Summary
हम कोशिकाओं और बहुकोशिकीय ऑर्गेनॉयड के साथ 3 डी संस्कृति और प्रयोग के लिए उपकरणों का निर्माण करने के लिए एक विधि का वर्णन । इस उपकरण को परिभाषित chemoattractant gradients के साथ 3 डी microपरिवेशों में घुलनशील संकेतों को सेलुलर प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है । ऑर्गेनॉयड कमजोर शोर आदानों का पता लगाने में एकल कोशिकाओं की तुलना में बेहतर कर रहे हैं ।
Abstract
2D कोशिका संस्कृति प्रणाली की विभिंन सीमाओं 3 डी कोशिका संस्कृति और विश्लेषण प्लेटफार्मों, जो बेहतर रहने वाले ऊतकों और vivo में ऊतक कार्यों में नकल की स्थानिक और रासायनिक जटिलता की नकल होगी में रुचि छिड़ गई है । माइक्रोफैब्रिकेशन प्रौद्योगिकियों में हाल के अग्रिमों में 3 डी के विट्रो वातावरण में जो कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से परिभाषित extracellular मैट्रिक्स (ECM) में एकीकृत किया जा सकता है और घुलनशील या मैट्रिक्स जुड़े biomolecules का एक निर्धारित सेट के विकास को सुगम बनाया है । तथापि, प्रौद्योगिकीय अवरोधों ने अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उनके व्यापक उपयोग को सीमित कर दिया है । यहाँ, हम एक परिभाषित chemoattractant ढाल के साथ 3 डी माइक्रोवातावरणों में कोशिकाओं और बहुकोशिकीय ऑर्गेनॉयड के साथ 3 डी संस्कृति और प्रयोग के लिए सरल उपकरणों का निर्माण करने के लिए एक विधि का वर्णन । हम एपिथेलियल कोशिकाओं और ऑर्गेनॉइड की प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए इस मंच के उपयोग की व्याख्या करने के लिए वृद्धि कारकों के gradients, ऐसे एपिडर्मल विकास कारक (egf) के रूप में । EGF gradients कई दिनों के लिए उपकरणों में स्थिर थे स्तन ऑर्गेनॉइड में निर्देशित शाखा गठन के लिए अग्रणी । इस विश्लेषण ने हमें यह निष्कर्ष निकालना था कि कोशिकाओं के समूह द्वारा सामूहिक प्रवणता संवेदन एकल कोशिकाओं बनाम अधिक संवेदनशील होती है । हम भी निर्माण विधि है, जो photolithography सुविधाओं की आवश्यकता नहीं है और न ही उंनत शीतल लिथोग्राफी तकनीकों का वर्णन । इस पद्धति के कैंसर सहित विकास और रोग राज्यों के विश्लेषण के संदर्भ में 3 डी सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो जाएगा ।
Introduction
शरीरक्रियात्मक वातावरण में कोशिकाएं कोशिकाबाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में समाहित हो जाती हैं और ढेर सारे जैव अणुओं के संपर्क में आ जाती हैं । कोशिकाओं और आसपास के microenvironment के बीच पारस्परिक क्रिया को विनियमित intracellular विभिंन phenotypes को नियंत्रित करने, प्रवास, विकास, भेदभाव और अस्तित्व1,2सहित प्रक्रियाओं । बहुत सेलुलर व्यवहार के बारे में एक पारंपरिक 2 डी कोशिका संस्कृति में सीखा गया है । हालांकि, intravital इमेजिंग और 3 डी hydrogels में एंबेडेड कोशिकाओं