחו חומר שאינו מתנהל כגון קלקר בתחתית והסירו את כל חומרי הניצוח בתהליך זה. הכנס את הקולגן לתוך המכשיר מיד, בתוך 5 דקות, לאחר הטיפול כדי להגדיל את הקשר בין ג'ל קולגן ושמיכות זכוכית.

2. הכנת תא: בידוד פריאיד ראשי לחלב

הערה: ניתן למצוא את פרטי הבידוד האורגמאיד בעבודה קודמת11. ניתן להכין כל סוג של תא יחיד או אורגנואיד בהתאם לפרוטוקולי הבידוד/ניתוק שלהם.

  1. האוהב את רקמת בלוטת החלב של העכברים עם אזמל עד הרקמה מרגיע לנער אותו 30 דקות ב 37 ° c ב 50 mL של הקולגן התמיסה/טריפסין פתרון (10 מ"ל לעכבר) ב DEME/F12 בתוספת עם 0.1 g של טריפסין, 0.1 g של הקולגנאז , 5 מ ל של FBS, 250 μL של 1 μg/mL אינסולין, ו 50 μL של 50 μg/mL gentamicin.
  2. צנטריפוגה את הקולגן התמיסה/טריפסין פתרון ב 1,250 x g עבור 10 דקות. הסר את הסופרנטנט על ידי השאיפה. לפזר תאים ב 10 מ ל של Dמאמ/F12, ו צנטריפוגה ב 1,250 x g עבור 10 דקות. לאחר הסרת Dמאמ/F12 על ידי השאיפה, להשעות מחדש תאים ב 4 מ ל של Dמאמ/F12 בתוספת עם 40 μL של DNase (2 יחידות/μL).
  3. לנער את הפתרון DNase ביד עבור 2-5 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,250 x g עבור 10 דקות.
  4. ארגונית נפרדת מתאים בודדים דרך ארבעה centrifugations דיפרנציאלי (הדופק 1,250 x g ולהפסיק את הצנטריפוגה 3-4 s לאחר שהוא מגיע למהירות המיועדת). בין כל פעימה, משלחים את הסופרנטאנט ומשלחים את הגלולה ב -10 מ ל/F12.
  5. השהה מחדש את הגלולה הסופית בכמות הרצויה של גידול בינוני של DMEM/F12 עם 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% אינסולין-הtransferrin-סלניום-X עבור הכנה קולגן.

3. הכנת קולגן והזרקה

הערה: סוגים אחרים של ג'לים ECM יכולים להיות מוכנים בהתאם לפרוטוקולי הגלגנציה שלהם.

  1. הכנת מסוג קולגן אני פתרון (3.78 mg/mL), 10x DMEM, 1 N NaOH פתרון, מדיום צמיחה רגילה על קרח.
    הערה: המשך בקרח עד להשלמת ההליך.
  2. הוסף 6 μL של 1 N NaOH פתרון, 200 μL של בינוני גדילה ו 50 μL של 10x DMEM לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש ולערבב את הפתרון ביסודיות.
  3. הוסף 425 μL של קולגן לתוך הפתרון טרום מעורב ולערבב ביסודיות על ידי ליטוף.
  4. צנטריפוגה את תערובת הקולגן בקצרה (פחות מ 5 שניות) כדי להפריד ולהסיר בועות מן התערובת.
  5. לשמור על הפתרון הקולגן מנוטרל על קרח 1 שעה כדי לגרום להיווצרות סיבים.
  6. הוסף 50 μL של השעיית תא לתוך תערובת הקולגן וערבבו ביסודיות.
    הערה: ריכוז הקולגן הסופי הוא 2 מ"ג/mL.
  7. הכנס את הפתרון באמצעות 200 μL pipet דרך החלל של התקן PDMS עד החדר כולו מתמלא. אם תערובת הקולגן גולשת דרך הפערים של העמודים, לגזור את ג'ל הקולגן עודף עם להב כירורגי חדה לאחר הגלציה.
  8. שמור את המכשיר בחממה ב 37 ° c עם 5% CO2 במשך שעה אחת כדי לגרום לגגנציה.
  9. ממלאים את המאגרים בשני הצדדים עם בינוני גדילה ולשמור את המכשיר בחממה ב 37 ° c עם 5% CO2 עד הדמיה קונפוקלית וקד מבוצע.

4.3D הדמיה וכימות

  1. התקנת תא חי הדמיה התמונה למיקרוסקופ קונפוקלית וקד ולהגדיר מראש את הטמפרטורה ו-CO2 כדי 37 ° צ' ו 5%, בהתאמה. כדי לקבל לחות, להוסיף מים במאגר של החדר ומניחים מגבונים רטוב בחדר במידת הצורך.
  2. הצב את התקן PDMS בתא והוסף EGF לאחד המאגר כ ' מקור ' של ה-EGF במערך מעבר הצבע. מאגר אחר ישרת ' כיור ' הדרושים לפיתוח התפלגות egf מדורגים מרחב. 2.5 nM של EGF נוספה הכיור לביצוע הדרגתי של 0.5 nM/mm במחקר זה.
  3. הגדר את הטווח של מחסנית Z המכסה את עוצמת הריבית של הארגון והפעל את ההדמיה.
    התראה: כדי להימנע מתמונות רעילות, נסה להשתמש בעוצמת לייזר נמוכה יותר בדימות ממוקד או השתמש בטכניקות הדמיה מרובות פוטון.
  4. בנייה מחודש של תמונה תלת-ממדית מערימות של תמונות דו-ממדיות באמצעות תוכנה מסחרית או תוכנית שנעשתה בהתאמה אישית. למדוד את האורך ואת הזווית של ענפים הארכת מאורגנואידים או הגירה של תאים בודדים. כאן, לבצע כימות על ידי ציור מיתאר ביד חופשית סביב הגוף אורגאיד באמצעות ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EGF הוא מווסת חיוני של הסתעפות מורפולגנזה בבלוטות החלב ואת כימוג קריטי המנחה את הגירה של תאים אפיתל השד בצמיחה סרטן פולשנית. השתמשנו מכשירים פלואידים מזוסקופיים שתוארו לעיל כדי ללמוד את תגובת התאים כדי להגדיר מעברי EGF (איור 1A, ב)10. המכשיר מניב אזור תרבות ברוחב 5 מ"מ, 10 מ"מ אורך, וגובהו 1 מ"מ. הצדדים של אזור התרבות מופרדים מבארות פתוחות על ידי עמודים משושה, אשר משמשים כדי ללכוד את ECM נוזלי ואת התערובת התא בתוך אזור תרבות התא דרך מתח פני השטח. אנו מודעים לכך, בהתחשב בגודל של התרבות התלת-ממדית הזו, זה יהיה קשה מאוד, יקר, וזמן רב לבנות עובש בגודל מתאים על ידי פוטוליטוגרפיה10. באמצעות יישום הרומן של טכניקה סטנדרטית, סטריאואוליתוגרפיה, אנחנו מהר ובזול הפיק את העובש. יתר על כן, על ידי שינוי העיצוב, מעבר מעריכי (איור 1c, i) או מעברי צבע ליניאריים מרובים בשבב (איור 1c, ii) ניתן לתוצאה כמו גם מעבר יציב עם זרימה רציפה (איור 1c, iii).

שניהם סיליקו (איור 2A,B, C) ו מחוץ גופית (איור 2A, E, F) בדיקות הפגינו היווצרות מעבר egf יציבה ליניארי על פני שטח תרבות התא אשר נמשך כיומיים ללא מילוי מקרוב ' ' מקור ' ו ' כיור ' מאגרים. הדיפוזיה תלויי הזמן של החלבונים הייתה מדומה באמצעות תוכנה רב-פיזיקה ממוסחר. הגיאומטריה התלת-ממדית של התצורה הקאמרית הייתה נוצרת מחדש על התוכנה והריכוז הממוצע בתוך אמצעי האחסון הפנימי נקבע והותווה. תוצאות אלה הציעו EGF, חלבון 6.4 kDa, יכול ליצור מעבר יציב מבוסס דיפוזיה בתוך ג'ל קולגן הכין כמתואר לעיל על פני תקופה קצרה יחסית של זמן. קבענו גם כי פרופילים דומים של חלבונים של 1, 10, ו-150 kDa יכול להיווצר באמצעות שיטה זו.