के साथ प्रयोग के आगमन के साथ, सेल व्यवहार में महत्वपूर्ण अंतर सरलीकृत 2D में विट्रो संस्कृतियों बनाम 3D ऊतक वातावरण की तरह में मांयता प्राप्त किया गया है । जबकि कोशिकाओं ECM फाइबर के साथ बातचीत और 3 डी मैट्रिक्स के भीतर अपने यांत्रिक गुणों भावना, जेल की सामग्री कठोरता एक 2D में विट्रो प्रणाली में एक पूरी तरह से स्वतंत्र चर नहीं है । विमीयता आसंजन गठन के फोकल बदल, विभिंन कोशिका आकारिकी और व्यवहार में जिसके परिणामस्वरूप । इसके अलावा, एक 2D सतह पर कोशिकाओं को 3 डी में सभी दिशाओं के लिए खुला से कम संकेतन cues को उजागर कर रहे हैं ।
इन सीमाओं 3 डी प्रणाली है कि रहने वाले ऊतकों की स्थानिक और रासायनिक जटिलता का प्रतिनिधित्व करते है और बेहतर vivo ऊतक कार्यों में भविष्यवाणी के लिए हितों में वृद्धि हुई है । वे स्वतः ecm3,4में interspersed कोशिकाओं को सेलुलर microstructures कोडांतरण के रूप में ऑर्गेनॉइड से कई रूपों में विकसित किया गया है । माइक्रोफैब्रिकेशन प्रौद्योगिकियों में हाल ही में अग्रिमों 3 डी संस्कृति प्रणालियों के विभिन्न प्रकार के आगमन की सुविधा है5,6,7,8,9 लक्षणप्ररूपी परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए और घुलनशील संकेतों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाएं; तथापि, प्रौद्योगिकीय बाधाएं अनुसंधान प्रयोगशालाओं में व्यापक उपयोग को सीमित करती हैं । कई मामलों में, निर्माण प्रक्रियाओं photolithography तकनीकों और नरम लिथोग्राफी के लिए पृष्ठभूमि knowledges की आवश्यकता है । इसके अलावा, विभिन्न कारकों को सफलतापूर्वक एक डिवाइस का निर्माण करने के लिए और समय की एक लंबी अवधि में डिवाइस के एक इष्टतम समारोह को प्राप्त करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए.
हमारी विधि का वर्णन कैसे परिभाषित chemoattractant gradients के साथ एक 3 डी microenvironment में कोशिकाओं और बहुकोशिकीय ऑर्गेनॉइड को शामिल करने के लिए एक 3 डी pdms उपकरण का निर्माण करने के लिए और फिर egf10के लिए उपकला प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण । हमारे आंकड़ों से पता चलता है कि उथले EGF ग्रेडिएंट्स का जवाब देने के लिए ऑर्गेनॉइड की क्षमता अंतर जंक्शनों के माध्यम से अंतरकोशिकीय रासायनिक युग्मन से पैदा होती है । यह कमजोर और शोर वाले स्पैटीली वर्गीकृत आदानों का अधिक सटीक पता लगाने के लिए ऑर्गेनॉइड की क्षमता का सुझाव देता है । निर्माण प्रक्रिया के लिए एक cleanroom सुविधा और न ही photolithography तकनीक की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, 3 डी PDMS डिवाइस 3 डी शारीरिक वातावरण के आवश्यक कारक भी शामिल है । इस विधि 3 डी सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो जाएगा और यह विभिन्न प्रकार के सेल के साथ महान अनुसंधान की क्षमता है, chemoattractants, और ECM संयोजन.