אורגנואידים של חלב יצרו ענפים מרובים בנוכחות אחידה מרחב 2.5 nM egf והקמת הענף הציג לא הטיה כיוונית על 3 ימים (איור 3a, D). עם זאת, אם התווסף EGF בצורת מעבר ליניארי של 0.5 ננומטר/mm, היווצרות הענף הציג הטיה כיוונית משמעותית (איור 3B, E). עם זאת, לא גילינו הטיה כזו עבור תאים בודדים באותו מעבר צבע. כדי לקבוע אם תקשורת בין-תאית הייתה נחוצה עבור תגובת מעבר הצבע, אנו חקרו אם חסימת צמתי הפער הבין-תאי עם מעכבי שונים תמנע את היווצרות הענף המווטה. מעכבי צומת הפער אכן דיכא את היכולת של האורגנואידים להגיב על מעבר הצבע (איור 3C, F). כפי שחקרו בהרחבה במחקר המקורי המתאר את השיטה הזאת10, התוצאה הזאת תומכת בהשערה כי התקשורת באמצעות צמתים הפער היא הכרחית עבור תגובת הדרגתי egf באורגנואידים של חלב10.

Figure 1
איור 1. מכשיר מסופלואידיג עם מעבר הדרגתי מוגדר EGF. (A) תצוגה תלת ממדית של שבב PDMS: (i) התצוגה העליונה ו (ii) מבט חזיתי של תבנית (יחידה: mm) (iii) מערך של תבניות (אדום) מלא ב-PDMS (הרביעי) (iv) pdms צ'יימברס ביטול מן העובש (v) תרשים סכמטי של התקן מורכב (vi) תמונה אמיתית של מילוי המכשיר ed עם ג'ל קולגן ובינוני תרבותי. (ב) תרשים סכמטי של התא המסופלודיום עם אורגנואידים מוטבע ג'ל קולגן ומאגרים של גבוהה (אדום) נמוך (אדום) ריכוז egf וכתוצאה מכך הדרגתיים egf (איור זה כבר שונה מ10). (ג) עיצובים פוטנציאליים לגרימת מעבר מעריכי (i), ארבעה מעברי צבע ליניאריים שונים בשבב (ii), ומעבר צבע יציב עם זרימה רציפה (iii). אזורים אדומים מצביעים על מקורות או כיורים המלאים באזורי תרבות בינוניים ואפורים מצביעים על התאים המלאים בתערובת ג'ל/תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. הערכה של ליגומעברי צבע על פני השבב. (א) הדמיה של ליגוריכוז על פני השבב המציג פרופילי מעבר צבע. פרופילי מעבר צבע מדומה (ב) 1 חלבון kda ו- (ג) 70 kda חלבון. (ד) התמונה של המכשיר עם מעבר ליניארי של 10 Kda כחול dextran המשמש להמחיש את הדיפוזיה של egf. קווים מנוקדים משושה מצביעים על עמודים בצד של אזור ג'ל. פרופילי מעבר ניסיוני של 1, 10 ו-150 kda תוספי על פני השבב (איור זה כבר שונה מ אליסון et al. 201610) (E) לאחר 8 שעות ו (F) אחרי 48 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. תגובה תאית למעבר הדרגתי של EGF. (א) הסתעפות של אורגנואידים בקולגן עם אחיד 2.5 ננומטר EGF. (ב) כיוונית הסתעפות של אורגנואידים ב קולגן עם מעבר ליניארי של 0.5 ננומטר/MM של egf. (ג) הסתעפות שאינה כיוונית של אורגנואידים במעבר צבע ליניארי של 0.5 ננומטר/MM של egf עם חוסם צומת מרווח. (D-F) היסטגרמות זוויתית של כיווני מסעף אורגנואיד המתאימים ל (א)-(ג), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הייצור של תבניות PDMS בוצע באמצעות שירות הדפסה תלת-ממדי מסחרי, אבל יכול להתבצע גם על-ידי מדפסת תלת-ממד באיכות גבוהה בתוך הבית. בין שיטות ייצור תלת-ממד, סטריאואוליתוגרפיה מומלצת ליצירת עובש ברזולוציה גבוהה. מכיוון שריפוי PDMS מתרחש בטמפרטורה גבוהה (80 ° c), החומרים צריכים להיות עמידים בפני חום מספיק, אשר יש לציין במפורש, אם ההדפסה היא מיקור חוץ. לאחר טיפול תרמי ניתן לדון עם חברת שירות ההדפסה כדי להגדיל את ההתנגדות התרמית של החלק. פרטי שירות ההדפסה והחומרים מצוינים בטבלת החומרים.

המאפיין המכני של התרופה לריפוי PDMS תלוי בטמפרטורת הריפוי. אם התערובת PDMS נשמרת בטמפרטורת החדר במשך זמן רב לפני הריפוי בתנור, היא הופכת גמישה מדי גם לאחר הריפוי המלא. לפיכך, התהליך החסר בטמפרטורת החדר צריך להתבצע תוך שעה או פחות. הכוונה ליישום מחזורי של ואקום שיכול לעזור להסיר כל מיקרו בועות בתוך PDMS.

ה-pH של פתרון הקולגן הוא קריטי לא רק עבור gelation אלא גם עבור הכדאיות התא. אם הקולגן אינו מנוטרל לפני ערבוב עם תאים, הכדאיות התא יהיה נמוך. הכמות של 1 N NaOH פתרון לנטרול תערובת הקולגן תלוי ב-pH של פתרון הקולגן המקורי וזה יכול להיות מחושב תיאורטית. עם זאת, מומלץ להוסיף את הפתרון NaOH לפתרון קולגן בהדרגה, בדיקת הקריאות pH של המדיום באמצעות אינדיקטור אדום באמצעות מחוון או שימוש בקלטות בדיקות pH.

הדרך לניטרול הג חשובה לאורך כל התהליך. אם בועות טופס במהלך gelation לאחר תערובת הקולגן מוזרק למכשיר, הם יכולים להיות גם הסיר על ידי הצבת המכשיר על הקרח עבור 10 דקות או יותר. על ידי שחרור הטמפרטורה, גודל הבועות מפחית ואת חללים הם בסופו של דבר מאוכלס על ידי תערובת ג'ל. באותה שיטה ניתן להשתמש כאשר בועות לכודים בין העמודים לאחר הוספת מדיום התרבות למאגרים.

השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי ליצור התקנים mesoflu, המאפשרים הטבעה של מבנים multi-סלולריים גדולים לתוך סביבת מטריצה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ולשלב אותו עם מעברי צבע מוגדרים של גורמי צמיחה מסיסים אחרים מולקולות ביואקטיביות. סטריאואוליתוגרפיה ברזולוציה גבוהה אפשרה לנו להפיק תבניות באיכות גבוהה, בעלות נמוכה. תהליך הייצור אינו דורש מתקנים בחדר נקי ולא טכניקות ליתוגרפיה, ובכך מאפשר דור פשוט אך יעיל של סביבת 3D עבור תרבות התא וניסויים, אשר יש יתרונות רבים לעומת 2D המסורתית ניסויים. המכשיר מומחש כאן תוכנן להיות באזור התרבות של 5 מ"מ רוחב, 10 מ"מ אורך, ו 1 מ"מ גבוה. אזור התרבות הגדול יחסית עם גובה עבה יותר מאפשר צמיחה של אורגנואידים גדולים או spheroids, החל בגודל של עשרות עד מאות מיקרומטר. הוא גם מאפשר ניתוח של הגירה האפיתל הסתעפות, וניתוח של העברת תאים קולקטיבית ויחיד בתוך הסביבה 3D. הצדדים של המכשיר הם בארות פתוחות המאפשרות שימוש בפיפטות סטנדרטיות כדי לשנות מדיה או להוסיף סמים ללא צורך בתקשורת מסובכת עם התקני הבקרה הנוזלית, המשמשים בדרך כלל להתקני microfluidic המיינסטרים. כמו-כן, התצורה הפשוטה של תא PDMS וזכוכית כיסוי בתחתית מתאימה באופן אוניברסלי למערכות מיקרוסקופית מגוונות. השימוש במכשירים הראה את כיוון ההסתעפות המוטה של הורפוגנזה ברקמת שד רגילה, בתגובה למעבר EGF המוטל כדוגמה מייצגת לשימוש במכשיר. עם זאת, שימוש זה יכול גם להיות מורחב לרקמות שונות, מקורות תא, כימוטים, ותרופות לניתוח של התנהגות תא/רקמה ב-3D. השימוש גם יכול להיות מורחב כדי להכיל מידול רקמות ריאליסטי יותר, אשר להכיל היווצרות הרשת כלי דם מתאים בודדים בתוך ג'ל יחד עם שילוב של סוגי תאים אחרים, כולל סטרומה mesenchymal ורכיבים החיסונית וסוגי תאים אפיתל מגוונים.