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Protocol
सभी पशु काम संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति, जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय, चिकित्सा के स्कूल द्वारा समीक्षा की और अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया गया था ।
1. mesofluidic डिवाइस के निर्माण
- एक 3 डी सीएडी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर PDMS डिवाइस के लिए मोल्ड का मुखौटा डिजाइन ।
- एक थर्मल प्रतिरोधी राल के साथ स्टीरियोलिथोग्राफी उपकरण का उपयोग कर मोल्ड प्रिंट ।
नोट: यहां बताई गई प्रक्रियाएं एक वाणिज्यिक 3D प्रिंटिंग सेवा द्वारा की जाती हैं । - एक 10:1 अनुपात में इलाज एजेंट के साथ अच्छी तरह से एक pdms एकलक समाधान मिलाएं । PDMS मिश्रण के 3 मिलीलीटर डिवाइस के निर्माण के लिए आवश्यक था । कुल मात्रा गढ़े जा करने के लिए molds की संख्या पर निर्भर करता है ।
- 1 घंटे के लिए एक वैक्यूम desiccator में एक घर में प्रयोगशाला वैक्यूम या वैक्यूम पंप के उपयोग के साथ एक वैक्यूम लागू करने से मिश्रण degas ।
- धूल हटाने के लिए एक चिपकने वाला टेप के साथ मोल्ड की सतह ढाब, और फिर मोल्ड करने के लिए PDMS मिश्रण डालना । बुलबुले प्रक्रिया में पेश कर रहे हैं, तो वैक्यूम desiccator में degassing दोहराएँ । मोल्ड के खंभों के बीच फंसे बुलबुले को तेज सुई से पोकिंग करके हटाया जा सकता है ।
नोट: कमरे के तापमान पर degassing प्रक्रिया 1 घंटे या उससे कम समय के भीतर किया जाना चाहिए । - 2 घंटे के लिए ८० ° c पर हीटिंग द्वारा PDMS इलाज । मोल्ड कमरे के तापमान पर शांत करने के लिए अनुमति दें ।
- एक ब्लेड के साथ मोल्ड और PDMS के बीच सीमा में कटौती और फिर से दूर मोल्ड से PDMS छील ध्यान से ।
- PDMS भाग ट्रिम 22 मिमी x 22 मिमी coverslip फिट और inlet पर एक छेद पंच ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । - कम lint ऊतकों और ७०% इथेनॉल के साथ सतहों पोंछते द्वारा PDMS भाग और 22 मिमी x 22 मिमी coverslip साफ. फिर एक चिपकने वाला टेप के साथ dabbing द्वारा बड़े धूल कणों को हटा दें ।
- या तो autoclaving द्वारा PDMS भाग और coverslip (१२१ ° c 8 मिनट के लिए गीला, 15 मिनट सूखी) या 1 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के लिए जोखिम ।
- ऊतक संस्कृति हुड में 5 मिनट के लिए कोरोना निर्वहन बंदूक के साथ PDMS भाग और कवर पर्ची के नीचे की सतह का इलाज और फिर उन्हें एक साथ बांड ।
सावधानी: किसी भी गैर-आयोजन सामग्री इस तरह के तल पर polystyrene फोम के रूप में रखना और इस प्रक्रिया के दौरान सभी संचालन सामग्री को हटा दें । उपकरण में कोलेजन सुई तुरंत, 5 मिनट के भीतर, उपचार के बाद कोलेजन जेल और ग्लास coverslip के बीच संबंध बढ़ाने के लिए ।
2. सेल तैयारी: प्राथमिक स्तन अंगाभ अलगाव
नोट: स्तन के अंगिका अलगाव का विवरण पिछले कार्य11में पाया जा सकता है । किसी भी प्रकार के एकल कोशिका या अंगोइड को उनके स्वयं के अलगाव/विलगन प्रोटोकॉलों के अनुसार तैयार किया जा सकता है ।
- चूहों के स्तन ग्रंथि ऊतक एक स्केलपेल के साथ mince जब तक ऊतक आराम और यह ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए हिला collagenase के ५० मिलीलीटर में ०.१ ०.१/ , FBS की 5 मिलीलीटर, 1 μg/mL इंसुलिन की २५० μL, और ५० μg/एमएल जेंटॅमाइलिन की ५० μL ।
- 10 मिनट के लिए १,२५० x g पर collagenase/trypsin समाधान अपकेंद्रित्र आकांक्षा द्वारा supernatant निकालें । DMEM/F12 के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फैलाने, और 10 मिनट के लिए १,२५० x g पर केंद्राभित्र । आकांक्षा द्वारा DMEM/F12 को हटाने के बाद, DMEM के 4 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित ४०/
- 2-5 मिनट के लिए हाथ से DNase समाधान हिला और फिर 10 मिनट के लिए १,२५० x g पर केंद्राउत्र ।
- चार विभेदक केंद्राग्रहों के माध्यम से एकल कोशिकाओं से अलग organoids (१,२५० एक्स जी के लिए पल्स और यह इरादा गति तक पहुंच जाता है के बाद अपकेंद्रित्र 3-4 एस बंद) । प्रत्येक नाड़ी के बीच, supernatant महाप्राण और DMEM के 10 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित/
- कोलेजन तैयार करने के लिए 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1% इंसुलिन-transferrin-सेलेनियम-एक्स के साथ अंतिम गुटिका को DMEM/F12 के विकास माध्यम की वांछित राशि में फिर से निलंबित करें ।
3. कोलेजन तैयारी और इंजेक्शन
नोट: ecm जैल के अन्य प्रकार के अपने स्वयं के जेलीकरण प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया जा सकता है ।
- कोलेजन प्रकार मैं समाधान (३.७८ मिलीग्राम/एमएल), 10x DMEM, 1 N NaOH समाधान, बर्फ पर सामांय विकास के माध्यम तैयार करते हैं ।
नोट: प्रक्रिया पूरी होने तक बर्फ पर रखें । - एक पूर्व-द्रुतशीतित माइक्रोअपकेंद्रित्र नलिका में 6-1 छ नव्भ् विलयन, २००-एल की वृद्धि माध्यम तथा ५०-एल-10x डीएमईएम जोड़ें तथा विलयन को अच्छी तरह से मिलाएं ।
- पूर्व मिश्रित समाधान में कोलेजन के ४२५ μL जोड़ें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
- अपकेंद्रित्र कोलाजेन मिश्रण संक्षेप (5 सेकंड से कम) अलग और मिश्रण से बुलबुले को दूर करने के लिए ।
- 1 घंटे के लिए बर्फ पर neutralized कोलेजन समाधान रखने के लिए फाइबर गठन प्रेरित ।
- कोलेजन मिश्रण में कोशिका निलंबन की ५० μL जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं ।
नोट: अंतिम कोलेजन एकाग्रता है 2 मिलीग्राम/ - पूरे चैंबर में भर जाता है जब तक pdms डिवाइस के प्रवेश के माध्यम से २०० μl पिपेट का उपयोग कर समाधान सुई यदि खंभों के अंतराल के माध्यम से कोलेजन मिश्रण ओवरफ्लो, बाहर तेज शल्य ब्लेड के बाद के साथ अतिरिक्त कोलेजन जेल काट gelation ।
- इस डिवाइस को ३७ ° c पर 5% के साथ 1 घंटे के लिए2 .
- दोनों तरफ के जलाशयों को विकास माध्यम से भरें और 5% CO2 के साथ ३७ ° c पर डिवाइस को इंक्यूबेटर में रखें जब तक कॉन्फोकल इमेजिंग किया जाता है ।
4.3 डी इमेजिंग और परिमाणीकरण
- एक संनाभि माइक्रोस्कोप के लिए एक जीवित सेल इमेजिंग संस्कृति चैंबर स्थापित करें और पूर्व निर्धारित तापमान और सह2 से ३७ डिग्री सेल्सियस और 5%, क्रमशः । नमी प्राप्त करने के लिए, कक्ष के जलाशय में पानी जोड़ें और यदि आवश्यक हो तो कक्ष में गीला पोंछे रखें ।
- चैंबर में PDMS डिवाइस प्लेस और ढाल गठन में EGF के एक ' स्रोत ' के रूप में जलाशय में से एक के लिए EGF जोड़ें । अंय जलाशय एक ' सिंक ' के लिए स्थानिक रूप वर्गीकृत egf वितरण के विकास के लिए आवश्यक काम करेंगे । इस अध्ययन में ०.५ एनएम/एमएम की ढाल बनाने के लिए सिंक में २.५ एनएम का ईजीएफ जोड़ा गया था ।
- Z-स्टैक की श्रेणी सेट ब्याज के ऑर्गेनॉइड की मात्रा को कवर और इमेजिंग शुरू करते हैं ।
चेतावनी: phototoxicity से बचने के लिए, संनाभि इमेजिंग में एक कम लेजर तीव्रता की कोशिश या बहु photon इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करें. - या तो वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर या एक कस्टम निर्मित कार्यक्रम का उपयोग कर 2D छवि के ढेर से एक 3 डी छवि पुनर्निर्माण । ऑर्गेनॉइड से विस्तार शाखाओं की लंबाई और कोण को मापने या व्यक्तिगत कोशिकाओं के प्रवास । यहां, imagej का उपयोग कर अंगाभ शरीर के चारों ओर एक मुक्तहस्त रूपरेखा ड्राइंग द्वारा मात्रात्मक प्रदर्शन करते हैं ।
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Representative Results
Egf स्तन ग्रंथियों और एक महत्वपूर्ण chemoattractant में संरचनाविकास शाखाओं में बंटी के एक आवश्यक नियामक है आक्रामक कैंसर के विकास में छाती उपकला कोशिकाओं के प्रवास के मार्गदर्शन । हम ऊपर वर्णित mesoscopic fluidic उपकरणों का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए परिभाषित EGF gradients (चित्रा 1a, बी)10. डिवाइस एक संस्कृति क्षेत्र 5 मिमी चौड़ा, 10 मिमी लंबे, और 1 मिमी लंबा पैदावार. संस्कृति क्षेत्र के पक्षों को हेक्सागोनल स्तंभों द्वारा खुले कुओं से अलग किया जाता है, जो सतह तनाव के माध्यम से कोशिका संस्कृति क्षेत्र के भीतर तरल ईसीएम और कोशिका मिश्रण को ट्रैप करने के लिए उपयोग किए जाते हैं । हम ध्यान दें कि, इस 3 डी संस्कृति के आकार को देखते हुए, यह बहुत मुश्किल होगा, महंगा है, और समय लेने के लिए एक उपयुक्त photolithography द्वारा मोल्ड आकार10का निर्माण । एक मानक तकनीक, stereolithography के एक उपंयास आवेदन का उपयोग करके, हम जल्दी और सस्ते में मोल्ड का उत्पादन किया । इसके अलावा, डिजाइन, एक घातांक ढाल (चित्रा1 सी, मैं) या एक चिप में एकाधिक रैखिक gradients संशोधित करके (चित्रा 1c, द्वितीय) प्रेरित किया जा सकता है और साथ ही निरंतर प्रवाह के साथ एक स्थिर ढाल (चित्रा 1 सी, iii).
सिलिको में (चित्र2ण्2, इ,ग) तथा इन विट्रो (चित्र 2d, E, F) परीक्षणों ने कोशिका संस्कृति क्षेत्र में एक स्थिर रैखिक egf प्रवणता के निर्माण का प्रदर्शन किया, जो लगभग दो दिनों तक बिना पुनःपूर्ति किए स्रोत ' और ' सिंक जलाशयों । प्रोटीन का समय निर्भर प्रसार एक commercialized multiphysics सॉफ्टवेयर का उपयोग कर नकली था । चैंबर विंयास के 3 डी ज्यामिति सॉफ्टवेयर पर निर्मित किया गया था और चैंबर मात्रा के भीतर औसत एकाग्रता निर्धारित किया गया था और साजिश रची । इन परिणामों का सुझाव दिया है कि EGF, एक ६.४ केडीए प्रोटीन, एक स्थिर प्रसार के रूप में समय की एक अपेक्षाकृत कम अवधि से ऊपर वर्णित कोलेजन जेल के भीतर आधारित ढाल फार्म कर सकते हैं । हमने यह भी निर्धारित किया है कि इस विधि का उपयोग करके 1, 10 और १५० केडीए के प्रोटीन के समान प्रोफाइल बनाए जा सकते हैं ।
Mammary ऑर्गेनॉइड स्थानिक रूप वर्दी २.५ एनएम egf की उपस्थिति में कई शाखाओं का गठन और शाखा गठन 3 दिनों में कोई दिशात्मक पूर्वाग्रह प्रदर्शित (चित्रा 3a, D) । तथापि, यदि EGF ०.५ एनएम/mm की रैखिक ढाल के रूप में जोड़ा गया था, शाखा गठन एक महत्वपूर्ण दिशात्मक पूर्वाग्रह प्रदर्शित (चित्रा 3 बी, ई) । तथापि, हम एक ही ढाल में एक ही कोशिकाओं के लिए ऐसा कोई पूर्वाग्रह का पता चला । आदेश में यदि बहुकोशिकीय संचार ढाल प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक था यह निर्धारित करने के लिए, हम पता लगाया कि विभिंन inhibitors के साथ अंतराकोशिक अंतर जंक्शनों अवरुद्ध पक्षपातपूर्ण शाखा गठन को रोकने होगा । अंतराल जंक्शन अवरोधकों ने वास्तव में ऑर्गैनॉइड की ढाल का जवाब देने की क्षमता को दबा दिया (चित्र 3C, F) । के रूप में और अधिक व्यापक रूप से पता लगाया मूल अध्ययन में इस विधि का वर्णन10, इस परिणाम परिकल्पना है कि गैप जंक्शनों के माध्यम से संचार स्तन ऑर्गेनॉइड10में egf ढाल प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है का समर्थन करता है ।
चित्रा 1 । परिभाषित EGF ढाल के साथ mesofluidic डिवाइस. (क) पीडीएमएस चिप का 3d दृश्य: (i) शीर्ष दृश्य और (ii) एक मोल्ड के सामने देखने (इकाई: मिमी) (iii) पीडीएमएस से भरे हुए molds (लाल) की एक सरणी () (iv) pdms कक्षों मोल्ड से बंद pilled (v) एक इकट्ठे डिवाइस का एक योजनाबद्ध आरेख (vi) डिवाइस भरण का वास्तविक चित्र कोलेजन जेल और संस्कृति माध्यम के साथ एड । (ख) एक कोलैजेन जेल और उच्च (लाल) और कम (लाल) egf एकाग्रता में एंबेडेड ऑर्गेनॉयड के साथ mesofluidic चैंबर के एक योजनाबद्ध आरेख egf gradients में जिसके परिणामस्वरूप (यह आंकड़ा10से संशोधित किया गया है) । (ग) चरघातांकी प्रवणता (प्), चिप में चार भिन्न रेखीय ग्रैडिएंट (पप) तथा सतत प्रवाह के साथ स्थिर ढाल (पपप) को उत्प्रेरित करने के लिए संभावित अभिकल्प । लाल क्षेत्रों से संकेत मिलता है कि संस्कृति माध्यम और धूसर क्षेत्रों से भरे हुए स्रोत या सिंक, जेल/कोशिकाओं के मिश्रण से भरे हुए कक्ष दर्शाते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 । चिप भर में लिगामेंट gradients का मूल्यांकन । (क) ग्रैडिएंट प्रोफाइल दर्शाते हुए चिप में लिग्व सांद्रण का अनुकरण । नकली ढाल प्रोफाइल (ख) 1 केडीए प्रोटीन और (ग) ७० केडीए प्रोटीन । (घ) 10 केडीए Dextran नीले की एक रैखिक ढाल के साथ डिवाइस की छवि egf के प्रसार को कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया । हेक्सागोनल डॉटेड रेखाएँ जेल क्षेत्र के किनारे स्तंभों को दर्शाती हैं । चिप के पार 1, 10 और १५० केडीए dextran के प्रयोगात्मक ढाल प्रोफाइल (यह आंकड़ा एलिसन एट अल से संशोधित किया गया है । २०१६10) (ङ) के बाद 8 घंटे और (च) ४८ घंटे के बाद । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 । EGF ढाल को सेलुलर प्रतिक्रिया. (क) एक समान २.५ एनएम ईजीएफ के साथ कोलेजन में ऑर्गेनॉइड का गैर-दिशात्मक शाखाकरण । (ख) ईजीएफ के ०.५ एनएम/एमएम की रैखिक प्रवणता वाले कोलेजन में ऑर्गेनोइड की दिशात्मक शाखाकरण । (ग) ईजीएफ के ०.५ एनएम/एमएम की रैखिक प्रवणता में आर्गेनॉइड का गैर-दिशात्मक शाखाकरण जिसमें अंतराल जंक्शन अवरोधक है । (D-F) (क)-(ग), क्रमशः के तदनुरूप कोणीय हिस्टोग्राम ऑर्गेनोइड शाखाएँ । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
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Discussion
PDMS molds के निर्माण एक वाणिज्यिक 3 डी मुद्रण सेवा का उपयोग किया गया था, लेकिन यह भी एक उच्च अंत में 3 डी प्रिंटर घर से पूरा किया जा सकता है । विभिंन 3d निर्माण तरीकों में, स्टीरियोलिथोग्राफी उच्च संकल्प मोल्ड पीढ़ी के लिए सिफारिश की है । क्योंकि PDMS इलाज एक उच्च तापमान (८० डिग्री सेल्सियस) पर होता है, सामग्री पर्याप्त thermally प्रतिरोधी होना चाहिए, जो स्पष्ट रूप से निर्दिष्ट किया जाना चाहिए, अगर मुद्रण आउटसोर्स है । एक थर्मल पोस्ट-इलाज मुद्रण सेवा कंपनी के साथ चर्चा के लिए भाग के थर्मल प्रतिरोध बढ़ाने के लिए किया जा सकता है । मुद्रण सेवा और सामग्री के विवरण सामग्री तालिकामें निर्दिष्ट कर रहे हैं ।
ठीक PDMS की यांत्रिक संपत्ति के इलाज के तापमान पर निर्भर करता है । यदि PDMS मिश्रण एक ओवन में इलाज से पहले एक लंबे समय के लिए कमरे के तापमान पर रखा जाता है, यह भी पूरा इलाज के बाद लोचदार हो जाता है । इस प्रकार, कमरे के तापमान पर degassing प्रक्रिया 1 घंटे या उससे कम समय के भीतर किया जाना चाहिए । विगैसन, वैक्यूम के चक्रीय अनुप्रयोग को संदर्भित करता है जो पीडीएमएस के भीतर किसी भी सूक्ष्म बुलबुले को हटाने में मदद कर सकता है ।
कोलेजन समाधान के पीएच न केवल जेलीकरण के लिए बल्कि सेल व्यवहार्यता के लिए महत्वपूर्ण है । यदि कोलेजन कोशिकाओं के साथ मिश्रण करने से पहले neutralized नहीं है, सेल व्यवहार्यता कम हो जाएगा । कोलेजन मिश्रण को निष्क्रिय करने के लिए 1 N NaOH समाधान की राशि मूल कोलेजन समाधान के पीएच पर निर्भर करता है और यह सैद्धांतिक रूप से गणना की जा सकती है । तथापि, यह करने के लिए जोड़ने के लिए सिफारिश की है NaOH समाधान के लिए कोलेजन का समाधान धीरे, जांच के पीएच रीडिंग के माध्यम से phenol लाल संकेतक या पीएच परीक्षण टेप का उपयोग कर ।
Degassing जेल पूरी प्रक्रिया में महत्वपूर्ण है । यदि बुलबुले के दौरान जेलीकरण फार्म के बाद कोलेजन मिश्रण उपकरण में इंजेक्ट किया जाता है, वे भी 10 मिनट या अधिक के लिए बर्फ पर डिवाइस रखकर हटाया जा सकता है । तापमान गिराने से बुलबुले का आकार कम हो जाता है और अंत में जेल के मिश्रण से वॉइड्स का कब्जा हो जाता है । जलाशयों के लिए कल्चर मीडियम जोड़ने के बाद खंभों के बीच बुलबुले फंसने पर इसी विधि का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
हम इस तकनीक का इस्तेमाल किया mesofluidic उपकरणों है कि बड़े बहु सेलुलर के embedding परमिट एक फिजिकली प्रासंगिक extracellular मैट्रिक्स वातावरण में constructs और यह विकास कारकों और अंय घुलनशील के परिभाषित gradients के साथ एकीकृत बायोएक्टिव अणुओं । उच्च संकल्प स्टीरियोलिथोग्राफी हमें उच्च गुणवत्ता, कम लागत molds के उत्पादन के लिए अनुमति दी । निर्माण की प्रक्रिया cleanroom सुविधाओं और न ही photolithography तकनीक की आवश्यकता नहीं है, और इस प्रकार की अनुमति देता है सेल संस्कृति और प्रयोग है, जो पारंपरिक 2 डी बनाम एकाधिक लाभ है के लिए एक 3 डी वातावरण की एक सरल लेकिन प्रभावी पीढ़ी प्रयोग. यहां सचित्र डिवाइस 5 मिमी चौड़ा, 10 मिमी लंबे, और 1 मिमी लंबा की एक संस्कृति क्षेत्र के लिए डिज़ाइन किया गया था. मोटा ऊंचाई के साथ अपेक्षाकृत बड़े संस्कृति क्षेत्र mesoscopically बड़े ऑर्गेनॉइड या spheroids के विकास की अनुमति देता है, आकार में दसियों से माइक्रोमीटर के सैकड़ों के लिए लेकर । यह भी शाखाओं में बंटी उपकला मोर्फोजेनेसिस के विश्लेषण, और 3 डी वातावरण के भीतर सामूहिक और एकल कोशिका प्रवास के विश्लेषण की अनुमति देता है । डिवाइस के पक्ष खुले कुओं कि मानक पिपेट का उपयोग मीडिया बदलने के लिए या तरल नियंत्रण उपकरणों के साथ जटिल interfacing के लिए आवश्यकता के बिना दवाओं को जोड़ने के लिए, आम तौर पर मुख्यधारा microfluidic उपकरणों के लिए इस्तेमाल की अनुमति है । इसके अलावा, एक PDMS चैंबर और नीचे एक कवर ग्लास के सरल विंयास विविध सूक्ष्म प्रणाली के साथ सार्वभौमिक संगत है । उपकरणों का उपयोग सामांय स्तन ऊतक में संरचनाविकास के पक्षपातपूर्ण शाखाओं में बंटी दिशा दिखाया, उपकरण के उपयोग के लिए एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में लगाया egf ढाल के जवाब में । हालांकि, इस उपयोग को भी विभिंन ऊतकों, सेल स्रोतों, chemoattractants को बढ़ाया जा सकता है, और कोशिका के विश्लेषण के लिए दवाओं/ उपयोग भी अधिक यथार्थवादी ऊतक मॉडलिंग है, जो अंय प्रकार के सेल के शामिल करने के साथ जेल के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं से संवहनी नेटवर्क के गठन को समायोजित किया जाएगा समायोजित बढ़ाया जा सकता है, मध्योतक stromal और प्रतिरक्षा घटकों सहित और विविध उपकला कोशिका प्रकार ।
हालांकि स्टीरियोलिथोग्राफी 3 डी मुद्रण तकनीकों के बीच बेहतरीन संकल्प प्रदान करता है, ंयूनतम सुविधा का आकार अभी भी माइक्रोमीटर के कई दसियों तक ही सीमित है । इसलिए, यह प्रोटोकॉल कई माइक्रोमीटर के पैमाने पर fabricating molds में photolithography की जगह के लिए पर्याप्त नहीं है । इस प्रोटोकॉल का एक और सीमा z दिशा में उच्च गुणवत्ता इमेजिंग के अपेक्षाकृत कम गहराई x-y दिशा है, जो इमेजिंग ऊतक पैमाने constructs का एक अंतर्निहित मुद्दा है की तुलना में पारंपरिक microscopy का उपयोग कर रहा है । हालांकि, यहां तक कि इन सीमाओं के साथ, वर्णित विधि एक शक्तिशाली और लचीला विश्लेषण मंच है कि आसान बनाना और उपयोग करना है प्रदान कर सकते हैं ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम AJE (NSF पीडी-11-7246, स्तन कैंसर अनुसंधान फाउंडेशन (BCRF-17-048), और NCI U54 CA210173) और अल (U54CA209992) को अनुदान द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
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