למרות סטריאואוליתוגרפיה מציעה את הרזולוציה הטובה ביותר בקרב טכניקות הדפסה תלת-ממד, גודל התכונה המינימלית עדיין מוגבל כמה עשרות מיקרומטר. לכן, פרוטוקול זה אינו מספיק כדי להחליף פוטוגרפיה ב בדיית תבניות בקנה מידה של מיקרומטר כמה. מגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא העומק הנמוך יחסית של הדמיה באיכות גבוהה בכיוון z בהשוואה לכיוון x-y, שהוא סוגיה הטבועה של מבנים בקנה מידה של רקמת הדמיה, באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונאלי. עם זאת, גם עם מגבלות אלה, השיטה המתוארת יכולה לספק פלטפורמת ניתוח רבת עוצמה וגמישה, שקל להמציא ולהשתמש בה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים כדי AJE (NSF PD-11-7246, סרטן השד מחקר הקרן (BCRF 17-048), ו NCI U54 CA210173) ו-AL (U54CA209992).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22mm x 22mm coverslip  Fisher Scientific 12-542-B
Collagen I, Rat Fisher Scientific CB-40236
Collagenease Sigma-Aldrich C5138
COMSOL Multiphysics 4.2 COMSOL Inc Used for simulating diffusion dynamics
10x DMEM Sigma-Aldrich D2429
DEME/F12 Thermo Fisher 11330032
DNase Sigma-Aldrich D4623
EGF Recombinant Mouse Protein Thermo Fisher PMG8041
Fetal Bovine Serum (FBS) Life technologies 16140-071
Fiji-ImageJ Used for measuring branching length and angles
Gentamicin GIBCO  5750-060
IMARIS Bitplane
Insulin Sigma-Aldrich 19278
Insulin-Transferrin-Selenium-X GIBCO  51500
Low-lint tissue Kimberly-Clark Professional Kimtech wipe
Mold Material Proto labs Accura SL5530 
Mold printing equipment Proto labs Stereolithogrphy Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm
Mold printing Service Proto labs Custom https://www.protolabs.com/
NaOH Sigma-Aldrich S2770
Penicillin/Streptomycin VWR 16777-164P
Spinning-disk confocal microscope Solamere Technology Group
Sylgard 184 Electron Microscopy Sciences 184 SIL ELAST KIT  PDMS kit
Trypsin Sigma-Aldrich T9935

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
  2. Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
  3. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  4. Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
  5. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
  6. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  7. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
  8. Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
  9. Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
  11. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).

Tags

ביו-הנדסה סוגיה 147 חישת מעבר צבע אברי-על-שבב כימוטקסיס סטריאואוליתוגרפיה מטריצה מינתאיים פיתוח אורגנואידים
ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, T. Y., Ellison, D., Lee, S.… More

Kang, T. Y., Ellison, D., Lee, S. H., Ewald, A. J., Levchenko, A. 3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients. J. Vis. Exp. (147), e59226, doi:10.3791/59226 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter